细胞凋亡与细胞坏死

细胞凋亡与细胞坏死（通用9篇）

细胞凋亡与细胞坏死 篇1

脑胶质瘤为颅内最常见的恶性肿瘤,死亡率居颅内肿瘤的首位,呈浸润侵袭性生长,术后极易复发,5 年生存率不到20%。TNF相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor- related apoptosis- inducing ligand,TRAIL)属于TNFSF中的成员之一,可与膜受体结合诱导细胞发生凋亡,且对正常的组织和细胞无毒性作用[1]。

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,BMSCs)具有很强的分化能力,在合适的条件下可以分化成骨、软骨、脂肪组织等多种组织细胞[2,3,4]。BMSCs的这一特点及其靶向迁徙的能力[5]使它在基因治疗中具有了独特的价值。BMSCs可作为理想的分子载体,通过外源治疗基因TRAIL修饰后的BMSCs可以向受损组织趋化及发挥修复作用。由此可知,BMSCs经过肿瘤杀伤基因修饰后有可能携带治疗性物质靶向杀伤肿瘤细胞。本实验将TRAIL的选择性杀伤细胞作用与BMSCs的肿瘤细胞迁徙性相结合,探究TRAIL转染骨髓干细胞后靶向治疗脑胶质瘤的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞和主要试剂

人骨髓间充质干细胞购于美国Millipore公司,U251胶质瘤细胞株购自南京凯基生物公司,血清和DMEM培养基均购于美国Millipore公司,RT-PCR(Reverse Transcription-Polym erase Chain Reaction,逆转录-聚合酶链反应)试剂盒,美国BIO-RAD公司,Trizol试剂,Invitrogen公司,质粒提取盒,天根生化科技有限公司,转染试剂(Trans IT-2020),Invitrogen公司,流式试剂,美国BD公司,一抗、二抗,英国Abcam公司,质粒由加拿大UBC大学实验室提供。

1.1.2细胞培养与传代

取出BMSC(U251)冷冻保存细胞于37℃水浴锅中迅速复苏,将细胞液移于离心管中离心、收集细胞,再加入含10%胎牛血清(fatal bovine serum,FBS)的完全培养基,充分吹打悬浮细胞,移于培养瓶中,置于37℃、5%二氧化碳孵育箱培养,待细胞长到80%~90%时,用0.25%胰酶消化、收集细胞,进行传代培养。

1.2 实验方法

1.2.1 BMSCs向肿瘤细胞迁徙的体外实验

利用8μm孔径的Transwells小室进行BMSCs迁徙实验。将1×105个/ml BMSCs置于上室,U251胶质瘤细胞置于下室,然后置于37℃、5%二氧化碳培养箱中24 h,取下滤膜,用PBS冲洗2遍,并用细胞铲刮除黏附的细胞,甲醛固定30 min,风干后用0.1%结晶紫染色30 min,随机选取5个视野在显微镜下观察、计数。

1.2.2质粒的扩增与提取

质粒属于绿色荧光蛋白的分泌型TRAIL真核表达质粒,内含有目的基因TRAIL以及抗AMP(ampicillin,氨苄青霉素)片段,置于-20℃保存备用。取质粒与感受态细胞(由实验室提供)冰上解冻,将两者混匀后于42℃水浴90 s,加入LB培养基(Luria-Bertani培养基),摇床振荡复苏细胞;在选择性培养板(AMP)上涂板,过夜培养。挑取单菌落加入含AMP的LB培养基中振荡培养,待LB变浑,采用高纯度质粒小提中量试剂盒(tiangen)进行提取,具体参照试剂盒说明书,提取的质粒置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.3质粒转染BMSC细胞

待细胞达80%左右时进行转染,转染前细胞用无双抗培养基培养24 h。将含TRAIL的质粒溶于Opti-MEM培养基中混匀,另取转染试剂Trans IT-2020溶于Opti-MEM培养基混匀,将两溶液吹打混匀后立即加入细胞中,并边加边摇,置于37℃、5%二氧化碳孵育箱中培养,6 h后换成完全培养基。培养24~48 h后于显微镜下观察。

1.2.4质粒转染的BMSCs中目的基因的表达

应用PCR检测TRAIL基因的表达情况,培养24 h后收集各组BMSC细胞,用PBS(phosphate belanced solution,磷酸缓冲液)冲洗3次,加入Trizol裂解细胞,严格按照说明书提取总RNA(ribonucleic acid,核糖核酸)。引物序列通过Olig 6软件设计,由宝生物公司合成。扩增TRAIL基因编码序列的引物:正向5'-TGACTGTGGCTGTGACTTA-3';反向5'-ACTCCCAGGTTTCTATCTT-3'。β-actin的正向5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3';反向5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。PCR扩增条件:共30个循环,每个循环包括94℃30 s,55℃30 s,72℃60 s。同时扩增管家基因β-actin作为对照验证。每孔加5μl样品,并在一侧加入5μl的2 000 Marker,进行琼脂糖凝胶电泳,20 min后获取图片,并对数据进行分析。

应用Western blot法检测相关蛋白的表达水平,β- actin作为内参。培养48 h后收集各组细胞蛋白产物,取50μl样本与5×SDS- PAGE缓冲液混合,电泳后经转膜仪将样本转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,经漂洗、封闭、一抗(抗TRAIL)孵育、二抗孵育,检测结果并通过Image J2X软件扫描图像及定量分析。

1.2.5流式细胞仪检测U251细胞的凋亡率

各实验组细胞处理48 h后,收集培养基到新的离心管中,加PBS冲洗3次,将冲洗液吸取到相应离心管中(避免丢失悬浮的凋亡细胞影响实验结果)。用0.25%胰酶消化、收集细胞到相应的离心管,1 000r/min,离心5 min。用预冷的PBS冲洗3次,然后用1×bind buffer将细胞配成(1-5)×104/ml的细胞悬液,取100μl加入新的EP管中,每管加5μl Annexin V-FITC和5μl PI(propidium iodide),暗环境培养15 min后加入400μl 1×bind buffer,立即用流式细胞仪检测,1 h内完成,并分析实验结果(实验需设置3组质控样本)。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,用配对资料t检验,各组数据均符合正态分布,转染后的BMSCs细胞对U251 细胞的增抑制率及凋亡率比较,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMS Cs向U251 细胞的迁徙能力

应用Transwell法验证BMSCs向肿瘤细胞的迁徙能力,BMSCs与U251 细胞共培养48 h后,随机选取5 个视野在显微镜下观察、计数,可见U251 细胞培养液可刺激更多的BMSCs发生迁徙,与生理盐水及培养基比较,差异有统计学意义(P <0.05)(见图1)。荧光显微镜下发现,BMSCs主要聚集于U251细胞周围,而在无U251 细胞的培养基周围仅散在少量BMSCs(见图2)。由此可证明,BMSCs向肿瘤细胞迁徙的特异性。

2.2 RT- P CR及We s te rn blot检测目的基因表达

通过PR- PCR扩增,将扩增的目的基因分别加样进行琼脂糖电泳,经20 min后观察结果并成像(见图3)。结果显示条带随培养时间的延长依次由淡变亮,表明TRAIL在BMSCs内成功表达。应用Western blot法检测转染组与未转染组目的基因的表达情况,可见转染组的TRAIL表达与PCR结果有相同效果,随着培养时间的延长表达量相继增加,β-actin在不同细胞的表达量无差异。见图4。

2.3 流式细胞仪检测U251 细胞的凋亡率

采用Annexin V/PI双染色法进行检测各组U251 细胞的凋亡情况并记录数据,U251 细胞的凋亡率取右下象限(见图5),即Annexin V- FITC(+)/PI(-),由表1 可见转染组诱导U251 细胞的凋亡率与空白组比较差异有统计学意义(P <0.05),而未转染组与空白组比较差异不明显(P >0.05)。TRAIL对BMSCs的凋亡作用见图6。 由表2 可见转染的TRAIL对BMSCs无明显毒性作用(P >0.05)。

生理盐水及培养基仅诱导少量的BMSCs发生迁徙比较,U251细胞培养液可刺激更多的BMSCs发生迁徙(P<0.05)

质粒属于绿色荧光蛋白的分泌型TRAIL真核表达质粒,转染后的BMSCs置于上室,U251胶质瘤细胞置于下室,共培养48 h后,可见BMSCs透过Transwell小室,且主要聚集于U251细胞周围,而无U251细胞的地方较少

A:β-actin组;B:TRAIL组。TRAIL组又分为24、48和72 h组。可见TRAIL条带的表达量随时间呈递增趋势

取未转染的BMSCs培养48 h后提取TRAIL表达蛋白产物行Western blot检测作为对照组;以转染后的BMSCs表达产物作为实验组,并依次分为24、48和72 h组,证明TRAIL的表达量随时间递增

A:实验以BMSCs TRAIL+U251作为实验组;B:BMSCs+U251作为阴性对照;C:单纯U251细胞作为空白对照组。共同培养48 h后收集细胞于新的离心管,分别加入Annexin V/PI试剂后行流式细胞检测,可见BMSCs TRAIL+U251组U251细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)

A:实验以BMSCsTRAIL作为实验组;B:单纯BMSCs作为对照组。共同培养48 h后行流式细胞检测,可见两组BMSCs的细胞凋亡率比较(P>0.05),证明TRAIL对BMSCs无影响

(%,n=3,±s)

注:1)与BMSCs+U251 组比较,P <0.05;2)与空白对照组比较,P >0.05

(%,n=3,±s)

3 讨论

人脑胶质瘤是神经外科最常见恶性肿瘤,发病迅速,致死率高[6,7],目前针对脑胶质瘤的治疗有放疗、化疗、手术治疗,但治愈率很低,术后极易复发[8],5年生存率也不足20%。因此,对脑胶质瘤是治愈要探索新的治疗手段,众所周知,细胞的分化受到基因的严密调节,能否选择一种方法在肿瘤细胞的生长分化过程中杀伤肿瘤细胞呢?许多专家已经证实肿瘤坏死因子和抑癌基因在调控细胞生长分化中至关重要[9],所以,基因治疗脑胶质瘤可能成为根治胶质瘤的有效方法。

