SSR标记（共9篇）
SSR标记 篇1
花生(Arachis hypogaea L.)是植物油和植物蛋白质的重要来源,经济价值较高。栽培花生是异源四倍体(2n=4X=40,AABB),其在形态、生理、农艺性状等方面存在着丰富的变异,而在DNA分子水平上揭示的多态性较少[1]。目前,花生DNA分子标记研究明显落后于其他作物,Hopkins等[1]首先筛选出6对多态性SSR引物,这些SSR引物在花生栽培品种中检测到的多态性高于此前报道的其他所有分子标记,从此建立在花生微卫星序列信息基础上的分子标记技术发展极为迅速,目前已设计出可利用的花生SSR标记800多对,其在花生遗传育种中的应用也越来越广泛。现就微卫星标记技术的原理及其在花生上的主要研究进展进行概述。
1 SSR的基本原理及特点
1.1 SSR标记的原理
SSR(Simple Sequence Repeats)标记即微卫星标记,是由1~6个核苷酸为单位串联重复而成的DNA序列,长度一般在200 bp以下,两端为较保守的单拷贝序列。由于重复序列数目不同或重复程度不完全相同而呈现多态性,呈孟德尔式遗传,共显性。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计位点专一的引物,利用PCR技术扩增每个位点的微卫星序列,扩增产物经聚丙酰胺凝胶电泳分离、显色后,比较谱带的相对迁移距离,分析核心序列的长度多态性。
1.2 SSR标记的特点
目前,在所应用的几种代表性的分子标记中,RFLP标记对DNA质量要求高,且分子杂交时会用到放射性同位素,对人体有害,其探针的制备、保存和发放也不方便,而且分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高,多态性程度偏低[2];RAPD标记受许多因素影响,试验的稳定性差。另外,RAPD对反应条件相当敏感,包括模板浓度、Mg浓度,因此试验的重复性差[3];AFLP技术过程复杂,涉及诸多步骤,试验过程中不论哪个环节出现问题,都不会得到理想的结果。此外,AFLP技术试验成本较高,且受专利保护[4]。与其他分子标记相比,SSR具有以下优点:一是数量丰富,多态性高,检测程序简单;二是共显性遗传,不易被自然选择和人工选择所淘汰,符合孟德尔遗传定律[5,6];三是保守性,SSR位点两侧的序列具有高度的保守性,在等位基因中多相同,便于重复利用已知引物;四是易于利用PCR技术分析,对DNA质量要求低,用量少,仅需微量组织便能有效地分析鉴定;五是费用低,易于检测、重复性好、便于自动化分析,同时可进行多位点的检测。SSR具有高度多态、共显性、保守性、DNA需量少、操作简便、重复性好、稳定可靠等优点,已广泛应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、分子标记辅助育种等方面的研究。
2 SSR标记在花生上的应用
2.1 花生遗传图谱构建
遗传图谱(Genetic Map)又称遗传连锁图谱(Genetic Linkage Map),是指以染色体重组交换率为相对长度单位,以遗传标记为主体的染色体线状连锁图谱[7]。构建遗传图谱不仅能了解基因的组成和结构,还能作为研究作物性状遗传、种质进化、基因克隆的工具。Moretzsohn等[8]利用野生品种A.duranensis和A.stenosperma为亲本,构建了F2群体。他们在433对SSR引物中筛选出204对在亲本间表现多态的引物,构建了1张花生的遗传连锁图,总长达1 230.89 c M,其中有170位点定位到11个连锁群中,这11个连锁群的长度在20.07~280.10 c M,平均每个标记之间的距离为7.24c M。姜慧芳等[9]用抗青枯病花生品种远杂9102与感病品种Chico杂交,从F2起用单粒传法构建了花生重组近交系群体(RIL)F6和F7。采用354对SSR引物对重组近交系F6群体的基因组DNA鉴定,获得多态性标记45个。结合重组近交系群体F6和F7青枯病抗性鉴定结果,构建了栽培种花生部分遗传连锁图。图谱总长度为603.9 c M,含29个标记(28个SSR标记和1个表型标记)的8个连锁群,还有17个独立的SSR标记;获得了与青枯病抗性相关的SSR标记2个(7G02和PM137),位于该图谱的第1连锁群上,与青枯病抗性基因间的遗传距离为10.9 c M和13.8 c M,并且位于抗性基因的两侧,两标记间的距离为23.7 c M。洪彦彬等[10]以粤油13和阜95-5为亲本,通过杂交构建包含184个F6重组自交系的遗传作图群体。对652对genomic-SSR引物和392对EST-SSR引物对亲本进行多态性检测,从中筛选出121对多态性引物,在亲本中共检测到123个多态性位点。利用作图群体对多态性SSR位点进行遗传连锁分析,获得包含108个SSR标记(102个genomic-SSR标记和6个EST-SSR标记),涉及20个连锁群、总长568 c M、平均图距为6.45 c M的花生栽培种遗传图谱。
2.2 花生遗传多样性分析
进行栽培和野生花生遗传多样性及亲缘关系的研究,对花生种质资源的收集、保存和育种工作都具有重要意义。SSR标记作为重复性稳定性高的共显性标记,在种内品种间多态性高,在基因组中分布广泛,很适合进行遗传多样性分析。Hopkins等[1]首先利用SSR标记对5个栽培品种的遗传多样性进行了研究。唐荣华等[11]从36对SSR引物中筛选出10对引物,能在24个珍珠豆型花生品种DNA中扩增出多态性片段,每对SSR引物可扩增出1~6个DNA片段,扩增位点数为2~11个,平均6.5个;多态性位点为1~11个,平均6.1个。根据SSR标记分析24个珍珠豆型花生的遗传距离为0.04~0.69 c M,平均为0.37 c M。聚类分析将24个珍珠豆型花生品种划分为4个品种群。陈静等[12]利用10对SSR引物对参加我国北方区域试验的27个花生品种进行PCR扩增分析,共扩增出57条带,其中45条呈现多态,多态性比率为78.95%。27个品种间的遗传相似系数在0.311~0.962,平均为0.651。聚类分析结果表明,27个参试花生品种在遗传相似系数0.61处分为3个类群,同一类型的参试品种优先聚为一类,同一地区或同一育种单位提供的品种往往首先聚为一类。
2.3 花生分子标记辅助育种
分子标记辅助育种(Marker Assisted Selection,MAS)是指把分子标记技术应用于育种过程中,利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择的现代育种技术。姜慧芳等[9]从354对SSR引物中筛选出2个与花生青枯病抗性相关的SSR标记7G02和PM137,其与青枯病抗性基因的遗传距离分别为10.9、13.8 c M。王辉等[13]利用抗、感北方根结线虫病花生品种为亲本配制杂交组合花育22号×D099,以其F2分离群体为研究材料,采用SSR技术和BSA分析方法,获得了2个与花生北方根结线虫病抗性基因连锁的SSR分子标记S322380和S892140,其与抗病基因间的遗传距离分别为4.421、7.404 c M。洪彦彬等[14]选用100对SSR引物对12个抗感黄曲霉花生品种的基因组DNA扩增,结果表明共有41对引物在不同品种间检测出2~4个等位基因,多态性信息量(PIC)为0.153~0.750。供试品种SSR标记基因型与黄曲霉侵染指数间的关联分析表明有5个标记与抗性相关,其中标记p PGSseq19D9与抗性关联度最高,Pearson相关系数达0.913。进一步观察发现,p PGSseq19D9的扩增带型能直接区分抗感品种,初步推断p PGSseq19D9可能与1个贡献率较大的抗黄曲霉基因连锁。
2.4 花生亲缘关系的比较和鉴定
利用形态指标进行植物分类时,易受环境影响而影响分类的准确性,且对于一些形态指标相近、性状较少的品种则难以区分。应用分子标记技术可以对花生的亲缘关系进行较全面的比较和鉴定。陈本银等[15]用44对SSR特异引物对花生属不同区组的21份种质进行了分析,获得能稳定揭示花生属种间差异的34对SSR引物。结果表明:21份材料间存在很大的遗传变异,平均遗传距离为0.63 c M,变异范围为0.08~0.95 c M。聚类分析表明,区组间的遗传分化大于区组内的遗传分化,匍匐区组的遗传分化大于其他区组的遗传分化,同一物种不同种质间也存在很大的差异。栽培种花生与花生区组材料的亲缘关系相对较近,与花生属的植物学分类一致,其中A基因组的A.duranensis和A.villosa及B基因组的A.batizocoi与栽培种花生的亲缘关系更近一些。唐荣华等[16]以5份花生栽培种资源和花生属6个区组的19份野生种资源为研究材料,通过SSR分子标记技术分析其DNA多态性并进行聚类分析。结果表明,大多数花生SSR引物为多位点引物,花生属种间种质存在丰富的DNA多态性,A.duranensis是花生栽培种(A.hypogaea L.)的野生种亲本之一,与花生区组野生种亲缘关系最近的是异形花区组,最远的是大根区组。周桂元等[17]对花生品种粤油14及亲本共7份资源进行了SSR标记聚类分析。结果表明:粤油14与湛油12、汕油27、汕油71的亲缘关系最近,其次是粤油116、粤油367,亲缘关系最远的是印度花皮。
2.5 花生突变体分析
