细胞转化（通用9篇）
细胞转化 篇1
B骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs) 是来源于中胚层具有多向分化能力的干细胞, 主要存在于结缔组织和器官间质中, 以骨髓组织中含量最为丰富, 到目前为止已从多种组织中分离出间充质干细胞，包括骨髓、皮肤、胰腺、肝脏[1]及脂肪组织等。间充质干细胞在一定的诱导条件下能分化为神经细胞、成骨细胞、造血细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、表皮细胞、腱细胞、脂肪细胞、肝细胞等[2,3]。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆, 也称为贴壁细胞或者成纤维细胞集落形成单位 (CFU-F) 、骨髓基质细胞 (MSC) 或间充质干细胞或间充质祖细胞 (MPC) .由于骨髓是其主要来源, 因此统称为骨髓MSCs。
近期国内外大量实验研究发现，骨髓间充质干细胞在一定条件下经体内外诱导可定向分化为肝细胞样细胞，而且易于分离、培养、扩增，易于外源基因的导入和表达，在体外长期培养的过程中始终保持多向分化的潜能，遗传背景相当稳定有望成为治疗终末期肝病的一种新型种子细胞[4]。下面就骨髓间充质干细胞向肝细胞转化的研究进展作简要综述。
1 形态及生物学特征
1987年Friedenstein等首先发现骨髓单个细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞经过20-30个培养周期仍能保持其多向分化潜能。由于骨髓中的这种多能细胞能够分化为多种中胚层来源的间质细胞，故称之为间充质干细胞（MSCs）。
MSCs在形态上类似成纤维细胞样，核浆比大，核染色质细，核仁明显，平行排列或旋涡样生长。骨髓MSCs无特异性表面标志，在培养时贴壁附着后较一致的表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等多种表面蛋白[5]，但不表达造血细胞表面标志，如CD14、CD34、CD45、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原 (HLA) 识别有关的共刺激分子B71、B72及主要组织相容性复合物Ⅱ类分子如HLA-DR。但是至今没有找到MSCs特异性抗原标记，所以目前鉴定MSCs主要依赖其形态水平及功能特征。
MSCs的分裂方式有两种，一种是对称分裂，形成两个相同的MSCs细胞。另一种是非对称方式，一个子细胞保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来，另一个子细胞不可逆的分化成为功能专一的分化细胞。MSCs通过不对称分裂一方面实现增殖与分化，另一方面维持自身干细胞数量的稳定。在正常生物体内，绝大多数MSCs处于相对静止的状态。只有在某些信号的诱导下，其分化潜能才被激发出来，经过多个细胞分裂周期，最终分化成为某种分化细胞。MSCs在体外具有很强增殖能力，可以在体外大量扩增和长期培养，并且可以长时间保持其未分化状态。不同来源的MSCs具有不同的生物学性质。Peister等[6]的研究显示不同品系小鼠来源的骨髓MSCs具有不同的增殖能力、免疫表型和分化能力。Javazon等[7]的研究显示大鼠骨髓MSCs比人骨髓MSCs具有更强的增殖能力，而且这两群细胞具有不同的细胞表型。
2 体外分离、纯化、培养
目前，骨髓MSCs的分离方法主要有以下几种： (1) 贴壁法：主要根据骨髓MSCs的贴壁生长特性，通过换液将其与不贴壁的造血系细胞分离，再利用单核细胞、MSCs、成纤维细胞等贴壁细胞在培养板上粘附性, 控制酶的浓度和消化时间纯化MSCs，该方法操作简单、成本低廉、对细胞损伤小，分离到的细胞分化潜能较好，是目前分离MSCs的主要方法； (2) 密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。普遍采用Ficoll或Percoll分离液来实现细胞间的分离。但是不同密度的分离液对MSCs的纯度影响极大。这种方法分离培养的MSCs大小均匀，纯度较高，也被广泛采用； (3) 细胞表面分子标记分选法：主要是根据骨髓MSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法进行分选。但由于目前仍未找到骨髓MSCs特异性的细胞表面标记，因而骨髓细胞体外培养较难获得纯的MSCc，且分离步骤复杂，该法较少采用。
3 体外实验研究
国内外研究表明，MSCs可以在体外分化为神经细胞、成骨细胞、造血细胞、肌细胞、表皮细胞、腱细胞、脂肪细胞、肝细胞等。目前，研究者在向肝细胞分化方面已经取得了一定的突破。
