无筛选标记（共6篇）
无筛选标记 篇1
转基因动物是现代生物医学和农业科学研究的重要材料。然而,获得转基因的动物中都会留有转基因筛选的抗生素和荧光标记基因,因此存在生物安全以及环境安全方面的危害。传统转基因技术的基因片段随机插入,可能会引起受体物种重要基因表达异常,或者导致外源基因的表达沉默。本试验旨在构建含有2 个同向的Loxp序列的表达载体,转染细胞后可与Cre［1 － 2］穿肽膜相作用,去除Loxp中间的标记基因,同时利用phi C31［3 － 4］整合酶系统介导载体中的att B位点与细胞内的假attp位点结合,实现外源基因的定点整合,从而建立无筛选标记的转基因供体细胞系,以期为制造转基因克隆细毛羊,使拟蛛丝蛋白基因［5 － 6］在毛囊中特异表达,从而提高羊毛的机械韧性,改变羊毛的品质并生产无标记的转基因动物打下基础。
1 材料
pEGFP - N1 质粒、N1 - p Kap - 2s质粒,内蒙古生物制造重点实验室提供; att B基因、引物,生工生物工程( 上海) 股份有限公司生产。
限制性内切酶( AgeⅠ、NotⅠ、StuⅠ、Eco O109Ⅰ、AatⅡ、Ase Ⅰ、Bam H Ⅰ、Xho Ⅰ) ,宝生物工程( 大连)有限公司提供; 连接酶( Ligation High) ,Fermentas公司提供; 抗生素( 卡那霉素) ,北京华越洋生物科技有限公司提供; 感受态细胞( DH5α) ,北京全式金生物技术有限公司提供; 琼脂糖、核酸染料、质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒,天根生化科技( 北京) 有限公司提供。
恒温培养箱、低温冰箱、普通PCR仪( AB 2720) 、超微量紫外分光光度计,购自Thermo公司; 电热恒温水浴锅,购自Poly Science公司; 普通台式离心机,购自Sigma公司; 微量移液器,购自Eppendorf公司。
2 方法
2. 1 主要试剂和培养基的配制
LB液体培养基( 200 m L) : 酵母1 g ,蛋白胨2 g,氯化钠2 g,加纯化水定容至200 m L,调p H值为7. 0,灭菌,4 ℃保存。
LB固体培养基( 200 m L) : 酵母1 g ,蛋白胨2 g,氯化钠2 g,调p H值至7. 0,加琼脂3. 0 g,再加纯化水定容至200 m L,灭菌,4 ℃保存。
10 × TAE电泳缓冲液: Tris碱54 g,硼酸27. 5 g,二水合乙二胺四乙酸二钠3. 72 g,用纯水( 用焦碳酸二乙酯处理过) 定容至500 m L,室温保存。
2. 2 引物的设计( 序列见表1)
注: 方框部分为酶切位点,下画线部分为添加的Loxp序列。
2. 3 目的基因的体外扩增
2. 3. 1EGFP片段的扩增利用引物PF - G和PR - G,以p EGFP - N1 质粒为模板,采用PCR扩增EGFP片段,扩增后的EGFP片段上游含有Loxp序列,胶回收测定浓度,- 20 ℃保存,备用。
PCR反应体系: 模板p EGFP - N1 0. 3 μL( 788 ng /μL) ,10 mmol/L PF - G 2. 5 μL,10 mmol/L PR - G 2. 5 μL,5 × Buffer 10 μL,d NTP 5 μL,GXL DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。
反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。
2. 3. 2 Neo - HSV - TK - Poly A片段的扩增利用引物PF - K和PR - K,以p EGFP - N1 质粒为模板,PCR扩增Neo - HSV - TK - Poly A片段,扩增后的Neo - HSV - TK - Poly A片段下游含有与EGFP片段上游同向的Loxp序列,胶回收测定浓度,- 20 ℃ 保存,备用。
PCR反应体系: 模板p EGFP - N1 0. 3 μL( 788 ng /μL) ,10 mmol/L PF - K 2. 5 μL,10 mmol/L PR - K 2. 5 μL,5 × Buffer 10 μL,d NTP 5 μL,GXL DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。
反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,60 ℃ 45 s,72 ℃ 90s,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。
2. 3. 3CMV片段的扩增利用引物PF - CMV和PR - CMV,以p EGFP - N1 质粒为模板,PCR扩增CMV,胶回收测定浓度,- 20 ℃ 保存,备用。
PCR反应体系: 模板p EGFP - N1 0. 3 μL( 788 ng /μL) ,10 mmol/L PF - CMV 2. 5 μL,10 mmol / L PR - CMV 2. 5 μL,5 × Buffer 10 μL,d NTP5 μL,GXL DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。
反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,59 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。
2. 3. 4 Kap - 2s - Poly A片段的扩增利用PF - 2s和PR - 2s,以N1 - p Kap - 2s质粒为模板,PCR扩增Kap - 2s - Poly A片段,胶回收测浓度,- 20 ℃ 保存,备用。
PCR反应体系: 模板N1 - p Kap - 2s 0. 4 μL( 512 ng /μL) ,10 mmol/L PF - 2s 2. 5 μL,10 mmol/L PR - 2s 2. 5 μL,2 × GC Buffer 25 μL,d NTP 5 μL,LATaq DNA聚合酶0. 5 μL,用去离子水补至50 μL。
反应条件: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 1 min,56 ℃1 min,72 ℃ 150 s,共35 个循环; 72 ℃ 10 min。
2. 3. 5att B片段的合成att B( 301 bp) 基因由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成,合成时两端已添加AseⅠ酶切位点。
2. 4 p EGFP - N1 - 2s重组质粒的构建
2. 4. 1含有Loxp序列的EGFP基因片段与p EGFP -N1 质粒的连接EGFP基因片段经AgeⅠ和NotⅠ双酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; p EGFP -N1 经AgeⅠ和NotⅠ37 ℃ 双酶切1 h,琼脂糖凝胶电泳胶回收,测定胶回收EGFP和p EGFP - N1 的浓度,16 ℃ 过夜连接。 连接体系: 34. 1 ng / μL EGFP4. 5 μL,20. 7 ng / μL p EGFP - N1 1. 5 μL,Solution Ⅰ6 μL。
转化: 连接产物转化感受态细胞( DH5α) ,冰浴30 min; 42 ℃ 热激45 s,再冰浴2 min; 加入500 m L室温的LB液体培养基,37 ℃、220 r/min摇床振荡1 h;将菌液4 000 r/min离心1 min; 弃上清液,留200 μL,然后混匀菌液,取100 μL涂在LB( 已加入卡那霉素)平板上,37 ℃倒置培养过夜。如果转化成功,次日平板上会长出菌落。挑取单菌落于LB( 已加入卡那霉素) 液体培养基中,37 ℃、220 r/min摇床振荡14 ~16 h,提取质粒并酶切鉴定,选择结果阳性的质粒送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序正确的重组质粒命名为p EGFP - N1 - G。