TRAIL是肿瘤坏死因子家族的最新成员,可与肿瘤细胞膜上的DR5 结合,再通过一系列级联反应组成DR5- FADD- Caspase 8(DISC)死亡诱导信号复合体,激活Caspase 8,诱导肿瘤细胞发生凋亡[10],而对正常细胞无影响[11]。另外,也有相关文献证明TRAIL联合放化疗可显著增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性,增加耐药性肿瘤的凋亡,因此,TRAIL日益受到人们的重视,但是TRAIL在肿瘤治疗中的应用较为局限,原因有:1TRAIL在血浆内的半衰期极短,大约小于1 h[12];2具备生物活性的TRAIL必须以三聚体的形式存在,故难以透过血脑屏障发挥作用;3应用腺病毒基因疗法体外能诱导数种人肿瘤细胞凋亡,但体内有引起宿主抗病毒免疫反应的可能。BMSCs的肿瘤迁徙性已在许多文献中被证实,可能是肿瘤细胞分泌相关性因子,从而诱导BMSCs发生迁徙,BMSCs的这一特性为靶向杀伤肿瘤细胞提供了理想的载体。BMSCs可以向肿瘤组织趋化,定位于其间质中增殖、分化[13],所以将目的基因转染入骨髓干细胞,通过骨髓干细胞将治疗基因带入肿瘤组织,由于治疗基因的存在及分泌杀伤物质从而达到肿瘤的抑制作用。本实验主要是探究TRAIL基因作为目的基因转染骨髓干细胞后对U251 胶质瘤细胞的体外靶向抗瘤作用。

实验构建TRAIL的表达载体转染骨髓干细胞,转染成功后,通过PCR及Western blot检测转染后TRAIL的表达,由图3、4 可知转染后的TRAIL基因在BMSCs中表达,且TRAIL的表达量随时间延长而增加。选择第3 天的转染组与U251 胶质瘤细胞共培养,并利用流式细胞仪检测U251 细胞的凋亡率,发现实验组U251 细胞的凋亡率明显增加,BMSCs作为基因载体诱导肿瘤细胞凋亡,自身却不发生凋亡。由此推断,BMSCs作为有效的基因载体,不仅克服TRAIL基因在血浆中半衰期短的难题,而且TRAIL修饰后的BMSCs具备靶向抗瘤的作用,这为恶性胶质瘤的治疗提供了新的途径。

综上所述,在体外实验中利用BMSCs肿瘤迁徙的特异性,将BMSCs作为基因载体,可提高TRAIL对U251 胶质瘤细胞的靶向抑癌作用。但U251 细胞仅属于脑胶质瘤细胞的一个细胞系,不能反映所有颅脑肿瘤的特性,对其他类型的脑瘤细胞仍需进一步的研究证实。

细胞凋亡与细胞坏死 篇2

教学目标

1.知识与技能:(1)说出癌细胞的主要特征;(2)说出引起细胞癌变的外因(致癌因子)

2.过程与方法:运用资料分析的方法,讨论健康的生活方式与癌症预防的关系。

3.情感态度与价值观:讨论恶性肿瘤的防治,选择健康的生活方式和积极的生活态度。

教学重难点

教学重点:(1)癌细胞的主要特征;(2)致癌因子

教学难点:原癌基因与抑癌基因的区别

教学过程

【导入】导入新课

大家都知道大自然是神奇的,万物相生相克,任何生物都有自己的天敌,但是人类在地球上没有天敌,但却有威胁生命的敌人,那就是疾病!任何疾病都有可能夺走人的生命,据统计,有四类疾病居于首位,我们称之为“四大杀手”—心血管病、癌症、艾滋病和糖尿病。

下面我们一起看一组图片,缅怀一下我们所熟悉并喜欢的人;影坛巨星、“百变天后”:梅艳芳;《红楼梦》我们所熟悉的林妹妹的扮演者:陈晓旭。也许是天妒英才,如蓝体字所标,这些让我们怀念的人都是被四大杀手之一---癌症夺走了生命。

我们再来看两张图表,“全球每年新增癌症病例”“我国癌症死亡人数”,(大家注意一下:两张图表的单位是万!)

之前我们已经完成了对细胞完整生命历程的学习,大家知道:细胞是有一定寿命、形态和功能的。正常机体内的细胞有正在进行着分裂和分化的,比如骨髓中的造血干细胞;有一些不分裂,但执行着重要功能,比如人体的心肌细胞、神经细胞;还有一些正在衰老的凋亡的细胞,比如皮肤表层的表皮细胞。但是,有的细胞受到外界环境的某些刺激后,细胞中的遗传物质会发生变化,这样的细胞就不再受机体的控制,连续的进行恶性增殖,我们就说这样的细胞是癌细胞。细胞癌变的外界因素就是我们所说的致癌因子。由于癌细胞大量的增殖,使机体患病,这样的疾病就是我们大家听到都会惧怕的癌症!这样,大家对于癌症应该或多或少都有一些了解吧?

讲到癌症,我们就不得不提到“肿瘤”这一概念。肿瘤是机体中成熟的或在发育中的正常细胞,在有关因素的长期作用下,呈过度增生或异常分化而形成的新生物。所以呢,有人就说了,癌症就是肿瘤,就目前你了解的情况,这种说法正确吗?大家讨论一下。

想必已经有结果了吧?肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。良性肿瘤生长缓慢,与周围组织界限清楚,不发生转移。而恶性肿瘤生长迅速,可转移,还会产生有害物质,破坏正常器官结构,使机体功能失调,威胁生命,称为“癌”。

而,“癌”是由多个癌细胞形成的,也就是说癌的结构基础是癌细胞。也许同学们都会有一些疑问:什么是癌细胞?癌细胞的特点是什么?如何预防癌症?带着这些问题,我们来一起学习一下今天的课程:细胞的癌变。(板书)

【讲授】癌细胞特征

(1)研究材料

要研究了解新事物,我们必须有研究材料,而我们研究癌症的机理,了解癌细胞的特点,科学家经过探索,找到了海拉细胞。海拉细胞来自名叫海拉的女性宫颈癌症患者,这位患者已死去58年,但从她身上取下的癌细胞却在实验室一代代地传了下来。说到癌细胞了,根据大家的预习,之前介绍癌症形成时我也提到了癌细胞的相关知识,大家已了解癌细胞的概念了吧?我们一起再看一下:机体有的细胞受到致癌因子的作用,细胞中遗传物质发生变化,就变成不受机体控制的、连续进行分裂的恶性增殖细胞。

(2)特点

知道了什么是癌细胞,为什么它就能夺走人的生命呢?这就与它的特点有关。

对比一下这两幅图片:正常细胞和癌细胞增殖的模式图,大家能得出什么结论呢?(学生思考、讨论)谁能告诉我?…………对!在适宜的条件下,癌细胞能够无限增殖,这就是癌细胞的第一个特征。(板书)

我们继续观察两张细胞图片----正常成纤维细胞和癌变的成纤维细胞,大家觉得正常细胞和癌细胞相对比,癌细胞什么发生了变化呢?(学生讨论)这是模式图,再来看一张真实的癌变后的成纤维细胞显微图,很明显,我们看到圆球型的细胞,由此,你能得出什么结论呢?…………癌细胞的形态结构发生了显著变化,这是癌细胞的第二个主要特征。(板书)

大家观察一下这幅癌细胞分散和转移示意图,图中明显看出癌细胞通过淋巴管或血管从一个组织转移到其他组织。我想问大家一个问题,正常组织细胞能转移吗?(不能)是的,正常组织细胞是不能随意转移的,细胞和细胞之间有连接,是固定在一定区域的。大家想一下什么物质使细胞相对固定呢?(学生可能回答糖蛋白,或者教师引导),这里大家可以想象一下,山楂是做成冰糖葫芦前较粘牙还是成为后粘牙。正是癌细胞表面的糖蛋白减少,细胞之间的粘着力降低,细胞才会容易转移。同样,这是癌细胞的第三个主要特征。

【讲授】癌变原因

了解了癌细胞的概念和特点后,大家肯定想知道机体正常的细胞为什么会发生癌变。大家想一下,中国人讲究“内外兼修”,细胞畸形分化、不正常增殖也是内因、外因相互作用导致的。我们先讲外因----致癌因子。上节课结束后我让大家预习本节课的内容了,谁能告诉我致癌因子的分类?………很好!包括物理、化学、病毒致癌因子。

A.我们先了解物理致癌因子:辐射(紫外线、X射线、电离辐射等)(介绍三幅图画和下张PPT)

B.第二类致癌因子:化学致癌因子。化学上把物质分为无机物和有机物,同样致癌因子也包括无机物—如石棉、砷化物、铬化物、镉化物等和有机物—如黄曲霉素、亚硝胺、尼古丁、甲醛、苯、联苯胺、煤焦油、苯并芘等。(随机介绍其中几种,如:亚硝酸—酸菜和发霉的食物中常含有的物质)让学生自己阅读命令按钮的PPT的内容,稍作讲解。

C.最后一类致癌因子:病毒致癌因子。如乙肝病毒、H7N9病毒等病毒感染人的细胞,将其基因整合进入人的基因组,诱发细胞癌变。

外因是通过内因发挥作用的,知道了外因,我们了解并掌握以下内因是什么以及内因的作用。通过前面的学习,我们知道细胞一切生命活动直接或间接受遗传物质DNA的调控,同样在细胞内有专门控制细胞分裂、分化、衰老和死亡的DNA片断(基因),包括原癌基因和抑癌基因。

原癌基因是细胞内与细胞增殖相关的基因,是维持机体正常生命活动所必须的,负责调节细胞周期,控制细胞生长和分裂的进程。在进化上高等保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异,基因产物增多或活性增强时,使细胞过度增殖,从而形成肿瘤。

抑癌基因也称为抗癌基因,正常细胞中存在基因,在被激活情况下它们具有抑制细胞增殖作用,但在一定情况下被抑制或丢失后可减弱甚至消除抑癌作用的基因。正常情况下它们对细胞的发育、生长和分化的调节起重要作用。

为了更清楚地了解细胞癌变的内在因素,我们来看一个流程图。(介绍图)

【讲授】预防与治疗

癌症,听起来相当可怕的一个名词,而且现在也没有有效的措施和药物治愈它。但是,我们可以“未雨绸缪”,做好预防工作,那么我们采取什么措施来预防癌症呢?大家讨论一下。我们都知道太阳光中含有相当数量的紫外线等其它射线,而且现在臭氧空洞越来越大,范围越来越广,长期在阳光下曝晒,易患皮肤癌,那么,我们还能晒太阳吗?应该怎么做呢?(找学生回答)总结为:早八点之前和晚五点之后可以适当晒晒太阳,阳光强烈时需要出门时涂抹防晒霜,打太阳伞。但不要因为怕得皮肤癌而不晒太阳,要知道适当的紫外线有助于钙的吸收哦!日常生活中还有哪些方面需要注意?(学生回答一些,教师总结)如:房子装修好后不要立即住进去;电脑、电视、手机等有辐射,尽量远离;另外,吸烟,之前大家看过一个吸烟者的肺和正常人的肺,差别特别大!所以如果你的亲人吸烟,尽量劝阻。另外,二手烟的危害也很大的,公共场所之所以不允许吸烟不只是为了卫生,也是为了我们大家的健康!

