人肝癌细胞（通用10篇）
人肝癌细胞 篇1
恶性肿瘤致死的最主要原因是肿瘤细胞的扩散和转移,而经淋巴道转移是肿瘤细胞扩散和转移最重要和最常见的途径之一。已有的研究发现,炎症、外伤或肿瘤时可出现淋巴管新生[1,2,3],淋巴管新生的基本过程包括内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成,新近研究表明,肿瘤淋巴管新生与肿瘤淋巴道转移关系密切。肿瘤细胞与淋巴管内皮细胞互动过程中,诱导了肿瘤淋巴管新生[4]。然而有关肝癌淋巴管新生尚未见报告。本实验拟通过transwell小室非接触式体外共培养HLEC和HepG-2细胞,观察HepG-2细胞对HLEC增殖,迁移和管样结构形成的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
HepG-2细胞株由大连医科大学附属第一医院中心实验室提供。HLEC购自上海丽臣商贸有限公司。基质胶购自GIBICO公司。台盼蓝购自迈晨科技有限公司。胎牛血清(FBS),低糖IMDM培养基,高糖DMEM,胰蛋白酶:购自GIBICO公司。
1.2 细胞培养
将HepG-2细胞常规复苏后接种于含10%新生牛血清的低糖IMDM培养液于37℃,CO2体积分数为5%的培养箱中培养。取对数生长期细胞用0.25%的胰蛋白酶消化,行细胞计数。HLEC培养与HepG-2细胞培养方法基本相同。实验均在细胞对数生长期内进行。
1.3 建立HLEC与HepG-2细胞共培养系统
根据实验不同选择不同孔径的insert(上室)和不同规格的培养板(下室)建立起transwell共培养系统。培养板预先用自制的鼠尾胶包被。首先取对数生长期的HepG-2细胞,消化制成细胞悬液,接种于下室内,于5%CO2、37℃、饱和湿度的孵箱中培养。12h后,取处于对数生长期的HLEC,消化制成细胞悬液,接种于上室,然后放于孵箱中共培养。
1.4 细胞增殖实验
取transwell(0.4µm孔径,6孔培养板)小室,6孔培养板预先用自制的鼠尾胶包被。将HLEC消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×104/mL,接种1mL于下室内,于5%CO2、37℃孵箱中培养。12h后,HepG-2细胞重悬,调整细胞数为1×104/mL接种于上室,同时设立空白对照组(未加HepG-2细胞),然后放于孵箱中共培养。绘制细胞生长曲线:实验中各组分别设6个时间平行孔,每个时间点又分别设3个复孔。每隔24h、连续6d对HLEC进行台盼蓝染色。每个样本随机选取5个视野(×200)计数,并记录每个时间点的平均细胞数。以培养时间为横坐标、平均细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。本试验重复3次。
1.5 细胞迁移实验
取transwell(8µm孔径,24孔培养板)小室,其中小室内预先铺设基质胶10µL。首先将HepG-2细胞消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×104/mL分别接种1mL于下室内,于5%CO2、37℃孵箱中培养。12h后,将HLEC消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×105/mL,0.1mL接种于上室,并设立空白对照组(下室未加HepG-2细胞),孵箱中培养24h后取出insert上室,用棉签轻轻擦去内表面的基质胶和HLEC。将insert上室置入95%乙醇中固定10分钟,行HE染色。倒置相差显微镜下照相,计数迁移到insert外表面的细胞数量。每个样本随机计数5个视野(×200)的细胞数,取平均值进行比较,实验重复3次。
1.6 基质胶实验
选择孔径为0.4µm的insert(上室)和6孔培养板(下室)建立起transwell迁移系统,6孔培养板预先铺设基质胶800mL/孔,基质胶(10g/L)与无血清的EBM-2(含10µg/LVEGF-C)按4:1加入。首先将HLEC消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×104/mL,分别接种1mL于下室内,于5%CO2、37℃、饱和湿度的孵箱中培养。12h后,将HepG-2细胞消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×105/mL,0.1mL接种于上室,同时设立空白对照组(上室未加HepG-2细胞),然后放于孵箱中共培养。24h后,倒置相差显微镜亮视野观察淋巴管内皮细胞聚集和管状结构形成情况。镜下(×200)随机选取5个视野,计数HLEC聚集数量和管状结构形成情况,实验重复3次。
1.7 统计方法
采用SPSS 11.5统计软件处理实验数据,进行统计学分析,结果以均数±标准差表示。与对照组比较采用t检验,两实验组均数比较采用方差检验,以P<0.05作为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 成功构建HLEC与HepG-2细胞transwell共培养体系,其中HLEC于上室,HepG-2细胞于下室。
2.2 HepG-2细胞对HLEC增殖的影响
通过绘制细胞生长曲线,观察HepG-2细胞对HLEC增殖的影响。结果表明,与HepG-2细胞共培养体系中HLEC增殖速度明显高于HLEC单独培养组(P<0.05,图1A,图1B)。
1.单独培养的HLEC;2.与HepG-2细胞共培养系统中的HLEC
2.3 HepG-2细胞对HLEC迁移的影响
通过细胞迁移实验,观察HepG-2细胞对HLEC迁移的影响。结果表明,与HepG-2细胞共培养体系中HLEC迁移率(2.03±0.21)显著高于单独培养的HLEC迁移率(1.00±0.06,P<0.05,图2A,图2B)。
2.4 HepG-2细胞对HLEC管状结构形成的影响
通过基质胶实验,观察HepG-2细胞对HLEC管状结构形成的影响。使用基质胶作为淋巴管样结构形成的支持物,结果表明,与HepG-2细胞共培养体系中HLEC成管率(1.67±0.12)显著高于单独培养的HLEC成管率(1.00±0.08,P<0.05,图3A,图3B)。
3 讨论
作为肿瘤早期转移的主要方式,淋巴道转移机制的解析,对于肿瘤转移早期治疗有深远意义[5]。新近,肿瘤淋巴道转移机制研究取得进展,研究表明,肿瘤淋巴管生成与肿瘤淋巴道转移关系密切。
1.单独培养的HLEC;2.与HepG-2细胞共培养系统中的HLEC
1.单独培养的HLEC;2.与HepG-2细胞共培养系统中的HLEC
恶性肿瘤组织周围存在着淋巴管新生和淋巴管扩张的现象,恶性肿瘤具有使其周围淋巴管数目增加的特性,从而提高转移性能[6,7]。有关肿瘤淋巴管新生与肿瘤淋巴道转移的关系,已在诸多肿瘤研究中基本达成共识。有关肝癌淋巴管新生的研究未见报道,肝癌是以血管转移为主的恶性肿瘤,研究表明,淋巴道转移仅占肝癌转移总数的12.6%。我们关注了肝癌细胞与淋巴管内皮细胞互动过程中,对淋巴管内皮细胞生物学行为的影响,人淋巴内皮细胞体外培养为从细胞水平研究淋巴管生成提供了一个很好的研究平台,我们采用transwell小室建立HLEC与HepG-2细胞非接触共培养体系:下层培养液中HepG-2细胞的成分可以影响到上室内的HLEC细胞,从而分析下层HepG-2细胞分泌或代谢产物对上室内HLEC增殖、迁移、管状形成等的影响[8]。通过共培养体系,可以在相对接近体内环境下观察细胞与细胞之间的相互影响。
我们的研究表明HepG-2细胞能够促进HLEC细胞的增殖、迁移及管状形成,提示肝癌细胞能够诱导肿瘤淋巴管形成,肝癌淋巴管形成,可能参与了肝癌淋巴道转移。
参考文献
[1]Pepper MS,Wasi S,Ferrara N,et a1.Invitroang iogenic and Proteolytic properties of bovine lymphatic endothelial cells[J].Exp Cell Res,1994,210(2):298-305.
[2]Tan Y.Basic fibroblast growth factor-mediated lymphangiogenesis of lymphatic endothelial cells isolated from dog thoracic ducts:effects of heparin[J].Jap J Physiol,1998,42(2):133-l41.
[3]Tan Y,Wang H.Effects of extracellular matrix on lymphangiogenesis in vitro[J].Acta Anatomica Sinica,2002,33(I):69-72.
[4]Zhang D,Li B,Shi J,et al.Suppression of Tumor Growth and Metastasis by Simultaneously Blocking Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)-A and VEGF-C with a Receptor-Immunoglobulin Fusion Protein[J].Cancer Res,2010,70(6):2495-503.
[5]Zhuang Zhang,Joseph I,Helman,et al.Lymphatic Endothelial Cells and Lymphatic Metastasis in Head and Neck Cancer—A Review of Mechanisms[J].Int J Oral Sci,2010,2(1):5-14.
[6]Nakayama A,Ogawa A,Fukuta Y,et al.Relation between lymphatic vessel diameter and clinicopathologic parameters in squamous cell carcinomas of the oral region[J].Cancer,1999,86(2):200-206.
[7]Cursifen C,Schlotzer-Schrehardt U,Kuchle M,et al.Lymphatic vessels in vascularized human corneas:immunohistochemical investigation using LYVE-1and podoplanin[J].IOVS,2002,43(7):2127-2135.
[8]Cheng AL,Kang YK,Chen Z,et al.Eff icacy and safety of sorafenib in patients in the Asia-Pacific region with advanced hepatocellular carcinoma:a phaseⅢrandomised,double-blind,placebocontrolled trial[J].Lancet Oncol,2009,10(1):25-34.
人肝癌细胞 篇2
采用微管吮吸技术测定大鼠肝癌细胞的黏弹性;研究了秋水仙素、细胞松弛素D以及两者混合作用后对于肝癌细胞黏弹性的影响.结果表明:用CD处理癌细胞后发现癌细胞的弹性系数K1明显下降.与对照组相比:微丝骨架被CD抑制后,在加入Col后肝癌细胞的弹性系数K1显著降低;而微管骨架被col抑制后,在加入CD后肝癌细胞的`弹性系数K1、K2和μ无明显变化.提示在微管骨架系统完整的情况下,微丝对肝癌细胞的黏弹性系数的的影响起主要作用.而微管骨架系统受到破坏后,微丝需借助于微管网络的作用来影响细胞的黏弹性.本研究对揭示癌细胞中骨架系统之间的交互作用对于细胞黏弹性的影响提高实验依据.