目前, 对于MSCs在体外进行肝细胞定向诱导条件主要有以下几种： (1) 在培养基中添加诱导MSCs的HGF等细胞因子或某种药物; (2) 在培养基中添加肝患者血清等物质; (3) 与肝细胞共同培养; (4) 通过目的基因的转染。其中在培养液中加入细胞生长因子来诱导干细胞分化最为常用，这种方法主要是通过改变细胞的生长的环境来诱导干细胞分化，将干细胞诱导成目的细胞。将骨髓干细胞诱导分化为肝细胞，可以解决肝细胞的来源问题，将为治疗各种肝病提供可能。
在肝再生过程中起重要作用的生长因子和细胞因子很多，如：HGF, EGF, TGF2，白介素26, TNF2，胰岛素，去甲肾上腺素等[8,9]。HGF主要在肝脏kuffer细胞与肝窦内皮细胞中产生，一定浓度（1mg/ml）对肝细胞有促进有丝分裂作用，是正常肝细胞最强的促有丝分裂剂。HGF是作用于肝脏发育及肝再生的过程中最基本的细胞因子，其受体c-met表达的多种细胞的有丝分裂及塑型都具有刺激作用。并且在胚肝发育过程中也发挥重要作用。HGF的作用贯穿于整个肝脏的发生、发展及肝再生的过程，因此HGF是体外诱导骨髓干细胞向肝细胞方向分化的关键性细胞因子。
日本学者Oh等[10]早在2000年通过RT-PCR技术检测发现新鲜分离的大鼠骨髓细胞中存在表达AFP和C-met的细胞，因此他们在体外对骨髓干细胞转化为肝细胞进研究。经不同浓度的HGF体外诱导培养，他们检测到表达ALB、AFP、C-met和GAPDH mRNA肝细胞样细胞。因此认为骨髓中可能包含表达AFP的肝脏祖细胞，可被HGF诱导分化为肝细胞。但是这群细胞仅表达的是部分肝细胞的标记物，因此只能说为肝细胞样细胞。后来进一步对诱导体系进行改进，加入FGF4和EGF作为诱导因子，在试验过程中发现了肝细胞形态样细胞的出现，而且在RNA水平检测到成熟肝细胞标记物的表达[11]，从结果看，表达成熟肝细胞标记物的那类细胞可以认为是肝细胞。Schwartz等[12]从人、大鼠、小鼠的骨髓中分离出间充质干细胞的一个亚群CD44-、CD45-、HLA-Ⅰ-、HLA-Ⅱ-和c-kit-，在培养体系中加入成纤维细胞生长因子 (FGF-4) 、HGF等生长因子进行诱导后可分化为具有肝细胞的功能特征的上皮样细胞，可检测到AFP、ALB、CK-18等肝细胞标志物，并能合成糖原、尿素，还具有肝细胞的超微结构。
4 体内实验研究
早在1999年，Peterson等在《Science》杂志上发表了关于骨髓源性肝干细胞修复肝脏的论文，在研究中为证实肝系细胞和骨髓的相关性，他们通过大鼠雌雄授受法骨髓移植及将DPPIV+的骨髓细胞移植到DPPIV-小鼠体内，证实了肝卵圆细胞的骨髓源性。其后一系列研究证实MSCs可以在体内分化为肝细胞，来修复受损伤的肝脏。2001年Avital等[13]用免疫磁珠分离法从人和大鼠的骨髓中分离出一种Thy-1+/β2-m-的干细胞，这些细胞同时表达肝细胞特异性标志物如ALB、AFP、CK-18等，体内移植实验证实这些细胞整合入肝板，具有肝细胞的超微结构，而且还具有肝细胞的部分合成和代谢功能，能分化为成熟肝细胞。因此Thy-1+/β2-m-细胞可能是肝祖细胞，研究者命名为骨髓源性肝干细胞BDHSCs。近年，Terai等[14]建立CCL4诱导的小鼠肝硬化模型，然后从尾静脉注入1×105个经绿色荧光蛋白标记的骨髓细胞，1 d后GFP阳性标记细胞的骨髓细胞定植在肝小叶门脉周围，4w后肝脏中有25%的细胞是GFP阳性标记细胞，而无肝硬化的对照组中却没有GFP阳性的细胞出现。骨髓细胞移植组的血清ALB明显高于非细胞移植组。实验结果提示，体内环境和肝脏本身微环境是促进骨髓细胞向肝细胞转化的关键因素。Yamamoto等[15]在Terai实验的基础上，以孕11.5 d鼠胎肝作为抗原，获得一种单克隆抗体anti-Liv8，以此作为分选骨髓干细胞的标志，利用单克隆抗体anti-Liv8从GFP转基因大鼠骨髓中分选出anti-Liv8阴性细胞，并经尾静脉移植入持续性肝损伤的小鼠模型体内，4w后发现多数移植细胞分布于门静脉周围的肝实质内，同时表达Liv2和ALB。Liv8-negative细胞增殖并分化为肝样细胞的数量明显多于Liv8-positive细胞，后者同时表达CD45，而CD45是HSCs的重要标志。在受体血清ALB水平方面，Liv8-negative细胞移植组也显著高于Liv8-positive细胞移植组，由此得出认为：在一定条件下，MSCs更有可能分化为肝细胞。实验结果也提示，在肝脏损伤的情况下，骨髓干细胞可横向分化为肝细胞来更好地修复损伤的肝脏。以上实验为MSCs移植治疗肝损伤提供很好的思路。
