肝癌标记物研究

肝癌标记物研究（通用4篇）

肝癌标记物研究 篇1

肝细胞癌 (HCC) 是常见的恶性肿瘤之一, HCC有很高的致死率, 特别是在肝硬化基础上发展为肝癌的病人[1]。在我国, HCC主要和乙型肝炎病毒感染、肝硬化相关, 确诊时大多属于中、晚期, 缺乏有效治疗手段, 预后差。手术切除仍是目前最有效的治疗方法, 因此早期诊断非常重要。随着分子生物学的不断发展, 多种新标记物的不断发现, 早期诊断率有所提高, 但仍不尽人意。肝癌早期诊断的标记物主要分为原发性肝癌的蛋白质抗原、相关酶和同工酶、生长因子、肿瘤相关基因等几类, 目前血清标记物众多, 但尚无单一标记物能诊断所有类型的肝癌, 它们之间无相关性但有互补作用。现就此进行综述。

1 癌胚抗原和糖蛋白抗原

1.1 甲胎蛋白 (AFP)

AFP是一种糖蛋白, 属于胚胎性蛋白, 为目前诊断HCC最常用的标志物。但是总AFP在诊断HCC时有一定的局限性。新近一份HCV相关HCC的病例对照研究发现, 将总AFP值定在16ng·ml-1作为诊断标准时其敏感度和特异度最高[2], 以此标准, 敏感度区间为60%～80%;特异度区间为70%～90%[3,4,5]。但是AFP在一些良性肝病、部分生殖系统和胃肠道的恶性肿瘤中也会升高, 假阳性率和假阴性率均高达40%, 特别是在诊断肝癌早期或者是<3cm的小肝癌时[6]。AFP升高与HCC的恶性程度和是否转移无相关性。因此, 目前认为AFP作为单一的HCC诊断依据还值得进一步研究。

1.2 AFP-L3

AFP可以分为三个组分, 其中AFP-L1来自良性肝病, 占主要部分;AFP-L2来自孕妇;而AFP-L3为肝癌细胞特有。AFP-L3可以用比率方式即AFP-L3条带/AFP条带×100%来表示, 正常值是10%～15%, >15%即可诊断HCC。并且有研究发现, AFP-L3与HCC的恶性程度、分化和复发相关, 提示AFP-L3可用来预测远处转移及预后[7]。AFP-L3占总AFP的比例具有特异性, 可以作为诊断早期HCC的一个指标。但是最新的一个关于AFP-L3作为预测HCC发生指标的研究结果显示, 在一些严重的肝脏疾病AFP-L3也会升高[8]。故目前AFP-L3作为一个敏感而又特异诊断HCC的指标, 尚需要更多的试验来证明。

1.3 热休克蛋白70

热休克蛋白70 (heatshockproteins 70, HSP70) 是一种相对分子质量为70 000, 存在于大多数细胞腔隙中的一种主要分子伴侣 (molecularchaperons) , 它在维持组织细胞的自身稳定和环境适应性方面有重要作用, 对细胞抵御外界损伤具有保护作用, 在生理和应激条件下均能表达。Chuma等[9]以寡核苷酸微阵列法全面分析了7对HCC早期、进展期样本, 以及样本非肿瘤区肝组织的基因表达, 结果显示:肝细胞癌发展每个步骤的分子标记都有明显不同, 在早期变化中最明显的是HSP70, 这一点在RT-PCR中得到证实。免疫组织化学染色显示HSP70在早期HCC过度表达, 明显高于癌前病变, 而进展期HCC显著高于早期HCC, 提示作为分子信号的HSP70为一种HCC早期鉴别诊断的灵敏标志物。Lim等[10]以免疫组化法和点免疫染色法研究了一系列肝肿瘤包括癌前病变中的HSP27、HSP60、HSP70、HSP90、GRP78[STF2]和GRP94的表达水平, 分析其与肿瘤发生的关系, 结果显示HSP70的表达水平与HCC的发展阶段呈中等相关关系 (Spearmans, r=0.4～0.75) , 提示HSP70表达的增加可能是肿瘤恶化的一个结果。因此, 提示HSP70可能成为肝癌早期诊断一个新的标志物。

1.4 磷脂酰肌醇 (glypican 3, GPC 3)

GPC 3是硫酸类肝素蛋白多糖家族的一员, GPC 3是一种癌胚抗原, 在肝细胞恶化时可以再次活化。GPC 3在细胞的生长、分化和迁移过程中起重要作用, 虽然在间皮瘤、子宫癌、乳腺癌中这种蛋白表达均有下调, 但在HCC中, 无论是mRNA还是蛋白, 均高表达[11]。Wang等[12]的研究结果显示, GPC 3染色阳性在21例肝硬化后肝癌中占90% (19/21) , 在28例非肝硬化肝癌中占64% (18/28) 。在腺瘤中, 只有1个局灶恶性变是阳性染色;在94例巨结节中, GPC 3染色阳性在高度不典型增生或者早癌中占48% (14/29) , 在良性病变或者是中低度不典型增生中占3% (2/65, P<0.001) 。因此, GPC 3是HCC敏感而特异的免疫组化标记, 也是一个早期标记。GPC 3在胆管癌 (CCC) 中呈现下调, 从而用其可能可以区分HCC和CCC[13], 而且GPC 3的表达还可以用来精确诊断HCC的肝细胞和胆管分化区域, 这些是AFP不能做到的。所以, GPC 3可以用作HCC早期诊断的一个新标记物, 并且可以用来作鉴别诊断。

1.5 鳞状上皮细胞癌抗原 (SCCA)