作 者：冯全义 吴泽志 刘彬 蔡绍皙 周婵 林才 李校 付小兵 FENG Quan-yi WU Ze-zhi LIU Bin CAI Shao-xi ZHOU Chan LIN Cai LI Xiao-kun FU Xiao-bing 作者单位：冯全义,周婵,FENG Quan-yi,ZHOU Chan(西南大学生命科学学院,重庆,400716)
吴泽志,蔡绍皙,WU Ze-zhi,CAI Shao-xi(重庆大学生物工程学院,重庆,400044)
刘彬,LIU Bin(西南大学生命科学学院,重庆,400716;重庆大学生物工程学院,重庆,400044)
林才,LIN Cai(温州医学院附属第一医院烧伤外科,温州,325000)
李校,LI Xiao-kun(吉林农业大学生物工程技术研究院,长春,130000;温州医学院附属第一医院烧伤外科,温州,325000)
付小兵,FU Xiao-bing(中国人民解放军总医院创伤修复及细胞生物学实验室,北京,100853)
树莓可抑制肝癌细胞生长等 篇3
记者衣晓峰报道树莓可明显抑制肝癌细胞系增殖，使肝癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达减弱，并使抑癌基因野生p53的表达增强。由哈医大附属第四医院刘明博士完成的一项国家自然基金课题，为果蔬预防原发性肝癌提供了重要的理论依据。这一成果前不久获得了2008年度黑龙江省医药卫生科技进步奖一等奖。
树莓也称木莓、托盘、覆盆子，含有大量的维生素c、维生素E、超氧化物歧化酶、Y－氨基丁酸等抗衰老物质及鞣化酸等抗癌物质。
研究结果表明，随着树莓中植物化学物质浓度的增加，总抗氧化自由基清除能力也随之增强。0.25毫克／毫升～10毫克／毫升的树莓提取物对肝癌细胞系HepG－2的抑制率呈逐渐增加趋势，最高抵制率可达90％左右。应用聚合酶链反应检测结果显示，树莓提取物在体外有较强的抑制VEGF表达及影响野生p53表达的能力，随树莓提取物浓度升高，VEGF表达减弱，野生p53表达增强。
在利用化学毒物黄曲霉毒素和二乙基亚硝胺建立的稳定大鼠原发肝癌模型上，随着树莓提取物浓度的增高，实验组大鼠肝脏上的瘤径变小，肿瘤的数量减少，成瘤率减低，结节程度减轻，肝癌细胞VEGF、增殖细胞核抗原表达的程度亦明显降低。
美开发小样本癌症诊断技术
美国研究人员在近日出版的《医学》杂志上发表论文称，他们发明的一种机器可通过分析更细小的样本，如一滴血液或身体的一小块组织来分析癌症蛋白并跟踪治疗效果。
科学家称，新技术可能标志着外科手术活检的结束，活检通常需要移除大块的身体组织，而且要使用麻醉剂。
斯坦福大学的研究人员发明的这台机器，利用与癌症相关蛋白的电荷将这些癌症蛋白区分开来——电荷根据蛋白表面变化的不同而变化。科学家接着使用抗体来鉴定不同蛋白的数量和位置。新技术能够探测常见的人体淋巴瘤样本上的癌症基因的活跃程度，甚至可区分出不同类型的淋巴瘤。
领导该项研究的斯坦福大学肿瘤学教授迪安·菲尔斯表示，他们不仅能够探测皮克(10～12克)级的蛋白质，也能探测到蛋白被改变时的细微变化。
研究人员称，这个系统也能用于更快更方便地监测癌症治疗的效果。尽管该研究的重点主要在于血癌，科学家们也希望能够将其应用于固体肿瘤，他们目前正在使用该技术测试脑部和颈部肿瘤。
研究人员表示，他们已在一个淋巴瘤病人身上证明了一种降低胆固醇药物的抗癌效果，而且，他们也发现，这项技术对来自于实验室老鼠及培养肿瘤细胞的淋巴瘤样本也能起作用。
过量摄入肉类和乳品会损害精子质量
最新一期美国《生育与不孕》月刊上的一项研究发现，与常吃蔬菜和水果的男性相比，摄入过量肉制品和全脂乳品的男性的精子质量比较差。
据路透社新近报道，西班牙阿利坎特的研究人员对61名参加生育能力检查的男子进行调查。结果发现，其中一半男子精液质量较差，他们和另一半精液中拥有正常的精子数量的男子相比，大都摄入了过多的加工过的肉制品和脂肪含量很高的乳制品。
在所有这些男子当中。精子质量高的人则在日常饮食中选择了更多水果、蔬菜和低脂乳品。
负责此项研究的海梅·门迪奥拉桥说。他们的研究结果不能表明蔬菜和水果可以提高精子质量，但无疑证实一个平衡的膳食结构对生育能力至关重要。
门迪奥拉桥表示，水果和蔬菜中舍维生素c、番茄红素等丰富的抗氧化剂。而环境中的污染物通过饲料进入牲畜体内，在肉类和其他高脂肪食品的生产加工过程中也会产生多种化学物质。如果大量食用肉类、乳品等来源于牲畜的食品，这些物质将在人体内积聚。
门迪奥拉桥特别指出，虽然欧洲自1988年开始禁止使用带有激素的添加剂饲养牲畜，但此次调查的对象出生于上世纪70年代，所以无法排除肉类和乳品中的激素对他们造成的影响。
吸毒成瘾与大脑杏仁核有关
北京大学中国药物依赖性研究所的一项研究发现，吸毒者之所以“一朝吸毒，终身想毒”。是因为人体大脑杏仁核内部存在一种名为细胞外蛋白激酶的调节因子。这种调节因子正常情况下并不表达，但药物戒断之后便会逐渐诱导人体，使人对毒品产生渴求。该成果最近获得2008年度中华医学科技奖二等奖。
人肝癌细胞 篇4
1 材料与方法
1.1 主要试剂
Apigenin、MTT和LY294002购自美国Sigma公司,RPMI-1640培养液购自Gibco公司,新生牛血清购自杭州四季青生物工程公司,Akt、p-Akt、cyclin D1、β-actin抗体由Santa Cruz公司生产,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗均购自武汉博士德公司。
1.2 细胞与细胞培养
人肝癌Bel-7404由中国科学院上海细胞生物学研究所引进。用含有10%小牛血清、100 u/m L青霉素和100μg/m L链霉素的RPMI-1640培养液,在37℃,含5%二氧化碳的饱和湿度的培养箱内培养传代。
1.3 实验方法
1.3.1 MTT法
取对数生长期Bel-7404细胞,调节浓度为5 000个/m L,接种于96孔培养板,每孔200μL,培养24 h,吸弃培养基,分别加入含API(终浓度分别为5、10、20、40和80μmol/L)的培养基200μL/孔,溶媒对照组加入相同体积含终浓度为0.1%DMSO的完全培养基,每组3孔,培养48h,吸弃培养基,加入含0.5 mg/m L MTT的无血清培养基200μL/孔,继续培养4 h,吸弃培养基加入200μL/孔DMSO,振摇混均,用EXL-800型酶标仪在570 nm波长下测定吸光度值(A)。按公式:IR(%)=[1-药物处理组A均值/对照组A均值]×100%计算细胞增殖相对抑制率;半数抑制浓度IC50采用Calcus Zn程序计算。以上实验重复2次。
1.3.2 流式细胞术分析
Bel-7404细胞用含0.1%的小牛血清培养基培养24 h,使细胞周期同步化,分别加入不同浓度API使其终浓度分别为20、40和80μmol/L,溶媒对照组加入相同体积含终浓度为0.1%DMSO的完全培养基分别处理48 h后,收集细胞,用PBS吹打细胞成单细胞悬液,离心,冷PBS洗2遍,用4℃的70%乙醇固定24 h后,经碘化丙啶(PI)染色,用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。
1.3.3 Western blot
分别加入40μmol/L的API或10μmol/L的LY294002,溶媒对照组加入相同体积含终浓度为0.1%DMSO的完全培养基处理24 h,收集细胞,用PBS洗3次,细胞裂解液[0.1 M Na Cl,0.01 M Tris-cl.(p H 7.6),0.001M EDTA(p H8.0),1μg/m L Aprotinin,100μg/m L PMSF]裂解后,4℃,13 000×g离心10 min,用酶联免疫检测仪进行蛋白定量。取蛋白样品(25μg总蛋白/泳道)加入等体积上样缓冲液,100℃煮10 min,10%或6%SDS-PAGE电泳后转移(105 m A,3 h)至PVDF膜上。用含5%脱脂牛奶的TBST室温下封闭2 h,1∶200加入p Akt、Akt、cyclin D1和β-acting抗体37℃孵育2 h;TBST洗涤30 min,每10 min换液1次,加入相应的二抗室温孵育1 h后,用TBST洗膜3次,每次15 min。然后在含化学发光剂A、B的溶液中激发荧光,于暗室中压片,显影、定影。结果用图像分析仪分析,以面积和光密度的乘积表示蛋白表达丰度变化。
1.4 统计学分析
各组实验数据均用表示,采用SPSS windows 13.0软件One Way ANOVA方式行方差分析,两两比较采用Student's t检验,P<0.05为统计学意义显著性标准。
2 结果
2.1 AP I对人肝癌Be l-7404细胞活性的影响
MTT法结果显示:API对体外培养人肝癌Bel-7404细胞活性具有抑制作用,呈浓度依赖性,IC50值为59.4μmol/L,见图1。
2.2 AP I对人肝癌Be l-7404细胞周期的影响
为观察API对人肝癌Bel-7404细胞周期的影响,我们用PI染色流式细胞术测定DNA含量分析细胞周期。结果发现:API能使Bel-7404细胞周期阻滞在G1/G0期,见图2。
2.3 AP I对人肝癌Be l-7404细胞Akt蛋白磷酸化水平的影响
Western blot分析结果显示:经40μmol/L的API或10μmol/L的LY294002处理24 h后,Bel-7404细胞p-Akt蛋白水平较溶媒组分别下降18.4%和23.6%,见图3。cyclin D1蛋白表达与溶媒组比较下调至63.2%和56.7%,见图3B。
2.4 AP I对人肝癌Be l-7404细胞cyclin D1蛋白表达的影响
Western blot分析结果显示:经40μmol/L的API或10μmol/L的LY294002处理24 h后,Bel-7404细胞cyclin D1蛋白表达与溶媒组比较下调至63.2%和56.7%,见图4。
3 讨论
本文所获得的主要实验数据证实:API具有抑制人肝癌Bel-7404细胞活性作用,诱导细胞周期停滞于G1/G0期,降低细胞磷酸化Akt蛋白水平和Cyclin D1蛋白表达,为将API作为抗肝癌活性先导化合物提供了实验和理论依据。
乙肝病毒X(HBx)蛋白、胰岛素样生长因子-1以及肝细胞生长因子都被认为是肝细胞癌变中Akt信号通路的激活剂。胰岛素样生长因子已知可以通过它的受体激活包括Akt在内的多种细胞系统中的信号通路。血清中肝细胞生长因子水平已经被证实和未经治疗的肝癌患者的预后相关[4]。因此,Akt/蛋白激酶B的激活在肝细胞癌的发生、发展中起了重要的作用[3]。本文证实API抑制Akt信号传导具有普遍的肝癌治疗意义。
有研究表明,Akt激活通过m TOR磷酸化将有丝分裂信号传递给p70S6K,使细胞周期的主要蛋白如细胞周期素(cyclin)、细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK4)的翻译上调,同时抑制CDK4抑制剂p21CIP1等的表达,促进G1期进展,使细胞周期加速,促进细胞增殖,从而促进肿瘤的发生与发展[5,6]。本实验结果亦证实API能通过抑制Akt蛋白磷酸化,下调cyclin D1蛋白表达,进而抑制Bel-7404细胞活性,提示API的抑制肝癌细胞活性作用涉及抑制Akt信号传导。
参考文献
[1]GUPTA S,AFAQ F,MUKHTAR H.Involvement of nuclear fac-tor-kappa B,Bax and Bcl-2in induction of cell cycle arrest and apoptosis by apigenin in human prostate carcinoma cells[J].Oncogene,2002,[21]:3727-3738.