2. 4. 2含有同向Loxp序列的Neo - HSV - TK -Poly A片段与p EGFP - N1 - G质粒的连接Neo -HSV - TK - Poly A片段经StuⅠ和Eco O109 Ⅰ双酶切( 37 ℃ 30 min) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; p EGFP -N1 - G经StuⅠ和Eco O109Ⅰ双酶切( 37 ℃ 30 min) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,分别测定浓度后,16 ℃ 过夜连接。连接体系: 30. 6 ng /μL Neo - HSV - TK -Poly A 5 μL,23. 2 ng / μL p EGFP - N1 1 μL,SolutionⅠ6 μL。
用同样方法进行转化,摇菌,提取质粒,酶切鉴定,结果阳性的送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序正确的重组质粒命名为p EGFP -N1 - GK。
2. 4. 3p EGFP - N1 - GK质粒中启动子CMV的破坏和att B的连接将重组质粒p EGFP - N1 - GK进行AatⅡ单酶切( 37 ℃ 30 min) ,破坏原CMV片段,胶回收后测定浓度,16 ℃ 过夜连接。连接体系:56. 3 ng / μL p EGFP - N1 - GK 5 μL,去离子水1 μL,SolutionⅠ 6 μL。
用同样方法进行转化,并对破坏CMV后的重组质粒进行菌落PCR鉴定。
att B片段经AseⅠ单酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; 将破坏CMV的重组质粒进行AseⅠ单酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,分别测定浓度后,16 ℃ 过夜连接。连接体系: 2. 4 ng /μL att B 5 μL,46. 3 ng / μL重组质粒1 μL,Solution Ⅰ6 μL。
用同样方法进行转化、摇菌,提取质粒进行酶切鉴定,结果为阳性的重组质粒命名为p EGFP - N1 -att B。
2. 4. 4CMV片段与p EGFP - N1 - att B质粒的连接CMV片段经Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切( 37 ℃ 1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收; 将上一步的重组质粒p EGFP - N1 - att B进行Bam H Ⅰ 和Age Ⅰ 双酶切( 37 ℃1 h) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,分别测定浓度后,16 ℃ 过夜连接。 连接体系: 18. 5 ng / μL CMV4. 5 μL,33. 6 ng / μL p EGFP - N1 - att B 1. 5 μL,SolutionⅠ 6 μL。
用同样方法进行转化,摇菌,提取质粒,送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果正确的命名为p EGFP - N1 - att B - C。
2. 4. 5 Kap - 2s - Poly A片段与p EGFP - N1 - att B -C质粒的连接p EGFP - N1 - att B - C质粒进行XhoⅠ单酶切( 37 ℃ 30 min) ,琼脂糖凝胶电泳胶回收,测定浓度,采用无缝克隆法与Kap - 2s - Poly A片段50 ℃ 连接15 min。连接体系: 线性40 ng / μL p EGFP- N1 - att B - C 2 μL,80 ng / μL Kap - 2s - Poly A1 μL,5 × In - Fusion HD Enzyone Premix 2 μL,用去离子水补至10 μL。
用同样方法进行转化,摇菌,提取质粒,送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果正确即为重组质粒p EGFP - N1 - 2s。
3 结果与分析
3. 1 目的基因的体外扩增
3. 1. 1 EGFP片段和Neo - HSV - TK - Poly A片段扩增结果将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,分别获得1,2 泳道1 300 bp左右的条带和3,4 泳道的770 bp左右的条带,均与Neo - HSV - TK - Poly A片段和EGFP片段大小相符( 见图1) ,表明目的基因的体外扩增成功。
M.DL-2 000 Marker;1~4.PCR产物。
3. 1. 2 CMV片段扩增结果将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,获得1,2 泳道600 bp左右的条带,与CMV片段大小相符( 见图2 ) ,表明目的基因的体外扩增成功。
3. 1. 3 Kap - 2s - Poly A片段扩增结果将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,获得1 泳道的2 300 bp左右的条带,与Kap - 2s - Poly A片段大小相符( 见图3) ,表明目的基因的体外扩增成功。
M． DL － 2 000 Marker; 1，2． PCＲ 产物。
M.DL-5 000 Marker;1.PCR产物。
3. 2 重组质粒的鉴定
3. 2. 1 p EGFP - N1 - G和p EGFP - N1 - GK质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - G进行AgeⅠ和NotⅠ双酶切电泳,获得1 泳道770 bp左右的条带,大小与EGFP片段相符。将重组质粒p EGFP - N1 -GK进行StuⅠ和Eco O109Ⅰ双酶切电泳,获得2 泳道1 300 bp左右的条带,与Neo - HSV - TK - Poly A片段大小相符( 见图4) 。初步证明EGFP片段和Neo -HSV - TK - Poly A片段连接成功。
3. 2. 2 p EGFP - N1 - GK质粒测序鉴定重组质粒p EGFP - N1 - GK由生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,结果表明在EGFP起始密码子ATG上游和Neo - HSV - TK - Poly A下游均有Loxp的正确序列ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT。综上所述,两段同向的Loxp序列连接成功。
3. 2. 3 p EGFP - N1 - att B质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - att B进行AseⅠ单酶切电泳,获得3,7 泳道的300 bp左右的条带,与att B片段大小吻合( 见图5) ,初步证明att B片段连接成功。
3. 2. 4p EGFP - N1 - att B - C质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - att B - C进行Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切电泳,获得1,2 泳道600 bp左右的条带,与目的片段CMV大小吻合( 见图6) ,初步证明CMV片段连接成功。