我国花生辐射育种从20世纪60年代开始后,许多花生科技人员相继做了大量工作,但由于各种原因,较少开展突变分子机理的研究。近年来,对辐射诱变后代材料分子水平的研究始有报道,其中运用SSR标记进行分析的较多。周桂元等[18]用返回式卫星搭载花生品种粤油7号种子为材料,经过3年的地面种植和选择,获得21个变异株系。选用110对SSR引物对21个变异株系进行SSR多态性分析,有5对引物的扩增在变异株系与对照品种之间表现出多态性。苗华荣等[19]以60Coγ射线辐照花生品种鲁花11号,通过调查其M2代植株农艺性状,筛选到7个叶部特征明显变异的突变材料,利用107对SSR引物对其进行分析。结果发现突变材料与原品种之间存在不同程度的多态性,且均呈现多个位点突变。分析表明,60Co辐照诱变可使花生的DNA分子多个区段内发生重复或缺失等结构性变异。陈静等[20]以辐照处理花生品种鲁花11号M2为材料,通过农艺性状调查筛选变异材料。利用107对SSR引物对7个有代表性的变异材料进行PCR扩增,分析花生辐照诱变材料的SSR遗传多态性。同时,将筛选到的多态性标记用于分析原品种和诱变后代材料间的遗传相似性。结果表明,诱变材料与原品种之间存在不同程度的多态性,且呈现多个位点突变;60Co辐照诱变可使花生的DNA分子多个区段内发生重复或缺失等结构性变异,并非单纯的点突变。
2.6 其他方面的应用
SSR引物组合法在检测品种纯度上具有高效性和可靠性,在花生品种鉴定中也得到了应用。詹世雄等[21]以3对SSR引物对汕油21繁育种子60个样品进行种子纯度检测,共有2对标记引物检测到3个杂株样品,该批种子的纯度为95.0%;SSR标记在阐明物种进化关系的研究方面应用广泛。He等[22]利用珍珠豆型栽培种与花生区组二倍体野生
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种杂交产生的后代研究野生花生遗传物质渗入栽培种在分子方面的证据,研究认为杂交后代材料整合了野生亲本的遗传物质,并找到了野生亲本的特异微卫星标记(PM36、PM305)的谱带。在某些杂种后代中也扩增出亲本所没有的DNA条带,表明基因融合过程中发生了遗传物质的缺失或重组。
3 结语
目前花生SSR标记的研究已取得了一定的进展,初步展现出其在花生连锁图谱构建、分子标记辅助选择、遗传多样性分析、亲缘关系比较等方面发挥的重要作用,但目前可利用的SSR标记还远远不能满足上述研究的要求,因此SSR分子标记的开发将是未来一段时间花生分子生物学研究的重点。随着文库构建技术的不断成熟、方法的改进,以及花生基因组测序计划的启动,花生SSR标记将会更加丰富,在花生中的应用前景也将更加广阔。
摘要：综述了近年来SSR技术在花生遗传图谱构建、遗传多样性分析、分子标记辅助育种、亲缘关系鉴定等方面的应用情况,从而为相关研究提供参考。
关键词：SSR分子标记,花生,应用
SSR标记 篇2
采用10份花生品种材料,对通过数据库查询设计合成的.SSR引物和其他作者发表的SSR引物及STS引物进行了评估,并基于品种间简单匹配系数做了聚类分析.获得62个能产生多态性片段的SSR和STS引物对,总共获得427条带,其中291条(68.1%)为多态性带.平均每对引物产生6.88条带,4.69条为多态性带;多态性条带比率为16.7%～100%,PIC值为0.254～0.952,平均为0.760.9对SSR/STS引物,即Lec-1、Ah4-26、Ah4-4、SsS14、SHPAL-1、PG71、PG43、PM36、PG22,对所采用的10份花生品种区分率达到100%.说明SSR和STS标记应用于花生品种鉴定有效.
作 者：张建成 王传堂 杨新道 ZHANG Jian-cheng WANG Chuan-tang YANG Xin-dao 作者单位：山东省花生研究所,青岛,266100 刊 名：植物遗传资源学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF PLANT GENETIC RESOURCES 年，卷(期)：2006 7(2) 分类号：Q94 关键词：花生 栽培种 微卫星 序列标签位点 多态性★ 汗斑会不会遗传呢
★ 应用伦理学研究的问题
★ 双棘黄姑鱼人工繁育群体遗传多样性的RAPD分析
★ 英语课标
★ 技术标范本
★ 团县委书记在移动公司捐资助学仪式上的讲话
★ 生物多样性教学设计
★ 第二节 鸟类的多样性
★ 眼睑遗传问题解疑
SSR标记 篇3
关键词 西番莲 ；SSR ；种质资源 ；遗传多样性
中图分类号 Q949.759.5
西番莲别名鸡蛋果、百香果，是西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（Passiflora Linn）热带多年生草质到半木质藤本攀缘果树，广泛分布于热带、亚热带地区。西番莲富含17种氨基酸，具有柠檬、柑、桔、橙子、菠萝等水果香味，素有“饮料之王”、“水果味精”的美称，是生产果汁饮料的重要原料和添加剂。南美洲安第斯山脉地区被认为是西番莲属遗传多样性中心，拥有450多个种，尽管其中只有少数可食且具有香味的西番莲被开发和商业化[1]。其中在中国有19种，当前作为果实供食用的主要有6个种：紫果种（Passiflora edulis Sims）、黄果种（P. edulis Sim. F， flavicarpa Deg.）、樟叶西番莲（P. laurifolia L.）、大果西番莲（P.quadrangularis L.）、甜果西番莲（P. ligularis Juss）、香蕉西番莲（P. mollissima （HBK））等6类[2]。
分子标记的应用和发展在西番莲商业化品种选育上具有重要的作用，分子标记能直接从DNA水平反映种质之间的遗传差异，也是研究植物遗传多样性的有效工具。西番莲属自交不亲和，因此通过西番莲群体的基因流研究可解释种群间的遗传多样性[1]。目前，利用SSR标记对国内西番莲种质遗传多样性研究方面鲜有报道，尚缺乏较系统、有针对性地对不同产地的西番莲资源进行分子水平上的遗传评价与鉴定分类。本实验采用SSR标记分析西番莲遗传多样性，SSR标记数量众多，属于共显性遗传，具高度多态性、重复性和稳定性，简便可靠，因此被广泛地用于遗传多样性研究。它们丰富且均匀地分布在整个基因组中[3-4]，这使得它们适合于系谱关系的研究[5]。目前，SSR标记已经广泛地应用遗传图谱构建、基因定位和克隆、基因组结构、起源进化研究、分子标记辅助育种等方面。本研究以24份西番莲种质为材料，在前期体系优化的基础上，利用SSR分子标记技术研究西番莲资源的遗传多样性，以期为西番莲种质资源的分类、育种和资源的开发利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本实验采用的西番莲叶片取自中国科学院西双版纳热带植物园（采集地简称勐腊）、云南省农业科学院热带亚热带经济作物研究所（采集地简称保山）、中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业部热带作物种子种苗质量监督检验测试中心（采集地简称儋州）西莲种质圃，详见表1。
实验所用Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、标准分子量DNA（100 bp plus Marker）购自TaKaRa公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表2）。电泳所用主要试剂甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、去离子甲酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺等均为国产分析纯。
1.2 方法
西番莲总DNA提取参考Kit等[6]的改良CTAB法，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，将DNA浓度稀释至20 ng/μL。利用已开发的45对SSR引物，筛选出扩增多态性好、条带清晰的16对引物，对24份材料进行扩增。
PCR反应体系为20 μL，其中包括0.2 mmol/L dNTPs、1.0 U Taq DNA聚合酶、60 ng DNA模板、0.5 μmol/L引物及10×PCR buffer（含Mg2+）。PCR进行扩增的程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，52-62 ℃（根据具体引物的退火温度而定）复性1.0 min，72 ℃延伸1.0 min，32个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用8 % PAGE胶进行检测，PAGE胶经30 min预电泳，之后加入经变性剂变性后的产物4.0 μL进行点样，75 W恒功率电泳1 h，电泳结束后银染检测。
1.3 数据分析
选择重复性好、清晰可辨的照片进行谱带统计，依据SSR扩增图谱中同一位置上电泳条带的有无统计建立二元矩阵表，每个引物迁移率相同的条带记为1个位点，有条带的赋值为1，无条带的赋值为0，构建SSR的0、1数据库。
按照Nei等[7]的方法计算材料间的相似系数，并利用GS值按类平均法进行遗传相似性聚类分析和构建聚类图。应用NTSYSpc-2.10版软件，计算24份西番莲种质间遗传距离或遗传相似系数，然后根据非加权配对算术平均法（UPGMA）进行聚类分析，构建亲缘关系聚类树状图。
2 结果与分析
2.1 遗传多样性分析
从45对引物组合中筛选出16对扩增带清晰、重复性好的引物组合，分别对24份材料的DNA进行PCR 扩增，16对引物共产生68条扩增带，其中58条为多态性条带，多态性条带比率平均为85.3 %。
2.2 聚类分析