[2]胡太平,曹建国.芹菜素诱导人胃癌细胞凋亡作用及机制研究[J].国际病理科学与临床杂志,2007,27[1]:6-9.[2]HU TP,CAO JG.Study on pro-apoptotic effect of apigenin on human gastric cancer cells and its underlying mechanisms[J].Int J Pathol Clin Med,2007,27[1]:6-9.Chinese
[3]MICHL P,DOWNWARD J.Mechanisms of disease:PI3K/AKT signaling in gastrointestinal cancers[J].Z Gastroenterol,2005,43[10]:1133-1139.
[4]MOTTET D,DUMONT V,DECCACHE Y,et al.Regulation ofhypoxia inducible factor-1alpha protein level during hypoxic conditions by the phosphatidylinositol3-kinase/Akt/glycogen syn-thase kinase3beta pathway in HepG2cells[J].J Biol Chem,2003,278[33]:31277-31285.
[5]SHI DY,LIU HL,STERN JS,et al.Alpha-lipoic acid inducesapoptosis in hepatoma cells via the PTEN/Akt pathway[J].FEBS Lett,2008,582[12]:1667-1671.
人肝癌细胞 篇5
[关键词] RMP基因；肝癌细胞；基因稳定性；细胞运动
[中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2011）24-41-02
Effect of RMP gene on stability and migration ability of hepatoma carcinoma cells
ZHOU Feng
Department of Pharmacy,Jiangxi University of TCM Science and Technology College,Nanchang 330025,China
[Abstract] Objective To study the effect of RMP gene on stability and migration ability of hepatoma carcinoma cells. Methods Randomly divided SMMC-7721 cells into experimental group and control group. The author synthesized the siRNA eukaryotic expression vector of RMP gene,and transfectioned the vector to SMMC-7721 cells of experimental group.Screen the experimental groups with G418 for the cell strains with interfered RMP gene,and detectedthe expression of RMP gene in 2 groups by RT-PCR.It tested the migration ability of 2 groups of cells with scarification experimentation. Results Stable cell strains of interfered RMP gene had been built successfully. Compared to control group which hasn't been interfered, the experimental group cells had a weaker expression of p21 gene and a lower ability of migration. Conclusion The RMP gene contributes to the stability of hepatoma carcinoma cells and affects the migration ability.
[Key words] RMP gene;Hepatoma carcinoma cells; Gene stability;Migration ability
RMP（RPB5-mediating protein）是RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，RNAP Ⅱ）第5亚基RPB5的调节蛋白，其通过与RPB5的特异性结合来调节RNAPⅡ的转录活性，调节多种基因的转录和表达[1-2]。RMP最早于1995年由Cheong等采用Far-Westen印迹法，以32P标记的重组人RPB5探针从人肝癌细胞株的cDNA文库中筛查得到[3]。目前已有研究表明：RMP是一个重要的转录因子，在基因转录、细胞凋亡、基因组稳定以及肿瘤发生发展中均可能起重要作用[4]。笔者通过合成RMP基因的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）真核表达载体，转染到肝癌SMMC-7721细胞中，研究RMP基因对肝癌细胞稳定性及迁移能力的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
SMMC-7721肝癌细胞株从苏州大学医学部细胞生物学系实验室购买；G418从Sigma-aldrich公司购买；RT-PCR试剂盒从Fermenant公司购买。RPIM1640培养液和小牛血清从Gibco公司购买。
1.2 方法
将肝癌SMMC-7721细胞等量分为实验组与对照组，分别置于含15%小牛血清的RPIM1640培养液中，将其放入7.5% CO2的培养箱中以37℃恒温培养24 h。分离出处于对数生长期的细胞进行实验。向实验组中加入2 mL含6μg转染液，在相同条件下继续培养24 h。用G418筛选实验组中干扰RMP基因的细胞株。共72 h后，RT-PCR检测实验组与对照组RMP、p21 mRNA的表达情况。用Bandscan软件测出两组细胞能RMP/GAPDH和p21/GAPDH的灰度值（%）做比较。用体外划痕法检测两组细胞的迁移能力。
1.3 统计学处理
用SPSS13.0软件对所得数据进行分析，数据用（）表示，进行t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
RT-PCR结果显示实验组RMP表达水平比对照组明显下降，实验组p21mRNA水平也显著低于对照组，说明干扰RMP基因降低了p21的表达，p21对维持DNA的稳定性起重要作用，说明RMP基因有维持细胞基因稳定性的作用。用体外划痕法比较实验组与对照组的细胞迁移能力，发现实验组的划痕宽度高于对照组，说明实验组细胞的迁移能力明显低于对照组，RMP基因对保持细胞的迁移能力有重要作用。见表1。
3 讨论
肝癌是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第3大常见恶性肿瘤，目前正严重影响着越来越多的国人的生活质量。RMP作为一
种重要的转录因子，在基因组稳定、细胞运动、肿瘤发生发展中均可能起到重要作用。如何确定RMP基因对肝癌细胞稳定性以及迁移能力的影响，成为笔者研究的方向。
在本研究中，笔者将合成的小干扰RNA成功转染到SMMC-7721肝癌细胞中，筛选出稳定表达的细胞株作为实验组。利用RT-PCR技术检测发现，与对照组相比，实验组细胞RMP基因表达水平明显降低（P＜0.05），而且实验组p21 mRNA水平也显著低于对照组（P＜0.05），说明RMP基因被干扰以后，能相应减弱p21 mRNA的表达水平，而p21基因对细胞周期调控有重要作用，那么RMP基因对维持细胞稳定性也能起到一定作用。通过体外划痕试验，笔者发现实验组的划痕宽度显著高于对照组（P＜0.05），说明成功干扰RMP基因的细胞株的迁移能力下降，提示RMP基因在保持细胞的迁移能力中也有重要作用，其中体外划痕实验的结果与连晓宁等[4]的研究结果一致。
综上所述，笔者认为RMP基因与肝癌的发生、发展有一定联系，并且RMP基因对维持肝癌细胞的稳定性起重要作用，可能是和p21基因协同调控肝癌细胞的细胞周期，还能保持细胞的迁移能力，为肝癌的基因治疗提供了新的研究方向。
[参考文献]
[1] Delgerma L, Hayashi N, Dorjsuren D, et al.Subcellular localization of RPB5-mediating protein and its putative functional partner[J].Mol Cell Biol, 2008, 24(19):8556-8566.
[2] Cramer P, Bushnell DA, Fu J, et al.Architecture of RNA polymeraseⅡ and implic- ations for the transcription mechanism[J].Science, 2007, 288(5466): 640-649.
[3] Cheong JH, Yi M, Lin Y, et al.Human RPB5, a subunit shared by eukaryotic nuclear RNA polyerases，binds human hepatitis B birus X protein and may play a role in X transactivation[J].EMBO J, 2008, 14(1):143-150.
[4] 连晓宁，杨慧翠，曹锴，等.RMP siRNA对SMMC-7721肝癌细胞增殖和迁移能力的影响[J].肿瘤，2010，30（1）：15-20.
人肝癌细胞 篇6
1 材料与方法
1.1 药品和试剂
硒酸酯多糖 (Kappa-Selenocarrageenan, KSC) 由江苏张家港天赐福生物工程有限公司惠赠, 含硒量1.68%。RPMI 1640干粉培养基为美国GIBCO公司产品;胰酶, Amersco公司;胎牛血清, 杭州四季青;噻唑蓝 (MTT) 、Hoechst 33258染料、碘化丙啶 (PI) 染料均为Sigma公司产品;紫杉醇 (Paclitaxel) , 北京四环医药公司, 分子量为853.92, 用生理盐水配成1mmol· L-1 的储存液, 用时以1640培养基稀释至所需浓度;96 孔培养板, Coster 公司产品。
1.2 肿瘤细胞株
人肝癌细胞株HepG-2购自黑龙江省肿瘤研究所, 于RPMI 1640 基础培养液中加入10% 的胎牛血清, 青霉素100U· mL-1, 链霉素100mg·L-1, 置37 ℃、5%CO2 孵箱中培养, 3～4d 传代1 次。
1.3 仪器和设备
CO2培养箱 (美国NBS公司) , 酶标仪 (美国Bio-Rad公司) , 倒置显微镜 (日本OLYMPUS公司) , 荧光显微镜 (德国Leica公司) , 流式细胞仪 (美国BECKMAN-COULTER公司, EPICSXL) , 超净工作台 (北京东联有限公司) , 电子分析天平 (Sartorius) , TDL80-2B低速离心机 (上海安亭科学仪器厂) 。
1.4 细胞活力检测 (MTT 比色法)
取对数生长期HepG-2细胞, 用0.25 %胰蛋白酶消化, 含10 %胎牛血清的RPMI 1640 培养液配成单个细胞悬液, 每孔加样100μL于96 孔培养板中 (终浓度为4 ×104 ·mL-1) 。KSC浓度组分为15、30、60、120 mg·L-1 4 组。每一剂量各设6个复孔, 以未加药物的细胞作为阴性对照组, 阳性组 (紫杉醇, 1nmol·L-1) 。置培养箱 (37 ℃饱湿度, 5 % CO2孵箱) 分别作用24、48、72h, 实验结束前4 h, 每孔加入MTT (5 mg·L-1) 20μL再孵育4 h, 终止培养, 离心 (2 000 r·min-1, 10min) 弃上清, 每孔加入DMSO 150μL, 振荡10 min, 使结晶溶解。选择570 nm 波长, 酶标仪上测定各孔光吸收值 (A) 。