请大家阅读教材P.127,资料分析:“健康的生活方式与防癌”。(半分钟后)有道是“病从口入”,癌症也是一种病,它也是从“口入”的吗?我们一起看一下这三幅图,食物是不是很诱人呀?薯条、酸辣粉、炸鸡腿,哇!真的很好吃的!口水流出来了吧?好吃归好吃,但不能多吃,它们都含有有毒物质----丙烯酰胺、亚硝胺、苯并芘,它们可是属于我们刚学的化学致癌因子哟!大家再来看一下这个表格。(一分钟)这些我们常吃的食物中含有较多致癌物质,如黄曲霉素、亚硝酸盐、苯并芘等,及防腐剂、食品添加剂等,且营养成分低。所以呢……(师生一起总结)。为了健康,我们应该多吃这些食物:大豆,动物肝脏等。

除了在饮食方面多注意些,我们还应该做什么呢?(学生讨论,教师总结)

答案是:增强体质,保持心态健康,养成良好的生活习惯,从多方面积极采取防护措施。

课后小结

学了部分关于癌症的知识,我们做一下总结,回顾一下知识点。(师生一起随着PPT做总结)。我给大家选了四个研究性课题作为课后作业,大家选一个做,不过,如果你想多做一个或全做完,我也不反对!

大纲对这节课的要求我们已经讲完了,为了拓宽大家的知识面,我们了解一下癌症的诊断和治疗。常用的诊断方法有病理切片的显微观察,CT,核磁共振以及癌基因的检测等。现在大家都擅长利用网络查资料,这些方法的具体机理,感兴趣的同学自己了解吧,我就不

过多详细介绍了。而大家知道的常规的治疗方法有?我们一起看一下它们的介绍和区别:手术切除,这就需要尽可能在早期发现癌组织,才能完全清除;放射线疗法是使用高能X射线或γ射线集中照射患病部位,杀死癌细胞。放射线疗法不适于病灶范围已经扩大的患者;化学疗法主要利用抗癌剂杀死癌细胞。多种抗癌剂混合使用往往可以获得较好的疗效,并且副作用小。除了常规方法,我们现在还有中医药治疗、干细胞治疗、内分泌治疗、免疫治疗、生物治疗等治疗癌症的方法,同样,感兴趣的同学自己查阅资料,课后大家也可以交流一下。

课后习题

1.某人长期吸烟成瘾,晚年不幸得了肺癌,他的致癌是受到了哪种因子的作用

A.物理致癌因子B.化学致癌因子

C.病毒致癌因子D.物理和化学致癌因子

2.人和动物细胞的染色体上普遍存在着原癌基因,但是大多数人不患癌症,只有少数人患癌症,其原因是()

A.原癌基因不能被激活B.在正常情况下,原癌基因处在受抑制状态

C.癌细胞是细胞畸形分化造成的D.大多数人体内有抵抗癌细胞的免疫功能

3.人体中的某一体细胞,如果连续分裂了60次以上还在继续分裂,则此细胞很可能发生了()

A.分化能力很强B.全能性增强C.衰老D.癌变

4.下列关于原癌基因的说法,不正确的是()

A.细胞中不正常的基因B.和抑癌基因共同调控细胞周期

C.原癌基因被激活导致细胞癌变D.可被内外因子激活的正常基因

5.导致癌细胞易于扩散的原因是()

A.癌细胞没有接触抑制现象B.细胞之间的黏着性下降

C.通过血液或淋巴转移D.细胞能无限增殖

6.致癌因子的作用主要是()

A.造成细胞中遗传物质数量减少B.使细胞中有关蛋白质变性

C.影响细胞中某些酶的活性D.导致细胞内有关基因的突变

7.(判断)癌细胞是能连续分裂的细胞()

8.(判断)人体所有的细胞中都有与癌变有关的基因()

板书

细胞的癌变

一、癌细胞的概念

二、癌细胞的特征

(1)在适宜的条件下,癌细胞能够无限增殖

(2)癌细胞的形态结构发生显著变化

(3)癌细胞的表面发生变化

三、癌变的原因

外因:物理、化学、病毒致癌因子

内因:原癌基因或抑癌基因突变

四、癌症的预防

五、癌症的诊断和治疗

细胞凋亡与细胞坏死 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂

巴戟天购自广东省德庆县药材公司,一等品,由河南省食品药品检验所鉴定,由所购生药提取得到巴戟天醇提物;IL-1β、TNF-α酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒购自美国R&D公司,批号分别为:110521、110430;末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记测定[terminal dexynucleotidyl transferase(Td T)-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL]法检测试剂盒购自美国Roche公司,批号:13764213211;其他试剂均是国内分析纯。

1.1.2 仪器

Langendorff灌流装置(上海奥尔科特生物科技有限公司);CASTEAX2100型全自动酶联免疫分析仪(美国Beckman公司);Biofuge Stratos台式高速低温离心机(德国Heraeus公司)。

1.1.3 实验对象

健康雄性Wistar大鼠,体质量260~303 g,平均(281±18)g,购自河南省实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 离体心脏灌流模型的建立

用腹腔注射质量分数2%的戊巴比妥钠(0.2μL/g)方法麻醉大鼠,同时注射质量分数2%的肝素钠(0.1μL/g)抗凝;开胸出取心脏,放于盛有0~4℃预冷灌流液的器皿中,冲洗后,于Langendorff灌流装置上开始进行灌流。灌流压:82 k Pa;以Krebs-Hanseleit磷酸缓冲液作为灌流液,其成分(mmol/L)如下:Na Cl 118,Na HCO325.0,KCl4.7,Mg SO4·7H2O 1.2,KH2PO41.2,Ca Cl222.5,Glucose 11.0,p H为7.4;渗透压达到300 m Osm/L。灌流前用95%O2+5%CO2混合气体平衡15 min,灌流过程中保持,保持装置内温度处于37℃,并持续通气。

1.2.2 分组及处理方法

80只健康雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组、IRI组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组四组,每组各20只。空白对照组:持续灌流110 min;IRI组:预灌20 min,保持在37℃条件下,停灌60 min,再复灌30 min;巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组:分别在预灌时加入浓度为600、300 mg/L巴戟天醇提物,其他处理同IRI组。

1.2.3 IL-1β、TNF-α的检测方法

离体大鼠心脏灌流结束后,每组中取10只剪取左心室,用滤纸吸干,然后用匀浆器将左心室组织制成质量分数0.85%生理盐水匀浆,4℃低温高速离心机3 500 r/min离心10 min,取适量上清液,采用ELISA法检测IL-1β、TNF-α的表达,具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 心肌细胞凋亡的检测方法

离体大鼠心脏灌流结束后,每组中取另外10只大鼠剪取左心室,用40 g/L多聚甲醛固定,然后经梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋等,最后制成4μm切片进行TUNEL染色。TUNEL法具体操作按照试剂盒说明书进行。TUNEL染色后,正常心肌细胞的细胞核呈蓝色,而发生凋亡的心肌细胞的细胞核呈棕黄色。每只大鼠心脏观察3张切片,每张切片在400倍镜下选择5个视野,每个视野计数100个细胞,然后计算心肌细胞的凋亡指数。凋亡指数=(总凋亡细胞数/总观察细胞数)×100%。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,IL-1β、TNF-α及凋亡指数计量资料用均数±标准差表示,并进行正态性检验和方差齐性检验,比较采用单因素方差分析和LSD-t检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 心肌缺血再灌注后各组IL-1β、TNF-α水平比较

与空白对照组相比,IRI组的IL-1β、TNF-α水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与IRI组比较,巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05);巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组的IL-1β、TNF-α水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 心肌缺血再灌注后各组心肌细胞凋亡指数比较

与空白对照组比较,IRI组的心肌细胞凋亡指数升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与IRI组比较,巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组凋亡指数降低(P<0.05);巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组的凋亡指数比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3 讨论

心肌IRI是一个多机制参与、多因素相互影响而导致的复杂的病理生理过程,发生过程中存在多条信号转导通路的相互作用。近年来,大量研究表明,炎症反应也参与了心肌IRI的形成[3,5,6]。冠状动脉再通后,中性粒细胞能够释放IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α、细胞间黏附分子(ICAM)等炎症因子,这些炎症因子相互影响、相互作用,形成一个动态的细胞因子网,能够促进血管内皮细胞的通透性增加、中性粒细胞的黏附、通过血管壁等活动,进而导致心肌的损伤或心肌细胞的凋亡等。总之,炎症反应通过炎症因子的分泌或释放对IRI后心肌产生各种不同的影响,从而促进或阻止心肌IRI的发生、发展。