SCCA是丝氨酸蛋白酶抑制剂高分子家族的一员, 在一些不同的上皮癌中呈现高表达。它分为2个不同的亚型, 分别由2个同源基因编码SCCA 1和SCCA 2, 分别以中性及酸性的形式表现。SCCA曾有报道在HCC中呈现高表达[14]。Giannelli等[15]的研究显示, 肝癌组织中SCCA的表达水平明显高于肝硬化癌前病变组织, 肝硬化癌前病变组织中SCCA表达只限于恶性结节中, 肝硬化后肝癌病人的血清中SCA水平亦明显升高。因此SCCA可能是肝癌早期诊断的另一个新标记物。Guido等[16]做了关于SCCA的表达和肝癌发展关系的研究, 结果为在低度和高度不典型增生结节中SCCA的表达分别是29%和100%, 在HCC中的表达是93%。此结果表明, SCCA的异常表达是在肝细胞癌性转化的早期, 故SCCA可作为肝癌诊断的早期指标。Pontisso等[17]的研究表明, 肝硬化病人中逐渐增加的SCCA-IgM免疫复合物与肝癌的发展相关, 且较AFP有更好的敏感性, 并描绘了ROC曲线以显示2个诊断标记物改变水平的比率和诊断的精确性, SCCA-IgM明显比AFP高。提示血清中SCCA-IgM水平也可以作为肝癌早期诊断的一个标记物。

2 酶

2.1 肝脏特异性γ-谷氨酰转移酶

γ-谷氨酰转移酶 (GGT) 在正常成人中主要是由肝脏Kupffer细胞和胆管内皮细胞分泌, 在HCC中或是胎肝中它的活性明显增加, 总GGT可以被聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳分成12种同工酶 (Ⅰ, Ⅰ′, Ⅱ, Ⅱ′, β, δ, ε, φA, ⅦB, φC, γA, γB) , 其中 (Ⅰ′, Ⅱ, Ⅱ′) 只能在HCC病人血清中检测到, 称为肝脏特异性γ-谷氨酰转移酶 (HS-GGT) 。用其检测HCC的敏感度为74.0%, 小肝癌的敏感度为43.8%[18]。GGT特异性差, 大多数良性肝、胆、胰疾病也可伴GGT的活性增强, 并且它不能鉴别原发性或继发性肝癌。令人欣喜的是同时检测GGTⅡ、DCP和AFP可以明显提高检出率[19]。因此GGT可以作为检测小肝癌和肝癌诊断中的一个补充指标。

2.2 异常凝血酶原DCP (desgammacarboryprothrombin)

凝血酶原是由肝细胞合成的, 异常凝血酶原的差别就在于其氨基酸特定位置上的谷氨酸残基未经过羧基化, 是去γ羧基凝血酶原 (DCP) 。在VitK缺乏或服用VitK拮抗剂后, 凝血酶原的非羧化形式可以释放入血中。在肝癌病人的血清中DCP的阳性率高, 是一种特异性强的HCC标志物。最近的报道认为, DCP或许比AFP更有价值, Wang等[19]的研究结果显示, DCP的精确性 (81.9%比68.5%) 、灵敏度 (77%比59%) 、特异度 (86.4%比77.3%) 均较AFP为高, ROC曲线下面积DCP亦较AFP为好, 并且无论是在大肝癌还是在小肝癌中其诊断优越性均较AFP为好。DCP用于肝癌再发的研究[20]提示, DCP与肝癌的发生发展相关, 是一个良好的早期诊断指标, 并且因为部分患者AFP升高和DCP的升高不一致, 因此DCP可以作为AFP诊断HCC的补充指标, 同时测定DCP和AFP可以提高诊断灵敏度[21]。

3 细胞因子

3.1 转化生长因子 (TGF-β1)

TGF-β是一组生长调节蛋白 (相对分子质量25 000) , 在肝细胞再生过程中起重要作用。TGF-β家族中包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3, 内皮细胞及结缔组织表达TGF-β1, 上皮细胞及神经元细胞表达TGF-β2, 间质细胞表达TGF-β3, 在肝癌发生早期TGF-β1呈过度表达状态, 抑制免疫系统, 促进癌细胞生长、浸润及远处转移。Yao等[22]的研究显示, TGF-β1表达相关于HCC的分化和HBV复制的情况, 但和肿瘤的大小和数量均没有关系, 循环中的TGF-β1和TGF-β1mRNA在HCC中明显增高, 诊断HCC的敏感度和特异度分别为90%和94%;Dong等[23]的研究结果显示, 联合检测TGF-β1和血清AFP可以提高HCC的检出率 (达到97%) 。有研究认为血清中TGF-β1可以在23%的AFP正常水平的HCC病人中检测到[24], 因此在诊断HCC的时候, TGF-β1可以作为AFP的补充诊断因子。但也有人认为, TGFβ1的水平可能在肝硬化的病人也是增加的, 这是由于肝细胞在清除方面的减少。这方面的情况可能会减少它在肝病方面的研究, 另外一方面是由于TGF-β1在损伤愈合、血管发生、纤维化和肝外肿瘤中均过度表达, 因而缺乏疾病的特异性[25], 这些都是TGF-β1应用的障碍。

3.2 胰岛素样生长因子-Ⅱ (IGF-Ⅱ)