M． DL － 5 000 Marker; 1，2． 酶切产物。
M.DL-5 000 Marker;1~7.酶切产物。
M.DL-5 000 Marker;1,2.酶切产物。
3. 2. 5 p EGFP - N1 - att B - C质粒测序鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - att B - C送至生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果证明att B和CMV连接成功。
3. 2. 6p EGFP - N1 - 2s质粒酶切鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - 2s进行Xho Ⅰ 单酶切电泳,获得2 300 bp左右的条带,与目的片段大小吻合( 见图7) ,初步证明Kap - 2s - Poly A片段连接成功。
M.DL-5 000 Marker;1.酶切产物。
3. 2. 7 p EGFP - N1 - 2s质粒测序鉴定将重组质粒p EGFP - N1 - 2s送至生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序,测序结果正确,证明p EGFP - N1 - 2s片段连接成功,可定点整合的无筛选标记拟蛛丝蛋白基因表达载体p EGFP - N1 - 2s构建成功,见286 页彩图8。
4 讨论
试验以Cre /Loxp［7］系统为基础去除筛选标记基因,在需要切除的基因两端分别添加同向的Loxp序列,转染细胞后,Cre穿肽膜可以识别Loxp序列并且切除其中间的标记基因,达到去除筛选标记的作用。
为了能够实现目的基因在细胞内的定点整合,试验采用了phi C31 整合酶系统,在构建的载体中添加att B位点,与phi C31 整合酶［8］共转染细胞,phi C31 整合酶可以介导att B［9］位点整合到细胞中的假attp位点上,从而达到了目的基因的定点整合。
试验还采用了无缝克隆［10］的技术连蛛丝蛋白基因与载体,无缝克隆( seamless cloning /in - fusion cloning)［11］区别于传统的PCR产物克隆,唯一的差异在于载体末端和引物末端具有15 ~ 20 个同源碱基,由此得到的PCR产物两端便分别带上了15 ~ 20 个与载体序列同源的碱基,依靠碱基间作用力互补配对成环,无需酶连即可直接用于转化宿主菌,进入宿主菌中的线性质粒( 环状) 依靠自身酶系将缺口修复。突破传统的双酶切再加上连接,只需要一步重组法,即可得到高效率克隆的重组载体。
此外,本研究旨在建立无筛选标记的转拟蛛丝蛋白基因的绵羊细胞系,为后续核移植生产无标记的转基因动物奠定基础［12］,所以前期需构建无筛选标记的拟蛛丝蛋白基因表达载体。
5 结论
试验构建的含Loxp序列、att B位点和拟蛛丝蛋白基因( 2s) 的p EGFP - N1 - 2s表达载体经PCR、酶切检测为阳性,测序正确,可以用于后续培养无筛选标记的转拟蛛丝蛋白基因的绵羊细胞系,为核移植提供安全的供体细胞。
摘要：为了构建可定点整合的无筛选标记的拟蛛丝蛋白基因表达载体,试验以p EGFP-N1为骨架载体,并采用PCR技术分别添加Loxp和att B片段,利用无缝克隆法将拟蛛丝蛋白基因(2s)连入质粒,经过转化、阳性克隆筛选、酶切及DNA测序鉴定。结果表明:PCR产物及酶切片段大小符合预期结果,测序结果与相应寡核苷酸序列一致。说明试验成功构建了可定点整合的无筛选标记拟蛛丝蛋白基因表达载体p EGFP-N1-2s,可用于无筛选标记的转基因供体细胞的构建。
关键词：定点整合,无筛选标记,拟蛛丝蛋白基因(2s),无缝克隆,Cre/Loxp系统,pEGFP-N1
无筛选标记 篇2
ISSR(Inter-simple sequence repeat)标记技术是在SSR基础上发展起来的一项新的标记技术,由于其引物设计比SSR简单,具有操作简单、稳定性高以及扩增产物特异性强等优点,在作物分子育种中被广泛研究。
该研究应用亚麻耐盐碱品种和不耐盐碱品种对100条ISSR引物进行筛选,以期为亚麻耐盐碱分子辅助育种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所采用的耐盐碱亚麻品种7 000 ha-1及不耐盐碱亚麻品种原05-10均由黑龙江省农业科学院经济作物研究所提供[1]。试验所用ISSR引物共100条,由上海生物工程公司合成[2,3]。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取与浓度检测
取亚麻幼苗上部新长出的无病叶片,采用北京天根公司生产的Plant Genomic DNA Kit试剂盒提取基因组DNA,0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定DNA质量及浓度,稀释至20 ng·μL-1,-20℃保存。
1.2.2 ISSR反应体系的建立
ISSR反应总体系(20 μL),包括:3.5 U Taq DNA聚合酶、10×buffer 2.5 μL、1 mM Mg2+、250 μM dNTPs、0.5 μM random primer、100 ng模板DNA。最后采用的ISSR优化反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min、52℃复性1 min、72℃延伸2 min,共35个循环;最后72℃延伸10 min[4,5,6]。
2 结果与分析
利用筛选出的亲本对100对ISSR进行引物的筛选,扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶(加入溴化乙锭0.5 μg·ml-1)进行电泳。电泳结束后在紫外灯下用凝胶扫描成像系统扫描记录(见图1),筛选出特异性引物25对,其中,筛选出来的引物U807,U827,U856多态性较好,条带清晰丰富,可用于进一步进行QTL分析等的研究。
通过此方法共筛选出特异性引物25对,筛选出的特异性引物序列见表1。
注(Note):N=(A,G,C,T),R=(A,G),Y=(C,T),B=(C,G,T)(i.e.not A),D=(A,G,T)(i.e.not C),H=(A,C,T)(i.e.not G),V=(A,C,G)(i.e.not T),K=(G,T)(Keto in large groove),M=(A,C)(aMino in large groove),S=(G,C)(Strong[3 H-bonds]),W=(A,T)(Weak[2 H-bonds])
3 结论
ISSR标记技术具有简便、稳定和DNA多态性高等优点,目前在许作物育种中得以广泛的研究利用,但在纤维亚麻分子育种中应用还较少。该试验在优化了ISSR反应体系的基础上,筛选出了25个对2个材料具有特异性的引物,为亚麻耐盐碱分子标记辅助育种提供理论依据。
摘要：为选育耐盐碱亚麻品种,探讨亚麻耐盐碱分子辅助育种手段,以亚麻耐盐碱材料7 000ha-1和不耐盐碱材料原05-10为材料,对100条ISSR引物进行了筛选。结果表明:筛选出25条在两个品种间有特异性的引物,为进一步ISSR标记应用于亚麻群体分析奠定基础。
关键词：亚麻,耐盐碱,特异性引物
参考文献
[1]赵东升.亚麻耐盐碱品种筛选的研究[J].黑龙江农业科学,2011(7):11-12.
[2]杨华,宋绪忠,尹光天,等.黄藤ISSR反应体系的条件优化[J].福建林学院学报,2006(2):19-22.
[3]罗佶,伍贤进,彭帅,等.翻白草总DNA的提取与ISSR-PCR体系的建立与优化[J].安徽农业科学,2008,(3):21-25.
[4]宋晓兵,彭埃天,刘景梅,等.ISSR分子标记及其在中国南方果树上的应用[J].广东农业科学,2009,(7):17-19.
[5]易琼,殷海滨,龚丽琼,等.8个云南主要栽培梨品种亲缘关系的ISSR分析[J].安徽农业科学,2009(2):28-30.
