肝癌细胞凋亡（精选9篇）
肝癌细胞凋亡 篇1
凋亡是程序性细胞死亡, 是指为维持内环境稳定, 由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡异常在肿瘤发病中起了重要作用, 因此选择性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的凋亡干预技术已成为治疗恶性肿瘤的基本策略之一。有许多因素能诱导细胞发生凋亡, 如糖皮质激素、药物、损伤等, 有研究报道乙醇可诱导多种肿瘤细胞发生凋亡, 细胞凋亡是乙醇引起肿瘤细胞死亡的一个重要途径。本实验主要是观察乙醇对小鼠肝癌细胞 (H22) 凋亡的诱导作用, 以期能对相关实验提供一定的基础。
1 材料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 细胞系
小鼠肝癌细胞由山东大学医学院免疫学研究所培养。
1.1.2
主要试剂RPMI1640, 胰蛋白酶 (GIBco公司) ;胎牛血清 (杭州四季青公司) ;碘化丙锭 (美国基因公司) ;0.01mol/LPBS (pH7.4) , 枸橼酸钠, 无水乙醇, 台盼蓝, D-Hanks液等。
1.1.3 主要仪器及材料
CO2培养箱;台式离心机;流式细胞仪;超净工作台, 倒置显微镜。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞传代培养
H22细胞, 用含15%胎牛血清, 青霉素和链霉素各100μg/mL的RPMI1640, 37℃, 5%CO2饱和湿度环境常规传代培养, 待生长至对数生长期, 细胞计数板计数, 接种于24孔板中, 每孔约 (2～3) ×105个细胞, 37℃, CO2培养箱培养过夜, 待细胞贴壁。
1.2.2 乙醇诱导细胞凋亡
上述培养细胞待贴壁生长至对数生长期, 吸去培养液, 用PBS (pH7.4) 洗2次, 将浓度分别为4%、6%、8%、10%、12%、14%的乙醇加入24孔板中, 放入37℃, CO2培养箱培养6h后, 倒置显微镜下观察结果。
1.2.3 倒置显微镜下观察H22细胞凋亡百分率
H22细胞与乙醇共培养6h后, 细胞加入终浓度为4g·L-1台盼蓝染色10min后, 在倒置显微镜观察, 计数凋亡细胞。凋亡细胞计数时, 随机选取视野, 计数1000个细胞中的凋亡细胞数。重复4次, 取平均值。
2 结果
倒置显微镜观察可见, 4%乙醇组细胞无明显的形态学变化, 6%～12%乙醇组可见部分细胞缩小变圆, 弯亮, 贴壁性降低和胞浆“出泡”等凋亡形态学特征其凋亡率分别为33%、70%、92%、99%。14%乙醇组大部分细胞变暗, 形状不规则, 胞浆收缩, 颗粒增多, 并有碎片状漂浮物, 为坏死的形态学变化。随着乙醇浓度的增加, 细胞的杀伤率逐渐增加。
3 结果
乙醇可诱导小鼠肝癌细胞凋亡, 12%乙醇与小鼠肝癌细胞共培养6h后诱导凋亡的百分率最高, 乙醇浓度再高则可使其发生坏死。
4 讨论
4.1 关于乙醇诱导细胞凋亡的方法已有很多报道, 但目前对于乙醇诱导小鼠肝癌细胞凋亡的研究很少。本实验探索了乙醇诱导小鼠肝癌细胞凋亡的方法, 希望能对有关小鼠肝癌细胞凋亡的实验提供一定的帮助。
4.2 乙醇诱导肝细胞凋亡的机制尚未完全阐明, 目前认为与以下几种因素有关系:细胞色素P4502E1 (CYP2E1) 的活化;肿瘤坏死因子 (TNF) 和肿瘤坏死因子受体 (TNF-R) 的活性增高;肌纤维母细胞和转化生长因子- (TGF-) 的作用;氧应激的作用;肝脏铁负荷增加等。总之, 乙醇诱导肝细胞凋亡是多个因素及基因调控的复杂过程。
摘要：目的研究乙醇诱导小鼠肝癌细胞凋亡的方法。方法不同浓度的乙醇与小鼠肝癌细胞共培养6h后观察细胞凋亡率。结果乙醇与小鼠肝癌细胞共培养6h后, 12%的乙醇诱导凋亡的百分率最大。结论乙醇可诱导小鼠肝癌细胞凋亡。
关键词：凋亡,小鼠肝癌细胞,乙醇
参考文献
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细胞凋亡与细胞坏死 篇2
教材中“被病原体感染的细胞的清除”这句话，从教材的前后语境来看，强调通过细胞凋亡来清除机体不再需要的细胞（被病原体感染的细胞），来维持内部环境的稳定。下面我们通过例题进行讲解。
例1 关于细胞凋亡与细胞坏死，下列说法正确的是（ ）
A．细胞凋亡是由细胞内的遗传物质控制的
B．细胞死亡是细胞凋亡的同义词
C．细胞坏死受到严格的由遗传机制决定的程序性调控
D．细胞的自我更新，被病原体感染的细胞的清除不是通过细胞凋亡完成的
解析 该题错误率较高。主要是对细胞凋亡与细胞坏死区别的理解不透彻。细胞死亡一般包括细胞凋亡和细胞坏死两种情况。细胞坏死是病理性死亡，对机体有害。细胞凋亡是细胞内遗传物质控制的正常死亡，正常代谢中的细胞的更新和被病原体感染的细胞的清除是机体不需要的细胞，清除通过细胞凋亡完成。
答案 A
例2 下列关于细胞凋亡和细胞坏死的叙述中，错误的是（ ）
A．细胞凋亡是主动的，细胞坏死是被动的
B．细胞凋亡是生理性的，细胞坏死是病理性的
C．细胞凋亡是有基因控制的，细胞坏死是由外界因素引起的
D．细胞凋亡是急性的，细胞坏死是慢性的
解析 该题主要考查对细胞凋亡与细胞坏死区别的理解。细胞凋亡是指细胞在凋亡因子刺激下发生的受基因调控的细胞自杀性行为，是细胞主动死亡的过程，是一种生理性变化。细胞坏死是细胞受到化学因素（如强酸、强碱、有毒物质）、物理因素（如热、辐射）和生物因素（如病原体）等环境因素的伤害，引起细胞死亡的现象。是被动死亡过程，是一种病理性变化。两者不存在急性和慢性之分，细胞坏死既有急性的也有慢性的。
答案 D
例3 下列哪些现象与细胞凋亡无关（ ）
A．胃肠道上皮细胞的脱落
B．早期肿瘤细胞的清除
C．儿童早衰症
D．老年性痴呆
解析 通过细胞凋亡，有机体得以清除不再需要的细胞，对维持正常生命活动有积极意义。不正常的细胞凋亡则会导致疾病，如：老年性痴呆。儿童早衰症则是细胞过早衰老产生的一种疾病。
答案 C
【练习】
1. 下面为动物机体的细胞凋亡及清除示意图。以下分析不正确的是（ ）
A. ①过程表明细胞凋亡是特异性的，且体现了生物膜的信息传递功能
B. 细胞凋亡过程中有新蛋白质合成，体现了基因的选择性表达
C. ②过程中凋亡细胞被吞噬，表明细胞凋亡是细胞被动死亡过程
D. 凋亡相关基因是机体固有的，在动物生长发育过程中的不同时期表达
2. 下列关于动物细胞编程性死亡的叙述，正确的是（ ）
A．细胞癌变属于细胞编程性死亡
B. 细胞编程性死亡属于正常生理过程
C．细胞编程性死亡属于细胞分化过程
D．细胞编程性死亡与基因表达无关
3. 下列哪项不是细胞凋亡的意义（ ）
A. 细胞凋亡是生物体正常发育的基础
B. 细胞凋亡能维持组织中细胞数目的相对平衡
C. 细胞凋亡是机体在外界因素刺激下的细胞死亡
D. 细胞凋亡是机体的自我保护机制
4. 由细胞凋亡与癌症生物学研究实验室主任Hermann Steller教授领导的研究项目表明，当细胞以异常的模式进行复制的时候，机体会释放一系列的死亡信号激发细胞自我摧毁，以免异常的细胞变成癌细胞。他们首次披露一种名为IAPs(细胞凋亡抑制蛋白)的蛋白控制细胞凋亡的机制。IAPs的作用机制是与细胞凋亡酶——Caspases酶结合抑制细胞凋亡。他们研究小鼠发现IAPs蛋白的一个RING区域具有抑制细胞凋亡的作用，人为去除小鼠细胞IAPs蛋白的RING区域，能有效地促进更多的细胞凋亡。Steller说：“癌细胞无限繁殖的秘密在于破坏细胞凋亡的信号。”
（1）细胞凋亡是由基因所决定的细胞 的过程。
（2）癌细胞是不受机体控制的、 的恶性增殖细胞。癌细胞的形成是由于致癌因子的作用， 发生突变所致。