24份西番莲资源以0.45为阈值，可分为7个类群，第Ⅰ类群包括2份种质，来自农业部质检中心儋州基地的樟叶西番莲、Danzhou 1号；第Ⅱ类群包括1份种质，来自儋州农业部质检中心基地的双花西番莲；第Ⅲ类群包括1份种质，来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃的Passiflora yucatanesic；第Ⅳ类群包括15份种质，其中来自儋州农业部质检中心基地的有9份，包括Danzhou 2号、Danzhou 3号（黄果）、Danzhou 4号（紫红果）、Danzhou 5号、Danzhou 6号（黄果）、Danzhou 7号、Danzhou 8号、Danzhou 9号、紫果西番莲，表明分子标记不能区分种质的果实颜色；来自云南农科院热经所保山种质圃的有3份，包括紫果西番莲、黄果西番莲、泰国种；来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃的有3份，包括澳A、澳B、Passiflora edulis（紫果）；第Ⅴ类群包括2份种质，P.Coccinea和Passiflora coccinea，来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃；第Ⅵ类群包括1份种质为Passiflora faetida，来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃；第Ⅶ类群包括2份种质，大果西番莲和Passiflora guadrangularis（大果西番莲），分别来自云南农科院热经所保山种质圃和中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃（图1）。
3 讨论与结论
西番莲变异系数大，可用于一些重要农艺性状的、定位的天然杂交群体[1]。开展西番莲基因流、迁移率和有效群体大小的预测对了解国内西番莲自然群体活力和物种生殖系统的研究很重要。Diana等[8]利用AFLP、SSR对来自哥伦比亚的70份材料进行种内变异研究；Juliana等[9]利用ISSR标记评估改良和未经改良的黄果西番莲遗传变异研究；Cerqueira-Silva1等[10]利用16条RAPD引物区分14种基因型西番莲种质；Eileen等[11]利用7条RAPD引物和SSR A08FP1引物对供观赏用的3个新品种西番莲杂种进行确认，扩增得到杂合西番莲种属特异性片段。冷言峰[12]利用14条ISSR引物对33份西番莲种质进行遗传多样性分析，多态位点比率为99.56 %，说明西番莲种质资源存在广泛的遗传变异，这与本研究结果相一致。
Danzhou 1号西番莲叶片的叶形与樟叶西番莲相似，叶革质、卵状长圆形、基部圆形、全缘、无毛、叶脉羽状，与樟叶西番莲的相似性系数为0.78，故其亲缘关系较近。其中双花西番莲单独聚为一类，在叶形、果实大小方面与黄果、紫果西番莲相比有较大的差异，其结果在分子与形态学上有着一定程度的一致性。
大多数供试的西番莲材料的亲缘关系较远，遗传相似性系数为0.09-1.0，可能由于西番莲属异花授粉植物，长期的开放授粉使不同基因型间基因频繁交流，使得种质之间存在一定的差异。种质间的遗传差异与材料采集地的关系不太明显，来自云南勐腊的澳A、澳B和来自云南保山的紫果、黄果、泰国种与来自海南儋州的大部分聚为一类，这与冷言峰[12]的研究结果一致。但来自儋州地区的Danzhou 2号、Danzhou 3号、Danzhou 4号、Danzhou 5号、Danzhou 6号、Danzhou 7号、Danzhou 8号、Danzhou 9号、紫果西番莲等大多数西番莲聚为一类，这也表明目前儋州地区西番莲种质资源的遗传基础较为狭窄。其可能是该地区引进的品种较为单一；也可能是育种者为保持其亲本的的优良性状，采用无性繁殖的方式，而推广优良无性系是西番莲繁殖的主要途径，使得在这些种质的某些性状的基因趋于一致，从而导致后代亲缘关系多数较近；还有以实生选种为主的育种过程，也是同一地区种质的遗传关系趋向于一致。在国内西番莲的研究还处于初级阶段，地域之间的种质交流不频繁也是导致这一结果形成的原因。
本研究结果还发现黄果西番莲和紫果西番莲聚为一类，在分子上不能按果实颜色来区分种质。其原因在于西番莲种质之间的亲缘关系近，这跟国内的一些育种现状相吻合，黄果西番莲是紫果西番莲的突变种，其亲缘关系较近，如‘占果1号’、‘古杨1号’均是从黄、紫果种杂交后代中选出的优良品系[13]。
来自云南农科院热经所保山种质圃的大果西番莲与中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃的Passiflora guadrangularis（大果西番莲）两者聚为一类，表明大果西番莲与其他品种西番莲的差异较大，分子标记能完全将大果种西番莲与其他品种的西番莲区分开来。来自中科院西双版纳热带植物园勐腊种质圃P. coccinea、Passiflora coccinea聚为一类，相似性系数为0.83，亲缘关系很近，可能为同一品种的不同突变株。来自儋州的紫果西番莲与来自勐腊的Passiflora edulis（紫果）相似性系数为1，可能为同一个品种材料。
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SSR标记 篇4
1 SSR的基本原理及特点
微卫星DNA由两部分组成, 即核心序列和两翼的序列, 核心序列即前面所称“重复”的短序列, 两侧一般是相对保守的单拷贝序列。在PCR基础上的SSR分析是根据微卫星DNA两翼区域的序列设计位点专一的引物, 以总基因组为模板进行PCR扩增, 扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶分离, 用放射自显影、银染或荧光进行检测。这种序列广泛分布于真核生物基因组, 其重复次数的不同就产生了等位基因之间的多态性。由于SSR两端多为相对保守的单拷贝序列, 通过设计引物便可以PCR扩增, 进行多态性检测。
与其他分子标记相比, SSR有以下优点: (1) 共显性遗传, 不易被自然选择和人工选择所淘汰, 符合孟德尔遗传定律[1,2]; (2) 多态性高, 可通过PCR扩增呈现出来, 试验程序简单, 重复性高; (3) SSR序列的两侧序列较保守, 在等位基因中多相同, 便于重复利用已知引物; (4) 易于检测、重复性好、可进行自动化分析, 1个位点一般可在24h内完成, 且可同时进行多位点的检测; (5) 对DNA质量和数量的要求不高, 仅需微量组织便能有效的分析鉴定。尽管微卫星作为分子标记有许多优点, 但同样存在不足之处, 其中一个最大的麻烦就是必须预先知道试验材料的基因组信息, 至少必须知道重复序列两翼的序列信息, 才能设计出适宜的引物, 这大大地限制了它的应用。
2 SSR标记在棉花遗传育种中的应用
2.1 SSR标记在棉花遗传图谱构建中的应用
遗传图谱 (Genetic map) 是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图, 是植物遗传育种及分子克隆等应用研究的理论依据和基础。而SSR作为一种新型分子标记技术, 由于其丰富的多态性信息含量, 被广泛的应用于棉花遗传图谱的构建。2008年陈利等[3]利用3 458对SSR引物筛选陆地棉中棉所35和渝棉1号间的多态性引物, 获得了173对, 以多态性引物检测两者杂交的F2群体180个单株的标记基因型, 共获得178个标记位点。构建的遗传连锁图谱包括148个标记, 36个连锁群, 总长1 309.2cm, 标记间平均距离8.8cm, 覆盖了棉花基因组的29.5%。李朋波等[4]利用70个SSR标记和15个AFLP标记构建了总长为814cm的遗传图谱, 覆盖棉花基因组的18.3%。与AFLP标记相比, SSR标记通常只扩增1个基因座位, 有利于遗传图谱之间的比较, 这对于确定连锁群所属的染色体及QTL具有比较重要的意义。
2.2 SSR标记在棉花功能基因及QTLs定位分析中的应用
QTLs定位是阐明控制有关数量性状的主要基因数目, 这些基因在染色体上的位置, 以及其联合效应的遗传图。高密度SSR连锁图的构建为基因或QTL定位奠定了基础。利用SSR标记技术对棉花遗传育种进行研究的一个重要方面就是QTLs定位。利用SSR标记技术, 可使棉花育种表型选择逐步过渡到基因型选择, 进一步利用QTLs定位的成果进行标记辅助选择, 大大提高育种的效率。杨昶等[5]用5 300对SSR引物筛选亲本多态, 获得了115个多态位点并进行标记间连锁分析, 构建了一张包括20个连锁群全长560.1cm的陆地棉品种间分子标记遗传图谱。用复合区间作图法进行QTL定位, 在苗期检测到了3个抗病QTL, 成株期检测到9个与纤维品质相关性状的QTL及11个产量构成因素的QTL, 为棉花抗病育种同时兼顾产量和品质育种提供了非常有用的信息。胡文静等[6]用陆地棉优质品系7235、渝棉1号做亲本, 以7235×渝棉1号的F2与F2:3分离群体为材料, 从5514对SSR引物中筛选到117个多态性标记, 并用其中80个标记构建了总长为1 147.8cm的遗传图谱;应用复合区间作图分析了该组合的F2单株和F2:3家系纤维品质性状, 共检测到36个纤维品质QTL。
2.3 SSR标记在棉花标记辅助育种中的应用