注:与空白对照组比较,△P<0.05;与IRI组比较,*P<0.05;与巴戟天高剂量组比较,※P<0.05

注:与空白对照组比较,△P<0.05;与IRI组比较,*P<0.05;与巴戟天高剂量组比较,※P<0.05

IL-1β是一种重要的炎症因子,在正常心肌组织中的表达较低,当心肌IRI发生时其水平明显增加。IL-1β引起心肌组织损伤的机制可能是:IL-1β能够直接上调ICAM-1等的表达,进而诱导中性粒细胞黏附于内皮细胞及其基质并通过内皮进入缺血区,经释放氧自由基和栓塞微血管等途径,最终引起IRI后心肌的损伤及细胞的凋亡[7,8]。TNF-α也是一种重要的炎症因子,通常情况下,其在心肌组织中的水平较低,当心肌IRI发生后,损伤的细胞会大量释放TNF-α,而其通过以下途径促进心肌IRI的进展:TNF-α能够抑制心肌收缩功能;刺激内皮细胞和中性粒细胞产生黏附分子,加快加重细胞间的黏附以及血管内凝血,从而导致心肌细胞发生坏死、凋亡等,加重心肌IRI的程度。TNF-α同时还参与心肌细胞的损伤后重建[9,10]。

本研究结果显示:IRI组的心肌组织中IL-1β、TNF-α水平均高于空白对照组,进一步提示这两种炎症因子参与了心肌IRI的进程,也可作为心肌IRI程度的评估指标;巴戟天醇提物两个剂量组的IL-1β、TNF-α水平低于IRI组,提示巴戟天醇提物能够通过减轻心肌IRI后的炎症反应而减轻心肌损伤。本研究表明,心肌IRI后,心肌细胞凋亡指数增加,进一步提示心肌IRI的形成有心肌细胞凋亡的参与,也可作为心肌IRI程度的评估指标;巴戟天醇提物两个剂量组的心肌细胞凋亡指数低于IRI组,提示巴戟天醇提物降低了心肌IRI后心肌细胞凋亡。

综上所述,巴戟天醇提物能够减轻心肌IRI后心肌细胞凋亡,这可能与其能够降低心肌组织中的IL-1β、TNF-α表达有关,巴戟天醇提物可能通过这一途径发挥保护IRI心肌的作用。

参考文献

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6.3细胞的衰老与凋亡教案 篇4

导入

每个生物个体都要经历出生、生长、成熟、繁殖、衰老直至最后的死亡，生物体内的细胞也是一样，要经过增殖、分化、衰老和凋亡。前面我们已经学习了细胞的增殖和细胞的分化，今天我们就来学习第三节，细胞的衰老和凋亡。

问题一：婴儿体内有没有衰老细胞？为什么老人表现出衰老，但是婴儿却没有表现出衰老？

答案：有。老人体内的衰老细胞非常多，而婴儿体内很少。个体衰老与细胞衰老的关系有什么关系呢？

对于单细胞生物体来说，因为是整个生物体是由一个细胞构成的，因此细胞的衰老或死亡就是个体的衰老或死亡。但对于多细胞生物体来说，组成生物体的细胞总是在不断更新着，总有一部分细胞处于衰老或走向死亡的状态，也有一些是幼嫩的细胞，但从总体上看，个体衰老的过程也是组成个体的细胞普遍衰老的过程。

一、个体衰老与细胞衰老的关系 1.单细胞生物体 2.多细胞生物体

现在请同学们想一下，在45十以后，我们来参加同学聚会，你的同学会有变化吗？大家现在就来想一下我们老了之后会变成什么样？ 答案：（1）那时候，我们的头发都会变白，这主要是由于人体内酶的活性降低。黑色素是酪氨酸酶催化酪氨酸造成的，酶的活性降低，黑色素合成减少。

（2）那时候，我们脸上可能已经出现了老年斑。这主要是由于色素的积累。

（3）大家有没有发现老年人特别怕冷。在冬天的时候，我们年轻人只穿了2-3件衣服，但是老年人却要穿4-5件衣服。主要是由于人体的能量主要是由于呼吸作用提供的，呼吸作用减弱了，人体得到的热能就少了。而人体的呼吸作用主要是在线粒体内进行的，所以衰老的细胞线粒体的数量也是减少的。

（4）大家有没有注意到老年人的皮肤皱巴巴的，这主要是由于什么原因呢？

这主要是由于老年人体内的水分减少的原因。而体内许多化学反应都要在水中进行，所以水分的减少，必然导致人体的新陈代谢的减慢。

（5）有的老人还会出现“救生圈”，这也主要是由于老年人新陈代谢减慢的引起的。在吃进相同的食物后，他们消耗能量的能力下降了，自然就化成脂肪堆积了。总结：个体衰老是由于细胞的衰老引起的，现在就让我们来总结一下细胞衰老的特点：

二、细胞衰老的特征

（1）水分减少，体积变小，新陈代谢速度减慢。

（2）酶的活性降低。头发会变白，这主要是由于人体内酶的活性降低。黑色素是酪氨酸酶催化酪氨酸造成的，酶的活性降低，黑色素合成减少

（3）细胞的通透性有所改变，使物质的运输功能下降

（4）细胞核体积变大，核膜内折，染色质收缩，染色加深（5）线粒体内呼吸速率变慢（6）细胞内色素积累，妨碍细胞内物质交流和传递，影响正常功能

过渡：细胞在衰老之后就要死亡，接下来我们就来学一下细胞的死亡。就像人一样，细胞也分老死和死于非命两种。一种就是细胞凋亡，也称编程性细胞死亡，还有一种就是细胞坏死。

三．细胞的凋亡与细胞坏死

1、细胞凋亡：由基因所决定的细胞自动结束生命的过程，就叫细胞的凋亡。

2、细胞坏死：在不利因素下，由于细胞的正常的代谢活动受损引起的细胞死亡。

细胞凋亡——自寻短见（自杀）

细胞坏死——死于非命（他杀）

问题九：假如我不小心被开水烫伤，细胞死了。这些细胞是死于是属于细胞凋亡还是细胞坏死？

答案：细胞坏死。

问题十：大家想一下，如果细胞没有死亡，人体会有什么异常？

答案：如果该死的细胞没有死亡，就会导致细胞的恶性增殖，导致癌症。所以说，细胞凋亡对于多细胞生物完成正常发育，维持体内环境，抵御外界各种因素干扰有着非常重要的作用。但是对于单细胞生物来讲，细胞的凋亡，就会导致个体的死亡。

例子：人体胚胎发育早期要经历有尾的阶段，后来尾部的细胞死亡，尾才消失。

人体在胚胎发育早期五个手指是愈合在一起的，后来随着之间细胞的死亡，五个手指才分开。

细胞凋亡与细胞坏死 篇5

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MTT (美国Sigma公司) ;RPMI 1640培养液、胰蛋白酶 (美国Gibco公司) ;TUNEL试剂盒 (瑞士Rocho公司) ;荧光定量RT-PCR试剂盒 (美国Promega公司) ;Bcl-2、Bax、Caspase-3、HIF-1α及GAPDH抗体 (美国Santa Cruz公司) ;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 细胞培养与分组

人脐静脉内皮细胞株ECV304购自中国科学院上海细胞研究所。于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中常规培养。用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化传代。取对数生长期的细胞用于实验。实验分为正常氧对照组和低氧处理组。正常氧对照组常规培养48 h;低氧处理组传代24 h后置于三气数字培养箱内, 用混合气 (94%N2-5%CO2-1%O2) 置换法低氧分别处理12、24和48 h。

1.3 MTT法检测细胞增殖率

ECV304细胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液消化, 以5×104/m L的密度接种于96孔板, 每组设6个复孔。于实验结束前4 h, 各组细胞加入MTT (浓度为5 mg/m L) 20μL, 继续培养4 h, 弃去培养液, 每孔加入DMSO 150μL, 室温振荡15 min, 酶标仪于490 nm处测吸光度 (OD) 值。以上实验重复3次。生长抑制率 (%) = (1-实验组OD值/对照组OD值) ×100%。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡率

用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液消化细胞, 4℃、500 g离心5 min, 沉淀加入1 m L预冷的70%乙醇, 轻轻吹打成, 4℃固定过夜。4℃, 500 g, 离心10 min, 沉淀用PBS清洗2次。然后用1 m L PI染液 (50μg/m L PI, 25μg/m L RNase, 0.5%Triton X-100) 重悬细胞, 4℃避光染色30 min, 流式细胞仪检测细胞凋亡率。以上实验重复3次。

1.5 TUNEL检测细胞凋亡

冷PBS洗涤ECV304细胞3次, 4%多聚甲醛室温固定40 min, PBS洗涤3次;3%H2O2-甲醇室温30 min, PBS洗涤3次, 加入含0.1%Triton X-100的0.1%枸橼酸钠溶液4℃冰上通透3 min, PBS洗涤3次, 加入TUNEL反应混合物, 37℃湿盒内孵育90min, PBS洗涤3次, 加入POD转换液, 37℃湿盒30min, PBS洗涤3次, DAB显色, 室温孵育10 min镜下观察。然后苏木素复染, 脱水透明、封固、镜检。随机选取5个高倍视野, 计算每1000个细胞中的凋亡细胞数。

1.6 荧光实时定量RT-PCR检测Bcl-2、Bax、Caspase-3和HIF-1α的m RNA表达

收集细胞, 按照说明书要求, 采用Trizol一步法, 常规方法提取RNA。各组取RNA 1μg进行反转录反应并建立PCR反应体系。各组均取2μL c DNA作为PCR反应的模板, 加入2×Ultra SYBR Mixture 10μL、上、下游引物 (浓度10μmol/L) 1μL, 加无DNase-RNase水至总体积20μL。PCR反应参数为:95℃5 min预变性后, 95℃变性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 进行40个循环, 于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。扩增结束后, 以GAPDH为内参照基因, 计算目的基因表达的相对定量值 (RQ值) 及以此为依据进行统计学分析。引物序列如下:Bax上游引物:5'-GATGCGTCCACCAAG AAGC-3', 下游引物:5'-AAGTCCAATGTCCAGCCCA T-3'。Bcl-2上游引物:5'-TGTGTGGAGAGCGTCAA CC-3', 下游引物:5'-TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3'。Caspase-3上游引物:5'-ACTGGACTGTGGCATT GAGAC-3', 下游引物:5'-TTGTCGGCATACTGTTTC AGC-3'。HIF-1α上游引物:5'-TCTGGGTTGAAACT CAAGCAACTG-3', 下游引物5'-CAACCGGTTTAAG GACACATTCTG-3'。GAPDH上游引物:5'-TGAACG GGAAGCTCACTGG-3', 下游引物5'-GCTTCACCAC CTTCTTGATGTC-3'。