无筛选标记 篇3
随着科技的发展, 转录组测序使人们能够全面快速地获取某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本及基因序列。在分析转录本的结构和表达水平的同时, 还能发现未知转录本和稀有转录本, 提供最全面的转录组信息。因此, 利用转录组测序能帮助人们分析鉴定这些基因对癌变发生的潜在影响, 识别并鉴定这些癌症相关的候选突变分子在基因网络调节中的作用具有重要的意义。
1 资料与方法
1.1 临床资料
向所有收集的患者履行告知义务并签署书面知情同意书, 严格按照国家和国际有关伦理学的要求对69岁老年男性、临床Ⅱ期 (T2b N0M0) 、多次复发、术后诊断明确为膀胱尿路上皮癌的样品 (肿瘤组织和正常膀胱组织) 进行收集。收集到的病例样品进行病理切片诊断, 正常组织样品基本不含肿瘤细胞, 用于高通量测序的样品干重尽量达到2 g以上, 必须是新鲜切除, 置于RNAlater中长期保存备用。
1.2 实验流程
1.2.1 文库构建
根据Trizol (Invitrogen) 试剂说明书提取肿瘤样品和膀胱正常组织中的总RNA, 然后根据Tru Seq RNA样品准备流程, 采用Ⅱlumina标准试剂盒制备m RNA:即从每个样品中取10μg RNA, 通过亲和柱层析从总RNA中分离多聚 (A) (poly A) +m RNA, 随后用Ⅱlumina专用的Buffer对RNA样本片段化, Oligo (d T) 磁珠经两轮纯化富集m RNA, 以片段化后的m RNA为模板, 用逆转录酶 (Super ScriptⅡ) 和随机引物将RNA逆转录成第1条c DNA链, c DNA在缓冲液、d NTPs、RNase H和DNA聚合酶Ⅰ作用下进一步互补合成双链c DNA。随后用QIA Quik PCR纯化试剂盒纯化产物, 产物经末端修复、加A并连接测序接头, 然后用2%琼脂糖选择c DNA片段, 最后进行PCR扩增, 通过Aligent Technologies 2100分析仪检测测序文库的大小、纯度及浓度, 文库构建完成。
1.2.2 测序和数据过滤
使用Ⅱlumina测序平台, 对肿瘤样品和正常样品以Paired-End测序方式 (2×115 bp) 进行测序。原始RNA-seq (RNA sequencing) 数据通过Fastx-tools (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) 得到原始reads后, 用以下方法进行数据过滤: (1) 去除测序中仪器误读产生的Artificial reads; (2) 去除reads中的接头序列; (3) 去除测序质量 (Q<20) 较差的末端序列, 并保留过滤后长度大于50bp的reads。 (4) 过滤后的reads用于下一步的分析。
1.2.3 RNA-seq reads比对
上面数据过滤后得到clean reads, 用Top Hat v1.3.1将clean reads[4]和UCSCH.Sapiens参考基因组进行比对, 比对过程中允许有2个碱基的错配。下载H.Sapiens UCSC hg19软件, 将UCSC hg19软件运行参数做为Top Hat的默认参数。
1.2.4 转录本估计
采用Cufflinks v1.0.3[5]来计算基因表达量 (单位为FPKM, Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads) ;置信区间通过Bayesian推理方法计算;Cufflinks参考的GTF注释信息来自Ensemble数据库[6] (Homo_sapiens.GR Ch37.63gtf) 。
1.2.5 膀胱癌差异表达基因 (differential expressed gene, DEG) 的筛选
利用定位结果, 运行Cufflink (http://cufflinks.cbcb.umd.edu/) 的cuff diff获取膀胱癌组织和正常组织转录组中的基因表达水平和差异表达基因 (FDR<0.05) 。在不同病例的差异表达中筛选出相同的基因作为肿瘤特异的差异表达基因。
1.2.6 差异表达基因的GO功能和KEGG pathway的富集分析
以膀胱癌中所有表达的基因为背景, 共同的差异表达基因为前景, 利用DAVID v6.7[7]完成差异基因的初步功能富集分析, 然后筛选FDR<0.05 (false discovery rate, FDR) 的结果。通过GO FAT和KEGG pathway的功能注释候选基因作为分析的对象。
2 结果
2.1 原始数据的统计情况
所有样品采用Ⅱlumina公司的Genome AnalyzerⅡx测序仪进行转录组的双端测序, 测得的原始碱基数目分别为87亿和89亿 (见表1) 。利用Top Hat软件和 (the university of california santa, UCSC) 参考基因组比对, 发现所获得的读对和Ensemble参考基因的匹配度达~78%。序列测序深度几乎达到50×的人类基因组测序深度。仅仅不到1%的读对和r RNA匹配。结果表明测序样品的c DNA文库构建成功。Reads在基因上分布均匀, 覆盖完整, 见图1。
A、C分别为正常和肿瘤样品的reads在基因上的分布图;B、D分别为正常和肿瘤样品的reads在基因上的覆盖率的分布图
2.2 差异表达基因
差异表达基因指在不同样品间表达量出现显著差异的基因) 的识别采用软件Cufflinks中的cuff diff程序来实现。肿瘤和正常样品分别检测到14520和14 199个基因表达, 两者的相关性为0.77 (见图2A) , 一共检测出1 879个基因的差异有统计学意义 (FDR<0.05) , MA图展示差异倍数与表达量没有明显偏好 (见图2B) 。其中筛选得到与肿瘤密切相关的几个和膀胱肿瘤相关的DEGs具体表达情况见图3, 其中VEGFA、CDH1、PTPRF和CLDN7肿瘤组织和正常组织相比表达上调, Y轴下方的MMP2表示其表达下调 (q<0.05) 。
A:肿瘤和正常样品的全部表达基因的散点关系图;B:差异表达的MA图, 图中的黑色点表示差异无统计学意义基因, 红色和蓝色点分别表示肿瘤中上调和下调的差异表达基因;横轴表示基因表达量的2为底的对数, 纵轴表示2为底的差异倍数的对数