肿瘤细胞抑制率 (%) = (1-试验孔A值 / 对照孔A值) ×100 %
1.5 形态学观察
取对数生长期的HepG-2细胞, 用0.25%胰酶消化后, 以3 ×105·mL-1的密度接种于含消毒盖玻片的6 孔板中, 每孔1mL, 培养24h待细胞贴壁后, 各组分别加入1mL 15、30、60、120 mg· L-1的KSC, 空白组加1mL的1640培养液, 阳性组为1nmol· L-1的紫杉醇。培养至48h后, 吸去培养液, 每孔加入0.5mL的固定液 (甲醇:冰醋酸=3:1) , 4℃固定10min, 弃固定液用PBS洗2遍, 加入800μL 5mg· L-1的Hoechst 33258染色液, 37℃避光孵育30min后, 取出盖玻片, 荧光显微镜下观察凋亡细胞形态。
1.6 细胞周期和凋亡细胞分析测定 (流式细胞仪)
对数生长期的HepG-2细胞接种于6孔板, 待细胞生长至75%融合左右, 空白组加入1640培养基, 实验组加入不同浓度的KSC (15、30、60、120 mg· L-1) , 阳性组加入1nmol· L-1的紫杉醇, 作用24、48、72h 后, 胰酶消化收集细胞, PBS 洗涤后, 加入2mL 70%冷乙醇-20 ℃固定过夜。检测前PBS 冲洗细胞1 次, 调整细胞浓度为106 · mL-1, 加入800μL 含10 mg· L-1 RNase A 的 PI 染色液 (终浓度为50 mg· L-1) , 混匀, 室温避光染色30min, 300 目尼龙网过滤后流式细胞仪检测, 以激发波长488nm 测定, CellQuest 及Motift 软件分析SubG1 峰和细胞周期。
1.7 实验数据处理
应用SPSS11.5 软件对数据进行统计学处理, 结果以undefined表示, 组间比较采用方差检验。
2 结果
2.1 KSC对HepG-2细胞生长的抑制作用
KSC作用于肝癌HepG-2细胞株24、48、72h后, 细胞生长明显受抑制, 与对照组相比差异显著 (P<0.05) 。细胞生长抑制率随药物浓度和作用时间的增加而升高, 其中120 mg· L-1 KSC作用72h最为显著, 其IC50为43.92 mg· L-1 (见表1) 。
注:与对照组比较, *P<0 .05, **P<0 .01。
2.2 KSC对HepG-2细胞形态学的影响
KSC作用于HepG-2细胞48h后, 细胞经Hoechst 33258染色, 荧光显微镜下可见早期和晚期凋亡细胞, 细胞变圆, 细胞核固缩, 随着KSC浓度的增加, 细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状荧光, 细胞的凋亡小体逐渐增多 (图1) 。
A:阴性对照组;B:1nmol· L-1紫杉醇;C:15 mg· L-1 KSC;D:30 mg· L-1 KSC;E:60 mg· L-1 KSC; F:120 mg· L-1 KSC
2.3 KSC对HepG-2细胞周期及凋亡率的影响
流式细胞术结果显示, KSC作用组与对照组比较G1期比例明显减少, S 期比例明显增加, 并且随着药物浓度的增加及作用时间的延长, S 期比例逐渐增大, 表明KSC可使HepG-2细胞受阻于S 期, 并具有剂量和时间依赖性 (见表2、图2) 。另外, KSC还可诱导HepG-2细胞发生凋亡, 24h 时KSC各组均未有凋亡, 48h后30～120 mg· L-1各组均出现凋亡峰, 凋亡率在21.71%～27.56%之间。
3 讨论
硒是人体必需的一种微量元素, 哺乳动物体内的硒主要以硒代半胱氨酸 (Se-Cys) 的形式参与蛋白质组成, 硒代半胱氨酸也因其重要性被称作第21 个氨基酸, 它是一些酶活性部位的基本组成部分。20 世纪70年代含硒谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 的发现为硒的生物化学奠定了基础, 它具有清除氧自由基, 防止细胞损伤, 预防肿瘤产生的作用[7]。实验显示一定浓度的硒化合物可抑制肝癌、胃肠道癌、肺癌、卵巢癌等多种癌细胞生长, 并诱导其凋亡[8]。
A:阴性对照组;B:1nmol· L-1紫杉醇;C:15 mg· L-1 KSC;D:30 mg· L-1 KSC;E:60 mg· L-1 KSC;F:120 mg· L-1 KSC
陆瑞芳[9]报道KSC对人肝癌SMMC-7721细胞具有生长抑制作用, 100mg·L-1 KSC作用第6天细胞生长抑制率为36.86%, 并显著降低细胞培养液中丙二醛 (MDA) 的含量。戴伟娟[10]研究表明4-硒硫酸酯多糖对人肝癌Bel-7402细胞生长的抑制作用, 可能与抑制瘤细胞DNA、RNA 及蛋白质合成有关。
本文结果显示, 15～120mg/L 剂量范围内KSC对人肝癌HepG-2细胞生长有明显的抑制作用, 并具有显著的时效、量效关系。荧光显微镜下, 形态学观察KSC组出现早期和晚期凋亡细胞, 且随作用浓度的提高凋亡小体逐渐增多。流式细胞仪分析显示药物作用48h 才出现凋亡峰。细胞周期分析发现KSC主要减少G1期细胞, 使肿瘤细胞停留在S 期, 表明KSC可阻滞癌细胞S 期向G2 期进程, 阻断DNA 合成, 说明KSC抑制肝癌HepG-2细胞增殖可能与其阻滞细胞周期的有序进行, 以及选择性地抑制生物大分子的合成有关, 从而诱导肝癌细胞的凋亡。
摘要：目的:探索硒酸酯多糖 (KSC) 在体外对人肝癌细胞HepG-2的作用。方法:以KSC为实验药物, 通过MTT法检测细胞活力, 荧光显微镜观察凋亡细胞形态, 流式细胞仪分析凋亡峰及细胞周期等, 研究其对HepG-2细胞的诱导凋亡作用。结果:随着作用时间及药物浓度的增加, KSC对HepG-2细胞生长的抑制作用就越明显。120mg.L-1KSC作用72 h, 细胞生长抑制率达69.31%, IC50为43.92 mg.L-1。形态学观察可见早期和晚期凋亡细胞及凋亡小体, 细胞周期主要受阻于S期。结论:KSC可在体外诱导人肝癌细胞凋亡。
关键词：硒酸酯多糖 (KSC) ,HepG-2细胞,MTT,细胞凋亡
参考文献
[1]林正杰, 王雨.硒酸脂多糖——一种新型的有机硒化合物[C]∥微量元素分析与应用.武汉:同济医科大学出版社, 1993:34-36.
[2]刘珊林, 施冬云, 潘喜华, 等.硒对肝癌细胞凋亡作用的研究[J].生物物理学报, 1998, 14 (3) :553-557.
[3]戴娟, 索金良, 林志彬.4-硒硫酸酯多糖的体内抗瘤作用[J].济宁医学院学报, 2000, 23 (3) :15-17.
[4]何更生, 程棕, 陆瑞芳, 等.硒酸酯多糖对人乳腺癌细胞株 (BcaP237) 生物学作用的研究[J].中华预防医学杂志, 1997, 31 (2) :105-105.
[5]魏虎来.硒酸酯多糖和亚硒酸钠抗白血病效应的实验研究[J].兰州大学学报:自然科学版, 1996, 32 (2) :122-125.
[6]吴兴, 陈峥嵘, 陈中伟.硒酸酯多糖诱导人骨肉瘤细胞凋亡作用的体外实验[J].肿瘤防治杂志, 2004, 11 (9) :927-930.
[7]BROWN K M, ARTHUR J R.Selenium, selenoproteins and hu-man health:a review[J].Public Health Nutr, 2001, 4 (2B) :593-599.
[8]MCCARTY M F.Selenium, Calcium channel blockers, and canc-er risk-the Yin and Yang of apoptosis[J].Med Hypotheses, 1998, 50 (5) :423-433.
[9]陆瑞芳, 潘喜华.硒酸酯多糖对人肝癌SMMC-7721细胞的生物学作用[C]∥中国营养学会第六届微量元素营养学术会议论文摘要汇编.1999.
人肝癌细胞 篇7
过氧化物酶(peroxiredoxin,Prx)是具有过氧化物酶活性的巯基特异性抗氧化蛋白[2]。Prx 6个家族成员中,Prx1在包括肺癌在内的多种人类肿瘤中表达异常增加[3,4]。本研究主要分析正常肝细胞和肝癌前病变细胞中过氧化物酶1(peroxiredoxin 1,Prx 1)的表达情况,探讨Prx1通过表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)/Akt信号通路肝癌前病变细胞生长增殖情况。此外,本课题还在肝癌移植瘤模型中证实了Prx 1对肿瘤生长和恶性转化的影响。本研究结果表明肝癌前病变细胞中Prx 1表达增加,Prx 1能够促进肝癌前病变细胞中表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)表达,并激活EGFR/Akt信号通路,移植Prx 1表达能够抑制肝癌移植瘤模型中肿瘤生长和转移。
1 材料与方法
1.1 细胞培养和EGF处理
在含10%(v/v)小牛血清、100 u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中培养人正常肝细胞株L02和CCL13细胞。所有细胞在37℃下含5%二氧化碳CO2和95%空气的培养箱中培养。细胞血清饥饿24 h后,用含10 ng/ml EGF的无血清培养基继续培养10 min。立即收获细胞并对其进行冷冻以用于后续实验。
1.2 活性氧(reactive oxygen species,ROS)形成检测
使用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(2’,7’-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)荧光染料分析细胞提取物中ROS形成速率。DCFH-DA通过与ROS反应氧化为二氯荧光素(fluorescent dichlorofluorescein,DCF)。从485 nm激发波长和530 nm发射波长上的荧光增加斜率计算ROS形成速率,使用标准DCF校正。
1.3 肝组织活检
肝组织活检钳,检查肝癌患者血常规、肝功能、凝血酶原时间和活动度、B超、心电图,对患者进行屏气动作训练。B超术前定位,取右腋中线第8~9肋间或腋前线第9~10肋间隙为穿刺点,于患者深呼气末屏气时采用16号活检枪,1 s负压吸取肝组织,标本放入10%甲醛中固定、石蜡包埋,常规做苏木精一伊红(HE)染色、Masson及网状纤维染色,视临床病情需要加做免疫组织化学及特殊染色。术后予束腹带包扎4 h,卧床休息8 h,监测血压、脉搏,1周内避免剧烈活动。
1.4 肝细胞原代培养
肝组织活检取下标本后,立即置入含青霉素(100 u/ml),链霉素(100μg/ml)的无血清DMEM培养基内,并于1 h内处理。组织块置于培养皿中,加入DMEM液,用眼科剪将不需要的血块和组织(坏死组织或结缔组织等)除去,再用DMEM液漂洗两次后剪成约1mm3大小,加入1g/L胶原酶Ⅵ消化液37℃消化30 min,细胞悬液纱布过滤,1 000 r/min 5 min离心2次,弃上清;800 r/min 4 min离心2次,弃上清,每次以DMEM液重悬沉淀。细胞沉淀重悬于含100 ml/L FBS的DMEM中,测细胞活力,以>1×109个/L的浓度接种于25 ml培养瓶,50 ml/L二氧化碳CO2培养箱37℃孵育。24 h后换液,去除未贴壁细胞,加入DMEM液(含10 mg/L胰岛素,1 mmol/L谷氨酰胺,100 u/ml青霉素,100μg/ml链霉素,100 ml/L FBS)。37℃50 ml/L二氧化碳CO2培养箱内静置培养。每两天半换液,每天倒置显微镜观察,成纤维细胞通过反复贴壁分离法、机械刮除法去除,得到纯化的表皮样生长细胞,每3天传代1次。
1.5 Prx 1短发卡RNA表达载体的构建