1.7 蛋白印迹法 (Western blot) 检测Bcl-2、Bax、Caspase-3和HIF-1α的蛋白质表达

收集细胞, 加入细胞裂解液, 重悬细胞冰上裂解30 min, 4℃, 8 000 r/min离心10 min, 用改良的Lowry法对上清进行定量。各组取等量的蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后, 电转移至PVDF膜, 5%脱脂奶粉室温封闭, 用相应稀释后的一抗4℃孵育过夜, TBST漂洗三次后加入相应二抗, 室温孵育2h, 化学发光法进行显色, 对条带进行吸光度积分扫描。

1.8 统计学分析

采用SPSS 11.5软件进行分析。计量资料以 (±s) 表示, ANOVA分析处理和Dunnett检验。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 低氧对ECV304细胞增殖的影响

MTT结果显示, 低氧处理ECV304细胞12、24和48 h均能抑制细胞的增殖, 且抑制作用具有时间依赖关系, 与正常氧对照组相比, 差异有显著性 (均P<0.05) 。见表1。

注:1) 与正常氧对照组比较, P<0.05;2) 与低氧处理12 h组比较, P<0.05

2.2 低氧对ECV304细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示, 正常氧对照组ECV304细胞中仅有少数出现凋亡。低氧处理ECV304细胞12、24和48 h后, ECV304细胞中发生凋亡的细胞数呈时间依赖性增加, 与正常氧对照组相比, 差异有显著性 (均P<0.05) 。TUNEL结果显示, 低氧处理ECV304细胞12、24和48 h后, TUNEL阳性细胞数呈时间依赖性增加, 与正常氧对照组相比, 差异有显著性 (均P<0.05) 。见表2。

注:1) 与正常氧对照组比较, P<0.05;2) 与低氧处理12 h组比较, P<0.05

2.3 低氧对ECV304细胞凋亡相关分子Bcl-2、Bax和Caspase-3 m RNA和蛋白表达的影响

荧光实时定量RT-PCR和Western blot结果表明, 与正常氧对照组相比, 低氧处理ECV304细胞不同时间均导致Caspase-3、Bax m RNA和蛋白表达逐步升高 (P<0.05) , Bcl-2 m RNA和蛋白表达逐步渐下降 (P<0.05) , Bcl-2/Bax比值降低, 呈时间依赖性 (P<0.05) 。见图1。

1) 与0 h组相比, P<0.05;2) 与12 h组相比, P<0.05;3) 与24 h组相比, P<0.05;n=3;A:Western-blot结果;B:蛋白表达水平;C:实时定量RT-PCR结果

2.4 低氧处理后ECV304细胞HIF-1α基因m RNA和蛋白表达的变化

QPCR和Western blot结果显示, 与正常氧ECV304细胞相比, 低氧条件培养ECV304细胞不同时间后, HIF-1α的m RNA和蛋白表达水平呈明显的时间依赖性上升 (均P<0.05) 。见图2。

1) 与0 h组相比, P<0.05;2) 与12 h组相比, P<0.05;3) 与24 h组相比, P<0.05;n=3;A:Western-blot结果;B:蛋白表达水平;C:实时定量RT-PCR结果

3 讨论

组织、细胞缺氧是静脉性血管病变的重要病理生理基础, 低氧能促进内皮细胞凋亡, 使内皮结构破坏, 继而出现功能异常, 最终发展为血管痉挛、血栓形成、血管阻塞等[3]。尽管人们对低氧状态下细胞的分子特性改变越来越关注, 但具体的作用机制尚不明确, 尚需深入分析。

HIF-1由HIF-1α亚基和HIF-1β亚基组成, 其中HIF-1α亚基主要介导氧对HIF-1活性的调节, 能最早参与细胞对低氧产生的特异性应答反应[4,5]。因此, 关于低氧条件下HIF-1α的功能及机制的研究已成为热点。研究证实, 低氧条件下, 内皮细胞凋亡占内皮细胞死亡比例的35.00%~50.00%[6]。内皮细胞增殖与凋亡之间的平衡是血管内皮保持完整性的基础, 靶向性促进内皮细胞增殖、抑制其凋亡能加速内皮损伤的修复。本文发现低氧通过影响凋亡相关分子的表达促进ECV304细胞凋亡, 并且这种促凋亡作用与HIF-1α的表达呈正相关关系。

组织缺氧是通过抑制细胞增殖和迁移抑制内皮伤口的修复, 有研究表明, 促进细胞增殖可加速伤口愈合[7]。笔者也发现低氧12 h已明显抑制ECV304细胞的增殖。检测细胞凋亡的结果显示, 低氧能明显促进ECV304细胞的凋亡。Caspases是执行凋亡的主要酶类, 其中Caspase-3是核心蛋白酶, 能够裂解胞内多种蛋白酶, 裂解产物能进一步激活Caspase-3, 从而形成正反馈调节, 以及后续产生Caspase级联反应, 最终使细胞发生凋亡[8]。在细胞凋亡过程中, Bcl-2家族成员也发挥重要的作用。通常认为, Bcl-2家族成员中凋亡抑制蛋白和凋亡促进蛋白的比例及二者形成二聚体的组成决定着细胞的存活与凋亡[9]。随后的结果表明低氧处理细胞导致Caspase-3、Bax m RNA和蛋白表达逐步升高, Bcl-2m RNA和蛋白表达逐步渐下降, Bcl-2/Bax比值呈时间依赖性降低。NEELAM S等研究发现, 人晶状体上皮细胞中靶向抑制HIF-1α和HIF-2α可影响Bcl-2和Bax表达[10]。国内梁俊清等也证实, 低氧可显著下调Bcl-2表达, 而明显上调Bax和HIF的表达, 且通心络可通过调节上游信号PI3K/Akt信号通路的活化上调HIF的表达, 进而提高血管内皮细胞对抗低氧的能力[11]。因此, 笔者推测, 在内皮细胞中, HIF-1α与细胞的增殖凋亡的机制是错综复杂的, 需要进一步深入研究, 以HIF-1α为靶点的药物治疗活基因治疗也会成为研究热点。

总之, 本研究发现, 低氧使ECV304细胞HIF-1α的表达水平呈明显上升, 提示:低氧可能通过上调HIF-1α的表达, 进而使Caspase-3和Bax的表达上调Bcl-2的表达下调, 发挥促ECV304细胞凋亡的作用。然而, 更深入的分子机制仍需进一步实验来证明。

摘要：目的 探讨低氧对人脐静脉内皮细胞ECV304凋亡及低氧诱导因子-1α表达的影响及意义。方法 人脐静脉内皮ECV304细胞分为低氧处理组和对照组, 处理后MTT法检测细胞增殖抑制率;流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡;应用荧光实时定量PCR (QPCR) 和Western blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3和HIF-1α的mRNA和蛋白表达。结果 与对照组比较, 低氧处理能明显抑制细胞的增殖, 且抑制作用随着低氧处理时间的延长而增强 (P<0.05) ;低氧处理细胞后凋亡率明显增加, 且呈时间依赖性 (P<0.05) ;QPCR和Western blot结果显示, 低氧处理组细胞Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表达均显著升高 (P<0.05) , Bcl-2则明显下降 (P<0.05) , Bcl-2/Bax比值显著降低, 且呈时间依赖性 (P<0.05) 。低氧呈时间依赖性上调HIF-1α的mRNA和蛋白水平 (P<0.05) 。结论 低氧能促进人脐静脉内皮细胞ECV304细胞凋亡, 其机制可能与HIF-1α表达上调及Bcl-2的表达降低、Caspase-3和Bax的表达升高有关。

关键词：低氧诱导因子-1α,人脐静脉内皮细胞,凋亡

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细胞凋亡与细胞坏死 篇6

肺癌是世界上常见的高发肿瘤之一。世界范围内, 每年发现的肺癌患者高达135万例, 其中约118万位患者因此死亡[1]。近年来, 国内发病率呈递增趋势, 目前已占男性恶性肿瘤的首位。由于诊断技术的局限性以及无特异性临床表现, 超过70% 的患者就诊时已经存在转移性疾病, 从而不适宜手术治疗, 这些患者主要采取以化疗为主的综合治疗。化疗能够延长生存期, 但是化疗药物伴随严重的毒副作用, 对患者组织细胞损害大;不仅如此, 化疗药物易引起肿瘤多耐药性 (multiple drug resistance, MDR) , 是患者化疗效果有限的主要原因之一。

多细胞生物中存在两种细胞清除机制:坏死和凋亡[2]。细胞凋亡是一种更为清洁、自然的细胞死亡方式。研究表明, 细胞正常凋亡的破坏部分是由凋亡相关蛋白的异常表达或突变引起的。凋亡受阻将引发肿瘤发生及药物耐受。因此, 深刻理解肺癌细胞中凋亡诱导的机制对于抗癌药物的研发和肺癌治疗尤为重要。在这篇综述中, 我们主要讨论肺癌细胞中凋亡信号转导途径以及与凋亡抑制相关的因素。

1 细胞凋亡的主要途径

在哺乳动物细胞中, 细胞凋亡的发生主要包括两种不同的信号途径: (1) 外在途径, 由死亡受体的识别引发, 随后激活caspase-8; (2) 内在途径, 起始于细胞应急反应, 激活caspase-9[3]。这些不同的细胞凋亡信号转导途径最终在凋亡的执行阶段实现汇聚, 即激活caspase-3和/或caspase-7。

1.1 细胞凋亡的外在途径

在死亡受体途径或外在凋亡途径中, 受体位于细胞膜上, 由胞外配体结合并激活。比较有代表性的死亡受体包括成纤维细胞相关抗原受体即Fas/CD95受体, 肿瘤坏死因子受体1, DR3、DR4和DR5, 它们属于肿瘤坏死因子家族。前3种受体相应的配体分别为FasL、TNF、APO-3L, 后两种配体均为TRAIL。