红色:上调分子;蓝色:下调分子, 其颜色深浅和上调或下调成正比
2.3 差异表达KEGG分析
差异表达基因富集在细胞黏附分子 (CAMs) 通路 (见图4) 、细胞外基质受体相互作用通路 (ECM-receptor interaction) 和细胞黏合通路等 (见表2) , 这些通路的基因在肿瘤表达中往往有所改变。
3 讨论
本研究首次运用转录组测序对多次复发的、肌肉浸润的膀胱尿路上皮癌进行了深度、全面的转录组测序, 总共得到60 M的reads, 为研究提供一个检测基因表达量的大的reads范围, 从这些差异表达基因中再筛选出与膀胱肿瘤密切相关的基因。
本研究从筛选得到的差异表达中发现, VEGFA是PDGF/VEGF生长因子家族的成员之一, 能促进血管内皮细胞的增殖和血管的形成[8], 和目前用Microarray和基因表达谱的检测数据一致, 显示在膀胱肿瘤组织中表达上调, 预示着VEGFA可能成为膀胱尿路上皮癌一个常见的过度表达基因。另外还发现, 与正常膀胱组织比较, 大部分的金属基质蛋白酶 (MMPs) , 尤其MMP2和MMP9在膀胱肿瘤组织的表达下调。金属蛋白酶参与血管的重建、血管生成、组织修复以及肿瘤侵犯等[9], 高表达的MMP2和MMP9与肿瘤分期和级别有关, MMP2的异常表达与肿瘤的复发和生存期密切相关[10,11]。本研究筛选到特异表达的可能成为诊断膀胱肿瘤和预测肿瘤复发的分子标记物还包括:CDH1 (E-cadherin) 、KRT20 (Cytokeratin 20) 、BIRC5 (Survivin) 和PSCA (Prostate Stem Cell Antigen-14) 。
CLDN7作为锚定家族的一员, 和紧密连接密切相关。研究[12]发现, CLDN3、CLDN4和CLDN7在上皮组织中高表达, 而在其他组织如脑组织中低表达。膀胱尿路上皮癌主要是发生在上皮的肿瘤, 与本研究的结果是符合的。另一种典型的上皮性卵巢肿瘤研究也报道CLDN7的一个重要的发现, 在人类卵巢癌2774和Hey A8细胞株中, 抑制CLDN7的表达能增敏顺铂化疗药的作用[13]。膀胱癌患者有较长生存期、高复发率和浸润至肌层但远处转移少见的特点, 本研究也发现CLDN7相对表达量表达上调或基本不变, 与之前研究观点基本一致。
蛋白酪氨酸磷酸酶受体类型F (PTPRF) 被认为是白细胞相关抗原 (LAR) 的一员。在肿瘤相关的研究报道中存在不一致的地方。THEODORE等[14]认为, PTPRF参与β-连环蛋白信号通路, 在前列腺癌组织中的表达水平明显升高, 其中PTPRF的E亚单位贡献最大。而最近的一项研究[15]报道PTPRF在有转移的肿瘤组织中表达下降, 异常的PTPRF和另一个PTP家族成员PTPN9与肿瘤的浸润、转移和肿瘤的形成有关。
另外, 许多其他的肿瘤相关突变分子的报道, 如ARPC5 (p16) 和FGF2[8], 本研究检测到的表达水平并没有改变, 推测是由于肿瘤的遗传异质性或者突变产物虽然有害但是它的表达水平并没有改变。
本研究筛选到的肿瘤相关差异基因在其他肿瘤基因有报道, 但在膀胱肿瘤基因未见报道, 如MACF1、ADD3、NUMB和PDGFA等。MACF1、ADD3和NUMB在非小细胞肺癌中有报道[16,17,18], PDGFA作为血小板源生长因子家族的一员, 选择性剪切6号外显子产生2个异构体:长的异构体PDGFAA和短异构体PDGFAB。在本研究中, 外显子6跳跃剪切在正常组织中存在而在肿瘤组织中没有检测到。预示着UCB长异构体PDGFAA主要在肿瘤组织表达, 而在正常组织中主要表达PDGFAB。长异构体PDGFAA在老鼠脑胶质瘤中有不同的表达, 且在人胶质瘤细胞系中得到克隆[17], 但PDGFAA在膀胱尿路上皮癌中的作用机制有待进一步的研究证实。
无筛选标记 篇4
1 材料与方法
1.1 样本来源与分组
所有标本均取自青岛市市立医院, 青岛大学医学院第一、二附属医院。共收集经病理或临床诊断确诊、HBV阳性、未经治疗的HCC血清52份, HBV阳性33份, 健康对照37份, 其中所选HBV组合健康对照组的年龄、性别组成与HCC组基本一致, 然后从中随机选取HCC患者30例 (男12例, 女8例, 平均年龄51岁) 、HBV阳性携带者20例 (男13例, 女7例, 平均年龄48岁) , 健康对照20例用于筛选模型的建立, 剩余样本用于所建模型的双盲法验证。
1.2 材料
HPLC水, 乙氰, 三氟乙酸, SPA (Sinapinic acid) , Triton X-100, 尿素, HEPES, CHAPS均购自美国Sigma公司, 蛋白质芯片时间飞行质谱仪 (PBSⅡC) 及WCX-2芯片购自美国Ciphergen Biosystems公司。
1.3 方法
1.3.1 标本采集
采集全血2 m L, 立即放入4℃, 静置4 h, 4℃4 000 r/min离心30 min, 收集上清分装置-86℃冰箱保存。取出样品, 冰上融化后, 4℃10000 r/min离心10 min。取10μL血清, 加入20μL U9缓冲液 (9 mol/L urea, 20 g/L CHAPS, 50 mmol/L Tris-HCl, p H9.0, 10 g/L DTT) , 混匀后500 r/min冰上振荡30 min, 然后加入360μL醋酸钠缓冲液 (50mmol/L, p H4.0) 稀释后备用。
1.3.2 样品检测和质谱采集
将WCX-2芯片装入蛋白工作平台, 每孔加入200μL结合缓冲液 (50m M Na Ac, p H4.0) 预处理芯片, 置于振荡器5 min, 重复上述操作1次。在每孔中加入50μL预处理的样品, 剧烈震荡, 孵育1 h。弃掉样品, 每孔用200μL结合缓冲液洗涤2次, 每次5 min。弃去孔中液体, 每孔加入200μL HPLC水, 立刻甩出。从蛋白工作平台中取出蛋白芯片, 空气中干燥, 每孔加入0.5μL EAM, 重复1次。干燥后用蛋白质芯片时间飞行质谱仪进行质谱分析。采用PBSⅡc型蛋白芯片阅读仪读取芯片信息, 仪器用标准多肽校正, 系统的质量偏差为0.1%。芯片阅读仪参数设置如下:激光强度200, 检测灵敏度9, 优化范围Mr 2 000~20 000 Da, 最高分子质量Mr 50 000 Da。用Ciphergen Protein Chip 3.1.1软件自动采集数据。