IGF-Ⅱ是胰岛素密切相关的促有丝分裂多肽。肿瘤细胞可高表达IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ受体, 因此IGF-Ⅱ被推测作为多个肿瘤的自分泌生长因子, 当肝细胞发生癌变时, 肝细胞逆转呈胚胎性重新过量表达IGF-Ⅱ, 并与分化程度呈正相关。其作用机制为IGF-Ⅱ在HCC新血管形成中可能是一个重要的因子, 在人体肝癌细胞中IGF-Ⅱ增加可同时增加血管内皮生长因子 (VEGF) mRNA和蛋白的量。在体外, IGF-Ⅱ可能是HCC中低氧诱导血管生成因子并且刺激HCC细胞的生长。Tsai等[26]的研究结果显示, IGF-Ⅱ在肝癌中的表达较肝硬化和慢性肝病高, 但是其敏感度、特异度均不及AFP, 作为一个新的标记物值得怀疑。但有趣的是Dong等[27]发现, IGF-Ⅱ在AFP阴性的HCC中有35%呈现阳性, 但与肿瘤大小无关。因此也许可用作AFP阴性病例的补充诊断指标。

4 相关基因

4.1 AFPmRNA

正常人血液中无AFPmRNA表达, 外周血中检测到的AFPmRNA是来自于癌灶脱落入血的完整肝癌细胞, 因此可作为肝癌细胞血液播散标志。外周血AFPmRNA检出率与血清AFP浓度之间无明显关系, 这是因为从基因表达理论上说, 基因激活后被转录成为mRNA并翻译, 最终表达产物, 这是基因表达的完整过程。但是有10%～30%HCC患者AFP基因表达停止在转录后, 因翻译缺失, 因此这部分病人血清AFP阴性。把AFPmRNA作为AFP诊断HCC的补充因子来诊断AFP阴性的HCC, 可以提高诊断的敏感性, 并可对转移和术后复发做出初步评价[28,29]。

4.2 GGTmRNA

在正常肝组织、良性肝病、继发性肝癌、HCC均可测到GGTmRNA, 其分为3种亚型 (A、B和C) 。RT-PCR检测出在正常肝组织中, A型为表达优势型, B型没有发现, C型少见, 并且各型表达在急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、酒精性肝病、继发性肝癌、良性肝肿瘤和正常肝组织中相似, 在HCC中B型mRNA表达比正常组织有明显增高, A型有明显下降[30]。GGTmRNA亚型转化、GGT基因异常表达以及甲基化状态的改变与HCC的发生关系密切。

4.3 IGF-ⅡmRNA

IGF-ⅡmRNA主要位于细胞增殖活跃的癌巢边缘, 在小肝癌中有较高表达。有研究显示, 在肝癌病人外周血中检出IGF-ⅡmRNA的阳性率为34.2%, 而其他良性肝病组织中均未出现阳性, 在肝癌发生远处转移时外周血中IGF-ⅡmRNA全部阳性, 其变化有助于选择正确的治疗方案[27]。

5 其它

其它的标记物如人类端粒反转录酶Mrna (hTERT-mRNA) 、VEGF、白介素8 (IL-8) 、肿瘤特异生长因子 (TSGF) 等为新近发现的标记物, 但其临床价值尚需进一步验证。

6 展望

我国是肝炎病毒感染较为严重的国家之一, 尤其HBV、HCV感染与HCC的关系密切, HCC的防治已是医学界的一项艰巨任务。在高危人群中, 早期监测和发现HCC, 可赢得手术治疗的时间, 提高生存率, HCC的成功切除和预后, 完全取决于早期诊断。影像学检查, 尤其是CT联合肝动脉造影可发现部分较小的HCC, 但是其鉴别良、恶性病变较难, 可以用标志物作为诊断的补充。临床上目前标志物众多, 但在血清检查中尚没有单一使用就可以诊断HCC的标志物, 对于一些新近研究的标志物尚需一些试验来进一步验证其价值。尤其是对于标志物的联合应用是否可以提高对肝癌早期诊断的灵敏度和特异度, 以实现更好地早期诊断肝癌仍然需要大量的研究来说明。

肝癌标记物研究 篇2

1 材料与方法

1.1 样本来源与分组

所有标本均取自青岛市市立医院, 青岛大学医学院第一、二附属医院。共收集经病理或临床诊断确诊、HBV阳性、未经治疗的HCC血清52份, HBV阳性33份, 健康对照37份, 其中所选HBV组合健康对照组的年龄、性别组成与HCC组基本一致, 然后从中随机选取HCC患者30例 (男12例, 女8例, 平均年龄51岁) 、HBV阳性携带者20例 (男13例, 女7例, 平均年龄48岁) , 健康对照20例用于筛选模型的建立, 剩余样本用于所建模型的双盲法验证。

1.2 材料

HPLC水, 乙氰, 三氟乙酸, SPA (Sinapinic acid) , Triton X-100, 尿素, HEPES, CHAPS均购自美国Sigma公司, 蛋白质芯片时间飞行质谱仪 (PBSⅡC) 及WCX-2芯片购自美国Ciphergen Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集

采集全血2 m L, 立即放入4℃, 静置4 h, 4℃4 000 r/min离心30 min, 收集上清分装置-86℃冰箱保存。取出样品, 冰上融化后, 4℃10000 r/min离心10 min。取10μL血清, 加入20μL U9缓冲液 (9 mol/L urea, 20 g/L CHAPS, 50 mmol/L Tris-HCl, p H9.0, 10 g/L DTT) , 混匀后500 r/min冰上振荡30 min, 然后加入360μL醋酸钠缓冲液 (50mmol/L, p H4.0) 稀释后备用。