本研究构建了表达短发卡RNA(sh RNA)的含人类u6启动子的自失活逆转录酶病毒表达载体。Bam HⅡ/HindⅢ双酶切MSCV表达质粒和p M-SCV-EGFP-Neo载体,双酶切获得片段链接重组,将识别Prx 1或错义序列的短发卡RNA重组至p M-SCV-EGFP-Neo载体。Prx 1 sh RNA能够识别人类Prx 1 c DNA(NM002574)的474-492碱基对。寡核苷酸对的序列为:5'-GATCCGTTCTCACTTCTGTATCT ATTCAAGAGATAGATGACAGAAGTGAGAATTTTT TGGAAA-3'和5'-AGCTTTTCCAAAAAATTCTCACT TCTGTCATCTATCTCTTGAATAGATGACAGAATGA GAAC-3'。错义序列为:5'-GATCCCGTTCTCCGAAC GGTGCACGTTTCAAGAGAACGTGCACCGTTCGGA GAATTTTTTGGAAA-3'和5'-AGCTTTTCCAAAAAA TTCTCCGAACGGTGCACGTTCTCTTGAAACGTGCA CCGTTCGGAGAACGG-3'。采用ABI 3700毛细管测序仪(Applied Biosystems)确认序列准确性。
1.6 构建稳定表达细胞株
使用Lipofectamine 2000试剂将Prx 1或错义sh RNA表达载体转染至Phoenix包装细胞。48 h后,收集上清液,0.45μm滤膜过滤,并于-80℃冰箱保存。将过滤后的Prx 1或错义sh RNA病毒上清液与4μg/ml凝聚胺(脂质体转染增强剂)分别共同感染Hep G2细胞。连续2 d每8 h将新鲜的病毒上清液加入到细胞中。含有2μg/ml嘌呤霉素的生长培养基中培养10 d,选取感染成功细胞用于后续实验。
1.7 蛋白质印迹分析(Western blot)
弃去培养皿中DMEM培养基,用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)轻柔洗涤去除杂质,按每皿50 L加入含2%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)的蛋白裂解液,冰上裂解5 min,收集裂解产物超声破碎10 min后4℃12 000 rpm离心30 min。收集上清蛋白液,采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法对蛋白含量定量后备用。定量过的样品按每泳道30 g蛋白含量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,结束后用湿转法将蛋白转至硝酸纤维素膜上,5%脱脂奶粉室温下封闭1 h,加入一抗(兔抗小鼠Prx 1,1∶2000;β-actin,l∶1 000;兔抗小鼠p-Akt,1∶500),4℃过夜。山羊抗兔二抗(1∶20 000)室温下1 h,化学法发光,压片后分析结果。最后用SPSS 18.0图像分析系统测定各条带灰度值。
1.8 体内成瘤实验及肝转移瘤确定
将培养至对数生长期的各组细胞用0.25%的胰酶消化,并将细胞浓度调整为106/ml,将500μl细胞悬液注射至非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠背部皮下。8周后引颈处死,分离肿瘤组织,并测量肿瘤组织体积,肿瘤组织制作成冷冻切片用于免疫荧光分析。使用游标卡尺每周2次测量分析肿瘤生长情况,肿瘤体积由公式(长度×宽度2)/2估算。
注射肿瘤细胞后8周后将小鼠处死。将每只小鼠的肝脏从周围组织中剖离,之后将肝脏横切。通过气管注射墨汁直至肝脏染黑。随后将肝脏切开,随后将标本放置在Fekete溶液中24 h漂白肝脏表明肿瘤结节。对比染色形成白色肝脏转移瘤和黑色正常肝脏组织之间的明确区分。
1.9 统计学方法
采用SPSS19.0统计学软件包进行数据处理,计量资料以均数±标准差形式(±s)表示,进行描述性统计分析、样本的正态性检验、方差齐性检验、单因素方差分析(one-way ANOVA)及LSD-t检验(多个样本均数间两两比较采用)。除方差齐性检验时取P<0.10认为检验结果有统计学意义外,所有统计学分析均取P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 异常肝细胞中Prx 1和p Akt上调
本实验通过获取配对肝细胞,并检测配对肝细胞中Prx 1蛋白表达差异情况,探讨癌前肝细胞中Prx 1的表达情况。原代肝细胞从肝癌组织、近癌肝组织和远癌肝组织中分离培养。与正常肝细胞比较,异常(癌前病变,源自近癌肝组织)肝细胞Prx 1表达上调(见表1、图1)。正常细胞到异常细胞的表型转化与Akt等细胞内信号分子变化有关,采用Pearson直线相关分析p Akt水平与Prx 1蛋白表达水平之间的关系,用相关系数r表示,结果显示:Akt水平与Prx 1蛋白表达水平呈正相关(r=0.863,P<0.01),提示p Akt水平上升与Prx 1蛋白表达水平紧密相关。
提取远癌肝组织(正常肝组织)和近癌肝组织(恶性转化肝组织)蛋白,Western blot检测Prx 1、p Akt、Akt及β-actin在两组肝组织中的表达差异。
N1-4:远癌肝组织;A1-4:近癌肝组织
2.2 Prx 1增强EGF介导的EGFR与Akt激活
与空白对照组肝细胞株L02比较,癌前病变肝细胞(CCL13)中Prx 1蛋白表达明显上升,差异有统计学意义(t=5.738,P=0.037)。基线状态时,L02或CCL13细胞中均未检测到Akt激活(见图2A)。与Prx 1低水平表达的L02细胞比较,Prx 1表达较高的CCL13细胞中EGF介导的Akt激活明显增加,差异有统计学意义(t=8.412,P=0.001)(见图2B)。5种关键性EGFR磷酸化残基中,只有酪氨酸1173残基对EGF处理有反应;这种残基被称为导致Akt激活的磷酸化位点,结果提示原代肝细胞中,Prx 1水平较高增加了Akt信号,Prx 1可能与EGF介导的信号通路有关。
2.3 Prx 1表达敲除对肿瘤生长和体内新陈代谢的影响
Western blot检测表明,转染稳定表达靶向Prx 1的短发卡RNA(sh Prx-1)Hep G2细胞中Prx 1表达明显受到抑制,与对照组比较,差异有统计学意义(t=12.341,P=0.000)(见图3A),证实sh Prx 1转染成功,但是转染sh Prx 1对Hep G2细胞内ROS产生无影响,与对照组比较,差异无统计学意义(t=0.124,P=0.892)(见图3B)。Prx 1表达敲除后显著地抑制了肿瘤生长,第24天开始,sh Prx 1组肿瘤体积均明显比无义sh RNA转染组小(均P<0.05)(见图4)。第56天时,在SCID鼠体中皮下注射每种细胞3×106个,并检查肝转移瘤确定远端转移特性。如图5所示,敲除Prx 1降低了Hep G2移植瘤中肝转移瘤的发病率,sh Prx 1组肝转移瘤数量明显少于无义sh RNA转染组(t=6.132,P=0.035)。
A:L02和CCL13肝细胞血清饥饿培养24 h后,10 ng/ml EGF处理10 min,提取细胞总蛋白,Western blot检测Prx 1和p Akt的表达情况。B:Western blot检测总EGFR和各EGFR磷酸化形式的表达
此外,磷酸化Akt程度与Prx 1蛋白表达水平密切相关,Pearson直线相关分析血清磷酸化Akt程度与Prx 1蛋白表达水平呈正相关(r=0.954,P<0.01)(见图6)。肿瘤中Prx 1表达敲除后的作用持续至首次注射肝癌细胞56d后,Prx 1表达敲除肝肿瘤p Akt表达水平较低,该结果表明,Prx 1在调节人类肝癌Akt激活中起主要作用。
A:Western blot检测3种细胞株中Prx 1的表达情况;1:对照组Hep G2细胞;2:转染无义sh RNA组Hep G2细胞;3:转染Prx 1sh RNA组Hep G2细胞。B:Prx 1表达对Hep G2细胞荧光素酶的影响;1:转染无义sh RNA组Hep G2细胞;2:转染Prx 1 sh RNA组Hep G2细胞
3 讨论
本文实验结果发现癌前病变肝细胞中Prx 1表达水平明显高于正常肝细胞,在恶性肝癌组织中Prx 1表达水平也显著升高。进一步研究发现,正常细胞向异常细胞转化过程中的Prx 1表达升高与Akt激活增加有关。采用sh RNA抑制肝癌细胞中Prx 1表达后,肝癌细胞移植瘤模型中肿瘤生长和转移明显受到抑制,提示Prx 1可能与肿瘤进展和侵袭有关,而Akt激活降低与肿瘤发生减少显著相关。
以往研究认为Prx 1能够增强细胞生存能力,是因为Prx1具有抗氧化剂作用[5]。Prx1在N端(Cys52)含有具有催化作用的半胱氨酸,该半胱氨酸能够通过巯基氧化(Cys52-SOH,次磺酸)降低细胞内ROS水平。Cys52-SOH在C-端,Cys173能够通过保守解离的半胱氨酸形成一种分子间的双硫键,该双硫键通过硫氧还蛋白(Trx)/硫氧化还原蛋白还原酶(TR)等体系的电子供体还原为活性巯基形式,Cys52-SH[6,7]。体内外研究均表明抑制Prx 1表达能够增强肠癌肺癌放射治疗敏感行。这些研究均证实以下这一观点:Prx 1是抗氧化蛋白,因为抑制Prx 1表达引起放射敏感性增强是由于ROS产量升高。尽管以往体内外研究都发现抑制Prx 1表达能够显著增强POS产生,但是本研究中Prx 1表达下调肝癌细胞中ROS并未显著增加,本研究结果与Kim等[8]研究结果一致,Kim等发现放疗后,Prx 1过表达在抑制了c-Jun N-端激酶激活(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和凋亡性细胞死亡。然而,Prx 1的抗氧化活性功能对于该过程并不是必需的,因为野生型Prx 1和缺少抗氧化活性的突变Prx 1(Prx-1C52S)都能通过与GSTpi-JNK复合物结合高效阻断JNK激活和细胞凋亡。
本研究结果还表明Prx 1具有调控人肝细胞中EGFR介导信号通路的潜在作用。Prx 1高表达细胞中配体诱导EGFR Tyr1173残基磷酸化增强,从而导致Akt激活。Prx 1增强EGFR信号功能的分子机制仍需进一步研究。近期研究表明,Prx 1具有分子伴侣的功能,且这一功能不依赖于Prx 1的过氧化物酶活性[9]。作为伴侣蛋白,Prx 1改变了各种细胞蛋白的功能和活性,包括c-Abl酪氨酸激酶、巨噬细胞移动抑制因子、c-Myc致癌基因、雄激素受体等。Prx 1具有多种生理功能的重要原因就是Prx 1能够与生长调节蛋白相互作用。近期蛋白质组学分析提示Prx 1能够与细胞内信号转导蛋白Ezrin相互作用。Ezrin是一种磷蛋白,能够增强生长因子诱导磷酸化,并将PI3K/Akt等信号通过蛋白间直接相互作用转导至下游。Ezrin是论证Prx 1增强EGFR-Akt生存信号通路功能的理想靶点。
本文研究结果进一步揭示Prx 1能够通过EGFR-Akt信号通路介导细胞正常至异常转化、肿瘤形成、转移,提示Prx 1可能是肝癌早期检测重要靶点。目前有许多研究致力于基于靶点策略进行肿瘤早期检测,但是这些靶点都专注于个别靶分子。随着Prx 1研究的深入,与Prx 1相互作用的靶分子/效应分子的范围可能进一步扩展。尽管这些相互作用的功能结果需要以细胞类型和组织环境限制模式进行检测和阐述,但抑制Prx 1表达能够同时作用多个靶点蛋白干预肝细胞癌形成。
摘要：目的 探讨过氧化物酶1(Prx 1)在肝癌形成和恶性进展中的作用。方法 蛋白质印迹法(Western blot)检测远癌肝组织和近癌肝组织中Prx 1、p Akt及Akt表达差异。肝细胞饥饿培养24 h后,10 ng/ml表皮生长因子(EGF)处理10 min,提取总蛋白,Western blot检测Prx 1、p Akt、不同位点磷酸化表皮生长因子受体(EGFR)和总EGFR。Western blot检测检测未处理组、转染无义sh RNA组及转染Prx 1 sh RNA组Hep G2细胞中Prx 1蛋白的表达。DCFH-DA法检测3种Hep G2细胞中活性氧簇总量。转染无义sh RNA组及转染Prx 1sh RNA组Hep G2细胞皮下注射至SCID小鼠,注射后每周测量1次皮下肿瘤体积。Western blot检测两组小鼠皮下肿瘤组织中Prx 1和p Akt的表达情况。结果 与正常肝细胞比较,Prx 1在肝转化细胞中表达升高。Prx1增强了EGF介导的EGFR和Akt激活。Prx 1表达沉默抑制了Hep G2体内成瘤能力。减少Hep G2皮下移植瘤的肝转移。Prx 1表达沉默还抑制了Akt体内激活。结论 Prx 1具有调控人肝细胞中EGFR介导信号通路的潜在作用。Prx 1能够通过EGFR-Akt信号通路介导细胞正常至异常转化、肿瘤形成及转移
关键词：过氧化物酶1,肝癌,移植瘤
参考文献
[1]陈建国,陈万青,张思维.中国2003-2007年肝癌发病率与死亡率分析[J].中华流行病学杂志,2012,33(6):547-553.