1.3.3 数据处理与HCC筛选模型的建立
将获得的各蛋白质谱用Biomarker Wizard软件计算HCC组和非肿瘤组各蛋白峰值的差异 (P值) , 筛选出可作为HCC标记物的差异蛋白;然后用BPS5.1 (Biomarker Patterns systems) 软件进行分析, 由BPS从中选取差异蛋白, 建立HCC筛选模型。
1.3.4 盲筛法验证诊断模型
用剩余样本 (肝癌22例、HBV阳性携带者13例, 健康人17例) 对上述建立的诊断模型进行盲法验证 (masked analysis) , 验证该模型的特异性和灵敏度。
2 结果
将Ciphergen Protein Chip 3.1.1软件采集的数据用Biomarker Wizard软件进行分子量 (6 637 Da) 和能量校正, 共获得185个蛋白峰 (见图1) , 其中在肝癌组和对照组有显著差别的有25个 (P<0.01) 。将这些差异峰用BPS软件进行分析, 自动选取其中5个差异峰 (6 888, 13 764, 6 487, 3 450, 6 814 Da) (见图2) , 建立了筛选肝癌的诊断模型 (见图3) , 此模型的根节点为6 888 Da, 首先根据此峰值强度29例标本被划分到左侧的枝结点2内, 41例被划分到右侧的枝结点3内, 又根据13 764 Da、6 487 Da、3 450 Da、6 814 Da的峰值强度, 将标本进一步划分, 最终将70例标本划分开。30例肝癌有29例被正确划分, 40例对照有36例被正确划分, 该模型检测灵敏度为96.7% (29/30) , 特异性为90.0% (36/40) 。用该模型对22例肝癌, 14例HBV阳性携带者, 16例健康人进行盲法验证, 21例肝癌, 27例对照被区分正确, 灵敏度为95.5% (21/22) , 特异性为90% (27/30) 。
3 讨论
近来研究表明, 肿瘤性疾病从蛋白质组学的角度又可以被认为是一种蛋白质缺陷病, 其发生过程中有多种蛋白会发生异常变化。肿瘤在发生发展转移的过程中, 在分子水平有不同的功能性蛋白参与。蛋白表达异常不仅包括蛋白表达量的增加或减少, 还包括蛋白翻译后加工上的改变, 从而导致肿瘤组织表达的蛋白质谱 (protein profile) 的改变。虽然从m RNA水平能够研究相应转录子的表达谱, 但在翻译的过程中要进行磷酸化、乙酰化、糖基化等修饰, 并不能了解肿瘤进展过程中蛋白表达质与量的变化。因此, 利用蛋白质组学方法检测蛋白质谱的变化可以更加准确地诊断肿瘤及了解肿瘤的发病机理。
蛋白质组学 (Proteomics) 是在整体水平上研究细胞内外蛋白质组成及其活动规律的学科[7], 蛋白质组学研究的最终将构建出细胞的“功能图”。SELDI蛋白质芯片技术是近年来新兴的一种蛋白质组学技术, 它具有简单、快捷、灵敏等特点, 而且能对原始样品直接进行检测[8], 可以检测分子量在500~500 000Da之间的蛋白或多肽, 而且所需样本体积小, 在蛋白质组学中得到越来越广泛的应用。
肝癌与HBV感染有极大的相关性, 有90%的肝癌是由HBV感染后经过漫长的时间转化而来的, 而且HBs Ag阳性的携带者比非携带者肝癌的发生率高100倍。本实验笔者选择HBV阳性携带者与健康人做对照, 检测到有25个蛋白在肝癌患者中有差异表达, 并选择其中的5个蛋白峰建立了诊断模型, 经过盲筛验证有较高的灵敏度与特异性。
在本文中所使用的标本例数较少, 这是在蛋白质组学分析中, 由于不同个体的性别、年龄、饮食、治疗方法等等诸多因素均会影响其血清中的蛋白种类和水平, 且蛋白芯片价格昂贵。因此, 为降低研究成本, 尤其是尽量减少非特异性因素的影响, 国际公认的常规做法是:首先对所大范围收集的样本进行平衡, 剔除极端病例并使各组样本的一般状况尽量接近, 所以尽管筛选后所剩的样本数量往往较少, 但其结果却更具有代表性。尽管如此, 笔者仍将继续收集标本来验证其准确性。
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无筛选标记 篇5
关键词：三维测量,双目视觉,SIFT,SVD,拼接
0 引 言
近年机器视觉技术已在许多领域得到广泛应用,尤其是三维光学轮廓测量技术更是研究中的热点[1]。在需要人类视觉的场合几乎都需要用到机器视觉,基于相位投影的双目光学测量系统已经广泛应用于几何量的尺寸检测、地形测绘、精密零部件或产品的三维外形检测等领域中。
由于受到投影相位场和相机拍摄范围的限制,在许多应用场合,对于较大物体的测量需要多次测量后进行点云拼接才能够完成,目前市场上成熟的产品一般都是采用在被测量物体的表面粘贴圆形标记点的方法完成,首先在被测量对象表面上粘贴标记点,然后提取圆心坐标,对两次测量的圆心标记点进行匹配,再由四元素法或者SVD分解得到两次测量点云的旋转和平移矩阵。这种粘贴标记点的拼接方法必然会破坏被测量物体表面的真实三维点云数据,增加后期三维处理的工作量。为了不引入粘贴标记点,保证被测量对象三维点云数据完整性,研究了一种基于SIFT的无标记点三维点云自动拼接技术。
1 无标记点自动拼接算法原理简介
针对相位投影双目视觉测量原理,在拼接测量过程中不对物体粘贴标记点,而是采用SIFT配准原理来辅助完成点云自动拼接工作。无标记点点云自动拼接原理如图1所示,在两次测量过程中,分别提取测量时左相机图像,由SIFT算法计算得到特征点,经RANSAC算法去除误匹配,得到两次测量时候二维图像点的对应匹配关系;由相位投影测量中左右图像点的相位周期和相位值相等的原理可知,每一次左图像整数点和右图像亚像素点再经极线约束,根据标定参数计算得到一个对应三维点,计算出刚才两次测量中由SIFT计算得到的二维图像点对应的三维点坐标;再由SIFT匹配关系,不难得到两次测量中这些二维特征点对应的三维点之间的匹配关系;最后由SVD分解法得到旋转和平移矩阵,完成点云拼接。
1.1 相位法三维测量原理
相位测量轮廓术的基本原理是光波的干涉理论。投影系统将一正弦分布的光场投影到被测物体表面,如图1所示,由于受到物面高度分布的调制,条纹发生形变,由摄像机获取的变形条纹可表示为式(1)[2]:
In(x,y)=R(x,y){A(x,y)+B(x,y)cos[ϕ(x,y)+δn]} (1)