分子标记辅助育种 (molecular marker-assisted selection MAS) 是现代分子生物学与传统遗传育种相结合, 借助分子标记对育种材料从DNA水平上进行选择, 从而达到作物产量、品质和抗性等综合性状的高效改良[7]。它是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断目标基因是否存在[8]。与传统的表型性状选择相比, 标记辅助育种具有标记基因型鉴定可以在低世代和植株生长的任何阶段进行、共显性的分子标记允许在杂合体阶段鉴定隐性基因、对目的基因的选择不受基因表达和环境条件的影响等优点。应用标记辅助育种, 理论上只要回交3代就可以选到理想的材料。因此, 可以加快育种速度, 提高选择效率, 特别是对多基因位点控制的许多重要农艺性状的准确选择很有利, 同时对于开发高新产品具有重要意义。石玉真等[9]用一个已定位的高强纤维QTL紧密连锁的2个SSR标记, 在2套杂交组合的不同世代群体中进行分析研究, 成功培育出9个纤维优质的株系。
2.4 SSR标记在棉花种质鉴定及遗传多样性分析中的应用
遗传多样性是指生物种内不同群体之间或群体内不同个体间遗传变异的总和, 它是生物多样性的基础和重要组成部分[10]。不同基因型的种质材料或棉花品种中存在简单重复核苷酸序列差异, 应用同一个SSR引物进行PCR扩增时, 由于引物互补的模板DNA数目和位点不同, 所扩增条带的数目和片断大小就存在差异, 从而呈现出多态性。武耀廷等[11]对36份陆地棉栽培品种SSR遗传多样性研究表明, 分子标记确定的遗传关系基本上与品种系谱的种质系统一致, 但并不能按系谱或种植生态区简单的确定品种的归属。庞朝友等[12]利用37对多态性SSR引物和15个表型性状对155份棉属种间杂交基因渐渗系及其10份陆地棉亲本进行了聚类分析, SSR聚类结果与种质材料的系谱来源基本吻合, 而表型性状聚类结果与材料系谱来源相差悬殊。因此, 综合利用SSR、表型性状聚类结果将促进棉属种间杂交基因渐渗材料的高效利用。朱四元等[13]利用22对多态SSR引物对14份不同类型的抗虫棉花材料进行扩增, 运用Jaccard遗传相似系数计算14个品种间的遗传距离为0.035~1.056, 聚类分析表明14份棉花品种可分为2大类4亚类, 揭示了大多数品种的遗传基础比较狭窄。陈光等[14]利用24对扩增效果好的引物对53个海岛棉种质资源进行遗传多样性的检测分析, 共检测出多态性等位基因变异97个, 占总数的91.5%, 采用UPGMA法对所选材料进行聚类分析表明, 53个品种被分为2大类, 与系谱来源一致, 这证明了SSR分子标记在鉴别品种和品种遗传多样性研究方面具有重要的作用。
3 展望
与其他分子标记技术相比, SSR分子标记技术是一种较为快捷、简单、稳定的遗传标记。在未来的发展中, 相信随着大量可利用的微卫星序列的开发, 其在棉花遗传育种中的应用前景会更加广阔。
摘要：SSR是建立在PCR基础上的分子标记, 具有多态性高、重复性好、共显性、操作简单等优点, 已在棉花研究中被广泛应用。综述了SSR标记的原理与特点, 以及其在棉花遗传图谱构建、功能基因及QTLs定位分析、标记辅助育种、种质鉴定及遗传多样性分析等方面的应用;展望了SSR分子标记技术广阔的应用前景。
SSR标记 篇5
关键词： 玉米种子；苏玉20；盐溶蛋白；SSR标记；纯度鉴定
中图分类号： S513.037 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）03-0072-02
盐溶蛋白电泳一直是种子企业鉴定玉米种子纯度的主要方法之一。该方法简单、便于操作，对技术人员和检验设备要求不高，一般的种子企业检验室都可开展该项工作，因此在实际检验工作中被广泛应用。包和平等利用玉米盐溶蛋白PAGE法和田间小区种植鉴定法对吉林省生产商应用的16个杂交玉米种子纯度进行测定，试验表明，同一样品种子纯度田间小区鉴定普遍高于蛋白PAGE法鉴定纯度值，纯度越高2种方法所测值偏差越小[1]。郭景伦等将玉米杂交种子纯度室内鉴定结果与田间种植鉴定结果进行了对比研究，结果表明，2种方法鉴定结果较吻合，一般相差在5.0%以内，并且玉米种子纯度越高，室内鉴定结果和田间鉴定结果相差越小；纯度越低，2个结果差异越大[2]。
但盐溶蛋白PAGE法有一定的局限性，有些品种双亲蛋白质水平上的差异较小，难以鉴定；鉴定大批量玉米种子纯度时，药品配制量大且步骤繁琐，有些试剂容易失效；另外盐溶蛋白的电泳谱带分辨率低，有时会出现误读或谱带难以辨别，因此对结果判定有一定的影响。近几年来随着SSR分子标记的发展和应用，表现其独特的优越性。孟庆长等以苏玉20杂交种及其亲本为材料，筛选出在苏玉20双亲之间多态性明显、重复性较好的4对引物bnlg1306、phi065、bnlg2291和umc1590用于苏玉20鉴定[3]。此标记特异性好，田间鉴定与利用SSR标记鉴定结果高度一致。本试验利用孟庆长等筛选的4对引物，结合盐溶蛋白电泳法对苏玉20种子纯度进行鉴定，并比较分析，验证2种试验结果的相关性，以便建立一套适应苏玉20品种纯度准确、快速鉴定的试验方法。
1 材料与方法
1.1 材料
苏玉20杂交种及其亲本苏951和苏651种子均由江苏明天种业科技有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 盐溶蛋白电泳法 参照NY/T 449—2001《玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法》。
1.2.2 SSR分子标记 切取少量胚乳，利用碱煮法[4]提取玉米基因组DNA。利用文献[3]中提供的4对引物（表1）用于苏玉20纯度鉴定，所用引物由上海英俊生物工程有限公司合成。PCR反应体系：DNA模板1.0 μL，Super Taq Mix 5.0 μL（上海浦迪生物科技有限公司），ddH2O 3.0 μL，上下游引物（2.0 μmol/L）各0.5 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应在BIO-RAD 5808R型PCR仪上进行。
PCR反应产物在30%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（N，N-亚甲基二丙烯酰胺 ∶丙烯酰胺=1 ∶29）分离1.5 h后，经0.2% AgNO3银染后显色，拍照观察并记录。
2 结果与分析
2.1 盐溶蛋白及SSR分子标记电泳结果参照农业行业标准NY/T 449—2001《玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法》，将待检批次的苏玉20及其父、母本蛋白质上样，电泳并分析（图1）。结果表明：苏玉20及其亲本自交系间存在差异，且杂交种F1代和双亲谱带互补。图1中，有1个泳道的谱带呈偏母本型，可能是母本接受外来花粉造成的混杂，可以确定为非杂交种。这表明盐溶蛋白电泳可用于苏玉20品种纯度鉴定。
利用孟庆长等筛选出的4对引物[3]对苏玉20杂交种及亲本进行扩增，其中引物umc1590经PCR扩增后，F1代图谱出现3条互补带，因此不建议作为区分此品种的首选引物。而引物bnlg1306、phi065、bnlg2291经PCR扩增后父母本各为1条带，杂交种为双亲的2条互补带，可很好地区分（图2）。
2.2 2种方法的结果比较
对10个不同批次种子同时用2种方法进行对比（表2），研究发现，同一批次种子，蛋白电泳纯度数值比SSR分子标记数值高平均0.78百分点，差异范围在-0.8～3.1百分点。2种方法数值有一定的相关性，种子纯度越高，2种方法数值越接近，如果纯度越低，SSR分子标记数值相对越低。
为进一步验证筛选出的3对引物能否很好地鉴定品种纯度，每一粒种子经玉米单粒磨碎仪研磨后，取少许胚乳做DNA模板，对应的种胚做盐溶蛋白电泳。经比较，2种方法的纯度结果基本吻合（表3）。另外研究发现，152个检测样品，4个母本自交系种子在不同引物标记及蛋白电泳检测中表现均一致，而经phi065检测显示为父本的个体在其他方法中显示为F1代，经bnlg1306和蛋白电泳检测显示为杂株的个体在其他检测方法中显示为F1代。这种现象可能和玉米种子在不同发育时期蛋白表达不同有关。同时也说明在实际工作中，应结合该批种子是自交苗、回交苗、其他类型杂株还是遗传不稳定因素，根据实际情况，选择合适的引物对，对各单株检测结果进行综合判定，确定待测杂交种的纯度。
3 讨论与结论
刘宏魁等利用盐溶蛋白PAGE法和SSR分子标记对先玉335和泽玉11指纹图谱进行了分析，研究发现，盐溶蛋白法可大批量用于纯度检测，对于难以鉴定的品种可用SSR分子标记法作为辅助手段进行鉴定[5]。本试验以同一玉米种子为材料，提取不同取样部位的基因组DNA，利用SSR分子标记法和盐溶蛋白电泳法对苏玉20纯度进行了鉴定，结果表明2种方法均可区分亲本自交系和杂交种。这说明碱煮法适于苏玉20的提取，盐溶蛋白电泳法也可以用于此品种的纯度鉴定。
试验中利用3对SSR引物和蛋白电泳进行比较（表3），研究发现2种方法结果比较吻合。但各个引物的SSR标记图谱和蛋白电泳图谱个别个体表现并非一一对应，这正解释了SSR标记作为一种随机DNA标记，个体在不同引物间存在一定差异，而SSR 标记和盐溶蛋白法个体的差异表现正说明蛋白质电泳图谱易受种子（或幼苗）发育阶段及表达器官的影响，不够稳定从而影响了鉴定结果的准确性。这和赵久然的研究结果[6]是一致的。
参考文献：
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[5]刘宏魁，闫洪朗，原亚萍. 应用盐溶蛋白电泳和SSR分子標记鉴定玉米种子纯度的研究[J]. 安徽农业科学，2011，39（19）：11396-11398.