[2]Jeong W,Bae SH,Toledano MB,et al.Role of sulfiredoxin as regulator of peroxiredoxin function and regulation of its expression[J].Free Radical Biology and Medicine,2012,53(3):447-456.
[3]段婷,姚兵.过氧化物还原酶蛋白家族与疾病[J].医学研究生学报,2015,28(1):98-101.
[4]Martinez-Pinna R,Ramos-Mozo P,Madrigal-Matute J,et al.I-dentification of peroxiredoxin-1 as a novel biomarker of abdominal aortic aneurysm[J].Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology,2011,31(4):935-943.
[5]Cao J,Schulte J,Knight A,et al.Prdx1 inhibits tumorigenesis via regulating PTEN/AKT activity[J].EMBO J,2009,28(10):1505-1517.
[6]Shen J,Person MD,Zhu J,et al.Protein expression profiles in pancreatic adenocarcinoma compared with normal pancreatic tissue and tissue affected by pancreatitis as detected by twodimensional gel electrophoresis and mass spectrometry[J].Cancer Res,2004,64(24):9018-9026.
[7]Sobin LH,Compton CC.TNM seventh edition:what’s new,what’schanged:communication from the international union against cancer and the american joint committee on cancer[J].Cancer,2010,116(22):5336-5339.
[8]Kim YJ,Lee WS,Ip C,et al.Prx-1 suppresses radiation-induced c-Jun NH2-terminal kinase signaling in lung cancer cells through interaction with the glutathione STransferase Pi/c-Jun NH2-terminal kinase complex[J].Cancer Res,2006,66(11):7136-7142.
人肝癌细胞 篇8
1. 材料与方法
1.1 材料
HepG2细胞株 (滨州医学院干细胞与组织工程研究所提供) ;RPMI1640培养基、小牛血清、MTT (购自Gibco公司) ;大蒜素 (购自上海禾丰制药有限公司) ;二氧化碳培养箱 (德国Heraeus公司产品) 、倒置相差显微镜 (日本Olympus公司产品) 、Multiskana scent酶标仪 (芬兰Labsystems公司产品) 。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
HepG2细胞复苏后, 用含10%小牛血清的RPMI1640培养液, 于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下静置培养。传代3次后取生长活跃细胞进行分组实验。
1.2.2 实验分组
实验分正常对照组 (C组) 、大蒜素5μg/ml组 (A1组) 、大蒜素10μg/ml组 (A2组) 、大蒜素20μg/ml组 (A3组) 、大蒜素50μg/ml组 (A4组) 和大蒜素100μg/ml组 (A5组) 共六组。
1.2.3 形态学观察
实验组加入用RPMI1640配制的大蒜素溶液, 作用24h后, 与正常对照组一起在倒置相差显微镜下观察HepG2细胞的形态学改变, 并拍照记录。
1.2.4 MTT法检测细胞生长增殖情况
细胞进入对数生长期后, 胰蛋白酶消化细胞, 制成单细胞悬液, 以每孔5×103个细胞接种于96孔培养板, 每孔100�l, 正常对照组不做处理, 实验组分别加入不同浓度的大蒜素, 每组设定6个复孔, 放入37℃、5%CO2培养箱中, 孵育20h后每孔加新鲜配制的MTT溶液20�l (5mg/mL) , 于培养箱中继续孵育4h后, 吸弃孔中培养液, 每孔加入150�l DMSO (二甲基亚砜) , 振荡5min, 使结晶充分溶解, 置酶标仪测定各孔光密度 (optical density, OD) 值 (测试波长570nm) 。
1.3 统计学处理
结果均以均数±标准差 (±s) 表示, 采用SPSS13.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析, 组间比较采用LSD检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 大蒜素对HepG2细胞形态学的影响
相差显微镜下可见, 正常HepG2细胞呈梭形或不规则多边形, 呈“铺路石”样排列, 细胞间连接紧密, 胞体饱满, 核圆形或不规则, 核质比例大, 核仁明显, 折光性强 (图1A) ;20μg/ml的大蒜素作用24后, HepG2细胞失去原有“铺路石”样排列, 细胞间连接减少或消失, 细胞间隙增大, 有些细胞胞体皱缩、变圆, 细胞粘附性下降, 出现凋亡小体, 有典型的细胞凋亡的特征 (图1B) 。
2.2 大蒜素对HepG2细胞生长增殖的影响
MTT比色法检测结果发现, 不同浓度大蒜素作用下检测到的HepG2细胞光密度值 (OD值) 均比正常对照组小, 细胞生长受到抑制, 并且随着大蒜素浓度的增加, OD值逐渐减小, 呈剂量依赖性, 见表1。
3. 讨论
大蒜素 (allicin) 是以大蒜鳞茎为原料提取的生物活性成分的总称, 它是多种烯丙基有机硫化物复合体, 对许多真菌和细菌有很强的杀灭作用。近来研究表明, 大蒜素具有抗肿瘤作用, 对多种恶性肿瘤有明显抑制作用[3～4]。大蒜素潜在的最大优点在于几乎无副作用, 能提高机体的免疫力, 既能单独使用, 也可以和放疗、化疗等现有的治疗方法结合使用, 有望成为一种新的肿瘤治疗药物[5]。
肿瘤的发生是一个复杂、多步骤过程, 一般认为肿瘤都具有细胞异常增殖、分化和凋亡减弱等特性, 因而要抑制肿瘤细胞的生长, 一方面可以通过影响细胞周期, 使其不能进行正常的有丝分裂;另一方面可以促进细胞凋亡, 以达到治疗目的。肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一, 其手术切除率低, 易复发和转移, 预后差, 目前尚无有效的药物治疗, 严重威胁人类的健康, 因此, 寻找新的有效的药物, 对肝癌的治疗具有重要的意义。
本研究以体外培养的人肝癌HepG2细胞为实验对象, 利用形态学观察、MTT实验, 初步研究了大蒜素对人肝癌HepG2细胞的生长的影响。形态学观察显示, 在大蒜素作用下HepG2细胞形态发生变化, 失去原有“铺路石”样形态, 细胞间连接减少甚至消失, 细胞胞质皱缩、黏附性下降、出现凋亡小体, 说明大蒜素作用后HepG2细胞活力降低, 有典型的细胞凋亡的特征, 能够显著抑制肿瘤细胞的生长。
MTT比色法检测显示, 实验组细胞OD值均比对照组低, 并且随着大蒜素浓度的升高, OD值逐渐降低, 说明不同浓度的大蒜素对HepG2细胞的生长增殖均有抑制作用, 且随着药物剂量的升高, 对细胞生长增殖的抑制作用越明显, 具有剂量依赖性。体外实验结果表明大蒜素对人肝癌HepG2细胞的生长增殖起一定的抑制作用, 然而, 大蒜素在HepG2细胞生长增殖过程中的具体作用机制目前尚不清楚, 有待进一步研究。
综上所述, 大蒜素对人肝癌HepG2细胞的生长起一定的抑制作用, 说明大蒜素对人肝癌具有潜在治疗作用, 从而为肝癌的治疗提供新思路。
摘要：目的:研究大蒜素对人肝癌HepG2细胞生长的抑制作用。方法:体外培养人肝癌HepG2细胞, 形态学观察大蒜素作用下HepG2细胞的生长变化, 四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 比色法检测实验各组HepG2细胞的生长增殖情况。结果:形态学观察显示, 在大蒜素作用下, HepG2细胞失去原有“铺路石”样排列, 细胞间连接减少或消失, 细胞黏附性下降, 出现细胞凋亡特征;MTT比色法检测发现, 不同浓度的大蒜素均能抑制肝癌细胞的生长 (P<0.05) , 且呈剂量依赖性。结论:大蒜素对人肝癌HepG2细胞的生长起一定的抑制作用。
关键词：大蒜素,HepG2细胞,生长
参考文献
[1]林青, 乔竟原.大蒜素的药理与临床应用[J].首都医药, 2004 (6) :38～39.
[2]吕艳欣, 李威, 严云勤.大蒜素诱导肿瘤细胞凋亡的作用[J].现代肿瘤医学, 2006, 14 (1) :117～118.
[3]Oommen S, Anto RJ, Srinivas G, et al.Allicin (from garlic) induces caspase-mediated apoptosis incancer cells[J].Eur J Pharmacol, 2004, 485 (1-3) :97～103.