（3）请就以上资料对癌症的治疗进行大胆地设想： 。
【参考答案】
1. C 2. B 3. C
肝癌细胞凋亡 篇3
1 材料与方法
1.1 药品和试剂
硒酸酯多糖 (Kappa-Selenocarrageenan, KSC) 由江苏张家港天赐福生物工程有限公司惠赠, 含硒量1.68%。RPMI 1640干粉培养基为美国GIBCO公司产品;胰酶, Amersco公司;胎牛血清, 杭州四季青;噻唑蓝 (MTT) 、Hoechst 33258染料、碘化丙啶 (PI) 染料均为Sigma公司产品;紫杉醇 (Paclitaxel) , 北京四环医药公司, 分子量为853.92, 用生理盐水配成1mmol· L-1 的储存液, 用时以1640培养基稀释至所需浓度;96 孔培养板, Coster 公司产品。
1.2 肿瘤细胞株
人肝癌细胞株HepG-2购自黑龙江省肿瘤研究所, 于RPMI 1640 基础培养液中加入10% 的胎牛血清, 青霉素100U· mL-1, 链霉素100mg·L-1, 置37 ℃、5%CO2 孵箱中培养, 3～4d 传代1 次。
1.3 仪器和设备
CO2培养箱 (美国NBS公司) , 酶标仪 (美国Bio-Rad公司) , 倒置显微镜 (日本OLYMPUS公司) , 荧光显微镜 (德国Leica公司) , 流式细胞仪 (美国BECKMAN-COULTER公司, EPICSXL) , 超净工作台 (北京东联有限公司) , 电子分析天平 (Sartorius) , TDL80-2B低速离心机 (上海安亭科学仪器厂) 。
1.4 细胞活力检测 (MTT 比色法)
取对数生长期HepG-2细胞, 用0.25 %胰蛋白酶消化, 含10 %胎牛血清的RPMI 1640 培养液配成单个细胞悬液, 每孔加样100μL于96 孔培养板中 (终浓度为4 ×104 ·mL-1) 。KSC浓度组分为15、30、60、120 mg·L-1 4 组。每一剂量各设6个复孔, 以未加药物的细胞作为阴性对照组, 阳性组 (紫杉醇, 1nmol·L-1) 。置培养箱 (37 ℃饱湿度, 5 % CO2孵箱) 分别作用24、48、72h, 实验结束前4 h, 每孔加入MTT (5 mg·L-1) 20μL再孵育4 h, 终止培养, 离心 (2 000 r·min-1, 10min) 弃上清, 每孔加入DMSO 150μL, 振荡10 min, 使结晶溶解。选择570 nm 波长, 酶标仪上测定各孔光吸收值 (A) 。
肿瘤细胞抑制率 (%) = (1-试验孔A值 / 对照孔A值) ×100 %
1.5 形态学观察
取对数生长期的HepG-2细胞, 用0.25%胰酶消化后, 以3 ×105·mL-1的密度接种于含消毒盖玻片的6 孔板中, 每孔1mL, 培养24h待细胞贴壁后, 各组分别加入1mL 15、30、60、120 mg· L-1的KSC, 空白组加1mL的1640培养液, 阳性组为1nmol· L-1的紫杉醇。培养至48h后, 吸去培养液, 每孔加入0.5mL的固定液 (甲醇:冰醋酸=3:1) , 4℃固定10min, 弃固定液用PBS洗2遍, 加入800μL 5mg· L-1的Hoechst 33258染色液, 37℃避光孵育30min后, 取出盖玻片, 荧光显微镜下观察凋亡细胞形态。
1.6 细胞周期和凋亡细胞分析测定 (流式细胞仪)
对数生长期的HepG-2细胞接种于6孔板, 待细胞生长至75%融合左右, 空白组加入1640培养基, 实验组加入不同浓度的KSC (15、30、60、120 mg· L-1) , 阳性组加入1nmol· L-1的紫杉醇, 作用24、48、72h 后, 胰酶消化收集细胞, PBS 洗涤后, 加入2mL 70%冷乙醇-20 ℃固定过夜。检测前PBS 冲洗细胞1 次, 调整细胞浓度为106 · mL-1, 加入800μL 含10 mg· L-1 RNase A 的 PI 染色液 (终浓度为50 mg· L-1) , 混匀, 室温避光染色30min, 300 目尼龙网过滤后流式细胞仪检测, 以激发波长488nm 测定, CellQuest 及Motift 软件分析SubG1 峰和细胞周期。
1.7 实验数据处理
应用SPSS11.5 软件对数据进行统计学处理, 结果以undefined表示, 组间比较采用方差检验。
2 结果
2.1 KSC对HepG-2细胞生长的抑制作用
KSC作用于肝癌HepG-2细胞株24、48、72h后, 细胞生长明显受抑制, 与对照组相比差异显著 (P<0.05) 。细胞生长抑制率随药物浓度和作用时间的增加而升高, 其中120 mg· L-1 KSC作用72h最为显著, 其IC50为43.92 mg· L-1 (见表1) 。
注:与对照组比较, *P<0 .05, **P<0 .01。
2.2 KSC对HepG-2细胞形态学的影响
KSC作用于HepG-2细胞48h后, 细胞经Hoechst 33258染色, 荧光显微镜下可见早期和晚期凋亡细胞, 细胞变圆, 细胞核固缩, 随着KSC浓度的增加, 细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒状荧光, 细胞的凋亡小体逐渐增多 (图1) 。
A:阴性对照组;B:1nmol· L-1紫杉醇;C:15 mg· L-1 KSC;D:30 mg· L-1 KSC;E:60 mg· L-1 KSC; F:120 mg· L-1 KSC
2.3 KSC对HepG-2细胞周期及凋亡率的影响
流式细胞术结果显示, KSC作用组与对照组比较G1期比例明显减少, S 期比例明显增加, 并且随着药物浓度的增加及作用时间的延长, S 期比例逐渐增大, 表明KSC可使HepG-2细胞受阻于S 期, 并具有剂量和时间依赖性 (见表2、图2) 。另外, KSC还可诱导HepG-2细胞发生凋亡, 24h 时KSC各组均未有凋亡, 48h后30～120 mg· L-1各组均出现凋亡峰, 凋亡率在21.71%～27.56%之间。
3 讨论
硒是人体必需的一种微量元素, 哺乳动物体内的硒主要以硒代半胱氨酸 (Se-Cys) 的形式参与蛋白质组成, 硒代半胱氨酸也因其重要性被称作第21 个氨基酸, 它是一些酶活性部位的基本组成部分。20 世纪70年代含硒谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 的发现为硒的生物化学奠定了基础, 它具有清除氧自由基, 防止细胞损伤, 预防肿瘤产生的作用[7]。实验显示一定浓度的硒化合物可抑制肝癌、胃肠道癌、肺癌、卵巢癌等多种癌细胞生长, 并诱导其凋亡[8]。
A:阴性对照组;B:1nmol· L-1紫杉醇;C:15 mg· L-1 KSC;D:30 mg· L-1 KSC;E:60 mg· L-1 KSC;F:120 mg· L-1 KSC
陆瑞芳[9]报道KSC对人肝癌SMMC-7721细胞具有生长抑制作用, 100mg·L-1 KSC作用第6天细胞生长抑制率为36.86%, 并显著降低细胞培养液中丙二醛 (MDA) 的含量。戴伟娟[10]研究表明4-硒硫酸酯多糖对人肝癌Bel-7402细胞生长的抑制作用, 可能与抑制瘤细胞DNA、RNA 及蛋白质合成有关。
本文结果显示, 15～120mg/L 剂量范围内KSC对人肝癌HepG-2细胞生长有明显的抑制作用, 并具有显著的时效、量效关系。荧光显微镜下, 形态学观察KSC组出现早期和晚期凋亡细胞, 且随作用浓度的提高凋亡小体逐渐增多。流式细胞仪分析显示药物作用48h 才出现凋亡峰。细胞周期分析发现KSC主要减少G1期细胞, 使肿瘤细胞停留在S 期, 表明KSC可阻滞癌细胞S 期向G2 期进程, 阻断DNA 合成, 说明KSC抑制肝癌HepG-2细胞增殖可能与其阻滞细胞周期的有序进行, 以及选择性地抑制生物大分子的合成有关, 从而诱导肝癌细胞的凋亡。