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SSR标记 篇6
空间诱变育种是利用返回式卫星、宇宙飞船和高空气球等将作物种子、组织器官或其它生命个体等材料送入宇宙空间, 在宇宙空间特殊的诱变因子作用下使生物的遗传物质发生变异, 再返回地面进行选育的作物育种新技术[5]。我国自1987年以来, 先后利用返回式卫星、神舟号飞船和高空气球搭载植物种子进行航天诱变, 并通过地面试验选育出了一批农作物新品种和优异的种质资源, 取得可观的经济效益和社会效益[3]。选用20份小麦品种 (系) 为试验材料, 2006年经过实践八号育种卫星搭载, 返回地面后, 经2007～2008年的田间种植构建变异群体, 并采用DNA分子标记技术 (SSR和EST-SSR) 对其SP2个体植株进行突变分析, 以期了解空间诱变对小麦后代的诱变效果和特点, 为高产、优质等性状选择提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验共选用6份材料:龙辐03K539、龙辐01-0174、龙辐02-0072、龙辐02-0387、龙辐01-0089、龙辐02K418。
1.2 方法
1.2.1 卫星搭载
种子搭载于实践八号专用育种卫星, 于2006年9月9日15∶00, 在酒泉卫星发射中心发射, 在轨运行15 d后, 于9月24日10时43分返回。卫星运行的近地点高度为180 km, 远地点高度为469 km, 轨道倾角为63°[6]。
1.2.2 材料种植与DNA样品制备
田间种植采用双行区, 每份材料4区, 行长3 m, 每隔4区设1区对照, 每区播种250粒, 生育期间进行植物学特性调查, 成熟后按垄单收, 2007年形成SP1。2008年6份材料田间点播种植为SP2并点播相应对照, 每份材料的群体为1 000株。待植株生长至分蘖期时, 每处理随机选取40株, 取其幼嫩叶片, 按照CTAB法[7]提取基因组DNA, 以备SSR分子标记检测。
1.2.3 SSR分子标记分析
PCR扩增仪为英国Techne公司生产的TC-512型梯度PCR仪。PCR扩增在25 μL反应体系中进行, 10×PCR Buffer 2.5 μL, 10 mmol·L-1dNTP 2.0 μL, Taq DNA聚合酶 (5 U·μL-1) 0.2 μL, 上游引物1.5 μL, 下游引物1.5 μL, 模板DNA 5.0 μL, 灭菌双蒸水13.3 μL。PCR扩增程序:首先预扩增94℃变性30 s, 60 (55) ℃复性45 s, 72℃延伸45 s进行一个循环, 以后每次降低1℃退火温度进行1个循环, 直到退火温度为55 (50) ℃为止, 进入正式扩增程序94℃变性30 s, 51～59℃复性45 s, 72℃延伸45 s共35个循环, 72℃延伸5 min, 扩增产物于4℃保存。扩增产物采用非变性PAGE凝胶电泳技术分离, 快速银染法显色[8]。
2 结果与分析
2.1 SP2的SSR标记突变分析
通过预备试验, 并参考前人利用SSR分析小麦品种多样性研究结果, 选用12对SSR引物对随机选取的240个SP2个体进行了基因组突变分析 (见表1) , 得出12对SSR引物在SP2的基因组DNA中共扩增出3种突变类型, 即扩增片段增多、扩增片段减少和扩增片段长度差异。6份供试品系个体在12个SSR位点上的第2种突变类型 (扩增片段减少) 居多, 另外2种类型的扩增情况基本相近。个别品系同时出现多类型突变, 如龙辐01-0174在wmc522位点上出现了扩增片段减少和扩增片段长度差异2种突变类型;龙辐03K539在Xgwm415位点上出现了扩增片段增多和扩增片段减少2种突变类型。12对SSR引物在相应对照上均未出现差异扩增片段。
注:a为扩增片段增多;b为扩增片段减少;c为扩增片段长度差异;-为无变化。
1～20为02-0387 SP2不同个体, 21～24为对照02-0387亲本
供试的6份品系之间突变位点也存在差异。与各自对照相比, 突变频率最低的是龙辐02-0387, 为5.42%;突变频率最高的是龙辐01-0089, 为12.08%。表明, 不同小麦品系对空间搭载的敏感性有差异。龙辐01-0089有较高的突变频率, 表明该品系基因组序列的重复区在空间条件下易产生变异。而龙辐02-0387与之相反, 基因组重复区相对保守。从SSR标记位点上看, 突变频率介于3.33%～15.00%。不同的SSR位点间突变频率各不相同, 突变频率最低的是Xgwm437, 最高的是wmc517。如果将所有12个SSR标记位点突变频率的平均数9.03%为基准, 大于平均数的6个位点中, 突变率最多的3个SSR位点在A组染色体上, 最少的1个位点在D染色体上, 有2个位点在B组染色体上。A组染色体上出现高频率的SSR位点突变, D染色体上则少, 表明小麦A组染色体基因组的重复区在空间条件下更容易产生变异, 而D组染色体相对保守。这一结果与前人的研究结果不完全一致[9]。
2.2 SP2的EST-SSR标记突变分析
为了分析空间搭载对小麦基因的影响, 选择了7个EST-SSR标记对空间搭载的SP2个体的表达基因位点突变进行了分析 (见表2) , 得出与DNA重复序列的SSR位点相比, EST-SSR标记位点的突变类型单一, 仅有扩增片段增多一种类型, 且突变频率较低, 标记位点的平均突变频率介于0～8.33%;供试品系的平均突变频率介于0～2.86%。
注:a为扩增片段增多;-为无变化。
1～20为01-0089空间搭载SP2不同个体, 21～24为对照亲本01-0089
在所检测的7个EST-SSR标记位点上, 大部分标记未检测到突变, 只有Xcwem477和Xcwem5 2个标记位点有突变发生。这2个EST-SSR标记位点的突变频率相差较大, Xcwem477仅在龙辐01-0089上检测到突变, 其频率为0.83%;而Xcwem5在龙辐03K539、龙辐02-0387、龙辐02-0072和龙辐01-0174品系上都检测到突变, 其平均频率为8.33%。这一结果表明, 在所选择的7个表达基因位点上, 只有Xcwem5位点所标记的基因组序列变异易受空间条件的影响, 而其它6个EST-SSR位点标记的基因组序列对空间条件不敏感。
3 讨论
选用6份春小麦品系为试验材料, 于2006年随育种卫星进行空间搭载, 2008年每个品系分别获得了1 000个单株组成的SP2群体。12对SSR引物对每个品系随机选取的40株个体进行PCR扩增发现, 12对SSR引物共扩增出3种突变类型:即扩增片段增多、扩增片段减少和扩增片段长度差异。240个SP2单株在12个SSR位点上以扩增片段减少突变类型居多, 在同一品系的不同个体上同时出现多种类型突变的情况很少。突变频率在品系之间以及SSR染色体位点上都存在差异。6份品系的突变频率介于5.42%～12.08%。因此可以认为, 突变频率的不同, 反映了不同的品系在其基因组诱变效率上存在基因型差异。同时研究结果也显示, SSR标记检测到的最高突变频率出现在A组染色体组上最多, D染色体组上最少, B染色体组上的介于二者之间。这方面的研究鲜有报道。前人利用DNA分子标记分析的大都是选出的高世代突变系, 然后结合原始亲本进行多态性分析, 其研究结果大多是对突变系差异性的描述。如周峰[10]利用SSR标记对来自于同一亲本5个突变株后代的DNA多态性分析、蒲志刚[11]利用AFLP分子标记对突变体黄金1号的检测、张宏纪[8]对航天诱变品种龙辐麦18遗传特性分析等。因此, 该研究结果对了解空间搭载后小麦SP2个体的变异特点提供了更多信息。该研究在A染色体组上获得较高的SSR标记位点突变频率, 与前人的研究结果不完全一致。前人在利用SSR分析小麦品种多样性时, 一般认为小麦B组染色体基因组上的SSR标记具有更高多态频率[10], 在该研究中, B组染色体基因组上的SSR突变率仅处于第二位。这种结果上的差异可能与所选用的SSR标记数目较少、变异群体来源不同有关, 或者就是空间搭载对小麦基因组诱变的特点有待进一步研究。
利用DNA分子标记研究空间搭载对小麦基因组诱变效果时, 所选用的标记主要是RAPD、SSR和AFLP等[10,11,12], 但这些标记在空间搭载影响表达基因的诱变效果时, 选择上存在盲目性。该研究选择了7个EST-SSR标记对空间搭载的SP2个体的表达基因位点进行了突变分析。结果表明, 与DNA重复序列的SSR位点相比, EST-SSR标记位点的突变类型单一, 仅有扩增片段增多一种类型, 且突变频率较低, 大部分基因位点都没有突变发生。这表明, 空间搭载对小麦的表达基因的诱变具有一定的影响, 即使有突变产生, 也仅仅发生在个别表达基因位点上。同时也表明, 空间搭载对表达基因的诱变效果存在基因型差别。
摘要：为了考察空间搭载对小麦的诱变效果, 以实践八号育种卫星搭载的小麦品系为试材, 对SP2的DNA分子标记突变频率进行分析。结果表明:12对SSR引物共扩增出3种突变类型:扩增片段增多、扩增片段减少和扩增片段长度有差异。出现的单一突变类型居多, 在同一品系的个体上同时出现多类型突变的情况很少。突变频率在供试的品系之间以及SSR染色体位点都存在差异。该研究又以7个EST-SSR标记对上述SP2个体的扩增结果显示, 与一般的SSR位点相比, EST-SSR标记检测到的突变类型单一, 仅有“扩增片段增多”一种类型, 且突变频率普遍较低, 大部分基因位点无突变发生。表明空间搭载对小麦基因组产生的诱变主要发生在重复序列区, 基因表达区相对较少。
关键词：空间诱变,春小麦,SSR分子标记
参考文献