[4]张钧书, 崔健, 丁丽君, 等.紫杉醇联合大蒜素对胃癌细胞的增殖抑制及促凋亡作用[J].中国普通外科杂志, 2007, 16 (4) :341～345.
人肝癌细胞 篇9
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株
人肝癌细胞株来自上海肿瘤研究所。
1.1.2 药物和试剂
β-榄香烯为大连金港制药集团有限责任公司产品。RPMI 1640及新鲜小牛血清由西安保泰克生物技术有限公司提供。用含10%小牛血清RPMI 1640培养液配制成浓度分别为1、10、100和1 000 nmol/L的溶液, -20℃冰箱保存备用。细胞在含10%小牛血清RPMI 1640培养液中, 37℃体积分数为5%的CO2条件下培养。每3～4 d按1 ∶ 4～1 ∶ 5传代。Giemsa染色剂按文献[6]配制, 4℃冰箱保存备用。流式细胞仪分析试剂盒[DNA anal-yse kit, KINESISR50]由BIO-RAD公司提供。
1.1.3 实验仪器
FACSCalibur流式细胞仪 (美国BD公司产品) , 6 MeV直线加速器 (美国瓦里安2300CD型, PRIMUS, X线, 6 MeV, 剂量率400 cGy/min) 。CO2细胞培养箱 (美国Nuair公司产品) 。
1.1.4 分析软件
ModFit LT for Mac V2.0。
1.2 方法
1.2.1 β-榄香烯放射增敏试验
指数生长期贴壁细胞 (5×106) 个, 加入含不同浓度 (1, 10, 100, 1000 nmol) 紫杉醇的培养液培养, 对照组仅用培养液培养。分别于给药后2, 6, 12, 24 h, 弃含药物的培养液, PBS洗涤3次, 更换新的不含药物的培养液, 立275即用直线加速器分别照射2, 4, 6, 8, 10 Gy, 照射后单细胞悬液制备、细胞定量接种培养、染色及克隆计数同上, 实验重复3次, 取均值。
1.2.2 放射增敏率的计算
用β-榄香烯组细胞存活分数校正β-榄香烯联合放射组细胞存活分数, 校正后的细胞存活分数=β-榄香烯联合放射组细胞存活分数/β-榄香烯组细胞存活分数。绘制单独放射及校正后不同药物浓度-时间条件下的β-榄香烯联合放射组剂量-存活率曲线。按拟合多靶单击公式S=1-1 (1-eD/D0) N推算出ACC-2单独放射及不同时间-浓度条件下β-榄香烯联合放射的D0, 算出不同时间-浓度条件β-榄香烯联合放射的辐射增敏率 (SER) 。SER=单独放射组D0/β-榄香烯联合放射组D0。SER>1表示β-榄香烯对ACC-2细胞有辐射增敏作用。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期
对照组及药物组弃培养液, PBS洗涤3次, 0.25%胰蛋白酶消化, 制备单细胞悬液, 2 000 r/min离心10 min, 弃上清液, 预冷的70%乙醇固定, 4℃保存过夜。1 500 r/min离心10 min, 弃上清, PBS洗涤3次, 制成单细胞悬液500 μl, 加入流式细胞仪分析试剂盒 (DNA anal-yse kit) , 避光室温孵育30 min, 上机检测细胞周期分布百分率和凋亡细胞百分率, 每份标本检测10 000个细胞。分析软件分析成图, 实验重复2次。
2 结果
2.1 β-榄香烯对人肝癌细胞的放射增敏作用
不同时间-浓度条件下药物+放射组的细胞存活分数较放射组均有不同程度下降。药物组细胞存活分数校正后, 10 nmol/L, 24 h;100 nmol/L, 24 h;1000 nmol/L, 24 h时间-浓度条件下的SER>1, 提示上述条件下β-榄香烯对人肝癌细胞有放射增敏作用。其中100 nmol/L β-榄香烯作用24 h对人肝癌细胞的放射增敏作用最大, SER为1.71 (见表1) 。
2.2 不同时间-浓度条件下β-榄香烯对人肝癌细胞细胞周期的影响
随时间和β-榄香烯浓度增加, 人肝癌细胞的G2/M期细胞分布百分率相应地逐渐上升, 在100 nmol/L, 24 h达到高峰, G2/M期细胞百分率约为54.13%。而>6 h, 在相同作用时间下, 随浓度升高到1000 nmol/L, G2/M期细胞分布百分率又逐渐下降 (见表2) 。
2.3 不同时间-浓度条件对β-榄香烯诱导人肝癌细胞凋亡作用的影响
大部分时间-浓度条件下β-榄香烯并无诱导细胞凋亡, 仅10 nmol/L, 12, 24 h;100 nmol/L, 12, 24 h;1000 nmol, 24 h等5个时间-浓度条件下β-榄香烯诱导人肝癌细胞细胞凋亡。其中, 诱导细胞凋亡百分率的最高峰出现在10 nmol, 24 h水平, , 细胞凋亡百分率约20.71%。此后, 随时间减少以及浓度升高而逐渐递减 (见表3) 。
3 讨论
β-榄香烯能对细胞产生强大的G2/M期阻滞作用。而G2/M期被证明是细胞周期中对放射最为敏感的时相[1]。Lang首先提出并证明β-榄香烯具有放射增敏作用且G2/M期阻滞作用是其放射增敏的主要机制。研究表明β-榄香烯的放射增敏作用与其G2/M期阻滞作用密不可分[5,7]。β-榄香烯联合>3 Gy剂量放射能诱导大量细胞凋亡, 显示β-榄香烯放射增敏可能与β-榄香烯诱导细胞凋亡有关[8]。
本研究将β-榄香烯放射增敏实验结果与各时间-浓度条件下人肝癌细胞的G2/M期分布百分率相对比, 发现发生放射增敏效应的两个时间-浓度组100 nmol/L, 24 h和1000 nmol/L, 24 h的G2/M期细胞分布百分率与其他时间-浓度条件相比有非常明显的升高 (P<0.01) , 存在明显的G2/M期阻滞现象。G2/M期阻滞较显著的100 nmol, 24 h组的放射增敏率也高于G2/M阻滞较弱的1000 nmol/L, 24 h组, 表明β-榄香烯的G2/M期阻滞作用与其对人肝癌细胞放射增敏作用相关。检测结果显示, 随着β-榄香烯作用时间的延长, 人肝癌细胞G2/M期分布百分率逐渐上升, 呈时间依赖性效应。而在相同时间条件下, 随浓度增大, G2/M期细胞百分率渐大, 在100 nmol/L时达到最高。当浓度增加到1000 nmol/L, G2/M期细胞百分率又出现下降, 二者之间差异有统计学意义 (P<0.05) 。后者, 在其他文献中也见到类似报道[9]。研究者认为产生这一现象可能是过高浓度的β-榄香烯可阻滞细胞于G1/S期或直接导致部分G2/M期细胞死亡[10]。研究显示1000 nmol/L组的S期分布百分率均高于100 nmol/L, 且二者之间差异有统计学意义 (P<0.05) 。
β-榄香烯能够诱导细胞凋亡的早有报道[5]。Olive对0.01μg/ml浓度β-榄香烯作用24 h后里淋巴母细胞的细胞周期进行分析时发现, 较低浓度β-榄香烯作用较短时间即可以诱导细胞凋亡, 放射增敏率较高的条件下, 亚G1期比例也出现明显升高, 表明β-榄香烯放射增敏作用与非G2/M期依赖的细胞凋亡有关[10]。本研究细胞凋亡百分率检测结果显示, 诱导细胞凋亡百分率的最高峰出现在10 nmol/L, 24 h水平。但随时间减少以及浓度升高而逐渐递减。具有放射增敏效应的条件下均有不同比率的细胞凋亡产生。而细胞凋亡比率最高的10 nmol/L, 24 h组, G2/M期细胞百分率却较低, 而放射增敏效应较高 (SER=1.29) 。本研究显示, β-榄香烯放射增敏效应与β-榄香烯G2/M期阻滞作用及诱导细胞凋亡作用相关, 提示β-榄香烯对人肝癌细胞放射增敏作用并非单一机制的现象, β-榄香烯的G2/M期阻滞作用和诱导细胞凋亡作用均可起重要的作用。有关作用的机制, 有待今后进一步探讨。
摘要：目的通过体外实验探讨β-榄香烯对人肝癌细胞株的放射增敏作用机制。方法用克隆形成法检测不同时间-浓度条件β-榄香烯和/或放射作用后的人肝癌细胞株存活分数, 计算放射增敏率 (SER) 。用流式细胞仪分析不同时间-浓度条件下β-榄香烯对细胞周期和细胞凋亡的影响。结果10、100、1000nmol/Lβ-榄香烯作用24h后SER分别为1.32, 1.71和1.36。β-榄香烯作用时间和浓度越高, 人肝癌细胞G2/M期的比率也越高。100、1000nmol/Lβ-榄香烯作用24h后, G2/M期比率明显升高。10nmolβ-榄香烯作用24h细胞凋亡百分率20.71%。结论β-榄香烯对人肝癌细胞有放射增敏作用, 其作用机制可能与对诱导肝癌细胞凋亡和β-榄香烯对细胞的G2/M期阻滞有关。
关键词：肝癌细胞,β-榄香烯,放射增敏
参考文献
[1]TishlerRB, SchiffPB, Geard CR, etal.Taxol:a novel radiationsen-sitizer.Int J Radiat Oncol Biol Phys, 1992, 22 (4) :613-617.
[2]Posmidis P, Mylonakis N.Paclitaxel and carboplatin in inopere-a-ble nonsmall cell lung carcinoma.Semin Oncol, 1996, 23 (6Supple16) :7-10.
[3]Machtay M, Aviles V, Kligerman MM, et al.A phase I trial of96-hour paclitaxel infusion plus accelerated radiotherapy for unre-sect-able head and neck cancer.IntJRadiat Oncol Biol Phys, 1999, 44 (2) :311-315.
[4]Jordan MA, Wendell K, Gardiner S, et al.Mitotic block inducedin HeLa cells by lowconcentration of paclitaxel (Taxol) results inab-normal mitotic exit and apoptotic cell death.Cancer Res, 1996, 56 (2) :816-825.
[5]Lang FF, YungWK, Raju U, etal.Enhancementofradiosensitivi-ty of wildtype p53human glioma cells by adenovirus-mediated de-livery of the p53gene.J Neurosurg, 1998, 89 (1) :125-132.
[6]Milas L, Hunter NR, Mason KA, et al.Role of reoxygenation inin-duction of enhancement of tumor radioresponse by paclitaxel.Canc-er Res, 1995, 55:3564-3568.
[7]鄂征.组织培养和分子细胞学技术.北京出版社, 1997:140.
[8]Steren A, Sevin BU, Perras J, etal.Taxol sensitizes human ovari-an cancer cells to radiation.Gynecol Oncol, 1993, 48 (2) :252-258.