5 存在问题与展望
骨髓间充质干细胞来源于中胚层具有多向分化潜能即可塑性，在不同培养条件下、不同的微环境可以使骨髓干细胞向不同的组织分化，因此可以作为多种器官细胞的种子细胞。BMSCs诱导为肝细胞在临床再生医学中具有重要的理论意义和的使用价值。骨髓MSCs具有多向分化潜能并易于体外基因操作，是一种较为理想的基因治疗靶细胞，已经在基因治疗领域显示出广阔的应用前景，但实际应用中仍有一些问题尚待解决。首先，要寻找合适的培养体系，使MSCs数量扩增的同时保持其多向分化潜能；其次，MSCs作为基因治疗靶细胞所带来的安全性问题也需谨慎对待，已有报道植入的MSCs具有致瘤性[16,17]。Rubio[17]的实验结果显示，尽管转基因的MSCs通过体外实验发现在6至8w内可以安全有效表达，但是在长期的体外实验中有可能会发生自发性的突变（4-5个月）。此外，进行转基因时有病毒载体和非病毒载体两大类，前者的安全性更需要提防，而后者的转导效率偏低，未能得到广泛应用。因此，如何考虑病毒安全性及转基因过程中可能导致的插入突变，从而带来比既往基因治疗更为严重的后果，是值得认真研究对待的重要问题。最后，如何实现MSCs携带的外源基因在目的组织可调控的表达，体现外源基因表达的时间、空间特异性是此类治疗手段得以推向临床应用前必须解决的问题。因为，最初的干细胞治疗主要是胚胎干细胞, 但由于胚胎干细胞具有免疫排斥, 可形成畸胎瘤, 伦理方面有争议并且目前认为成人的心脏和胰腺几乎没有干细胞等问题限制了其应用。骨髓间充质干细胞的多向分化潜能揭示人类组织工程的细胞来源不一定是胚胎干细胞，由于它可以来自自体，避免了伦理问题的困扰，避免了组织相容性的限制，更适用于临床的细胞移植。研究证实微环境在细胞的转化中具有非常重要的作用，因此，深入研究微环境对骨髓间充质干细胞的诱导影响及转化机制，对于BMSC分化为有功能的组织细胞有着深远的影响。未来的某一天可能通过对BMSC的研究深入，能够使其发育成一个完整的器官。骨髓间充质干细胞对于组织的再生和构建有深远的意义。研究表明，MSCs是作为基因治疗的更理想的靶细胞。MSCs作为靶细胞具有以下诸多优势： (1) MSCs取自骨髓，来源充足，取材相对较容易； (2) MSCs体外分离培养操作简便，细胞数通过培养可获得大量扩增，且具有体外长期培养的遗传稳定性和可移植性； (3) MSCs免疫原性低，移植引起的排斥反应相对较轻； (4) 作为靶细胞，MSCs易于外源基因的表达，而且所携带的外源基因表达受所处微环境的影响，具有明显的组织特异性。这些优势使MSCs在基因治疗中具有较好的应用前景。
参考文献
[1]Campagnoil C, Roberts IA, Kumar S, et al.Identification of mesenchy-mal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver and bone-marrow[J].Blood, 2001, 98:2396-2402.
[2]M.Kassem, M.Kristiansen and B.M.Abdallah, Mesenchymal stem cells:cell biology and potential use in therapy[J].Basic Clin.Pharma-col.Toxicol.95 (2004) , pp.209-214.
[3]S.Sethe, A.Scutt and A.Stolzing, Aging of mesenchymal stem cells[J].Ageing Res.Rev.5 (2006) , pp.91-116.
[4].VaananenHK.Mesenchymal stem cells[J].AnnMed.2005:37 (7) :469-79.
细胞转化 篇2
根癌农杆菌感受态细胞的制备以及质粒ProkⅡ对其转化的研究
研究了根癌农杆菌LBA4404和C58C1生长的.培养基类型、菌株生长状态、转化溶液、质粒与感受态细胞共放置时间、质粒加入量、液氮速冻时间及热激条件对质粒ProkⅡ转化的影响.结果表明,以70 mmo/L CaCl2作为转化溶液,YEB培养基制备的、OD600为0.5的LBA4404感受态细胞与10 ng质粒DNA,于0 C共放置30min,液氮速冻5 min,37 C热激5 min时转化率最高,达1.40×105 μg-1;以70 mmo/L CaCl2作为转化溶液,YEB培养基制备的、OD600为0.5～0.6的C58C1感受态细胞与20 ng质粒DNA,于0 C共放置10 min,液氮速冻1 min,37 C热激1 min时转化率最高,达1.33×105 μg-1.