摘要：目的:探索硒酸酯多糖 (KSC) 在体外对人肝癌细胞HepG-2的作用。方法:以KSC为实验药物, 通过MTT法检测细胞活力, 荧光显微镜观察凋亡细胞形态, 流式细胞仪分析凋亡峰及细胞周期等, 研究其对HepG-2细胞的诱导凋亡作用。结果:随着作用时间及药物浓度的增加, KSC对HepG-2细胞生长的抑制作用就越明显。120mg.L-1KSC作用72 h, 细胞生长抑制率达69.31%, IC50为43.92 mg.L-1。形态学观察可见早期和晚期凋亡细胞及凋亡小体, 细胞周期主要受阻于S期。结论:KSC可在体外诱导人肝癌细胞凋亡。
关键词：硒酸酯多糖 (KSC) ,HepG-2细胞,MTT,细胞凋亡
参考文献
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中药抑制细胞凋亡的研究进展 篇4
关键词：凋亡；中药；综述
中图分类号：R2－03文献标识码：A
文章编号：1007－2349(2007)11－0046－03
细胞凋亡(apoptosis)是一种细胞生理性死亡的形式，是多细胞有机体为保持身体组织稳定、调控自身细胞增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞自动性死亡过程，在机体的生长发育、衰老、免疫调节、内环境稳定以及肿瘤、感染、自身免疫性疾病等生理病理过程中均有重要意义。机体通过凋亡过程来清除体内不需要或有害细胞，或通过抗凋亡过程维持细胞功能。抑制凋亡在维护生命个体的稳定、抗衰老等过程中有很重要的作用。近年来有关中药抑制细胞凋亡的研究日渐增多，研究涉及缺氧、缺血等因素导致的神经系统、心脑血管、胃肠功能损伤的保护、肿瘤治疗(放、化疗)后骨髓、免疫功能损伤的防治等方面。中医药可对细胞凋亡过程的不同环节进行调节，进而抑制细胞凋亡，维持机体内平衡，阻止组织病理过程的恶化。
1 通过调控细胞凋亡途径抑制凋亡
机体内存在多条细胞凋亡的信号转导途径，其中内源性的线粒体细胞色素C途径和外源性的死亡受体途径所介导细胞凋亡是目前研究较多的途径。
1．1 通过调控线粒体细胞色素C途径抑制凋亡 许多研究结果均表明，线粒体在细胞凋亡过程中起着“主开关”作用，是最重要的途径之一，其通过Cyt－C途径诱导细胞凋亡。在细胞凋亡信号的刺激下，会使caspases激活，胞质Ca2+水平升高，产生ceramide，诸如此类的改变会直接或间接地引发线粒体通透性转变孔道(PTP)开放，使能量产生中断，线粒体内膜跨膜电位(△ψm)的下降，并导致外膜破裂，释放出Cyt－C等各种活性蛋白，Cyt－C从线粒体内释放是关键的一步。胞浆内的Cyt－C在dA7P存在下，与凋亡蛋白酶活化因子－1(Apaf－1)结合，诱导caspase－9前体的寡聚化，并形成凋亡体。凋亡体的形成可激活caspase－9，继而活化Caspase－3，启动Caspase的级联反应，引起细胞凋亡。
有研究以缺氧／缺糖再给氧为模型，观察清开灵注射液对神经细胞线粒体膜电位的保护作用。结果发现清开灵注射液能显著降低细胞内Ca2+浓度，抑制细胞凋亡，提高线粒体膜电位和活性，认为清开灵注射液可抑制缺氧一缺糖再给氧损伤所致的线粒体膜电位的降低、抑制神经细胞内钙超载与抑制细胞凋亡有关。
1．2 通过调控死亡受体途径抑制凋亡 凋亡还可以通过死亡受体通路介导，现知死亡受体途径主要包括Fas／FasL途径和TNFa／TNFR途径。死亡受体家族成员包括7NFRl、TNFR2、Fas／CD95、TRAlL－Rs等，当死亡受体与其相应的配基(死亡配体)特异性结合后，将凋亡信号由胞外传人胞内，在连接分子的媒介下，激活Caspase，导致细胞凋亡。
1．2．1 通过调控Fas／FasL途径抑制凋亡 中药可以通过调控Fas／FasL的表达，抑制受损细胞的凋亡。参附注射液对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧／复氧时凋亡相关基因Fas／FasL蛋白表达影响研究发现，结果缺氧4.5h及10.5h后，心肌细胞Fas／FasL蛋白的阳性表达指数(positive expressionindex，PEI)参附注射液组明显低于缺氧组；参附注射液可通过下调Fas／FasL蛋白表达，参附注射液组还见到caspase-3活性下降，提示参附注射液抑制乳鼠心肌细胞凋亡是通过Fas／FasL-caspase-3途径实现的。
1．2．2 通过调控TNFa／TNFR途径抑制凋亡 研究还发现中药通过调控7NFa／TNFR途径抑制细胞凋亡。枸杞多糖对老年大鼠T细胞过度凋亡及相关基因表达研究发现，枸杞多糖可以下调促凋亡的TNFRl基因mRNA表达并上调抗凋亡的Bcl-2基因mRNA表达，降低老年大鼠T细胞的过度凋亡，从而改善老年大鼠T细胞过度凋亡的状态。
2 通过影响凋亡信号传导抑制凋亡
细胞抗凋亡的信号转导是在内外生存因子的刺激下，激活多种信号偶联途径的信号转导过程。常见的凋亡信号传导途径有磷脂酰肌醇－3－激酶(P13K)／蛋白激酶B(PKB或称为AKT)途径，RAS－MAPK途径，NF－κB途径，N()途径等。
2．1 P13K／PKB途径 P13K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，PKB是P13K的靶蛋白之一，P13K与PKB是促进凋亡作用的重要调节因子；其过量表达可抑制细胞的凋亡。黄芪多糖(APS)对2型糖尿病大鼠肾组织胰岛素信号分子表达的研究发现，认为黄芪多糖降低2型糖尿病大鼠血糖水平的机制可能与提高糖尿病大鼠肾组织中胰岛素受体(InsR)、胰岛素受体底物－1(IRS－1)、P13K水平，增加组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛素信号转导有关。
2．2 RAS－MAPK途径 丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKS)参与细胞凋亡的信号转导过程。MAPKS级联反应包括MAPKKK，MAPKK与MAPK等3个顺序的活化过程。每一种激酶又由不同成分组成。MAPK包括ERK，jNK／SAPK，P38。有研究探讨肝星状细胞丝裂原活化蛋白激酶(HSCs MAPK)通路中ERK、JNK的活化情况，以及丹参药物血清对磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(P－ERK)、磷酸化氨基末端蛋白激酶(P－JNK)表达，肝纤维化大鼠经丹参药物血清干预后较对照组均显著降低，正常大鼠经丹参药物血清干预后较正常大鼠对照组也均显著减少。表明活化的HSCs中ERK、JNK保持着较高的磷酸化水平，两者介导的信号转导通路是HSCs活化和增殖的重要途径之一；阻断MAPK信号通路可能是丹参治疗肝纤维化的重要作用途径之一。
2．3 NF－κB途径 在大多数细胞类型中，NF－κB在胞浆中与抑制亚单位lκB结合形成无活性的复合物。在TNF诱导的细胞凋亡过程中，可刺激lκB的磷酸化作用及降解作用。使NF－κB能从复合物中释放并活化，活化的NF-κB迅速转位进入胞核，继而作用于靶基因，诱导基因表达，编码前炎性蛋白，如IFN，细胞因子，生长因子，细胞黏附因子，红细胞生成素与MHC－I类分子等，抑制NOS的生成，并诱导编码凋亡抑制蛋白C－IAPl，C－IAP2基因表达，诱导抗凋亡基因Bcl－2，Bcl－x1的表达。探讨人参皂甙对心血管疾病的保健和防治机制的研究发现，结果显示内毒素脂多糖(LPS)促使HUVEC NF－κB向细胞核内转移，人参皂甙则能阻止