1.3.2 样品检测和质谱采集

将WCX-2芯片装入蛋白工作平台, 每孔加入200μL结合缓冲液 (50m M Na Ac, p H4.0) 预处理芯片, 置于振荡器5 min, 重复上述操作1次。在每孔中加入50μL预处理的样品, 剧烈震荡, 孵育1 h。弃掉样品, 每孔用200μL结合缓冲液洗涤2次, 每次5 min。弃去孔中液体, 每孔加入200μL HPLC水, 立刻甩出。从蛋白工作平台中取出蛋白芯片, 空气中干燥, 每孔加入0.5μL EAM, 重复1次。干燥后用蛋白质芯片时间飞行质谱仪进行质谱分析。采用PBSⅡc型蛋白芯片阅读仪读取芯片信息, 仪器用标准多肽校正, 系统的质量偏差为0.1%。芯片阅读仪参数设置如下:激光强度200, 检测灵敏度9, 优化范围Mr 2 000~20 000 Da, 最高分子质量Mr 50 000 Da。用Ciphergen Protein Chip 3.1.1软件自动采集数据。

1.3.3 数据处理与HCC筛选模型的建立

将获得的各蛋白质谱用Biomarker Wizard软件计算HCC组和非肿瘤组各蛋白峰值的差异 (P值) , 筛选出可作为HCC标记物的差异蛋白;然后用BPS5.1 (Biomarker Patterns systems) 软件进行分析, 由BPS从中选取差异蛋白, 建立HCC筛选模型。

1.3.4 盲筛法验证诊断模型

用剩余样本 (肝癌22例、HBV阳性携带者13例, 健康人17例) 对上述建立的诊断模型进行盲法验证 (masked analysis) , 验证该模型的特异性和灵敏度。

2 结果

将Ciphergen Protein Chip 3.1.1软件采集的数据用Biomarker Wizard软件进行分子量 (6 637 Da) 和能量校正, 共获得185个蛋白峰 (见图1) , 其中在肝癌组和对照组有显著差别的有25个 (P<0.01) 。将这些差异峰用BPS软件进行分析, 自动选取其中5个差异峰 (6 888, 13 764, 6 487, 3 450, 6 814 Da) (见图2) , 建立了筛选肝癌的诊断模型 (见图3) , 此模型的根节点为6 888 Da, 首先根据此峰值强度29例标本被划分到左侧的枝结点2内, 41例被划分到右侧的枝结点3内, 又根据13 764 Da、6 487 Da、3 450 Da、6 814 Da的峰值强度, 将标本进一步划分, 最终将70例标本划分开。30例肝癌有29例被正确划分, 40例对照有36例被正确划分, 该模型检测灵敏度为96.7% (29/30) , 特异性为90.0% (36/40) 。用该模型对22例肝癌, 14例HBV阳性携带者, 16例健康人进行盲法验证, 21例肝癌, 27例对照被区分正确, 灵敏度为95.5% (21/22) , 特异性为90% (27/30) 。

3 讨论

近来研究表明, 肿瘤性疾病从蛋白质组学的角度又可以被认为是一种蛋白质缺陷病, 其发生过程中有多种蛋白会发生异常变化。肿瘤在发生发展转移的过程中, 在分子水平有不同的功能性蛋白参与。蛋白表达异常不仅包括蛋白表达量的增加或减少, 还包括蛋白翻译后加工上的改变, 从而导致肿瘤组织表达的蛋白质谱 (protein profile) 的改变。虽然从m RNA水平能够研究相应转录子的表达谱, 但在翻译的过程中要进行磷酸化、乙酰化、糖基化等修饰, 并不能了解肿瘤进展过程中蛋白表达质与量的变化。因此, 利用蛋白质组学方法检测蛋白质谱的变化可以更加准确地诊断肿瘤及了解肿瘤的发病机理。

蛋白质组学 (Proteomics) 是在整体水平上研究细胞内外蛋白质组成及其活动规律的学科[7], 蛋白质组学研究的最终将构建出细胞的“功能图”。SELDI蛋白质芯片技术是近年来新兴的一种蛋白质组学技术, 它具有简单、快捷、灵敏等特点, 而且能对原始样品直接进行检测[8], 可以检测分子量在500~500 000Da之间的蛋白或多肽, 而且所需样本体积小, 在蛋白质组学中得到越来越广泛的应用。

肝癌与HBV感染有极大的相关性, 有90%的肝癌是由HBV感染后经过漫长的时间转化而来的, 而且HBs Ag阳性的携带者比非携带者肝癌的发生率高100倍。本实验笔者选择HBV阳性携带者与健康人做对照, 检测到有25个蛋白在肝癌患者中有差异表达, 并选择其中的5个蛋白峰建立了诊断模型, 经过盲筛验证有较高的灵敏度与特异性。

在本文中所使用的标本例数较少, 这是在蛋白质组学分析中, 由于不同个体的性别、年龄、饮食、治疗方法等等诸多因素均会影响其血清中的蛋白种类和水平, 且蛋白芯片价格昂贵。因此, 为降低研究成本, 尤其是尽量减少非特异性因素的影响, 国际公认的常规做法是:首先对所大范围收集的样本进行平衡, 剔除极端病例并使各组样本的一般状况尽量接近, 所以尽管筛选后所剩的样本数量往往较少, 但其结果却更具有代表性。尽管如此, 笔者仍将继续收集标本来验证其准确性。

参考文献

[1]张谦, 单岩, 王家祥, 等.应用SELDI-TOF-MS对先天性巨结肠血清蛋白质标记物检测[J].中国现代医学杂志, 2009, 19 (2) :164-167.[1]ZHANG Q, SHAN Y, WANG JX, et al.Using SELDI-TOF-MSfor serum protein markers in Hirschsprung's disease diagnosis[J].China Journal of Modern Medicine, 2009, 19 (2) :164-167.Chi-nese

[2]LIU W, GUAN M, WU D, et al.Using tree analysis pattern andSELDI-TOF-MS to discriminate transitional cell carcinoma of thebladder cancer from noncancer patients[J].Eur Urol, 2005, 47 (4) :456-462.