1.2 细胞凋亡的内在途径

细胞凋亡的内在途径又称为线粒体途径, 它由胞内或胞外的凋亡刺激信号所激活, 这些因素包括氧化应激、辐射、DNA损伤以及细胞毒性药物等[4]。与死亡受体依赖途径不同, 线粒体依赖途径起始于线粒体膜:Bax/Bak蛋白插入线粒体膜, 随后线粒体内膜释放细胞色素C进入胞质。释放入胞质的细胞色素C被招募至凋亡酶激活因子-1 (Apaf-1) 附近, 组装成一个二元复合物。在ATP或dATP存在的情况下pro-caspase-9即caspase-9的前体物与细胞色素C、Apaf1组装成一个三元复合体, 称为凋亡体。大小约为700 kBa-1.4 mBa[5]。Pro-csapase-9通过它的caspase募集结构域CARD与Apaf1结合, 两分子的csapase-9酶原相互剪切而活化。活化的caspase-9作为线粒体依赖的凋亡途径的起始者, 随后激活下游的凋亡执行者caspase-3, 从而开启蛋白水解的级联反应, 最终导致细胞死亡。

2 Caspases蛋白家族与凋亡

尽管细胞凋亡的分子机制尚不完全清楚, 但是已有的研究表明caspases即半胱氨酸蛋白酶是细胞凋亡过程中的核心环节和关键步骤。

Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶, 它们的活性位点均包含半胱氨酸残基, 能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键。Caspase-1是最早被发现的caspase家族蛋白, 它与新杆状线虫中发现的能促进凋亡的CED-3蛋白同源[7]。并非所有的caspase都参与细胞凋亡过程, 大多数caspase除参与细胞凋亡执行外, 还参与到细胞存活、增值、分化或炎症反应等多个过程。

2.1 Caspase的活化机制

细胞中合成的caspase在发挥活性之前以单链的无活性的酶原形式存在, 包含四个结构域:N端长度可变的prodomain区, 分子量分别为20kD和10kD的大小亚基, 以及连接两个催化性亚基的铰链区 (有些家族成员中缺少铰链区) 。Caspase前体活化时, 两个大小亚基间的连接区被自身剪切, 结果产生了由两个大亚基和两个小亚基组成的异源四聚体, 即具有活性的酶。Caspase 家族成员N端prodomain区长短不一, 较长的prodomain由至少90个氨基酸残基组成, 内含能与接头蛋白相互作用的调控区, 这些调控区具有DED或CARD功能域。DED-DED识别负责疏水蛋白相互作用, 而CARD-CARD接触引发静电相互作用。

根据其促凋亡功能, caspase蛋白家族分为两类:一类为引发器 (initiator) , 即凋亡的起始者, 包括caspases-2, -8, -9, -10, -11;另一类为效应器 (effector) , 或称为凋亡执行者, 包括caspases-3, -6, and -7。引发器caspase在外来蛋白信号的作用下被切割激活, 活化的引发器caspase负责切割并激活下游的效应器caspase蛋白。效应器caspase蛋白能够直接水解多种底物, 包括细胞核、细胞质以及细胞骨架中的结构和调控蛋白[8]。在某些情况下, 如凋亡起始信号较弱时, 引发器caspase也可以行使效应器caspase的功能, 这将有助于放大凋亡信号。此外, 效应器caspase也可以由其它的非caspase蛋白酶激活, 如组织蛋白酶、钙蛋白酶和粒酶。这些caspase蛋白水解信号级联系统相互交联, 最终导致凋亡信号被显著放大。

2.2 Caspase抑制剂

由于caspase在细胞凋亡过程中发挥关键性作用, 它们大多与癌细胞无限增殖密切相关。因此, 有效控制caspases的激活和抑制已成为癌症治疗的一个重要方向。

研究发现, caspase蛋白家族在恶性肿瘤中发生突变的几率较高[9]。在肿瘤细胞中, 恢复procaspase-3表达能够增加抗癌药物敏感性。另一方面, 通过反义RNA阻断一些caspase的表达能够使肿瘤细胞对一些经典的化疗药物敏感性增加。类似的工作有助于我们更好地理解caspase级联放大效应的激活机制, 从而为设计直接靶向caspase激活机制而又不引起正常细胞应激反应的的抗癌药物研发带来新的希望。

3 Smac在肿瘤发生发展中的作用

人类Smac最初由王晓东实验室在Hela细胞中发现, 位于第12条染色体的长臂, 由7个外显子组成。初始编码的Smac由239个氨基酸组成, 其氨基末端有一段特殊的由55个氨基酸残基组成的序列, 称为线粒体靶向序列 (mitochondrial targeting signal, MTS) 。当胞浆中的Smac蛋白被转运到线粒体后, MTS被剪切掉, 生成含有184个氨基酸残基的成熟蛋白, 以二聚体的形式存在于线粒体膜间隙。在凋亡信号刺激下, 成熟的Smac/DABLO释放进入细胞质。在胞质中, Smac通过与IAPs形成同二聚体而相互作用, 促进caspase活化, 从而发挥促凋亡作用[11]。Smac能够与XIAP的BIR2和BIR3结构域结合, 使XIAP无法发挥凋亡抑制作用, 从而使得caspase-3和caspase-9得以释放。其中, caspase-9的N末端有一个与Smac类似的四肽基序, 因此能够和Smac竞争结合XIAP的BIR3结构域;caspase-3的释放则是Smac的N末端基序与XIAP的BIR2结构域结合的缘故。

因为Smac在肿瘤细胞化疗敏感性方面扮演重要角色, 所以对于Smac表达水平是否与癌症演进过程呈负相关就显得非常有必要, 相关研究将为有望使Smac成为癌症预后或治疗的靶标。对肾细胞癌的研究发现, Smac mRNA及蛋白表达水平与肿瘤进展水平负相关[12]。此外, 术后Smac表达水平高的肾细胞癌患者生存时间也相应高于Smac低表达的患者;Smac低表达患者死亡概率要比高表达患者高四倍[13]。与此相似, Sekimura等在肺癌患者中也发现了Smac表达水平明显下降的现象[14]。由于非小细胞肺癌中IAPs表达水平会上调, 因此Smac表达降低将使得凋亡更难进行。进一步的研究发现, 临床三期患者XIAP/Smac比值明显高于一期和二期患者。

因此有望通过构建表达成熟型Smac的重组质粒作用于肺癌患者, 加入化疗药物紫杉醇作为凋亡诱导信号有望为肺癌的治疗提供新的思路。

细胞凋亡与细胞坏死 篇7

1对象与方法

1.1对象

选择2013年1~12月由于母亲或社会因素于广东省计划生育科学技术研究所(以下简称“我院”)行妊娠终止的病例,所有患者均采用米非司酮联合前列腺素进行引产。收集孕24~32周引产的女性胎儿卵巢组织18例。其中24~27周(中期妊娠)胎儿卵巢8例, 28~32周(晚期妊娠 )胎儿卵巢10例 。 本研究经我院医学伦理委员会讨论通过,收集的胎儿卵巢组织也均得到胎儿母亲的同意并签署知情同意书。

1.2方法

卵巢组织投入10%福尔马林溶液固定, 经脱水、 浸蜡、包埋。 最终切成3 μm石蜡切片。 石蜡切片经脱蜡浸水后,常规HE染色后显微镜下观察胎儿卵巢组织。 细胞凋亡检测试剂盒购自罗氏公司,具体操作步骤参照试剂盒说明书进行, 用荧光显微镜拍照后,二氨基联苯胺-过氧化氢显色,设立阳性对照(用DNA酶处理切片)和阴性对照(用PBS代替末端脱氧核糖核酸转移酶)。 结果判断:荧光显微镜下阳性细胞呈黄绿色荧光,二氨基联苯胺(DAB)显色后阳性定位于细胞核,或细胞核、细胞浆同时着色,呈棕黄色。

2结果

2.1HE染色结果观察

显微镜下观察,24~27周胎龄卵巢原始卵母细胞较多,颗粒细胞少,且大部分并未围绕卵母细胞形成原始卵泡,但是随着胎龄的增加,颗粒细胞围绕卵母细胞数目增多,原始卵泡形成开始增多。 27~28周胎龄,已有部分原始卵泡形成。 28~32周胎龄原始卵母细胞明显减少,颗粒细胞增多,原始卵泡形成。 随着孕龄增加,原始卵泡愈发完整。 见图1(封三)。

2.2凋亡细胞观察

阳性凋亡细胞的细胞标记为黄绿色荧光小体,主要见于未形成卵泡的卵母细胞及早期原始卵泡。 卵泡越成熟,凋亡发生越少见。 孕中期卵巢卵母细胞明显多于孕晚期,且凋亡主要发生于未形成原始卵泡的卵母细胞(图2,封三)。 部分孕晚期的胎儿卵巢中,凋亡主要发生于颗粒细胞(图3,封三)。

3讨论

卵泡发育是一个多阶段的复杂过程, 在妊娠11~ 12周时卵原细胞开始向初级卵母细胞转化 , 在妊娠20周时卵母细胞总数达高峰 ,然而 ,有2/3的卵母细胞在出生前被丢失[2]。 因此,细胞凋亡是卵巢功能和发育过程中不可或缺的组成部分。 细胞凋亡,又称程序性细胞死亡,凋亡在生物胚胎发生、器官形成发育、成熟细胞新旧交替、激素依赖性生理退化以及自身免疫性疾病和肿瘤等的发生发展中都发挥着不可替代的重要作用。 卵泡的凋亡可能发生于卵母细胞或颗粒细胞,最终导致卵泡闭锁。 有学者认为,原始卵泡、初级卵泡闭锁主要是由卵母细胞凋亡引起,而在生长卵泡中,颗粒细胞的凋亡起主导作用[5],但也有学者认为两种凋亡同时发生于卵泡生长发育的任何一个阶段[6]。