LPS诱导的NF－κB核内转移；能完全阻止LPS致内皮细胞核提取物NF－κB DNA结合活性；IJs能使HUVl3C PAl－1蛋白及mRNA表达显著增强，人参皂甙则使LPS的这种作用明显减弱。认为人参皂甙对心血管疾病的防治机制之一可能是通过NF－κB途径拮抗LPS致HUVEC PAI－1的表达。
2．4 NO途径 NO对细胞的增殖与存活有双重效应。它可以通过多种机制诱导细胞的凋亡，但在一些特定环境中，NO又可在一些细胞类型中作为凋亡的潜在抑制剂。川芎嗪对多巴胺诱导PCI2细胞凋亡的保护作用的研究发现，认为川芎嗪可抑制DA引起的PCI2细胞凋亡，此作用可能与降低NO生成有关。NO的抗凋亡作用还与caspase水平有关。在死亡配体依赖与配体非依赖的凋亡中，NO均能抑制caspase的活性。黄芪、当归注射液可通过促进NO的生成、诱导caspase3表达促进体外培养的血管平滑肌细胞凋亡。同时还可通过上调bcl－2表达而抑制其阻止氧自由基破坏细胞结构，起抗细胞凋亡作用，通过抑制粘着斑激酶的表达，调节其对细胞增殖和凋亡的影响。已发现，NO在某些细胞类型的线粒体中起抗凋亡作用。如在鼠肝线粒体中，生理浓度的NO能可逆性的抑制PTP的开放，机制是通过膜的去极化与Ca2+的积聚作用。
2．5 其他 胞浆中游离的Ca2+作为第二信使在凋亡信号传递过程中起关键作用；细胞核内钙离子浓度的持续升高是导致细胞凋亡的主要原因。细胞凋亡时最显著的变化是DNA的断裂，钙离子可直接激活核酸内切酶促进DNA断裂，也可通过激活蛋白酶、磷酸酶和磷脂酶，导致染色质结构完整性的丧失。葛根素及由红参和麦冬有效成分制成的参麦注射液对脑缺血／再灌注中神经细胞均有一定的抑制作用。作用机制可能是阻断Ca2+内流和／或胞内钙库的释放。从抑制神经细胞内钙超载。
目前发现在某些细胞中，cAMP是引起细胞凋亡的信号。细胞内cAMP浓度的上升可激活cAMP依赖性蛋白激酶，使靶细胞上某些丝氨酸和苏氨酸磷酸化，从而影响这些蛋白的生物学功能，引起细胞凋亡。黄精多糖对正常小鼠血糖水平无明显影响；但可显著降低肾上腺素诱发的高血糖小鼠的血糖值；其机制可能是降低肾上腺素模型小鼠肝脏中cAMP的含量，通过抑制凋亡减轻高血糖肝脏的损害。
3 通过调控凋亡相关基因表达抑制凋亡
Bcl－2基因家族是最重要的细胞凋亡调控基因。抗凋亡基因bcl－2和bcl－xL是Bcl－2家族蛋白成员中主要的抗凋亡分子。bax基因是Bcl－2家族中重要的促凋亡基因。另外，p53、c－myc、Fas、c－fos等基因均是参与调控细胞凋亡的重要基因。有研究用黄芪注射液进行治疗贫血小鼠，提示黄芪注射液可通过上调抗凋亡蛋白Bcl－XL表达减轻骨髓有核细胞的凋亡，并促进红系、巨核系造血。丹参对持续性非卧床式腹膜透析(CAPD)相关性腹膜硬化模型大鼠腹膜间皮细胞凋亡有抑制作用，其机理是下调Fas基因的蛋白表达，上调Bcl－2基因的蛋白表达。c－los是一种转录调节因子，正常情况下在脑内水平极低。c－fos不适当的过度表达可干预细胞核的修复功能，导致细胞凋亡。有实验表明。c－fos可能诱导脑缺血一再灌流时海马CAl区细胞晚期促凋亡基因的表达，共同调控细胞凋亡，而中药有效成分葛根素可通过下调凋亡相关基因c－fos的表达，减少神经细胞的凋亡，从而具有保护神经的作用。
4 通过调控细胞因子抑制凋亡
细胞因子(cytokine，CK)是机体细胞分泌调节细胞增殖、分化与死亡的一大类因子。与凋亡有关的细胞因子有氧自由基、氧化低密度脂蛋白(OX2LDL)及某些细胞因子等。清热解毒方泻心汤可显著降低实验性AS大鼠血清MAD水平，增强SOD活性，降低OX2LDL及N()水平等，从而抑制血管细胞过度凋亡。细胞因子如TNF(Tumomecrotiefactor)具有多种生物学功能，TNF在体外可诱导肿瘤细胞、树突状细胞及大鼠肝细胞出现凋亡，其中TNF-α与凋亡的关系更为密切，能与TNF受体结合，引起细胞内贮存Ca释放，引起细胞内游离Ca2+浓度升高，从而激活Ca2+依赖性核酸内切酶，引起DNA片段断裂和细胞凋亡。此外，与凋亡有关的细胞因子还有IL-2、IFN-γ、TGFβ1，NK细胞、IL-3、IL-4、IL-6、LAF-1(白细胞黏附因子)、CAM-1(细胞内黏附分子)、GM-CSF(粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子)、NGF(神经生长因子)、SCF(干细胞因子)、IGF-1(胰岛素样生长因子)、核转录因子xu等。黄芪对脂多糖(LPS)致大鼠急性肺损伤(AIJ)后大鼠肺组织细胞有保护作用，其机制是减少促炎因子TNF-α、IL-1β的释放，抑制肺泡上皮细胞凋亡。地黄饮子对阿尔茨海默病动物模型细胞凋亡抑制的机制，与上调核转录因子κB、hsp70mRNA的表达，抑制线粒体释放细胞色素C，控制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活有关。
5 结语
肝癌细胞凋亡 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
SEA购自北京诺必信生物工程有限公司,使用前用DMEM高糖液体培养基稀释到所需浓度;肝癌细胞Hep G2购于中科院上海细胞生物研究所;DMEM高糖液体培养基(美国Sigma公司);EDTA(上海华美公司);胎牛血清,PBS缓冲液(杭州四季青公司);血液组织细胞基因组提取试剂盒(DP304),D2000 DNA Marker(MD114)[天根生化科技(北京)有限公司]。Multimage light cabinet(Alphalmager公司);DYC-3C型电泳槽,DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂);二氧化碳培养箱(美国Thermo公司);倒置显微镜(CK-32PC,Olympus公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞系及培养
在有双抗(含100 U/ml的青霉素和100 U/ml的链霉素)的DMEM(高糖)培养液中培养,培养液含10%的胎牛血清,在37℃,5%CO2培养箱中培养,取对数生长期细胞,按2∶1,每3 d传代。
1.2.2 琼脂糖凝胶电泳DNA梯度检测
将对数生长期的Hep G2细胞用0.25%胰酶消化,重悬于10%胎牛血清培养液中,置入37℃、5%CO2培养箱中培养过夜,待细胞贴壁后,换液,加入SEA,使其终浓度为0.2μg/ml,培养24 h及48 h后,用0.25%胰酶消化,制成细胞悬液,调整细胞数位107个/ml。然后10 000 r/min离心1 min,倒尽上清,加200μl缓冲液GA,振荡至彻底悬浮;加入20μl Proteinase K溶液,混匀;加入200μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10 min,溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠;加人200μl无水乙醇,充分振荡混匀15 s,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12 000 r/min离心30 s;然后依次向吸附柱中加入500μl缓冲液GD;600μl漂洗液PW;重复加入漂洗液PW步骤;将吸附柱转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50~200μl洗脱缓冲液TE,室温放置2~5 min,12 000 r/min离心2 min,将溶液收集到离心管中,即收集到的DNA。取0.2μl DNA样品溴酚蓝染色后于1.5%琼脂糖凝胶电泳(电压150 V,10 min),紫外灯下观察结果。