[3]LIN YW, LIN CY, LAI HC, et al.Plasma proteomic pattern asbiomarkers for ovarian cancer[J].Int J Gynecol Cancer, 2006, 16 (1) :139-146.

[4]LI J, ZHANG Z, ROSENZWEIG J, et al.Proteomics and bioin-formatics approaches for identification of serum biomarkers to de-tect breast cancer[J].Clin Chem, 2002, 48 (8) :1296-1304.

[5]STRECKFUS CF, BIGLER LR, ZWICK M.The use of sur-face-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight massspectrometry to detect putative breast cancer markers in saliva:afeasibility study[J].J Oral Pathol Med, 2006, 35 (5) :292-300.

[6]JUNKER K, GNEIST J, MELLE C, et al.Identification of pro-tein pattern in kidney cancer using ProteinChip arrays andbioinformatics[J].Int J Mol Med, 2005, 15 (2) :285-290.

[7]KAVALLARIS M, MARSHALL GM.Proteomics and disease:op-portunities and challenges[J].Med J Aust, 2005, 182 (11) :575-579.

食管癌的分子标记物研究进展 篇3

关键词：食管癌,分子标记物,基因

0引言

食管癌是世界范围内常见的恶性上皮样癌,每年有4万人死于食管癌,最常见的类型是食管鳞状细胞癌(ESCC),在中国也以ESCC占大多数[1]。中国是食管癌的高发区,我国新疆北部以游牧为主的哈萨克族(哈族)聚居区是我国食管癌的高发区之一,哈萨克族食管癌死亡率达55.9/106,高于我国平均水平,其患病率与死亡率均居哈萨克族恶性肿瘤的首位[2]。很多因素诸如TNM临床分期、病理分期、肿瘤的部位都影响着食管癌的预后,早期发生的局部淋巴结或血行转移也是食管癌预后的影响因素。但这些因素并不能预测食管癌的结局。为了能区分高风险和低风险的患者,得到最佳的治疗,有必要找到食管癌分子标志物。 分子生物学标记的确定可以进行食管癌早期检测和分子改变的识别,有助于减少ESCC的致死率,改善食管癌临床治疗效果和结局,指导食管癌的治疗、预后的评价。本文就食管癌的分子生物学机制作一综述,并探讨食管癌的相关分子生物学特点。

1染色体异常区域与食管癌

研究发现在基因组拷贝数扩增区域内含有癌基因,基因组拷贝数缺失区域含有抑癌基因。目前,随着分子生物学技术的不断发展,人们逐渐认识到染色体重排与人类恶性肿瘤的关系。相关研究显示,食管癌染色体存在很多异常区域, 包括1p34,3q,5p, 7p12,8q,11q13,12p,17q12和22q区域的扩增,以及2q,3q,4q,5q,13q21,9p21和13q的缺失[3,4]。这些染色体区域的扩增和缺失都与相应基因有关。11q13是常见的血液肿瘤及上皮肿瘤发生染色体重排的区域, 文献中食管癌染色体区域的扩增和缺失主要发生于11q13.2及8q染色体区域段。

2基因与食管癌

人类肿瘤的发生与肿瘤抑制基因的失活和癌基因的激活密切相关,从基因水平寻找肿瘤的特定生物学标志物,建立有效的早期预防及有效的诊断方法, 已成为目前肿瘤乃至食管癌预防领域的研究热点。以下论述与食管癌有关的基因。

2.1细胞周期蛋白D1(CCND1即Cyc1in D1)

Cyc1in D是G1/S期转换的重要正性调控因子, Cyc1in D1是其中3个亚型之一[5]。恶性肿瘤的经典特征是细胞周期失调,导致增殖失控的状态,抑制分化和细胞凋亡。细胞周期蛋白D1由CCND1基因编码,是细胞周期的一种诱导剂。 CCND1表达上调发生在细胞受到生长因子刺激的癌症早期阶段。CCND1异常高表达导致细胞分裂的连续刺激,导致细胞增殖和最终肿瘤的形成[6,7]。在多种肿瘤中,CCND1呈现基因扩增和过表达,且CCND1的过度表达与肿瘤的恶性水平有关。因此,CCND1被认为是致癌基因。 CCND1蛋白定位于人染色体11q13上,在食管癌及食管癌发育不良中均有CCND1的扩增,同时CCND1在20%严重的食管发育不良及ESCC中高表达[8,9]。 CCND1属于高度保守的细胞周期蛋白家族的一员, 其作为一种细胞周期蛋白调节CDK激酶,结合并激活周期蛋白依赖性激酶CDK4或CDK6,推动细胞周期的G1/S期转换。CCND1的功能主要是促进细胞增殖,它在不同肿瘤中阳性检出率不同,与组织分化程度相关,在分化差的肿瘤中表达增强[10]。Peng等[11]使用组织芯片检测199例食管鳞癌组织,164例正常黏膜组织,34例基底细胞增生和30例不典型增生中CCND1的表达情况,发现CCND1在食管癌的异常表达率(70.9%)明显高于正常对照组(0.8%)。其表达水平在正常上皮→基底细胞增生→不典型增生→食管癌,CCND1的表达从基底细胞增生出现。从高分化鳞癌到低分化鳞癌,CCND1的表达逐渐减少,CCND1可能在食管癌的发生过程中起重要作用。因此,检测CCND1蛋白可能对食管癌的早期诊断有帮助。Zhao等[12]进行了关于CCND1与食管鳞状细胞癌临床病理及预后的关系的Meta分析,结果显示CCND1在高分化食管鳞癌的表达OR值为0.74 (95%置信区间[Confidence Interval,CI]:0.58-0.93),在中分化与低分化肿瘤表达的OR值为0.65 (95%CI:0.45-0.94)。 通过10项研究的数据,CCND1表达与预后之间的关联合并危险比为1.78(95%CI:1.49-2.12)。通过IHC检测,CCND1的表达水平与食管癌的恶性临床病理特征以及预后差有关。