N表示第n帧条纹图,In(x,y)是摄像机接收到的光强值,R(x,y)是物体表面不均匀的反射率,A(x,y)表示背景光强,B(x,y)/A(x,y)表示条纹对比度,δn为附加的相移值。相位的求解采用N相移算法,即光栅每次移动1/N周期,此时,条纹图的相位被移动2π/N,产生一个新强度函数In(x,y),利用不同相移值的条纹图,可以计算出相位函数。实际应用中,应用比较多是四步相移技术,按最小二乘原理可以得到式(2)[3]:
ϕ(x,y)=arctg
最后由左右图像上点的相位约束关系和极线约束关系,由标定参数可计算出三维点坐标,自动拼接过程中,两次测量的三维点云由相位法测量原理根据标定参数得到,同时也计算出由SIFT法得到这些二维特征点对应的三维点坐标。
相位法三维测量轮廓术的编程实现算法如下:
(1) 利用角点检查或者圆心检测算法,检测标定板上的已知空间距离的特征的二维图像坐标。
(2) 采用张正友平板标定技术,利用已知标定板上二维图像坐标和三维空间坐标之间的关系,求得摄像机的内部参数和外部参数。
(3) 根据相位法的测量原理,利用左右相机对极线约束和相位约束的方法,得到两幅图像上的匹配点坐标,即这两个点相位周期相等,相位值相等,并且属于一对极线上。
(4) 得到了匹配的左右图像的二维图像坐标后,利用标定参数得到匹配点的三维空间点坐标,左右图像上所有点都进行(3)和(4)的计算后,便可以得到被测量物体的点云。
(5) 对于较大物体一次测量无法得到完整点云,可以通过多次拼接测量的方法得到完整点云。
1.2 基于SIFT特征配准原理
实现自动拼接的关键步骤是找出两次测量过程中的同名点,通常都是采用在物体表面粘贴标记点实现,但会破坏被测量对象表面情况,因而为避免采用了SIFT特征点匹配技术辅助完成。文献[4]总结了现有的基于不变量技术的特征检查方法,提出了一种基于尺度空间的,对图像缩放和旋转甚至仿射变换保存不变性的图像局部特征描述算子,即尺度不变特征变换。SIFT算法首先在尺度空间进行特征检测,并确定关键点的位置和关键点所处的尺度,然后使用关键点领域梯度的主方向作为该店的方向特征,以实现算子对尺度和方向的无关性。文献[5]在图像二维平面空间和DoG尺度空间中同时检测局部极值作为特征点,以使特征具备良好的独特性和稳定性。
D(x,y,σ)=(G(x,y,kσ)-G(x,y,σ))×I(x,y) (3)
SIFT特征匹配包括两个阶段。第一阶段是SIFT特征生成,即从多幅待匹配图像中提取出对尺度缩放、旋转、亮度变化无关的特征向量;第二阶段是SIFT特征向量的匹配。
基于SIFT的特征匹配算法编程实现如下:
1) 尺度空间极值检测,在同一尺度周围邻域8个像素和相邻尺度对应位置周围邻域共26个像素进行比较,以确定在尺度空间和二维图像空间都检测到局部极值,以初步确定关键点位置和所在尺度。
2) 通过拟合三维二次函数以精确确定关键点位置和尺度,同时去除低对比度的关键点和不稳定的边缘响应点,以增强匹配稳定性,提高抗噪声能力。
3) 利用关键点领域像素的梯度方向分布特性为每个关键点指定方向参数,使算子具有旋转不变性。以下为(x,y)处梯度模和方向公式:
4) 生成SIFT特征向量,首先将坐标轴旋转为关键点方向,然后对每个关键点使用4×4共16个种子点进行描述,形成128维的SIFT特征向量。
5) 再采用关键点特征向量的欧式距离来作为两幅图像中关键点的相似性判定度量实现关键点的匹配。
6) 采用鲁棒的变换估计算法RANSAC,即随机抽样一致性算法,利用特征点集的内在约束关系进一步去除误匹配。
1.3 由二维特征点匹配映射到三维点云对
实现自动拼接,需要在两次测量过程中找到匹配的三维点对,点对数目至少满足四元素法或者SVD分解法求解变换矩阵的要求,一般至少4个点对以上。SIFT算法已经得到两次测量过程中,左相机拍摄图像中二维特征点的坐标以及二维特征点的匹配关系。再根据上述相位测量原理,把这些SIFT二维特征点的三维点坐标求取出来。可能在求取过程中受到相位调制度的限制,部分SIFT特征点无法得到三维点坐标。最后,可根据二维特征点的对应关系映射到这些点的三维点的对应关系上。这一步等同于在物体表面粘贴标记点后找出两次测量的标记点的三维点坐标对应关系。最后由得到三维点对便可求取变换矩阵实现点云拼接,流程如图2所示。
二维特征点匹配映射到三维点云算法编程实现如下:
1) 分别对第一次和第二次测量时候左相机拍摄的图像进行SIFT特征点检测和匹配,记录下匹配成功的两幅图像上二维特征点的坐标。
2) 采用相位轮廓术法对第一次和第二次测量进行立体匹配,分别得到第一次测量和第二次测量的点云,分别从中寻找出步骤1中的二维特征点对应得到的三维点云坐标,得到第一次和第二次测量时候左相机二维特征点和该次三维点云坐标的对应关系。
3) 根据两次测量中左相机图像特征点的匹配关系即可以映射到两次测量的三维点云的一一对应关系,这样就在没有粘贴标记点的情况下找出了两次测量点云的匹配关系。
4) 根据两次测量点云的匹配关系即可以求解出旋转矩阵和平移矩阵,实现拼接。
1.4 基于SVD的变换矩阵求取[6]
选择采用SVD分解法求取旋转矩阵和平移矩阵,完成以上过程后两次测量的特征点的三维点云对{pi} 和{p′i}就已经找出,两者之间可以由公式p′i=Rpi+T+Ni表示,其中R是一个旋转矩阵,T是一个平移矩阵,N是干扰向量,用最小二乘法
令
qi=pi-p,q′i=p′i-p′ (8)
经过以上变换可以得到
基于3×3矩阵奇异值分解的最小二乘法变换矩阵[7]求取步骤,以及软件编程实现方法如下:
1) 设有两个点集P={p1,p2,…,pn}和P′={p′1,p′2,…,p′n},在两个点集中找到相互对应的点对,按照刚体变换求解旋转矩阵R和平移矢量T,建立误差函数E(R,T)=
2) 利用式(5),式(7)计算三维点集{pi} 和{p′i}的质心。
3) 利用式(8)将三维点集作{pi} 和{p′i}相对于各自质心的平移,得到新的点集{qi} 、{q′i}。
4) 计算3×3矩阵:
5) 对矩阵H进行奇异值分解,对矩阵M作奇异值分解得:H=UΛTT,其中矩阵D为对角阵,D=diag(di),d1≥d2≥d3≥0。
再令
,如果rank(H)≥2,则R可以表示为:R=UAVT 。
6) 计算平移矢量:计算X的行列式|X|如果|X|=+1,则{R=X,T=p′-Rp}。