2 结果
SEA作用于Hep G2细胞24 h及48 h后,可以观察到明显的DNA梯带形成,见图1。
3 讨论
凋亡在多细胞生物的发展、自身稳定和抗癌细胞保护中发挥重要作用。由激素、免疫诱导信号产生凋亡的有效机制,已知其存在于大多数多细胞动物中。然而,它是一种随机的体细胞的突变和调节生长与死亡途径的基因的后天的失活,这些基因在癌症的发展中有重要作用。细胞凋亡是一种在基因控制下的主动死亡过程,是一系列生化级联反应的结果,以形态和生化上出现一定的改变为特征。细胞凋亡最突出的特点是细胞的凋亡起始于细胞核的改变,表现为核染色质的浓缩致密,DNA保存完好的细胞器和/或浓缩的细胞核碎片。凋亡晚期,凋亡细胞和凋亡小体迅速被巨噬细胞或邻近其他细胞吞噬消化。细胞凋亡既有细胞形态学上的变化,也有核DNA的断裂等生物化学反应的发生。核DNA断裂(形成“DNA梯带”)可以作为凋亡的指标[3]。
原发性肝癌是我国临床常见且恶性程度最高的消化系肿瘤之一,原发于肝细胞或肝内胆管上皮细胞,发病率高,手术治愈率低,预后极差,5年生存率只有14%[4]。肝癌具有发病隐匿、进展快、转移迅速等特点,且对放、化疗不够敏感,临床治疗效果不佳,因此探索出一种能有效诱导细胞凋亡的诱导剂,对肝癌的治疗具有重要的临床意义。原发性肝癌的发生、进展的整个过程都与肿瘤细胞增生与细胞凋亡的相互作用密切相关。本研究通过琼脂糖凝胶电泳DNA梯度检测细胞凋亡,可以说明,SEA在体外成功地诱导了人肝癌Hep G2细胞产生凋亡,形态学观察实验结果与细胞凋亡时DNA改变的理论相符合。
本研究表明SEA可以诱导肝癌细胞凋亡,可以作为体外抗肿瘤一种途径,但仍需进一步验证SEA在其他抗肝癌及诱导肝癌凋亡当中的作用及其机制。
参考文献
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[3]熊熙,张馨,李平,等.南蛇藤乙酸乙酯提取物诱导Hep G2细胞凋亡的实验研究[J].中国肝脏病杂志(电子版),2015,7(3):81-84.
肝癌细胞凋亡 篇6
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
人肝癌HepG2细胞株(武汉凯泰新生物技术有限公司馈赠)、RPMI1640培养液由干粉(美国Gibco公司)按说明配制并加10%新生胎牛血清(杭州四季青公司)和青链霉素混合液(碧云天公司),胰蛋白酶(美国Amresco公司)、钼酸氨(天津化学试剂厂,纯度99.0%)、AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒(南京凯基公司)、碘化丙啶(PI)和RNA酶试剂(Sigma公司)。
1.2 主要仪器与设备
超净工作台(BCM21000型,苏州净化设备有限公司)、CO2恒温培养箱(SWJ2300TVBB,美国Quene公司)、倒置显微镜(OLYMPUS2CK40,日本OLYM-PUS公司)、酶标仪(STATFAX22100型,广州市倍威仪器有限公司)、流式细胞仪(BDLSRⅡ,美国BD公司,)。
1.3 方法
1.3.1 药物制备
钼酸氨以生理盐水溶解配成1000 mg/L的溶液,滤菌后置4℃冰箱保存,临用前用培养基稀释成所需浓度。
1.3.2 细胞培养
人肝癌HepG2培养于含10%胎牛血清、青霉素和链霉素各1×105U/L的RPMI1640培养基中,在5%CO2、37℃的培养箱中换液传代培养,至稳定生长。
1.3.3 CCK-8法测定细胞抑制率
收集处于对数生长期的HepG2细胞,制成4×104/L单细胞悬液,以4×103细胞/孔接种到96孔板(每孔接种100μL),细胞贴壁后,吸去培养孔中的液体,分别加入含有不同终浓度钼酸氨(0.101、0.202、0.404、0.606 mol/L)的培养液200μL,继续分别培养24、48、72 h,同时设空白调零组(不加细胞仅加入等量培养液),以及阴性对照组(加细胞同时加入等量培养液),每组设6个复孔。在上述药物作用不同的时间点,各孔加入CCK-8 10μL,继续培养3 h,在酶标仪上以490 nm的波长测定吸光度(OD)值。结果判定:细胞生长抑制率=(对照孔平均OD值-实验孔平均OD值)/(对照孔平均OD值-空白孔OD值)×100%。
1.3.4 流式细胞仪检测细胞周期
取对数生长期的HepG2细胞,用胰酶消化后按每孔4.0×105个细胞接种于6孔板2 m L,24 h后换液,分别加入含有不同终浓度钼酸氨(0.101、0.202、0.404 mol/L)的培养液4 m L,继续分别培养24、48、72 h,同时设阴性对照组(加细胞和等量不含钼酸氨的培养液)。在上述药物作用不同的时间点收集细胞,PBS洗涤1次,-20℃预冷的70%乙醇固定3～4 h,PBS洗1次后各管加入600μL PI和RNA酶混合液,避光染色30min,流式细胞仪检测细胞周期,Modfit LT-Unititle软件分析数据。
1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡
细胞培养、接种、分组及作用时间同细胞周期测定,不同的时间点收集细胞,预冷PBS洗涤2次,用90μL Annexin V Binding Buffer重悬细胞,加入Annexin V-FITC和PI溶液各5μL,室温避光孵育15 min,加入200μL Annexin V Binding Buffer,于1 h内流式检测,BD-FACSDiva软件分析数据。
1.4 统计学处理
应用SPSS 11.5统计软件进行Friedman检验,以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 钼酸铵作用后Hep G2细胞形态学变化
不同浓度的钼酸铵作用于HepG2细胞24、48、72 h后,倒置显微镜下观察,对照组细胞贴壁生长状态佳,细胞轮廓清楚,呈梭形,随着培养时间的延长,细胞数量明显增加,而0.101 mol/L组细胞,随培养时间的延长细胞变化不明显:0.202 mol/L组细胞,1～2 d变化不明显,培养3～4 d,可见贴壁细胞中部分为圆形,有少量细胞漂浮在培养液中,细胞数目与对照组相比明显少:0.404、0.606 mol/L组细胞培养2d,细胞出现明显变化,细胞贴壁状况不良,圆形细胞及细胞碎片较多,有较多细胞漂浮在培养液中,贴壁细胞密度下降,培养3～4 d,上述变化更加明显。
2.2 钼酸铵对Hep G2细胞增殖的影响
CCK-8法检测结果显示随着药物浓度增大和作用时间延长,钼酸氨对HepG2细胞增殖抑制存在着明显的剂量-效应关系和时间-效应关系(P<0.05)即剂量越大、药物作用时间越长,则对HepG2细胞的抑制率越高,见表1和图1。
注:Friedman检验不同浓度、不同时间抑制率的χ2,P值分别为
2.3 钼酸铵对Hep G2细胞周期分布的影响
流式细胞仪检测细胞周期结果显示不同浓度钼酸铵对HepG2细胞作用24、48、72 h后,与对照组相比,细胞周期中各期细胞发生改变,即G0/G1期细胞及细胞凋亡率上升,S期和G2/M期细胞下降,差异性有显著(P<0.05),且与钼酸铵浓度和作用时间具有剂量依赖性和时间依赖性。见表2和图2-4。
注:Friedman检验χ2=9,P=0.029
2.4 钼酸铵对Hep G2细胞凋亡的影响