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SSR标记 篇7
1 DNA分子标记鉴定法
近些年, 现代生物分子学发展迅猛, DNA指纹技术在品种鉴定中得到长足发展和广泛应用。分子标记是通过对农产品分子水平上可标识的遗传多态性进行分析, 也就是对基因组中任何位点上的相对差异进行分析[10,11,12]。DNA分子标记技术的主要应用对象是样品的DNA, 也就是含有遗传物质的基因片段[13], 对农产品基因中碱基序列差异进行分析, 最终达到鉴定、区分农产品品种的目的。
DNA分子标记技术应用范围广, 不会受到环境、数量的限制;准确性、稳定性及重复性较高;分子标记表现为共显性, 能同时检测出显性和隐性等位基因, 可以鉴定农作物是纯合或杂合基因型。目前, 可以将数十种DNA分子标记技术分为4类[14]。第1类是利用限制性内切酶得到大小不等的DNA片段, 通过凝胶电泳对DNA条带进行分析, 最终探究DNA的多态性, 这一技术发现较早且具有代表性的是RFLP;第2类是与PCR技术紧密结合的分子标记技术, 根据选择引物的不同可以分为RAPD以及SSR、ISSR等, 区别在于PCR扩增时使用的是随机引物还是特定引物;第3类是将PCR与酶切技术相结合的分子标记技术, 根据扩增与酶切的先后顺序可以分为AFLP和CAPS;第4类是利用单核苷酸多态性的分子标记技术, 如SNP。目前, RFLP、AFLP、RAPD、SSR这4种DNA分子标记技术均被广泛地应用于玉米、稻谷等农产品品种鉴别及图谱构建中, 分析结果都能够直观地通过DNA表达出来, 季节、环境对其影响较小, 基因特征数量多且多态性丰富, 表现中性, 不会影响性状的表达, 但在实际的应用过程中, 这4种分子标记技术都具有不同的特性。RFLP在多态性检测方面不够灵敏, 操作复杂且操作条件要求较高, 需要使用放射性同位素;RAPD在结果的准确性方面存在不足, 可靠性中等, 同时还存在迁移的可能性, 影响因素较多, 因此重复性较差[15];AFLP要求在农产品样品中提取出高纯度的DNA, 对酶的质量及实验设备精度要求较高;SSR技术则是在引物的开发方面费用较高[16]。4种常用分子标记的特性如表1所示。
2 SSR技术优势与局限性
2.1 与RFLP、RAPD、AFLP相比的技术优势
英国遗传学家Jeffreys等于1985年建立DNA指纹技术, 该技术的发展主要经历了3个阶段:20世纪90年代RFLP、RADP以及AFLP的成功创立标志着第1代DNA分子标记技术诞生;21世纪初, SSR作为第2代DNA分子标记技术逐渐兴起;近些年, 第3代DNA分子标记技术SNP正处于启动研究之中[17]。其中, SSR技术是应用于品种鉴定中时间最长, 应用范围最广的[18]。
实践证明, 最理想的农产品品种鉴定技术应当满足可操作性好、自动化程度高、较为可靠等要求, SSR技术作为与PCR技术紧密结合的新型DNA分子标记技术, 具有其他分子标记技术所不能比拟的优势。首先, 农产品基因中的SSR覆盖整个基因组, 信息量大, 多态性丰富[19,20,21,22]。在SSR分子标记法中, 选择不同引物对应基因上的SSR位点也不相同, 不同样品SSR带型之间存在的差异是DNA水平上差异的具体表现。因此, 可以将SSR位点作为样品基因的一个特征, 并且这种特征基因数量多, 不会受到环境的影响, 稳定性和可靠性强;其次, SSR技术在具有RFLP标记遗传学优点的同时避免了使用同位素, 在重复性、可信度以及标记成本方面远远优于RAPD, 已经逐渐发展成为农产品DNA分子标记中的重要手段;再次, SSR技术比较成熟, 前期研发基础较好, 有大量已知染色体位置的共享位点;最后, SSR技术操作简单, 易于推广。SSR技术对应试样品中提取出DNA的纯度和实验仪器要求不高, 即使部分DNA受外部环境影响发生降解, 其中也可能包含足够用来扩增的SSR位点, 不会连接影响结果[23], 在没有昂贵仪器的情况下也可以进行SSR检测。SSR技术体系主要包括DNA提取、PCR扩增目的基因、聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染技术[24], 且近些年在DNA提取及PCR扩增技术方面都取得了一定的进展, 使得SSR技术的优越性更加突出。匡猛等[25]将单粒棉花种子作为材料提取纯化基因组DNA, 结果表明该方法极其适用于棉花品种的SSR分析。陈浩东等[26]研究、分析了适合棉花纯度检测的多重PCR组合条件, 将多重PCR组合程序进行优化, 使得快速鉴定棉花杂交品种技术更加成熟。王绍鹏等[27]利用扩增条带分布在不同范围的4对马铃薯SSR引物进行分析, 成功优化马铃薯SSR标记多重PCR体系模型, 为马铃薯DNA指纹图谱的构建打下基础。
2.2 SSR技术在农产品品种鉴定中的局限性
SSR指纹图谱可以在最大程度上避免受到环境、农作物生长、发育时间的影响, 且可以鉴定表型上难以鉴别的农作物品种, 具有非常大的发展潜力, 但局限性也不可忽略。首先, 欲使用SSR技术标记农产品基因, 必须要确定目标序列信息, 即需要构建基因组文库, 同时还需测序鉴定克隆获得的SSR, 工作难度较高;其次, 因SSR分子标记技术的一定种属限制, 大部分的SSR标记都不可以用于亲缘关系较近的农作物物种之中;最后, SSR鉴定能力受到待鉴定品种育成方式的影响, SSR只能对常规方法育成的品种进行鉴定和区别, 如果待鉴定品种接受过转基因技术、辐射等处理, DNA中的某个基因位点就可能发生变化, 如碱基替换、染色体替代等, 则不能直接进行鉴定和分析[28]。
3 SSR技术在农产品品种鉴定中的应用
3.1 SSR技术在马铃薯品种鉴定中的应用
叶景秀等[29]利用SSR技术提取、分析了20种青海省审定的马铃薯DNA, 经PCR扩增, 共检测出136条清晰的多态性条带, PIC平均值可达到0.7683。Mc Gregor等[30]在2000年分别使用RFLP、AFLP、RAPD、SSR等4种分子标记法鉴定、区分39个马铃薯栽培品种。结果表明, 4种分子标记技术都可独立区分39种马铃薯栽培品种, 其中多态性方面AFLP优于SSR, 但是在重复性方面SSR可以达到100%, 并且利用5对SSR引物可以将南美的24种马铃薯品种进行有效区分。王绍鹏等[31]在2009年利用STM001、STM002、STM003、STM004等4对引物成功地对黑龙江省7个马铃薯主栽品种进行区别, 4对引物共获得144条多态性条带, PIC值均高于0.8, 其中STM001、STM003、STM004等3对引物对黑龙江省7个马铃薯主栽品种的区分率达到100%, 试验重复性、稳定性较高, 可应用于马铃薯品种鉴定中。
3.2 SSR技术在棉花品种鉴定中的应用
武耀廷等[32]利用27对棉花SSR核心引物对30个棉花品种和4个杂交种亲本进行鉴定, 只用其中4对引物就可以成功将湘杂2号等4个棉花杂交品种的亲本与其他品种分离。Tyagi等[33]利用120对棉花SSR引物对来自美国的378份陆地棉材料进行研究, 结果表明美国陆地棉遗传多样性水平较低, 遗传基础较为狭隘。冯艳芳等[34]利用15对SSR核心引物分析鉴定20个棉花品种, 平均每对引物可检测出3.8个多态性位点, PIC平均值为0.878 2, 成功将各品种进行区分并建立了20个应试棉花品种的DNA指纹图谱。聂新辉等[35]从5 000对棉花SSR引物中筛选出75对核心引物, 多态性位点达226个, PIC平均值为0.662 4, 可以一次性区分开51份棉花常规品种中的21份, 利用40对引物则可以完全区分供试的51个品种, 并可构建供试品种的指纹图谱。
3.3 SSR技术在水稻品种鉴定中的应用
田大刚等[36]利用SSR标记技术构建了123份重要水稻品种的指纹图谱, 结果表明, 24对水稻SSR引物可以成功的区分鉴别这123份水稻品种。肖小余[37]在2006年利用SSR标记对四川省42份主推杂交水稻亲本进行了DNA指纹库构建研究, 在国内外首次报道了主栽水稻品种DNA标记指纹库的构建工作。彭锁堂[38]选取26对水稻SSR引物对我国9个杂交水稻组合品种及其亲本进行标记分析, 其中21对引物扩增出62条多态性条带, 能够有效区分所有恢复系和大部分不育系。罗兵等[39]利用平均分布在水稻12条染色体上的24对SSR引物对19份粳稻进行分析, 得到4对能够完全区分19个应试水稻品种的核心引物, 成功将应试品种区分为2个亚群。
4前景展望
农产品纯度一直是农业生产中所面临的突出问题之一, 是衡量农产品质量的重要指标, 受到农民及农产企业的密切关注。然而在农产品种植及运输过程中经常出现隔离不严、低温灾害等自然因素或机械混杂、人为掺假等情况, 导致农产品纯度受到影响。因此, 研究快速、准确的农产品真伪及纯度检测方法迫在眉睫。SSR技术准确性高, 信息量大, 可识别性强, 大力推广该技术可以有效防止不合格农产品流入市场, 维护农产品企业良好形象, 保证农产品的质量与安全, 促进社会稳定和谐。此外, SSR分子标记技术是国际植物新品种权保护联盟在BMT测试指南中确定用于构建DNA指纹数据库的标记方法, 该技术已经成为了当前农产品建库首选的分子标记法。实践证明, SSR分子标记技术在农产品的DNA指纹图谱数据库建立过程中起到不可替代的重要作用, 并且随着我国农业的快速发展, SSR技术将会应用于更多农产品品种鉴定及DNA指纹数据库的建立中, 有望成为传统田间小区种植鉴定方法的重要补充甚至是替代技术。
摘要：SSR分子标记技术具有稳定性好、正确性高、定性精准等优点, 已被广泛应用于农产品品种鉴定及其真实性和纯度验证之中, 对厘清我国农产品不同品种种质间的亲缘关系及种质创新具有重要意义。主要平行比较和分析了同等技术下, SSR分子标记技术的优越性及局限性, 简单介绍其在农产品品种鉴定中的应用情况, 并对其发展前景进行展望。