本研究发现,孕中期(24~27周)胎儿卵巢发育与孕晚期(28~32周)胎儿卵巢有明显区别。 在孕中期胎儿卵巢组织,主要由多量的原始卵母细胞密集排列构成,卵母细胞较小,核圆形深染,胞浆不多,颗粒细胞较少,卵巢间质不明显。 随着孕龄的增加,颗粒细胞增多,逐渐围绕原始卵母细胞,形成原始卵泡。 在孕27~ 28周的胎儿卵巢中,已可见部分原始卵泡形成,卵巢间质开始增多。 在孕晚期胎儿卵巢,原始卵母细胞明显减少,多数已被颗粒细胞包绕,随着孕龄增加,原始卵泡体积增大,卵母细胞核圆形,增大,胞浆丰富红染,围绕颗粒细胞增多,卵巢间质增多,血管增生。 随着孕龄增加,卵母细胞进一步减少,仅剩形态结构清晰的原始卵泡。 TUNEL染色发现,细胞凋亡主要存在原始卵母细胞,颗粒细胞也存在凋亡现象。 随着孕龄增加,卵巢发育进一步成熟,原始卵泡形成,数目逐渐减少,凋亡细胞相应减少,且主要发生于颗粒细胞。 说明在胎儿卵巢发育过程中, 卵母细胞的数量持续减少,原始卵泡形成,在这个过程中,细胞凋亡起着至关重要作用。 从而提示对于原始卵泡形成阶段,卵细胞的减少多由于卵细胞本身的凋亡,而对于原始卵泡形成后,卵泡闭锁可能基于颗粒细胞的凋亡。

近年来,对人胎儿卵巢细胞凋亡的研究已取得一些进展,有研究者[7]利用TUNEL法观察孕中、晚期胎儿卵细胞,发现部分卵细胞出现阳性反应,即发生凋亡,而且孕中期胎儿卵细胞凋亡发生率明显高于孕晚期, 且发现Caspase-3在胎儿卵细胞内广泛表达,而且与卵细胞凋亡呈正相关,提示Caspase-3可能参与卵细胞凋亡的调控。 另外,胎儿早期卵泡的颗粒细胞内未见Caspase-3表达,TUNEL法检测亦未见阳性颗粒细胞,提示早期卵泡闭锁始于卵细胞凋亡。 De Pol等[8]采用TUNEL法观察到了孕18~20周的人类胚胎卵巢内典型的凋亡细胞形态,并且还证实,这个时期的胚胎中只有生殖细胞发生了凋亡。 这与本实验结果一致。 说明在人胎儿卵巢的发育过程中,在卵细胞的选择性发育成熟过程中,细胞凋亡起着关键作用。

女性卵母细胞储备量一出生就已确定,在女性一生中只有少数卵泡能完成排卵。 妇女在其成年期大约可以排400个卵母细胞[9,10],在早期卵泡闭锁过程中 ,卵母细胞首先发生凋亡,卵泡颗粒细胞由内层向外层逐渐凋亡;而生长晚期的卵泡,颗粒细胞首先凋亡,诱导卵母细胞凋亡,触发了卵泡闭锁[11]。 胎儿时期卵母细胞的凋亡、每个卵泡周期非优势卵泡的清除以及植入前胚胎细胞的凋亡,均保证了卵巢、卵泡、卵母细胞和胚胎的正常发育,为获得优秀后代提供了保障。 卵巢内卵母细胞及颗粒细胞的凋亡不仅是引起卵泡闭锁的原因, 而且凋亡与卵巢正常或异常的功能相关。 卵巢颗粒细胞的凋亡就是卵巢早衰发病的主要原因[12]。 有学者从不同角度对其病因进行了研究,无论从组织水平、分子水平,还是基因水平,都发现有颗粒细胞的凋亡[13,14,15,16]。

因此,研究卵巢卵母细胞与颗粒细胞凋亡,对改善和提高女性生育能力, 保持卵巢功能有重要意义。 尤其是对人胎儿卵巢发育过程、 卵泡凋亡和闭锁的机制研究,将为最终实现对人卵泡发育的调控提供线索, 将有助于了解卵母细胞发育机制。 通过人为诱导,延缓或促进卵母细胞凋亡,开发利用卵巢内卵泡资源有重要意义,可为女性生殖系统疾病、辅助生殖技术提供基础研究方向, 有重大的理论意义和广泛应用价值。

孕 25+5周,主要为原始卵母细胞,荧光标记为黄绿色荧光,DAB 显色阳性主。原始卵母细胞大量显示凋亡,少许颗粒细胞也有显示凋亡

孕 31 周,主要为原始卵泡,荧光标记为黄绿色荧光,DAB 显色阳性主要定位。原始卵泡未见凋亡,少许颗粒细胞荧光染色阳性)

摘要：目的 探讨人胎儿卵泡的发育形成过程及卵细胞凋亡情况。方法 收集2013年1~12月于广东省计划生育科学技术研究所行中期妊娠及晚期妊娠(24~32周)引产的女性胎儿卵巢组织18例。其中24~27周(孕中期)胎儿卵巢组织8例,28~32周(孕晚期)胎儿卵巢组织10例。采用免疫组化苏木精-伊红(HE)染色及原位末端标记法(TUNEL),观察胎儿卵巢卵泡发育及形成过程及该过程中卵细胞凋亡情况。结果 HE染色显微镜下观察,孕中期胎龄卵巢原始卵母细胞较多,卵巢间质少,颗粒细胞较少。随着胎龄的增加,颗粒细胞逐渐增多;围绕卵母细胞,原始卵泡逐渐形成并开始增多,卵母细胞数量减少。孕晚期原始卵母细胞明显减少,原始卵泡形成,数量进一步增多,随着孕龄增加,原始卵泡愈发完整。TUNEL染色观察见阳性凋亡细胞多见于未形成卵泡的卵母细胞,卵细胞周围的颗粒细胞在孕晚期可见少许凋亡,卵泡内卵细胞未见阳性染色。孕中期卵巢卵母细胞凋亡明显多于孕晚期,且凋亡主要发生于未形成原始卵泡的卵母细胞。结论 胎儿卵巢发育过程中,原始卵母细胞数量逐步减少,原始卵泡形成,其发育过程中原始卵母细胞不断发生凋亡,导致生殖细胞丢失。

细胞凋亡与细胞坏死 篇8

急性肺损伤 (ALI) 是临床上一种常见的病理现象, 见于心肺移植等过程中, 可导致AEC损伤及肺泡内红细胞和纤维渗出物聚集, 以肺水肿、微肺不张为主要病理特征。肺泡Ⅱ型上皮细胞 (AECⅡ) 对维持肺泡的结构和功能具有重要意义。主要有 (1) 细胞修复:增殖、凋亡。 (2) 合成和分泌肺表面活性物质等功能[6]。ALI时AECⅡ凋亡胞浆内嗜锇性板层小体数量减少, 线粒体肿胀, 假包涵体形成, 细胞膜上微绒毛减少或消失。呼吸膜的完整性遭到破坏导致其功能异常, 血管内的炎性细胞释放出弹性蛋白酶分解SP-A等, 且SP可通过通透性增加的肺毛细血管膜进入血循环, 从而引起肺表面减张能力下降。同时需将受损的AECⅡ清除引起炎性反应, 加重已存在的肺组织的损伤。结果促使肺泡萎陷, 微肺不张及肺水肿, 发展至纤维化阶段, 最终导致肺功能改变和肺损伤发生[7]。

某些干预措施能够减轻ALI中ACEⅡ的凋亡。利多卡因能抑制脂多糖所致的大鼠ACEⅡ凋亡[3]。转染siRNAFAS通过抑制Fas基因的表达可降低内毒素诱导的ACEⅡ凋亡[8]。FGF-10通过抑制ERK信号相关的失巢凋亡途径及线粒体途径, 减少石棉诱导的ACEⅡ的凋亡[9]。Fu等证实应用N-乙酰半胱胺氨酸 (NAC) 能够阻断ACEⅡ的JNK激活, 同时减少高氧引起的Bax蛋白的含量[10]。

综上所述, 在ALI中ACEⅡ凋亡可能起主要作用, 凋亡为其发病机制和防治提出新的解释。由于凋亡途径的网络化、交互作用、共同激活等特点, 把某中因素或一条凋亡途径单独研究评价其最的生物学效应可能会差之毫厘而谬以千里。随着凋亡基因和影响因素研究的深入, 从不同环节和时期对细胞凋亡进行干预将成为ALI治疗的新途径。

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细胞凋亡与细胞坏死 篇9

本研究以二倍体虹鳟为对照,利用光镜、电镜切片和TUNEL染色观察三倍体虹鳟卵巢中卵原细胞的发育情况,利用荧光定量PCR分析180 dpf(6月龄)至300 dpf(10月龄)时期二、三倍体虹鳟卵巢中的GDF9、BMP4和BMP7基因表达情况,探讨三倍体虹鳟卵巢中卵母细胞发育停滞后的最终去向,并分析其原因。

1 材料

试验中所有程序都严格遵守东北农业大学的动物保护和使用委员会的规定,并严格遵守动物福利。本次试验所用二、三倍体全雌虹鳟发眼卵(全雌三倍体虹鳟由全雌四倍体虹鳟与全雌二倍体虹鳟杂交而成)购于美国,置于水族箱中,孵化过程水温恒定为8℃,待鱼苗体重达50 g后饲养于养殖基地,养殖水温恒定为12℃。180 dpf(6月龄)起每30 d采集一次二、三倍体虹鳟的卵巢组织,共采集5次,采集的卵巢样本分三组:两组用p H值为7.2的磷酸缓冲液(PBS)清洗后,分别放入4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中固定用于组织学观察;另外一组迅速放入液氮中暂存,然后转入超低温冰箱进行保存。

2 方法

2.1 组织学观察

2.1.1 光镜切片

将固定的卵巢组织从4%多聚甲醛中取出,从70%的乙醇开始进行梯度乙醇脱水,二甲苯透明,常规石蜡包埋与切片,切片厚度为5μm,H.E.染色,中性树胶封片,用Carl Zeiss显微镜观察,Motic Images plus 2.0系统拍照。

2.1.2 透射电镜切片

将固定的卵巢组织从2.5%戊二醛中取出,用锇酸再固定,Epon812包埋,在恒温培养箱中聚合,用Ultracut E型超薄切片机切片,经恒温培养后用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色,用JEM-1200EX型电子显微镜观察拍照。