这样经过上面的SVD算法,即计算得到两点云集之间的旋转矩阵和平移矩阵,便可完成点云的拼接。
2 实验比较及分析
为了验证算法的有效性和精度,使用一组已经由粘贴标记点成功完成的点云拼接数据,采用本文所描述的算法再进行自动拼接。实验中摄像机采用大恒公司提供的COMS工业彩色摄像机,分辨率为1280×1024,焦距为12mm的镜头,投影仪采用的是三菱公司DX-320型号的投影仪,亮度是2500流明,采用张正友的平板标定后得到的摄像机参数如表1所示。
1) 两次测量左相机图片求取SIFT特征如图3和图4所示,进行配准如图5所示。
2) 根据相位测量原理,求取两次测量特征点的三维点坐标数据如图6和图7所示。
3) 依据SIFT配准关系,映射特征点的三维点云数据对应关系,如表2所示。
4) 由SVD奇异值分解法求得旋转矩阵和平移矩阵。
根据三维特征点的对应关系,由SVD奇异值分解法得到变换矩阵如表3所示。
5) 最后实现两片点云拼接如图8所示,拼接效果如图9所示。
6) 应用实例以及精度分析。
对汽车零部工件进行了扫描和拼接测量,采用SIFT特征点拼接测量方式进行了拼接测量,测量效果如图10、图11所示。并且对测量的精度和拼接的精度进行了分析。
对实际应用实例中汽车零件测量拼接数据进行分析,单次测量点云间距平均距离为0.3mm,两次测量拼接后两片点云之间的平均距离为0.1606mm,标准偏差为0.0617mm。
实验结果表明本文的方法可以实现快速无标记点拼接。利用本文所述方法可以实现免粘贴标记点的自动拼接,从特征点的提取到特征点的匹配以及影射到三维特征点,最后计算得到旋转矩阵和平移矩阵,计算时间较粘贴标记点时间稍长。可能引入误差的地方包括:特征点的提取会受到SIFT算法的影响,导致提取得到的特征点不精确;从二维特征点到三维特征点的计算,会受到摄像机模型标定参数影响,导致计算得到的三维点存在误差。
3 结 语
受单次测量范围限制,需要在物体表面粘贴标记点进行拼接测量,破坏了物体表面特征。本文探讨了一种基于SIFT的无标记点自动拼接技术,利用SIFT匹配两次测量二维特征点,经过RANSAC方法来消除误匹配后,由相位法原理求取出这些二维特征点对应的三维点云数据,并且映射出三维点的对应关系,最后由SVD方法求解得变换矩阵,完成自动拼接。实验证明,该方法可以避免在被测量对象上粘贴标记点,能够快速准确地实现自动拼接功能。
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高寒地区无土草皮基质筛选试验 篇6
为了针对高寒地区生产季节短的特点, 筛选出适合高寒地区大规模生产无土草皮的理想基质, 进行了露天试验。
1 材料及方法
试验在黑龙江农业职业技术学院园艺试验基地废弃的砂石路面上进行, 试验地结构从下往上依次为20cm的砾石层、20cm炉渣、15cm粗沙层, 路面坡度约为2%。
试验采用随机区组设计, 3次重复。试验共设4个处理。处理1以蛭石为基质, 处理2以珍珠岩为基质, 处理3以草炭+炉渣 (1∶1) 为基质, 处理4为对照, 以试验地田园土为基质。将不同基质铺在遮荫网隔离层上, 做成厚度5cm、宽1m、长2m种植床, 每个种植床为一个小区。草种采用草地早熟禾 (优异+超优异+四季青比例为1∶1∶1) 。
2007年6月8日播种, 播种量为20g/m2, 播后覆盖0.5cm基质, 覆盖草帘, 浇水, 保持草帘湿润, 出齐苗后及时撤除草帘。出苗后进行浇水等正常管理, 根据雨水情况, 无土基质浇水频率是土壤的2倍, 但单次浇水量是土壤的1/2, 即浇水总量一样。7月1日开始喷日本园试营养液 (稀释100～200倍) , 每半个月一次。草皮成卷后及时将草皮铺植于试验田, 原地进行秋播试验, 管理方法不变, 霜冻前浇封冻水, 两组自然越冬, 一组用草帘保护越冬, 2008年3月30日撤除草帘, 浇返青水。
观测各种基质的出苗天数, 并分别从每种基质随机抽取10cm×10cm样块, 随机抽取10株种苗, 带回试验室内清洗, 记录分蘖数, 用直尺测定苗高, 求其平均值, 同时称取样块地上、地下部分鲜重, 每隔10d测定一次。全部试验过程, 以播种至草皮成卷天数 (60d) 为限, 对试验数据进行分析, 看其差异显著性。2008年4月20日观察秋播草皮越冬状况, 从每种基质不同处理中各随机抽取10cm×10cm样块一个, 清点返青苗数, 观察返青草颜色。
2 结果与分析
2.1 基质性能比较
从表1可以看出, 无土基质容重都明显小于土壤, 持水量和孔隙度都明显大于土壤, 表明所选基质都是轻质材料, 通气能力都较好。
2.2 不同基质对草皮出苗和成卷时间比较
从表2可以看出, 对于草皮的出苗, 由于都有较高的持水量, 又有草帘的保护, 不同基质的影响不是很大。对于成卷时间, 蛭石成卷最快, 可能是因为具有较高的持水量和孔隙度, 含有较多的钾、钙、镁等营养元素供草坪草吸收利用, 而且吸收能力强。珍珠岩也具有较高的持水量和孔隙度, 但所含的钾、钙、镁等营养元素的存在形态多数不能被草坪草吸收利用, 没有吸收能力, 而且在雨水大时常出现上部珍珠岩浮起, 影响草坪草生长, 成坪时间比土壤稍长。炉渣+泥炭持水量和孔隙度都不如前两者, 浇水湿得快干得也快, 而且基本不含有营养元素, 在同样养护管理条件下, 最终未在规定的时间内成卷。
2.3不同基质对草皮生长性状的比较
通过试验, 发现不同基质栽培条件下, 草皮的生长性状有较大区别。在同样浇水施肥条件下, 草皮的各项生长性状, 由于蛭石持水量和孔隙度适宜, 含有营养元素, 表现最优;其次为珍珠岩;炉渣+泥炭表现最差。
2.4不同基质草皮越冬状况比较
通过越冬试验证明无土草皮基本能够安全越冬, 由于无土基质容重小, 孔隙度大, 保水保肥能力差, 越冬能力明显低于有土草皮。有草帘保护的无土草皮越冬情况明显好于没有保护的无土草皮。
3 结论与讨论
a.通过对4种不同基质露天栽培草皮得到的出苗天数、株高、草皮重、成卷天数等数据的比较分析, 初步筛选认为蛭石是无土草皮生产比较理想的基质。它具有较高的持水量和孔隙度, 含有较多的钾钙、镁等营养元素供草坪草吸收利用, 而且吸收能力强, 又没有珍珠岩淋水较多会浮起的缺点, 容重小运输铺植成本低, 还可以考虑以蛭石为基础材料与其他基质组成混合基质, 进行无土草皮生产。