SSR标记 篇8
半夏(Pinellia ternata)为天南星科药用植物,其药用部位为块茎,具有燥湿化痰、和中健胃、降逆止呕、消痞散结的功效[1]。半夏品种具有多样性,不同品种的半夏其药用价值存在着较大差异[2,3],但品种之间很难从块茎上辨别。在实际生产中,半夏均为块茎引种,故一旦引种出现问题将会给半夏的种植带来巨大的经济风险。因此,生产中人们希望能够找到一类数量丰富、选择效应高的标记,以快速鉴别半夏品种。 开发基于DNA变异的分子标记是一种高效稳定的手段,应用最广泛的主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP等[4],其中SSR标记是一种共显性标记,其重复性好、可靠性高、分析简便,易于实现自动化、灵敏度高、检测遗传变异能力强[5]。
SSR(Simple Sequence Repeat)为简单序列重复,即微卫星DNA。这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中,含量丰富,且呈随机均匀分布。微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成,核心序列重复次数的差异形成了微卫星的高度多态性。即利用两端的保守区序列设计引物,可扩增出大小不同的DNA片段,之后通过高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性分析[6,7,8]。近年来,微卫星作为一种分子标记已成为种群研究和进化生物学最常用的分子标记之一,广泛地应用于生物杂交育种、遗传连锁图谱、种群遗传多样性、系统发生等研究领域[9,10,11,12]。本文对芍药叶型等不同叶型的半夏进行了SSR分子标记的开发研究,并用得到的SSR分子标记结果对四种不同叶型的半夏进行了初步筛选鉴定。
2 材料与方法
2.1 材料、仪器与试剂
材料:实验以能稳定遗传的四种半夏品种的叶片为材料,四种半夏品种根据叶型不同划分为芍药叶型(S)、竹叶型(Z)、桃叶型(T)和柳叶型(L),它们均采自四川省遂宁市蓬溪县红江镇。采样后立即冻存于液氮罐中,之后转存于-80℃超低温冰箱保存。本研究前期用芍药叶型(S)半夏作为分离SSR序列的样品,后期利用样品获得的SSR引物对四个半夏品种进行多态性鉴定。
仪器:德国Eppendorf低温冷冻离心机、德国Eppendorf台式高速离心机、美国GE公司NanoVue微量分光光度计、Bio-rad公司96孔PCR仪、Eppendorf各类量程移液器、漩涡混匀器、恒温水浴锅,琼脂糖电泳槽、直流电泳电源、洗瓶、搪瓷染色池、染色脱色摇床、不同体积的烧杯与试管、1.5—2.0mL容量EP管、棕色试剂瓶、液氮及液氮罐、磨样研钵、药匙。
试剂:5’端带有生物素修饰的(AC)15、(CT)15和(TAT)10三种SSR探针(上海生工生物公司合成),十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),十二烷基硫酸钠(SDS),乙二胺四乙酸(EDTA),三羟甲基氨基甲烷(Tris),苯酚(国产分析纯),氯仿(国产分析纯),异戊醇(国产分析纯),巯基乙醇(国产分析纯),乙醇(国产分析纯),冰醋酸(国产分析纯),甲醛(国产分析纯),超纯水,丙烯酰胺,N,N-甲叉双丙烯酰胺,过硫酸铵(APS),四甲基乙二胺(TEMED),核黄素,硝酸银,碳酸钠,浓硝酸,RNase(使用前煮沸15min,以破坏其中的DNase),MboI限制酶、FbaI限制酶、PCR Mixture(TaKaRa公司),天根植物基因组DNA提取试剂盒DP305-03,天根通用型DNA纯化回收试剂盒DP214。
2.2 半夏基因组DNA的提取
分别使用SDS法、CTAB法和试剂盒(天根生物)法提取芍药叶型(S)半夏基因组DNA,然后利用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoVue微量分光光度计检测所提取的DNA的质量和浓度。选择使用能使提取质量达到试验所需的方法,提取全部样品的DNA,储藏于-20℃冰箱备用。
2.3 半夏SSR分子标记的开发
基因组的酶切:参考张君毅等的研究结果[13],本实验分别进行了MboI单酶切和MboI+FbaI双酶切实验,并进行了1%琼脂糖凝胶电泳检测,以期获得最优的酶切结果。其中,双酶切体系为:MboI 1μL、Fba I1μL、10×K buffer 2μL、DNA 5μL、超纯水11μL;单酶切反应体系:MboI 2μL、10×K buffer 2μL、DNA 5μL、超纯水11μL。
接头引物的合成与制备:首先合成一个包含接头的互补单链全部序列信息的较长单链(Invitrogen公司合成)、5’(HO)TCCATTCGGCATCGCAGACGATCTGTCTG CGATGCCGAATGG(OH)3’;再经过冷却降温过程,使单链自身退火,形成以下回文序列,退火体系:单链DNA(400μM)5μl、10× 退火缓冲液2μL、超纯水1 3μL、5’(OH)TCCATTCGGCATCGCAGACAGATCTGTCTGCGATGCCGAATGG(OH)3’、3’(OH)GGTAAGCCG-TAGCGTCTGTCTAGACAGACGCTACGGCTTACCT(OH)5’。最后用与以上相同的内切酶,酶切体系:退火后形成的回文序列10μL、内切酶3μL、10×K buffer 2μL、超纯水5μL、37℃酶切2h,再在85℃水浴10min,便可得到目的接头:5’(HO)TCCATTCGGCATCGCAGACA (HO)3’、3’(HO)GGTAAGCCGTAGCGTCTGTCTAG (P)5’。
接头与半夏基因组酶切片段的连接与连接产物的扩增:构建连接体系,接头(100mM)0.5μL、10×T4DNA lig-ase buffer 2μL、T4DNA ligase 2μL、基因组酶切片段10μL、超纯水5.5μL,4℃过夜连接,然后在70℃气浴10min,灭活连接酶酶活。扩增引物为TCCATTCGGCATCGCAGA-CA ,扩增体系为:10×Taq Buffer 5μL、dNTP mixture(2.5μM)4μL、引物4μL、连接产物4μL、Taq酶(5U/μL)1μL、超纯水32μL,扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性30s,58℃退火45s,72℃延伸2min,35次循环,72℃延伸10min,4℃保温,扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测和DNA纯化回收。
扩增产物的磁珠探针筛选:按照(AC)15、(CT)15和(TAT)10三种不同的探针(上海生工生物公司合成)独立配置SSR探针杂交体系,纯化后的DNA 15μL、SSR探针(20μM)2μL、20×SSC 10.5μL、10%SDS 0.35μL、超纯水22.15μL;漩涡震荡混匀,95℃高温下孵育5min,然后置于95℃热水中缓慢冷却降温,先变性再退火,使SSR探针与半夏DNA片段充分接触;将杂交液加入到处理过的新鲜磁珠中,25℃孵育30min。使磁珠与探针牢固结合,然后利用SSC缓冲液洗涤掉未与探针结合的DNA片段,洗涤次数越多,效果越好;使用6×SSC缓冲液(含0.1%),分别进行3次室温和3次68℃洗涤(300μL/次),每次10min,之后再用3×SSC缓冲液进行,室温洗涤6次(300μL/次),每次10min,利用磁力架去除清洗液;最后加入50-70μL TE缓冲液,95℃温育10min(不断震荡),收集半夏SSR片段。
半夏SSR序列的克隆和测序:对以上得到的单链SSR序列进行PCR扩增并利用DNA纯化试剂盒(天根生物)进行纯化,电泳检测合格后,转化感受态细胞,挑选阳性克隆,送至上海生工生物公司测序。PCR扩增体系和反应条件同上。TA克隆转化体系为:PMD19-T 1μL,纯化后的DNA为4μL,Solution I为5μL。
SSR引物设计与合成:分析测序结果,统计SSR序列数目。筛选重复单元10 次以上且两端含有20-40bp的间隔序列的SSR序列,利用Primer Premier 6软件开发SSR引物,之后送至上海生工生物公司进行合成。
2.4 SSR引物对四种不同叶型半夏的鉴定分析
从以上得到的SSR引物中,随机选择62 对引物,对四种不同叶型的半夏进行PCR扩增,随后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性初步鉴定,筛选出能区分四种不同半夏品种的单一或组合引物对,即半夏SSR分子标记。PCR扩增体系为:DNA 1μL、Taq Mixture22μL、上游引物1μL、下游引物1μL。
3 结果与分析
3.1 DNA提取结果及分析
半夏基因组DNA提取结果见图1。从图1可见,三种方法提取到的DNA条带都较亮,完整性均较好。微量分光光度计检测结果显示,SDS法和CTAB法所得到的DNA浓度通常能达到200ng/μL以上,OD260/OD280介于1.7—2.0 之间;而试剂盒提取得到的DNA浓度在200ng/μL以下,OD260/OD280 在1.85左右。虽然人工萃取抽提法的DNA得率高于试剂盒法,但其机械操作过于频繁,容易造成DNA损伤和降解,且纯度往往不高;而试剂盒提取法可获得高质量的DNA,且杂质较少,方便后续实验操作,因此本实验使用试剂盒法提取半夏基因组DNA。