2.2 FBXO31

FBXO31是新近发现的泛素链接酶家族成员之一的SCF复合体(Skp1-Cull-F-box蛋白)中的一种蛋白组分,其主要通过个介导底物蛋白的泛素化和对Cyclin D1的降解来发挥作用。Kogo等[13]研究表示, FBXO31的过表达与食管癌患者的预后差有关。F- box蛋白(如FBXO7,FBX4和FBXW8) 参与泛素化FBXO31高表达组较低表达组预后更差,生存分析显示,FBXO31表达是食管癌的预后因素之一,提示FBXO31是ESCC的确定的预测标志物。

最近研究者们发现,FBXO基因是DNA损伤应答反应在信号转导通道的一个重要分支,DNA损伤后,FBXO31被活化的磷酸酶ATM磷酸化,使蛋白稳定且表达水平上升。Kogo等[14]研究表明,FBXO31水平显著与细胞周期蛋白D1基因扩增有关。FBXO31的表达是食管癌独立的预后因素。因此,在癌组织FBXO31基因表达可能是有希望的新的预后标志物, 有助于治疗方案的制定。

2.3 PTEN基因

磷酸酶基因(PTEN)为一新发现的抑癌基因,其中文名为人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因,位于10q23.3,转录产物为515 kb m RNA。属于PTP(protein tyrosine phosphatases)基因家族成员。PTEN是迄今发现的第一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因,PTEN蛋白在细胞生长、凋亡、 粘附、迁移、浸润等方面具有重要作用。PTEN基因是众多肿瘤预后的评价指标,研究其作用机制对肿瘤的诊断及其基因治疗具有重要意义。Sun等[15]报道了PTEN采用定量RT-PCR检测食管癌细胞m RNA和蛋白水平并采用免疫组化检测TEN在食管癌组织中的表达。结果显示PTEN在食管癌组织中的表达水平显著低于相应的非肿瘤食管上皮细胞(P<0.001),38例(51.4%)癌组织呈阴性PTEN的表达。在淋巴结转移阳性组织(PN+)中PTEN阴性表达率高于淋巴结未转移组织(P=0.021)。在PTEN阴性表达组的淋巴结复发率(60.5%)显著高于(36.1%)的PTEN阳性表达组(P=0.019)。进一步研究表明,PTEN表达的沉默在体外和体内促进细胞的增殖、迁移和侵袭。总之, PTEN蛋白阴性表达可能是一个有用的生物标志物, 可用PTEN来预测高风险的食管癌淋巴相关的转移。

2.4 MTDH基因

肝癌标记物研究 篇4

1 目前通过美国食品和药物管理局批准用于临床的膀胱癌相关的无创诊断方法

1.1 尿细胞学 (cytology)

尿细胞学不属于肿瘤标记物范畴, 作为膀胱肿瘤诊断金标准已多年, 传统细胞学 (conventional cytology, CC) 的涂片质量不十分理想, 从而影响到细胞学的诊断。尿脱落细胞学检测膀胱癌的敏感性为13%~75%, 特异性为85%~100%, 敏感性与肿瘤细胞分级密切相关。1996年FDA批准的液基细胞学检测 (1iquid based cytology, LBC) 技术, 从根本上改变了传统涂片的制作方法, 检测膀胱癌的敏感性为达90%以上, 特异度方面与传统细胞学相当, 对膀胱癌的诊断比传统细胞学更准确[1]。目前常见的几种液基细胞学检查技术有:新柏氏TCT技术、超柏氏LCT技术、利普液基细胞学LPT技术、国产液基细胞学技术如LBP。尿细胞学对诊断高分级的膀胱肿瘤具有较高的敏感度, 但对低分级的则敏感度较差, 且其结果易受操作者影响等缺点, 寻找理想的尿液中肿瘤标记物弥补其缺点, 甚至与其一同成为诊断金标准显得意义重大。

1.2 膀胱肿瘤抗原 (bladder tumor antigen, BTA)

膀胱肿瘤抗原 (bladder tumor antigen, BTA) 又称人补体因子H相关蛋白 (human complement factor H related protein, HCFHrp) 。肿瘤细胞分泌内源性基底蛋白与基底膜表面蛋白受体相结合, 并释放蛋白水解酶破坏基底膜, 基底膜碎片进入膀胱内聚成高分子复合物即BTA。BTA检测方法包括BTA、便携式免疫分析 (BTA stat) 和实验室ELISA (BTA TRAK) 。其中早期的BTA方法是检测基底膜降解复合物, BTA stat和BTA TRAK是BTA的改进方法, 可通过单克隆抗体的方法检测尿液中人类H相关蛋白补充因子, 可在门诊快速得到定性和定量结果。BTA的有优点是其高敏感度, 缺点是其高的假阳性率, 尤其是当患者存在非癌性血尿或感染[2]。在2008年一项前瞻性多中心临床试验501位患者中, BTA统计监测报告的膀胱癌复发的敏感性 (56%) 大于细胞学检查 (19.2%) 的, 特别是在1级病变 (48%:13%) , 特异性仍不及细胞学 (85.7%:98.3%) [3]。

1.3 核基质蛋白22 (nuclear matrix protein 22, NMP22)