[9]邹丽娟, 刘伟先, 于丽敏, 等.β-榄香烯诱导K562白血病细胞凋亡.中华肿瘤杂志, 2001, 23 (3) :196-198.
人肝癌细胞 篇10
关键词：华蟾素注射液,肝癌,CDK2,CyclinA,细胞周期
肝癌的药物治疗处于滞后状态,目前化疗药物对肝癌的有效率均<20%[1],靶向药物对于肝癌的治疗还处于研究阶段。寻找、研究有效的抗肝癌药物一直是肝癌治疗的热点问题。华蟾素注射液(Cinobutacini injection,CINO)为祖国医学传统抗肿瘤药物蟾蜍的水溶制剂,其有效成分总称为蟾蜍毒素类(Bufotoxins),包括蟾蜍甾二烯类、强心甾烯蟾毒类、吲哚碱类、醇类及多糖、氨基酸、肽类、肾上腺素等[2],对多种肿瘤有抑制增殖的作用,尤其对肝癌的有效率可达44.4%[3],是一个很有发展前景的抗肝癌药物。但是,其作用机制还有待于进一步明确。本实验探讨华蟾素注射液对人肝癌Hep G2细胞的增殖及周期有何影响,并初步分析可能存在的作用机制。
1 材料与方法
1.1 细胞及培养
细胞株为人肝癌HepG2(购于中国科学院上海细胞研究所);低糖IMEM培养基、10%新生牛血清购于GIBICO公司;将细胞置于培养箱中孵育(培养箱设为37℃、5%CO2、饱和湿度),每48h传代1次。实验细胞采用对数生长期细胞。
1.2 实验药品及试剂
华蟾素注射液(5mL/支,浓度以主要成分吲哚生物碱为标量测定,购于安徽省金蟾生化股份有限公司),实验时应用培养基将其配制成不同浓度的药液。MTT为biosharp公司产品;碘化丙啶和RNA酶A购于Sigma公司;CDK2/Cyclin A激酶活性比色法定量检测试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司。RT-PCR试剂盒购自Promega公司。
1.3 MTT法检测细胞生长情况
将细胞接种到96孔培养板上,5000个细胞/孔,每组设立8个平行孔。培养24h后将培养基更为含不同浓度华蟾素注射液的培养液(0.006μg/mL、0.013μg/mL、0.026μg/mL、0.053μg/mL、0.105μg/mL、0.21μg/mL、0.42μg/mL),200μL/孔,设立空白对照组和阴性对照组(未加华蟾素注射液)。分别培养24h、48h、72h后,每孔加入20μL的MTT液(浓度为5mg/mL),再避光培养4h后除去培养液,加入二亚基亚砜(DMSO)150μL/孔,震荡后使结晶完全溶解,置于酶标仪下将波长设为570nm,应用空白孔调零,测定各孔吸光值(B)。应用公式计算华蟾素注射液在不同浓度下对Hep G2细胞生长的抑制率(IR):IR(%)=(B对照-B试验)/(B对照-B空白)×100%;半数抑制浓度(IC50)的计算:取细胞存活率和剂量对数作图求出IC50值。实验共重复4次。
1.4 流式细胞术检测细胞周期分布
取细胞并将细胞配成2×106个/m2的浓度,分别取2mL接种到3个培养瓶内,培养24h后,应用PBS冲洗1次,进行同步化(即将培养基更为无血清的DMEM培养20h),再更为含有华蟾素注射液的正常培养基(其终浓度为0.21μg/mL),分别培养48h、24h、12h后,应用0.25%的胰蛋白酶消化下细胞,离心(1000r/min,10min)后弃去上清,应用冷PBS冲洗2次,再加入70%的冷乙醇,置于4℃下固定12h。用PBS冲洗2次,离心后弃去上清液,加入25μL浓度为2mg/mL的RNaseA,置于37℃下作用30min,再加入1mg/mL的PI染料25μL,于4℃下避光静置30min后,应用流式细胞仪(发射波长630nm,激发波长488nm)检测凋亡细胞的数量和细胞周期分布情况。实验共重复4次。
1.5 RT-PCR法检测CDK2mRNA、CyclinAmRNA表达水平
取细胞,接种于24孔板中,每孔5×105个细胞,设华蟾素注射液浓度为0.42μg/mL、0.21μg/mL、0.105μg/mL为实验组,设培养基组为阴性对照组,培养48h后收集各组细胞。提取各组总RNA时应用Trizol试剂盒(购于Invitrogen公司)并按其说明进行。RT-PCR的操作按照说明书进行(Ta Ka Ra RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0),以c DNA为模板进行PCR扩增,反应条件见表1。
将扩增产物加入到浓度为1.5%琼脂糖凝胶上,置于1×TBE缓冲液中,在电压为90v作用下电泳30min,于紫外透视仪下观察显示电泳带并用一次性成像仪扫描成像,然后进行灰度(ID)分析。实验共重复4次。
1.6 CDK2/Cyclin A激酶活性比色法定量检测
取细胞,将细胞配成1×105个/mL的浓度,取2mL接种于直径为60mm的培养皿内,孵育24h后,分别加入华蟾素注射液(0.42μg/mL、0.21μg/mL、0.105μg/mL),并设立阴性对照组(未加药物),培养48h,后续操作按该试剂盒内的说明书进行,并在酶标仪下(波长设为340nm)进行检测。
样品的活性=[(样品读数-背景读数)×样品稀释倍数×0.1(体系容积,mL)]/[0.005(样品容积,mL)×6.22(毫摩尔吸光系数)×0.6cm×5min]=U/mL
2 结果
2.1 MTT法检测肿瘤细胞生长状态
不同浓度的华蟾素注射液干预Hep G-2细胞24h、48h、72h后,IC50分别为0.48μg/mL、0.157μg/mL、0.08μg/mL,随着作用时间的延长和药物浓度的增加,其对细胞的抑制率逐渐增加,并与时间和浓度呈正相关。见图1。
2.2 流式细胞术检测细胞周期分布
浓度为0.105μg/mL的华蟾素注射液,作用HepG2细胞12h、24h、48h后,通过流式细胞仪检测分析,结果示:S期HepG2细胞所占比例与药物作用时间呈正比,具有时间依赖性,与对照组相比差异具有显著性(P<0.05)。见图2。
2.3 RT-PCR法检测CyclinAmRNA、CDK2mRNA表达水平
应用RT-PCR法检测华蟾素注射液(0.105μg/mL、0.21μg/mL、0.42μg/mL)作用于HepG2细胞48h后,其CyclinA及CDK2mRNA表达水平有何变化。实验组与对照组比较,随着药物浓度的增加Cyclin A mRNA、CDK2 mRNA表达水平减低,应用华蟾素注射液0.105μg/m L、0.21μg/mL、0.42μg/mL作用于Hep G2细胞后,CyclinAmRNA与β-actin m RNA条带灰度比值分别为(0.455±0.021)、(0.272±0.035)、(0.132±0.02),对照组灰度比值为(0.550±0.04),条带3、4(即华蟾素注射液浓度为0.21μg/mL、0.42μg/mL)与对照组相比具有差异具有显著性(P<0.05),见图3-1;CDK2mRNA、β-actin mRNA条带灰度比值分别为(0.266±0.021)、(0.167±0.015)、(0.117±0.020),对照组为(0.445±0.016),实验组与对照组相比差异具有显著性(P<0.05),见图3-2。
2.4 CDK2/CyclinA激酶活性比色法定量检测结果
应用比色法定量法检测华蟾素注射液作用于HepG2细胞48h后,CDK2/CyclinA激酶的活性与药物浓度呈负相关,对照组与各浓度组间差异具有显著性(P<0.05)。见图4。
3 讨论
肿瘤为细胞周期疾病,通过阻断细胞周期,实现对肿瘤的生长抑制是目前抗肿瘤药物的重要机制。
我们的研究表明华蟾素注射液能抑制HepG-2细胞增殖,并将细胞阻滞于S期。为探讨S期阻滞机制,我们观察了华蟾素注射液对细胞周期素A(cyclinA)及细胞周期素依赖性激酶2(cyclins dependent kinases 2,CDK2)的影响。cyclinA是人类cyclins家族中重要成员之一,在细胞周期中起正相调节作用,它首次被检测到是在原发性肝癌细胞中,在与HBV DNA的整合部位上,这种整合被认为是导致肝癌的主要原因。cyclinA存在于细胞核内,在DNA合成过程中的G1晚期出现,其作为调节亚基与相应的细胞周期素依赖性激酶(cyclins dependent kinases,CDK)中的CDK2、CDC2(cell division cycle 2)特异性结合,参与细胞DNA的复制及合成,并促进细胞进行分裂。CyclinA/CDK2/CDC2复合物可使细胞顺利完成并通过S期、G2/M期,如果该复合物表达出现异常,则可使具有缺陷的DNA丧失修复的时间而直接进入细胞周期,致使其出现异常增殖即生成肿瘤[4,5,6,7];而且也是肿瘤细胞恶性增殖及预后不良的指标之一[8,9]。DobashiY等在对非小细胞肺癌的研究中发现CyclinA、CDK2表达与S期细胞数量呈正相关与患者的生存期呈负相关[10]。本研究表明华蟾素注射液能下调CyclinA、CDK2m RNA水平表达,抑制CyclinA、CDK2活性。
我们的研究提示,华蟾素注射液可能通过影响CyclinA、CDK2实现对HepG-2细胞S期阻滞。
参考文献
[1]孙燕,石远凯.原发性肝癌,临床肿瘤内科手册[M].5版.北京:人民卫生出版社,2007: 539-549.
[2]王锋,张薇,董红兵,等.蟾蜍的药理研究及临床应用概况[J].国医论坛,2003,18(5):50-52.
[3]左小东,崔永安,秦叔逵,等.华蟾素抗肿瘤作用的临床研究进展[J].临床肿瘤学杂志,2003,8(3):232-235.
[4]Fisher RP.Cdks and cyclins in transition[J].Curr Opin Gene Dev,1997,7(1):32.
[5]King KL,Cidlowski JA.Cell cycle regulation and apoptosis[J].Annu Rev Physiol,1998,60(6):601.
[6]Meikrantz W,Gisselbrecht S,Sun W,et al.Activation of cyclinA-dependent protein kinases during apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1994,91(9):3754.
[7]Hoang AT,CohenK,Barrett JF,et al.Participation of cyclinA in Myc-induced apoptosis[J].Proc Nat Acad Sci USA,1994,91(15):6875.
[8]Wang J,Chenivesse X,Henglein B,et al.Hepatis B vieus in tegrationin a cyclin A gene in a hepatocellular carcinoma [J].Nature,1990,343(6258):555-557.
[9]Nozoe T,Korenaga D,Futatsugi M,et al.Cyclin A expression in superficial squamous cell carcinoma of the esophagus and coexistinginfiltrate lymphocyte follicle[J].Cancer Lett,2002,188 (122): 2212-2229.