不同浓度钼酸铵对HepG2细胞作用24、48、72h后,流式细胞仪检测细胞凋亡,与对照组相比,随着钼酸铵浓度的增加和作用时间延长,活细胞数百分比(Q3)逐渐减少,凋亡细胞数百分比(Q4+Q2)逐渐增加,且呈剂量依赖和时间依赖关系,差异有统计学意义(P<0.01),见表3和图5-7。
注:Friedman检验χ2=19.2,P=0.000
3 讨论
钼是人体14种必需的微量元素之一。其生理功能主要是通过各种钼酶的活性来实现。钼是醛氧化酶、黄嘌呤氧化酶、硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶等的重要组分。钼酶存在于所有生物体内,参与蛋白质、含硫氨基酸和核酸的代谢[4]。
十多近年来,随着人们对钼的认识的逐步深入及国内外大量的流行病学调查研究和试验研究[5,6,7,8]的进展,进而发现钼除了作为人体必需微量元素发挥多种生理功能外,还对肿瘤的发生、发展具有预防和抑制作用,其抗癌机理可能有:(1)钼是抗氧化剂,有阻断过氧化物生成的作用,从而防止氧化损伤。(2)钼是硝酸还原酶的组份,此酶防止硝酸盐及亚硝酸盐与二级胺生成亚硝酸胺化合物;(3)钼对肝P450酶和去甲基化酶的活性有影响,小浓度可促进亚硝胺代谢并减少肝脏DNA化合物的生成;大浓度钼可减慢亚硝胺的代谢;(4)钼有封闭类固醇类激素受体的作用,像黄体酮受体,雄性激素受体,钼也是体内转失活雌激素进入活性体的抑制剂,因为乳腺是雌激素调节的靶器官,雌激素是促进乳腺正常和异常生长的因素,钼使乳腺雌性激素受体失活减弱激素致癌过程的促进作用[9]。
该实验结果表明:(1)钼酸铵在体外能明显抑制人肝癌细胞HepG2的生长和诱导细胞凋亡,并呈一定的量效和时效关系,不同浓度钼酸铵对HepG2细胞的增殖抑制率和细胞凋亡率随着药物浓度的增加和时间的延长而升高,明显高于对照组(P<0.0l)。(2)钼酸铵对HepG2细胞周期各时相有一定影响,随着钼酸铵浓度的增加和作用时间的延长,G0/G1期细胞显著增多,S期和G2/M期细胞减少,并出现凋亡峰。说明钼酸铵可以诱导肿瘤细胞出现G1期→S期阻滞和细胞凋亡,使许多肿瘤细胞不能进行DNA合成,从而起到抑瘤作用。抑瘤药物对细胞周期的影响可以通过阻滞G1期→S期阻止DNA复制或阻滞S期→M期抑制细胞分裂而抑制肿瘤细胞的生长。G1期是细胞DNA复制前期,是合成细胞生长所需要的多种蛋白质、RNA等重要物质的关键时期;S期完成DNA合成,DNA含量在此期增加一倍,此两期皆是药物等因素作用的靶点,抑制细胞周期G1期或S期,从而抑制肿瘤细胞增殖[10]。该研究说明在钼酸铵的作用下,HepG2肿瘤细胞的DNA合成复制受到抑制,导致细胞增殖分裂减慢并部分凋亡。
综上所述,钼酸铵能抑制人肝癌细胞的体外增殖,其机制可能与阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡有关,其作用的具体分子机制尚需进一步探讨。
参考文献
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肝癌细胞凋亡 篇7
关键词：康莱特,肝细胞癌,细胞增殖,细胞凋亡
康莱特(KLT)注射液是从传统中药薏苡仁中提取的新型双相广谱中药抗肿瘤药物,临床上多用其静脉乳剂,研究表明[1,2],KLT具有阻滞肿瘤细胞有丝分裂,抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,影响癌基因表达,抑制肿瘤新生血管生成,调节细胞因子水平以及逆转多药耐药等作用,而且能明显改善患者的生存质量[3,4]。目前KLT对小鼠肝癌细胞Hepa1-6抗肿瘤作用的机制还缺少全面的研究。本实验旨在分析康莱特是否是通过抑制Hepa1-6细胞增殖、诱导Hepa1-6细胞凋亡来发挥抑瘤作用,为其在临床应用中提供进一步的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 药物与试剂
康莱特注射液(100 ml/瓶,浙江康莱特药业有限公司,国药准字:Z10970091);DMEM培养液为Invitrogen公司产品,小牛血清、胰蛋白酶及噻唑兰(MTT)均购自武汉博士德生物工程有限公司;青霉素、链霉素为HyClone公司产品。二甲基亚砜(DMSO):天津市化学试剂公司。
1.1.2 主要仪器
ZS-2板式酶标仪(中国航天工业总公司),SW-CJ-FD型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司),流式细胞仪,CO2细胞培养箱,普通台式离心机。
1.2 细胞培养
小鼠Hepa1-6肝癌细胞株购于中国农科院细胞库,以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下常规培养。隔天换液一次,3~4 d传代一次。取对数生长期细胞制备单细胞悬液进行不同的实验。
1.3 MTT法检测细胞抑制情况
取对数生长期细胞稀释为1×105/ml密度每孔200μl移入96孔培养板中。加入KLT组B(10 ml/L)、C(20 ml/L)、D(30 ml/L)、E(40 ml/L)、F(50 ml/L)的10%胎牛血清DMEM培养液。另设A组(空白对照组,10%胎牛血清DMEM培养液)。分别培养24、48、72 h,实验终止4 h前加入MTT液(5 mg/ml)20μl。弃上清,加入DMSO 150μl,振荡10 min使结晶溶解,用酶标仪(波长490 nm)测定吸光度(OD)值,重复3次取平均值。药物对细胞生长的抑制率:抑制率(IC)=(空白对照组OD均值-用药组OD均值)/空白对照组OD均值×100%。
1.4 光镜观察细胞形态学改变传代试验
取对数生长期细胞稀释为1×105/ml密度每孔1 ml接种于放有盖玻片的6孔板中,细胞贴壁后,随机分为四组,分别加入KLT(B、D、F),并设A组作为对照(每孔总液量均为2 ml),培养48 h后取出覆盖有细胞的盖玻片,PBS洗3次,浸入40 g/L多聚甲醛中固定15 min,PBS洗2次,常规苏木精-伊红染色,光镜下观察细胞结构变化。
1.5 流式细胞术测定细胞凋亡率
取对数生长期细胞消化成单细胞悬液置6孔培养板,培养24 h后弃上清,加入KLT(B、D、F),每种浓度设平行4孔(即每种浓度重复4次),并设A组作为对照,继续培养48 h后,加入0.25%的胰酶1 ml将细胞消化,置入离心管中,离心(1 000 r/min,5 min),弃上清;PBS洗2次,离心、弃上清,加70%无水乙醇2 ml固定,振荡混匀,离心,弃上清,过300目筛子,PBS洗3次,加入1 ml PI工作液,4℃避光染色30 min,流式细胞仪分析。
1.6 统计学方法
采用SPSS 16.0软件进行分析,计量资料数据以均数±标准差(±s)表示,采用单因素方差分析及LSD-t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 KLT对Hepa1-6细胞生长的抑制效应
Hepa1-6细胞在KLT不同剂量、时间作用后,MTT法观察细胞生长情况结果示:随着KLT剂量的逐渐增加、作用时间逐渐延长,其细胞生长抑制率逐渐增加。各给药组与A组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01);各给药组组间比较示:与B组比较,C组与B组(P>0.05),D组与B组(P<0.01);与D组比较,E组与D组(P>0.05),F组与D组(P<0.01)。提示,KLT对Hepa1-6细胞的抑制作用呈剂量、时间依赖关系;并且KLT以10、30、50 ml/L作用时,细胞抑制率显著,因此,后续实验用此三种浓度进行。见图1。