细胞核的成分之一, 参与姊妹染色体的正确分离;肿瘤细胞在凋亡中释放出来。膀胱癌患者尿中NMP22水平是正常人的25倍。可以用多克隆抗体 (NMP22 test) 或免疫定量分析 (NMP22 bladder check) 检测尿液中NMP22水平监测膀胱癌复发, 其在检测原发膀胱癌方面较差, Vinod Kumar Arora等[4]研究表明NMP22和细胞学检测膀胱肿瘤的敏感性分别为79%和65.8%, 特异性分别为80%和100%。其在低级别的肿瘤中敏感性优于细胞学检查的。FDA已承认其在监测膀胱癌复发方面的作用。Hosseini等[5]研究表明NMP22检测和细胞学检测复发的敏感性分别为78.8%和44.2%, 特异性分别为69.6%和83.7%。现很少单独应用, 多与细胞学联合应用以提高癌检出率。

1.4 Immuno Cyt

Immuno Cyt是一种结合了尿细胞学和荧光免疫细胞化学的独创技术, 属于免疫细胞学检查, 利用单抗19A211及抗体M344、LDQIO, 通过免疫荧光显微镜去识别尿细胞表面的膀胱癌粘蛋白抗原 (M344、LDQ10) 和糖基化癌胚抗原的高分子量成分 (19A211) , 其更普遍存在于低级别的表浅性膀胱癌中, 具有较好的敏感性, 较尿细胞学检查有明显优势。最近1个单中心研究Immuno Cyt显示其检测膀胱肿瘤的敏感性为73%, 特异性为49%[6]。有研究显示Immuno Cyt在低级别肿瘤检测方面比无论是尿细胞学或FISH都更为敏感。特异性无明显差异[7]。但由于其高成本, 对器械的要求及对检验医生水平要求较高也限制了其推广, 目前它仅用于尿细胞学检测之外的辅助检测。

1.5 荧光原位杂交 (FISH)

FISH用于尿路上皮癌的诊断和术后监测, 其灵敏度及特异度是现今尿液肿瘤标志物检查方法中最高的一种。且其检测结果不受卡介苗 (BCG) 治疗的影响, 可用于BCG膀胱灌注治疗的监测。但由于FISH法的工作量大且费用高, 因此在临床应用受到限制。2008年Hajdinjak[8]对14项研究共2477次的FISH检测结果进行Meta分析得出结论:fish诊断尿路上皮癌总的敏感性为72%, 特异性83%, 而尿脱落细胞学检查的敏感性及特异性分别为42%及96%尤其对于低分级低分期肿瘤, fish检测膀胱癌的敏感度要远高于尿脱落细胞学检查, 将Ta期肿瘤去除后再进行分析, fish诊断膀胱癌的敏感度仍然高于尿脱落细胞学检查, 分别为86%及61%。国内虽有研究显示我国膀胱癌患者的染色体号和畸变发生率与国外报道间存在显著差异[9]。但近年来的国内相关研究也都表明FISH的敏感度和特异性在国人膀胱癌的诊断上亦是理想的一种。随访过程中当FISH检查再次出现阳性时, 则可认定是膀胱癌复发。FISH还可以作为尿细胞学或Immuno Cyt的一个确证试验[7]。FISH检查有望和细胞学一同成为诊断膀胱肿瘤金标准。

2 处于研究阶段的膀胱癌肿瘤标志物

2.1 膀胱特异性核基质蛋白 (BLCA)

1996年, Getzenberg等[10]对17例膀胱癌组织和正常组织研究首次分离确定了9种膀胱核基质蛋白, 其中6种只在膀胱癌组织中表达而在正常膀胱人膀胱组织中缺乏, 这6种核基质蛋白命名BLCA1、2、3、4、5、6;另外3种只存在于正常人的膀胱组织中, 命名为BLNL-1、2、3。对膀胱癌细胞系253j、T24和UMUC-2研究中发现6种BLCA的5种 (BLCA-1、2、3、4、6) 存在于3种癌细胞系中, BLNL1-BLNL3未发现存在于癌细胞系中, 此组蛋白在膀胱癌转化与形成中的相互联系和作用尚不清楚, 检测BLCA-4的抗体多为抗人BLCA-4多克隆抗体, 更加特异的单克隆抗体正在研究将使检测结果更加准确;同时还需进行大量病例的研究, 建立更高的正常临界值, 以提高其特异性, 而不降低敏感性。国内有人制备了BLCA-4单克隆抗体并检测15例膀胱癌标本, 其敏感度和特异度分别为93.3%和100%[11], 最近一项研究表明BLCA-4高表达的膀胱癌患者预后差[12]。BLCA族其他成员在检测膀胱癌中的价值也尚处于基础阶段。

2.2 透明质酸及透明质酸酶

HA为一种葡萄糖氨基聚糖, 是真核细胞胞外基质和体液的基本成分。在肿瘤组织, 升高的HA大部分集中在肿瘤基质中。HAase是一种降解HA的内生性糖苷酶, 能促进肿瘤侵袭。目前发现有三种HAase基因, 诱导膀胱癌的类型是HYALI型;多元统计分析则表明[13], HYALI检测肿瘤的肌层浸润准确率为76.8%, 肿瘤复发准确率为67.8%, 在预测肿瘤肌层侵犯和转移方面, 是一个很有潜力的能独立预测预后的标记物。

2.3 细胞角蛋白 (eytokeratins, CK)