注:左图中,1—3泳道为SDS法提取的DNA,4泳道为DL2000Marker,5—7泳道为CTAB法提取的DNA。右图为试剂盒法提取的DNA,1泳道为DL2000 Marker。
3.2 SSR分子标记开发结果与分析
酶切结果与分析:如图2所示,无论是单酶切还是双酶切得到的半夏DNA片段在琼脂糖凝胶中均表现为一片弥散的亮区,从100bp—2000bp均有分布,由此可说明单双酶切的效果都较好。但双酶切得到的片段亮度不如单酶切片段高,说明单酶切得率相对较高,加之单酶切较经济,因此试验最终采用MboI单酶切方法进行DNA酶切。
连接接头后的半夏DNA片段扩增结果:连接接头后的半夏DNA片段扩增结果见图3(A),DNA条带明亮且均一的分散于整个泳道,说明PCR扩增效果良好,可用于下一步的实验。
注:1泳道、4泳道分别为FbaI和MboI双酶切结果,6泳道为MboI单酶切结果,3泳道为DL2000 Marker。
注:A.1—2泳道为连接接头后扩增得到的产物,3泳道为DL2000Marker;B.1泳道为DL2000 Marker,2—4泳道分别为(TAT)10、(CT)15和(AC)15探针筛选后的扩增产物。
探针筛选后的半夏SSR片段扩增结果:探针筛选后半夏SSR片段PCR扩增结果见图3(B)。SSR片段分布较弥散,集中于200—1000bp区间,说明实验所得SSR片段分布较均匀,筛选效果较好。
SSR筛选结果与SSR引物的开发:本研究阳性克隆率高达80%,测序后共得到841条半夏基因组序列,经过大规模的筛选统计,可用来开发SSR引物的序列有406条,其中(AC)15、(CT)15和(TAT)10探针分别对应155条、130条和121条,且筛选得到的SSR序列质量较好,平均重复次数在20次以上;利用Primer Prem-ier 6 软件,设计出231 条SSR引物,其中对应于(AC)15、(CT)15和(TAT)10探针的引物分别有65条、85条和81条,引物开发率为56.90%(表1)。
3.3 四种不同叶型半夏SSR分子标记的筛选
通过对PAGE电泳结果进行多态性分析,筛选得到7对能鉴别四种叶型半夏的SSR分子标记(见图4—6),它们分别为:引物*000135、*000136、*000152、*000154、*000154、*000253和*000274(表2),这些多态性位点主要分布在150bp—750bp之间。
注:第1泳道为DL2000 Marker,2—5泳道和6—9泳道分别为引物*000135和*000136以SZTL为模板的扩增图谱,方框内为多态性位点分布区域。
注:1—4泳道和17—20泳道分别为引物*000253和*000274以SZTL为模板的扩增图谱,21泳道为DL2000 Marker,方框内为多态性位点分布区域。
注:1泳道为DL2000 Marker,7—10泳道、15—18泳道和19—22泳道分别为引物000156、*000154和*000152以LTZS为模板的扩增图谱,方框内为多态性位点分布区域。
4 结论与讨论
只有当微卫星的重复率大于16时,能够提供的多态性信息含量PIC(Polymorphic Information Content)值才可能大于0.5[14],符合这种条件的才能用于进行相应的多态性分析。本研究获得的SSR序列平均重复次数在20个以上,质量普遍较高,因此所开发的半夏SSR引物能够为后续的多态性分析实验提供优质准确的数据基础。
本文通过对实验各个步骤的反复探索,优化了实验条件,相较于张君毅等人的报道[13]有了大量改进并取得了良好结果。主要表现在:1仅用单酶切进行基因组DNA的酶切,节约了酶的用量,同时提高了SSR位点的得率。2仅用一种低选择性引物进行全过程的特异性扩增,使探针文库含有更多的SSR序列。3开创了一种廉价的DNA接头获得的方法,相比传统的合成修饰法,能节约80% 以上的费用。 4 采用3 种探针(AC)15、(CT)15和(TAT)10,分别筛选SSR序列,可捕捉到所有可能的双碱基重复序列组合,这对后续其他领域的SSR分子标记开发工作提供了理论和数据参考。5改进了洗脱方法,增加了洗脱次数,使洗脱效率和洗脱片段的质量更高,有利于提高阳性克隆率,降低片段重复率。
目前公布于GenBank数据库的半夏微卫星相关序列仅有69条,能用于设计引物的就更少。本研究共获得841条半夏序列信息,其中能用于引物设计的序列达到406条,并开发出231条SSR引物。这一结果极大地丰富了半夏微卫星研究领域的数据信息。此外,试验中仅选用了62对引物,进行4种不同叶型半夏品种的鉴定,还有更多的SSR引物有待进一步研究分析。本研究也将有助于对半夏的种质资源、遗传性状等的鉴定分析工作。
SSR标记 篇9
1 材料和方法
1.1 水稻材料
本研究包含2个试验:试验一中的杂株类型来自正季鉴定中收集的9种杂株类型, 试验二所用样品为正季鉴定材料中的同一份样本。
1.2 实验方法
1.2.1 试验一:
在湖北省种子集团有限公司鄂州基地正季种植并按照当地栽培管理方法栽培两优287样品, 调查杂交稻表型性状, 并统计杂株类型和田间调查鉴定结果。取正季鉴定中9种杂株类型与杂交种F1, 取其叶片参照CTAB法[5]提取DNA, 按照PCR扩增10μL体系:1μL DNA模板, 1μL 10×PCR buffer, 0.8μL25 mmol的MgCl2, 0.2μL的10 mmol dNTP, 0.1μL的10μmol正向引物 (primer F) , 0.1μL的反向引物 (primer R) , 0.2μL rTaq酶 (Takara, 5 U/μL) , 6.6μL灭菌ddH2O。PCR反应条件为:94℃预变性5 min, 32～35个循环, 每个循环94℃变性30 s, 55℃退火30s, 72℃延伸30 s, 然后72℃延伸7 min。PCR电泳检测:采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.2.2 试验二:
取正季鉴定中同一份样本的1920粒水稻种子, 采用简易法提取DNA[6～9]:剪取0.5 cm长的水稻幼苗 (幼叶或幼茎) , 放入96PCR板的孔中, 每孔加入40μL 0.25 mol/L的NaOH, 在沸水中煮30 s, 然后加入40μL 0.25 mol/L的HCl和20μL 0.5 mol/L的Tris (pH 8.0, 含有体积分数为0.25%的IGEPAL-CA630) 的混合液, 在沸水中煮沸2 min, 用1μL进行PCR扩增, 其余4℃保存。然后按照试验一中的方法进行。
2 结果和分析
2.1 试验一鉴定结果
通过田间调查鉴定了两优287杂交稻材料的纯度, 选取其中的9种杂株类型, 包括不育系9802 s、父本、紫秆红稃尖、变异株1 (比两优287矮) 、变异株2 (比两优287高) 、紫秆迟熟株、迟熟株1 (迟熟25天以上) 、迟熟株2 (迟熟15天左右) 、青稞, 归类并统计杂株总数及所占比例, 结果见表1。
2.2 试验二纯度鉴定及对杂株类型分析结果
利用24对SSR标记对两优287大田正季鉴定中的这9种杂株类型进行差异化分析, 最终筛选出3对SSR标记RM19、RM71、RM224可以将这9种杂株类型相对区分开:通过RM71可以鉴别4和5 (变异株1和变异株2) 以及7 (紫秆迟熟株) ;通过RM19可以鉴别1 (不育系) ;通过RM71与RM19同时可以将3和6归在一起鉴别出来;通过RM71、RM19、RM224可以将2、8、9分别鉴定出来, 结果见表1。
2.3 试验一与试验二纯度鉴定及杂株类型分布结果比较
通过3对SSR标记和田间调查, 鉴定了两优287杂交稻材料的纯度并对杂株类型进行定量分析 (见表1) , 结果表明, 经过多对SSR标记检测的纯度为96.61%, 而田间调查鉴定结果为97.10%, 分子标记检测和田间调查鉴定结果基本吻合, 各种杂株类型的分布基本一致, 但是通过分子标记检测到0.31%的其它基因型的杂株。
3 讨论与结论
本研究结合大田正季种植鉴定, 利用多对SSR标记系统分析了两优287纯度、各杂株类型相互间的区别并对样本进行分析统计。按照需求, 选取了其中的3对SSR标记, 可以将9种杂株类型全部鉴定出来并相对应归类。研究还发现, 利用多对SSR标记鉴定的结果与大田正季鉴定的结果基本一致, 各种杂株类型所占的比例也基本一致。但是通过3对SSR标记鉴定分析, 还发现与9种杂株类型的基因型不一致的其他一些基因型杂株, 对这些基因型所代表的杂株表现型还有待在正季鉴定中进一步研究。
本次研究对同一份样本采取两种鉴定方法鉴定种子纯度, 产生一定的差异。研究认为, 造成多对SSR标记鉴定纯度偏低的主要原因是:有一些杂株在正季鉴定中不表现出杂株表现型, 而SSR标记能较明显的显示出是杂株, 3对SSR标记检测中发现有0.31%的其它杂株类型的基因型。其次, 两优287的父本在大田正季鉴定中也较难以明显鉴定出来, 所以也导致大田正季鉴定的父本所占比例较SSR标记鉴定的结果低0.12%。
本研究是本公司利用自己建立的生物实验室, 结合企业所在制种基地的实际生产情况, 将两优287大田制种和SSR标记试验纯度鉴定结合起来进行分析比较, 首次尝试采用多对SSR标记精确鉴定两优287的种子纯度及所含杂株类型定量分析。我们下一步拟采用这种方法, 对每一个品种所有的杂株类型进行SSR标记特性分析, 初步建立每个品种的SSR标记指纹库, 然后结合大田制种的实际情况, 选取几对SSR标记进行种子纯度及杂株类型定量分析, 确保公司种子安全。
参考文献
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