2.2 KLT对Hepa1-6细胞形态及传代试验的影响
光镜示,Hepa1-6胞质呈粉红色,胞核呈深蓝色。A组细胞形态呈多边形或三角形,伪足多、长,满视野瘤巨细胞及核分裂相。随着给药浓度增加,细胞伪足渐回缩,细胞形态变小、圆,细胞轮廓清晰度增强,排列松散或聚集成团,细胞分裂相渐减少,瘤巨细胞渐减少。传代试验表明,A组细胞生长快,分裂增殖旺盛,3~4 d传代一次,随着给药浓度增加,传代能力逐渐下降且失去传代能力,出现悬浮现象。上述现象表明,细胞形态及传代试验与药物浓度呈依赖性,见图2。
2.3 KLT对Hepa1-6细胞凋亡的影响
不同剂量KLT作用Hepa1-6肝癌细胞48 h后,均在G0/G1期前出现一个亚二倍体峰,且该峰随着KLT作用浓度的增高而升高(图3)。经KLT(B、D、F)作用48 h后,细胞凋亡率分别为(7.86±0.40)%、(12.34±1.09)%和(28.67±0.85)%,而对照组仅为(2.88±0.30)%,各药物组与对照组比较、各药物组间比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。
(A:对照组;B~F:依次为KLT 10、30、50 ml/L组。1:凋亡峰;2:G0/G1期细胞;3:G2/M期细胞;2-3:S期细胞)(A:Control group;B-F:The group of KLT 10、30、50 ml/L.1:The peak apoptosis;2:G0/G1cells;3:G2/M cells;2-3:S cells)
3 讨论
原发性肝癌系全球发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一,且近年来发病率有上升趋势[5]。目前临床治疗肝癌仍以手术、放疗、化疗为主,但70%~80%的患者就诊时已失去手术最佳时期。临床常用的西药化疗物虽有很强的癌细胞杀伤性,但药物的毒副作用使体质较差的患者难以耐受,极大地降低了患者的生存质量。因此,临床上寻求一种既能抑制肝癌的生长,又无明显的毒副作用、提高患者生存质量的药物迫在眉睫。
恶性肿瘤包括肝癌在内,共同生物学特征是细胞的失控增长,即细胞凋亡与细胞增殖失衡。因此,抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡已成为目前肿瘤综合治疗的重要途径之一[6]。KLT注射液是从传统中药薏苡仁中提取的新型双相广谱中药制剂,具有多靶点治疗、提高晚期癌症患者的生存质量和毒副作用小等优点,目前临床已应用于非小细胞肺癌[7]、胃癌[8]、大肠癌[9]等恶性肿瘤的综合治疗中。本研究通过MTT法观察,结果表明,KLT能够有效抑制肝癌Hepa1-6细胞增殖,抑制率呈明显的时间、浓度依赖性,且10、30、50 ml/L抑制作用明显。
苏伟贤等[8]将不同浓度的KLT作用于人SGC-7901胃癌细胞,研究发现随着药物浓度增加,胃癌细胞核浆比例显著缩小,细胞恶性程度降低,细胞分化趋向良性;本研究细胞爬片HE染色示,发现给药后Hepa1-6肝癌细胞伪足回缩,细胞变小、变圆,核分裂相减少,出现悬浮现象,传代能力减弱,且呈浓度依赖性。进一步提示KLT可能在一定程度上能够诱导肿瘤细胞向正常细胞分化。
肝癌细胞凋亡 篇8
关键词：二甲双胍,顺铂,细胞凋亡,联合用药
肝癌是世界第五大癌症且发生率逐渐上升[1],治愈率较低,传统化疗药物毒性较大。近几年发现二甲双胍对多种肿瘤细胞具有抑制作用如肝癌[2,3],其机制主要通过激活AMPK抑制肿瘤细胞增殖[4],二甲双胍是一种口服的治疗糖尿病的药物,普遍用于II型糖尿病的临床治疗。研究提示二甲双胍联合顺铂作用于脑胶质瘤细胞时,二甲双胍降低了顺铂对肿瘤细胞的毒性[5],说明联合用药时要慎重。二甲双胍联合顺铂是否能促进肝癌细胞凋亡、且顺铂用量减小未见文献报道。本文以HepG2和SMMC7721等肝癌细胞为模型,初步探讨二甲双胍联合顺铂对肝癌细胞凋亡与增殖的影响及量效关系,为进一步的体内研究及临床研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及细胞培养
人肝癌HepG2和SMMC7721由本实验室提供。胎牛血清、RPMI1640购自Hyclone公司,DMEM购自Thermo公司。AMPK、p-AMPK一抗及相应二抗购自Santa Cruz。二甲双胍、顺铂及MTT购自Sigma公司。SMMC7721和HepG2细胞培养于10%FBS DMEM培养基中,两种细胞的培养条件均为37℃,5%二氧化碳无菌培养箱中。
1.2 MTT法检测细胞存活率
无菌条件下,取对数生长期的SMMC7721和HepG2以1×104/孔分别接种于96孔培养板,每孔加200μL 10%FBS培养液,37℃,5%二氧化碳及饱和湿度条件下培养过夜,细胞贴壁后,吸弃上清液,6个复孔/组,调零组、对照组、单药组、联合用药组各组加入不同浓度的药物,20μL/孔,其它用10%FBS培养液补足至200μL。二甲双胍药物终浓度为0.5、2.0、5.0 mmol/L,顺铂终浓度为8μg/m L、联合用药组顺铂终浓度为8μg/m L,调零组、对照组加入等体积的PBS代替二甲双胍及顺铂干预细胞。加药后继续培养24、48和72 h,每孔加入20μL MTT(5 mg/m L),继续培养4 h,弃去上清,加入150μL/孔DMSO,振荡10 min,使其完全溶解,酶标仪490 nm波长处测定吸光度(A),经计算得细胞生长抑制率(IR)。IR=(A对照组-A给药组)/(A对照组-A空白组)×100%
1.3 细胞核染色质的形态观察(Hoechst 33258法)
取对数期HepG2细胞15×104/孔接种于12孔板中,37℃,5%二氧化碳培养过夜,细胞增长至70%～80%,用药处理24 h,实验方案:空白对照组;2mmol/L的二甲双胍单药组;8μg/m L顺铂单药组;(2mmol/L+8μg/m L)二甲双胍+顺铂联合用药组,3个复孔/组。药物作用后吸尽培养液,加入1 m L甲醇/丙酮(1∶1)固定液,固定。去除固定液,PBS洗2遍,120 r/min。加antifade于6孔板中,盖上盖玻片尽量避免气泡。倒置荧光显微镜下检测呈蓝色的细胞核。
1.4 Western blot检测AMPK/p-AMPK的表达
取生长期HepG2细胞接种于培养皿中,培养过夜,待贴壁后,加药处理,处理方案为:空白对照组;2mmol/L的二甲双胍单药组;8μg/m L顺铂单药组;(2mmol/L+8μg/m L)二甲双胍+顺铂联合用药组,培养24 h后收集细胞,使用细胞裂解液制备细胞总蛋白,BCA法测蛋白浓度,取等量总蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳,转膜过夜,5%BSA室温封闭1 h,加入各种一抗4℃过夜,之后加入相应二抗室温孵育1 h,TBST洗涤后,加入ECL显影剂,暗室显影。
1.5 数据分析
实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行χ2检验分析,P<0.05表示差异有显著性。
2 结果
2.1 MTT法检测细胞存活率
不同浓度DDP、二甲双胍单独及联合作用HepG2细胞24、48和72 h。(图1和2)。MTT结果显示,HepG2和SMMC7721细胞经DDP、二甲双胍以及两者联合作用后,在不同时间、不同浓度均能出现不同程度细胞抑制作用,并且均呈现剂量-时间依赖效应,与单药组相比,HepG细胞联合用药组抑制率明显增高,呈现相加作用,其中的低浓度二甲双胍联合DDP(8μg/m L)抑制效果明显(P<0.05),SSMC7721细胞联合用药组中高浓度二甲双胍联合DDP(8μg/m L)抑制效果明显(P<0.05)。