细胞角蛋白 (eytokeratins, CK) 是上皮细胞中间丝的组成成分, 表达水平依赖于上皮类型、分化及恶性程度, 也是一种常用的肿瘤免疫组织化学标记物, 阳性表达见于上皮细胞、间皮细胞;癌, 间皮瘤等。上皮组织存在20种不同的CK, 几乎所有上皮细胞在恶性转化过程中均维持其表达量, 因而是上皮来源肿瘤细胞的一种特征性变化。与膀胱癌相关的有CK8、CKl8、CKl9和CK20。应用酶联免疫吸附试验 (UBCⅡELISA) 测量尿液中的细胞角蛋白8和18对膀胱原位癌的诊断有一定意义, 尤其是对膀胱原位癌, 但其对膀胱肿瘤总的敏感性及特异性低[14]。CYFRA21-l是CKl9的可溶性片段, 通过识别2株单克隆抗体BMl9-21和KSl9-l的双抗体夹心法进行测定, 对Gl期膀胱癌的敏感性较好。CK20并不是一个真的可溶性标记物, 它需要对脱落细胞采用RT-PCR进行处理, 检测复杂、昂贵, 在许多非恶性疾病甚至健康人群中也会增高, 总之现今CK的检测方法均不如尿脱落细胞学检查, 限制其发展和应用。

2.4 微卫星 (Microsatelite MS)

微卫星是广泛存在于原核及真核细胞基因组中高多形性短阵串联的DNA重复序列 (每对大概24个碱基) 。目前在许多肿瘤中都发现了微卫星异常, 包括杂合性缺失和微卫星不稳定性 (体细胞微卫星位点的扩增、丢失和缺失) , 有学者发现国内膀胱癌患者微卫星异常较集中于D18S46、IFNA、D85S137、D16S47 6等位点[15], 检出率约为80%, 与国外报道显著不同。由于MS数目庞大, 分布较广, 敏感性和特异性受选择的位点及其组合的影响, 而位点及其组合的筛选需考虑种族、地域的影响, 因此如何选择恰当的位点, 值得深入研究。

2.5 纤维连接蛋白 (fibronectin, Fn)

FN是一种大分子非胶原糖蛋白, 在泌尿系统它只存在于尿路上皮的基底膜及黏膜下层。膀胱癌中基底膜FN均有不同程度的丧失, 肿瘤侵犯基底膜以及诱导产生的蛋白酶增加了FN从基底膜中的释放, 而使尿中FN的含量上升。国内有学者首先报道用尿FN诊断膀胱癌[16], 近年来也已自主研究出一种FN试纸, 可作为人群的筛检和门诊的初诊手段, 现已致力于FN试纸的临床研究, 正努力获得国内的认可和批准。

2.6 存活素 (survivin)

与抑制细胞凋亡细胞周期调控肿瘤血管形成肿瘤细胞耐药等有关, 是一个具有潜在价值的肿瘤标志物, 与肿瘤的预后也密切相关。Survivin基因在胎儿的发育过程中有表达, 成人健康组织中检测不到, 但许多肿瘤中丰富表达。Survivin能在膀胱癌尿液中检测到, 并与其复发、分期、预后和死亡率相关。利用RT-PCR技术检测尿液中Survivin的m RNA, 可用于筛选血尿患者, 但诊断的稳定性需大量的样本来验证。

2.7 成纤维细胞生长因子受体3 (FGFR3)

很多生长因子在文献晕都有报道, 如表皮生长因子受体、血管上皮生长因子、肿瘤坏死因子、纤维母细胞生长因子受体3 (FGFR3) 等。van Oers等[16]在一项280人的病例研究中发现FGFR3的变异率在膀胱癌和上尿道肿瘤的发生率相当, 并且与低度恶性肿瘤相关。约50%的早期膀胱肿瘤中存在FGFR3突变, 存在该突变的肿瘤患者多预后较好。

2.8 DNA甲基化

DNA甲基化肿瘤相关基因启动子Cp G岛甲基化状态异常广泛见于肿瘤, 有望作为临床肿瘤诊断的分子标记。并与肿瘤浸润发展、患者预后及总的生存率相关[17]。

2.9 其他

p53基因、癌胚抗原 (carcinoma embryonic antigen, CEA) 、端粒酶 (Telomerase) 、尿脱落细胞Lewis X抗原检测、纤维蛋白原降解产物 (FDP) 、基质金属蛋白酶 (MMP) 、尿激酶纤溶酶原激活物 (Urinary urokinase-type plasminogen activator, u PA) 、粘蛋白7 (Mucin 7) 、微小染色体维持蛋白5 (minichromosome maintenance proteins 5, MCM5) 、Upk3a、细胞分裂周期蛋白基因6 (cell division cycle 6, CDC6) 等均有待进一步研究及验证。

3 结论、存在问题及展望

许多肿瘤标志物检测方法的敏感度尤其在低级别肿瘤检测方面高于尿细胞学检测的, 可弥补其不足, 但多有特异性低、需要进行标准化前瞻性的多中心研究以验证其可行性、缺乏标准化和可重复性差等不足。BTA、FISH检查在检测低级别肿瘤较尿脱落细胞学更有优势。NMP22适用于膀胱癌术后复发的监测, 单独使用易误诊。FISH有望和尿细胞学一同成为膀胱癌诊断金标准, 尤其在原位癌及p Ta期膀胱癌。现仍没有发现可用于检测癌前病变的标记物, 期望不久的将来, 各种标志物试纸的出现会使膀胱癌的检测更为无创、方便、快捷。

摘要：目前膀胱癌诊断及随访主要依靠尿细胞学检查与尿道膀胱镜检相结合, 而膀胱镜检给患者带来较大的痛苦, 还有诸多并发症及操作不便。因此, 从尿液中寻找可用于膀胱癌早期诊断及判断预后的无创指标非常重要。本文概述了主要的尿液中膀胱癌肿瘤标志物的研究进展