2.1.3 细胞凋亡的TUNEL法检测

将固定的卵巢组织从4%多聚甲醛中取出,进行脱水、透明、浸蜡、包埋,制作石蜡切片。脱蜡后采用末端脱氧核苷酸转移酶(Td T)介导的原位末端标记法(TUNEL)测定凋亡率,按照细胞凋亡检测试剂盒(罗氏公司)说明书进行,将10月龄三倍体虹鳟设为阴性对照组,采用PBS代替一抗,最后经脱水、透明、封片,在光镜下观察、拍照,细胞核呈棕黄色为凋亡细胞。

2.2 总RNA的提取及c DNA的合成

使用TRIzol试剂(购自Invitrogen公司)按照说明书进行总RNA的提取。琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,紫外分光光度计检测RNA浓度与质量。使用Prime ScriptTM第一链c DNA合成试剂盒(购自Ta KaRa公司)进行c DNA的合成,并保存于-20℃。

2.3 Real-Time实时荧光定量PCR

根据已经公布的虹鳟GDF9、BMP4和BMP7基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计实时荧光定量PCR引物(由华大基因公司合成),序列见表1。以β-actin为内参基因,分析各受体基因的相对表达水平。Real-Time实时荧光定量PCR反应体系(20μL):SYBR premix Ex Taq(购自Ta KaRa公司)10μL,5倍稀释的c DNA模板2μL,上、下游引物各0.4μL,dd H2O 7.2μL。PCR反应条件:95℃30 s;94℃5 s,60℃30 s,共40个循环。PCR反应结束后,对扩增产物进行熔解曲线分析,检测反应的特异性。采用2-△△Ct法分析各基因的相对表达量。

2.4 数据的处理与分析

试验数据采用SPSS 17.0进行统计处理,利用One-way方差分析进行差异显著性检验,分析后的结果均表示为“平均数±标准差”,P<0.05为差异显著。

3 结果

3.1 组织学观察结果

3.1.1 光镜切片观察结果

观察180~300 dpf时期二、三倍体虹鳟的性腺组织切片观察结果见287页彩图1。二倍体全雌虹鳟的卵巢发育正常,卵巢中以初级卵母细胞为主,卵母细胞体积增大,大多数为圆形,结构完整,核仁多个并移至核膜内侧(见287页彩图1A中箭头所示),而后外排,随着发育出现皮质泡(见287页彩图1B、1C箭头所示),卵母细胞由Ⅱ时相发育至Ⅲ时相。三倍体卵巢发育明显迟于二倍体,180 dpf时期卵巢中主要以卵原细胞为主,并且发生卵原细胞囊泡化现象,表现为数个卵原细胞外被一层膜结构包裹,形成卵原细胞簇(见287页彩图1D中箭头所示)。随着日龄增加卵原细胞簇数目减少,卵原细胞未发育成初级卵母细胞,并发生染色质固缩现象,疑似发生细胞凋亡(见287页彩图1E、1F中箭头所示)。

3.1.2 透射电镜切片观察结果

透射电镜下观察可见:与发育正常的二倍体相比,三倍体虹鳟性腺中的卵原细胞出现细胞膜空泡化、细胞质浓缩、染色质固缩(见图2A中箭头所示),以及卵原细胞膜内陷、染色质边聚(见图2B中箭头所示)等典型的细胞凋亡现象,并能观察到凋亡小体(见图2C中箭头所示)。

3.1.3 TUNEL染色观察结果

采用TUNEL法检测二、三倍体全雌虹鳟性腺细胞凋亡,结果见287页彩图3。二倍体卵巢阴性对照未出现阳性结果(见287页彩图3A)。180~300 dpf时期二倍体卵巢中的初级卵母细胞未见凋亡,卵母细胞呈蓝色(阴性),随着卵母细胞发育,个体逐渐增大,部分滤泡细胞和间质细胞发生凋亡,其细胞核呈黄褐色(阳性),为卵巢发育过程中自然凋亡(见287页彩图3B、3C、3D);180~300 dpf时期三倍体卵巢中的卵原细胞发生凋亡则为普遍现象,180 dpf卵原细胞簇内的卵原细胞簇内还存在部分未凋亡的卵原细胞,随着发育凋亡的加剧,卵原细胞簇数目减少,大部分卵原细胞均呈阳性,部分滤泡细胞和间质细胞也发生凋亡(见287页彩图3E、3F、3G)。

3.2 二、三倍体虹鳟GDF9、BMP4、BMP7基因在卵巢中的表达结果

提取的二、三倍体虹鳟5月龄的性腺组织RNA经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测,RNA完整性良好,反转录得到的c DNA经内参基因β-actin检测发现可以用于实时荧光定量PCR试验。

试验结果表明,随着卵巢发育,三倍体虹鳟卵巢中的GDF9、BMP4和BMP7基因表达水平均显著低于同时期二倍体(P<0.05),并大体呈不规则的下降趋势。但240 dpf时BMP4在三倍体虹鳟卵巢中的表达显著高于二倍体(P<0.05)。见图4。

4 讨论

注:*表示二、三倍体虹鳟比较差异显著(P<0.05)。

4.1 二、三倍体虹鳟性腺组织学观察结果

细胞凋亡是1972年由Kerr教授根据形态学特征首先提出的,是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式,也是一种主动的、程序性的、细胞固有的生物学过程,是为更好地适应生存环境而主动争取的死亡过程,普遍存在于动植物中,又称细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)。细胞凋亡是最基本的生物现象,是机体生存和发育的基础,具有清除多余细胞、无用细胞、发育不正常的细胞和完成正常使命的衰老细胞等生物学意义[11]。光镜切片、透射电镜切片和TUNEL染色结果表明,在180 dpf至300 dpf时期,二倍体虹鳟卵巢中的卵母细胞并未发生凋亡,只有部分间质细胞因性腺发育而发生正常的凋亡现象[12]。而发育异常的三倍体虹鳟卵原细胞最终去向是发生了凋亡。在180 dpf时,三倍体虹鳟卵巢中的卵原细胞簇数目较多,其中仍有部分未发生凋亡,随着性腺发育,卵原细胞簇数目减少,绝大部分卵原细胞发生凋亡,几乎观察不到发育正常的卵母细胞。之前对于三倍体在生长过程中较二倍体显示出明显的生长优势,一直被认为是奇数染色体组会导致减数分裂的失败和性腺发育的失败,在二倍体鱼类中用来促进性腺发育的能量在三倍体鱼类中被用来生长[13]。结合以上观点,笔者认为三倍体虹鳟卵巢中卵原细胞凋亡为其后性腺的重组或重新分化奠定了物质基础,发育不正常的卵原细胞通过细胞凋亡的途径,使机体获得更强的生存能力和更优良的生长特性。

4.2 二、三倍体虹鳟GDF9、BMP4、BMP7基因在卵巢中的表达

对鱼类的研究表明,GDF9在异育银鲫卵细胞的发育过程中具有重要作用,尤其是参与调控卵母细胞的早期发育[9]。在60 dpf和100 dpf时均检测出GDF9和BMP7在虹鳟卵巢中的表达,GDF9、BMP4、BMP7在不同发育阶段的虹鳟卵母细胞中均有表达,在Ⅰ时期卵母细胞中表达量最高,随着发育在卵母细胞中的表达量逐渐降低[14]。本研究也发现,180 dpf至300 dpf期间,二倍体虹鳟卵巢中GDF9和BMP7基因随着月龄的增加呈上升趋势,在10月龄达到最高,可见GDF9、BMP4和BMP7在鱼类卵巢发育过程中的作用。

三倍体虹鳟卵巢中GDF9、BMP4和BMP7基因的表达量显著低于卵巢发育正常的二倍体虹鳟,整体呈不规则下降趋势。羊GDF9和BMP15基因表达异常会导致母羊产仔数目减少。人类多种卵巢疾病,如卵巢早衰(POF)、卵巢功能缺陷(POI)、多囊卵巢综合征(PCOS)都与GDF9和BMP15(GDF-9B)的突变和表达异常有关[15]。GDF9基因敲除的小鼠缺乏生育能力,卵泡发育停留在初级卵泡阶段,即使有GDF9的同系物BMP15的表达也不能弥补GDF9的缺失[16]。因此,笔者认为随着卵巢发育,三倍体虹鳟GDF9、BMP4和BMP7的表达量过低,可能不足以维持卵原细胞的正常发育,最终导致卵原细胞发生凋亡。

240 dpf时三倍体虹鳟卵巢中的BMP4表达量突然升高,并高于同时期二倍体虹鳟的表达量,随后表达水平恢复至显著低于二倍体,结合TUNEL染色结果可知,240 dpf三倍体虹鳟卵巢中卵母细胞凋亡程度加剧。有研究表明,BMP4已经被证实不仅能够促进大鼠原始卵泡的发育,还能作为存活因子抑制细胞凋亡[17]。因此可以推测BMP4在虹鳟中的功能可能与在鼠中的相似,不仅可以调节卵母细胞的发育,还能抑制卵原细胞的凋亡。

5 结论

1)三倍体虹鳟中发育不正常的卵原细胞最终去向为发生细胞凋亡。2)三倍体虹鳟中性腺发育相关因子GDF9、BMP4和BMP7的低表达可能诱导卵原细胞发生凋亡,且BMP4可能同时具备抑制卵原细胞凋亡的功能。

摘要：为了研究三倍体雌性虹鳟在生长过程中出现的性腺发育停滞、卵原细胞发育异常的原因,试验采集180300 dpf时期二倍体和三倍体虹鳟的性腺组织,利用光镜、电镜切片和TUNEL染色进行组织与细胞学对比研究,利用实时荧光定量PCR分析对卵巢发育和配子发生过程发育具有调节作用的生长分化因子9(GDF9)、骨形态发生蛋白4(BMP4)和骨形态发生蛋白7(BMP7)在二、三倍体相同时期的表达差异。结果表明:180300 dpf虹鳟三倍体卵巢中的卵原细胞发生凋亡,除240 dpf三倍体虹鳟BMP4表达量显著高于二倍体外,三倍体虹鳟中GDF9、BMP4和BMP7表达量显著低于同时期二倍体。说明三倍体虹鳟卵原细胞发育异常,最终发生凋亡,可能与GDF9、BMP4和BMP7的低表达有关,BMP4在调节卵母细胞发育的同时可能有抑制细胞凋亡的作用。