2.2 细胞核染色质的形态观察结果
经20 mmol/L的二甲双胍单药组;8μg/m L顺铂单药组;(20 mmol/L+8μg/m L)二甲双胍+顺铂联合用药组,作用于肝癌HepG2细胞,通过Hoechst33258染色观察细胞核染色质的形态。见图2。HepG2细胞的DNA结合了Hoechst 33258后,紫外光激发时发射明显的蓝色荧光。20 mmol/L的二甲双胍单药组;8μg/m L顺铂单药组;(20 mmol/L+8μg/m L)二甲双胍+顺铂联合用药组细胞核出现凋亡形态学的改变,严重时甚至裂解为碎块,产生凋亡小体,细胞数目明显少于对照组,D组细胞凋亡最严重。而未处理的HepG2细胞没有出现明显的细胞核染色质的形态学改变。
2.3 AMPK/p-AMPK的表达
二甲双胍、DDP单药及两者联合用药作用于HepG2细胞,p-AMPK表达均上调,但联合用药组较单药组,p-AMPK表达上调最明显(图3)。
差异具有显著性,P<0.05,A:对HepG2细胞的抑制作用;B:对SSMC7721细胞的抑制作用
A:空白对照组;B:8μg/m L顺铂单药组;C:20 mmol/L的二甲双胍单药组;D:20 mmol/L二甲双胍+8μg/m L顺铂联合用药组
1:空白对照组;2:2 mmol/L的二甲双胍单药组;3:8μg/m L顺铂单药组;4:20 mmol/L二甲双胍+8μg/m L顺铂联合用药组
3 讨论
随着对二甲双胍肿瘤抑制作用研究的深入,发现联合使用二甲双胍和化疗药物,不仅能降低化疗药物的剂量,从而减少化疗药物的副作用,而且能增强化疗药物的作用[6,7]。顺铂是一种金属铂的化合物,含有类似烷化剂的双功能基团,与细胞内亲核基团结合,主要作用靶点为DNA,作用于DNA链间及链内交联,形成DDP-DNA复合物,抑制DNA复制转录,导致细胞凋亡,其广泛用于治疗前列腺癌[8]、乳腺癌[9,10]、黑色素瘤[11]等多种肿瘤中。
本文通过不同浓度的二甲双胍与DDP(8μg/m L)作用不同的时间,结果显示单药组及联合用药组随着二甲双胍浓度的增加,肿瘤细胞抑制率明显增高,且随着处理时间的增加,肿瘤细胞抑制率明显增加,二甲双胍单药及二甲双胍联合顺铂均呈时间-浓度依赖性。MTT结果显示低浓度二甲双胍联合顺铂对HepG2细胞抑制明显,与单药相比差异具有显著性(P<0.05),而中高浓度二甲双胍联合顺铂对SSMC7721细胞抑制明显,与单药相比差异具有显著性(P<0.05)。可能二甲双胍联合顺铂治疗癌症可以明显的降低顺铂的浓度,从而降低其化疗毒副作用,减轻对人体正常细胞的伤害,但是由于同一浓度二甲双胍对两种细胞的抑制率不同。因此,在临床用药时应该注意根据肿瘤类型而特异性用药,达到高效低毒的效果。另外,联合用药可以在一定程度上减轻机体对化疗药物的耐药性,使其更加有效的发挥其抗肿瘤活性。Hoechst33258实验结果发现二甲双胍联合顺铂作用于HepG2细胞24 h实验组,细胞凋亡最严重,与MTT结果相似,提示临床上治疗肝癌可以采用二甲双胍联合顺铂治疗,毒副作用小,疗效高,尤其对于患糖尿病的肝癌病人,治疗效果可能更佳。Western blot结果显示二甲双胍、DDP单药及两者联合用药作用于HepG2细胞,p-AMPK表达均上调,但联合用药组较单药组,p-AMPK表达上调最明显,可能二甲双胍联合低浓度顺铂可以激活AMPK,从而抑制m-TOR表达,抑制癌细胞增殖,促进癌细胞凋亡[12],发挥其抗肿瘤作用。实验结果表示两者联合用药通过降低顺铂浓度,减小顺铂对正常细胞的毒副作用,达到较好的治疗效果。
本研究结果显示二甲双胍联合低浓度顺铂可以增加顺铂对肝肿瘤细胞的毒性,其作用机制涉及AMPK/p-AMPK通路,提示二甲双胍可能可以作为顺铂治疗肝癌时一种辅助治疗药物。本研究为进一步的体内研究和临床研究奠定了初步基础。
参考文献
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肝癌细胞凋亡 篇9
1 材料与方法
1.1 材料
选择80株人体肝癌细胞, 均从上海艾研生物科技有限公司购进, 将细胞随机分为对照组与观察组, 各40株, 对照组采用奥沙利铂与索拉菲尼2种药物联合作用, 观察组采用人参皂甙Rg3、索拉菲尼以及奥沙利铂联合作用。
1.2 方法
1.2.1 配置培养液与药物储存液。
(1) 培养液的配置:抽取10%的胎牛血清与青链霉素1%, 滴加到RPMI-1640培养基中。 (2) 对索拉菲尼储存液进行科学配置:将索拉菲尼完全碾碎, 并去掉包衣, 滴入100%DMSO中, 过滤除菌后, 将药物进行冰冻存储。 (3) 配置奥沙利铂药物储存液:溶入葡萄糖水内之后冰冻存储。 (4) 人参皂甙Rg3药物储存液的配置:将人参皂甙Rg3药物溶解到无菌蒸馏水内, 冰冻储存。 (5) 使用药物储存液时, 采用培养基稀释, 储存液中加入浓度为1μg/m L的奥沙利铂、浓度为1μmol/L的索拉菲尼, 人参皂甙Rg3的浓度设置为30μg/m L。
1.2.2 传代培养。
对肝癌细胞株进行复苏, 并在37℃的温度下放入接种瓶及培养瓶中进行接种和培养, 待细胞贴壁约80%后进行培养传代, 除去培养液后, 采用PBS液清洗培养瓶壁, 并倒入EDTA的胰蛋白酶, 以洗去胰蛋白酶。离心细胞混悬液后以1∶5的比例行肝癌细胞培养传代。本次实验的所有细胞均属对数生长期的细胞。
1.3 评定方法
细胞的凋亡状况:选择对数期生长良好的肝癌细胞, 制成单细胞型悬液, 在6孔板内进行接种, 并在6孔板内装上灭菌盖玻片。开始24 h的培养和爬片, 加入对应的药物300μL, 采用TUNEL方法进行细胞凋亡检测。
1.4 统计学处理
本次研究所得数据全部使用SPSS18.0统计学软件进行处理与分析, 计量资料以±s表示, 用t检验, P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组肝癌细胞株的细胞增殖抑制情况比较
用药后, 观察组肝癌细胞的增殖抑制情况显著优于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05, 表1) 。
注:与对照组比较, *P<0.05。
2.2 两组肝癌细胞凋亡率与凋亡指数比较
用药后, 观察组细胞凋亡率与凋亡指数显著高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05, 表2) 。
注:与对照组比较, *P<0.05。
3 讨论
肿瘤的生长和对患者癌细胞凋亡的抑制情况与细胞增殖过多有明显的关系。在肿瘤疾病的发生与发展中, 肿瘤的细胞凋亡速度下降, 可用药物进行诱导, 加快肝癌细胞的凋亡速度, 提高肝癌患者的临床治疗效果[3]。
奥沙利铂是一种新型铂类抗癌药物, 主要通过药物产生的烷化结合物, 对人体的DNA产生作用。索拉非尼是一种多靶向类口服药物, 是一种多激酶类抑制剂, 可对多类细胞内与细胞表面的激酶进行同时控制, 阻止肿瘤细胞继续生长。人参皂甙Rg3是从人参内提取的有效活性成分, 抗癌和抗癌转移作用较好, 能够大幅度提升患者的免疫能力, 抑制肿瘤内形成新的血管, 以免癌细胞脱落到血管壁内并着床;避免肿瘤细胞对患者的血管壁基底膜进行过度侵润, 具有很好的抗浸润和抗转移功效[4]。本研究表明人参皂甙Rg3可显著提高肝癌细胞的凋亡率, 抑制肝癌细胞的增殖, 在肝癌细胞凋亡中起着至关重要作用, 值得在临床上推广和应用。
参考文献
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