作 者：作者单位：刊 名：西北农林科技大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NORTHWEST SCI-TECH UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND FORESTRY(NATURAL SCIENCE EDITION)年，卷(期)：34(7)分类号：Q813.1+1关键词：根癌农杆菌 感受态细胞 质粒ProkⅡ 转化率
细胞转化 篇3
对于干细胞疗法的安全性和有效性，科学家们还在探路。但在某些“专家”的建议下，急于治病的患者也想提前享用这一“未来技术”。于是，无所不能的干细胞“急吼吼”冲上了病床，危险和乱象接踵而来。
在昨天举行的第48期院士沙龙上，上海社科院研究员、国家人类基因组南方研究中心伦理学部主任沈铭贤透露，我国首部《干细胞研究与应用伦理规范》已进入国家卫生部的审批程序，不久后将正式出台。
干细胞治疗陷入“灰色地带”
在神经损伤、器官修复等领域，万能的干细胞被寄予厚望。我国对于干细胞研究一直持鼓励态度，目前，所有试验仅限于研究范围，至今未对除造血干细胞之外的其他干细胞治疗的临床应用发放通行证。
病急乱投医，“神奇的干细胞疗法”不断吸引着病患心甘情愿地做起了“小白鼠”。“眼下，一些机构开展的所谓‘干细胞疗法’，正处于科学与不科学、规范与不规范的‘灰色地带’。”受卫生部委托，沈铭贤和一批知名伦理学家于2009年至2010年对国内的干细胞治疗现状进行了调研。
混乱的现状着实让专家们捏了把汗：一些人打着干细胞治疗的旗号，吹嘘炒作，声称“干细胞就是干什么都行的细胞”，甚至夸大疗效，用有效率达90%之类的数据吸引患者；某些机构不做研究，或以研究为名，将未经科学家评审和伦理审查的技术匆忙应用于临床，并收取高额费用。
“疯狂的干细胞”受到了国外媒体的关注。《自然》、《经济学家》杂志对此先后发表评论，《自然•生物技术》将这一现象称为“中国干细胞综合征”。
严格区分新技术的研究与应用
对于尖端生物技术，普通患者很难判断真伪，评估风险，相关部门的管理和必要的法规才能保障患者权益。
沈铭贤透露，即将出台的《干细胞研究与应用伦理规范》将继续支持干细胞的研究与应用，并以严格区分临床前研究、临床试验和临床应用为前提。也就是说，从临床前研究到临床试验属于研究范畴，不应向患者收费；临床应用则须经有关部门的行政审批。
事实上，患者对于“新技术”的追捧，干细胞并非第一次。从“开颅戒毒”到“人工心脏植入”，再到前阵子被炒得沸沸扬扬的“肖氏反射弧手术”，“新技术”对患者造成的种种伤害，从某种程度上看，都是由于从研究通往应用的道路上操之过急所致。
沈铭贤认为，严格区分研究与应用，对于医学新技术的规范发展具有普遍意义。“肖氏反射弧技术找到了一个新通路，从科学探索角度看，也许是一个很有价值的研究方向。由于缺乏必要的规范，它最终断送了自己的前途。”
转化医学兴起凸现伦理重要性
与伦理学家所持的“谨慎推广”态度相比，倡导“从实验室到病床”的“转化医学”，恰恰是要跨越新技术的应用鸿沟。作为一种没有终点的良性循环，转化医学是一个连续、双向、开放的研究过程，这意味着它将更直接、更频繁地面对类似“干细胞”的发展之惑。
“如果把伦理比作一座桥，有了这座桥，从研究到临床会顺畅许多；若没有这座桥，研究可能就到不了临床，或者要走冤枉路，甚至步入歧途。”沈铭贤表示，转化医学的兴起凸现了伦理规范的不可或缺性，让医学伦理研究成为每位研究者和临床医生无法回避的问题。
2009年3月，奥巴马甫一上任，就为美国的干细胞研究“松绑”；此前，美国FDA(食品药品监管局)批准了一项干细胞临床试验。沈铭贤将这一系列举动看作是美国政府成功策划的一次“抢跑”——所有试验和研究都是公开的，谁做、做什么、用多少时间，都由FDA公布；这不仅有力推动了干细胞研究向临床的转化，也为将来占領可能的市场布下了棋子。不可否认，伦理在其中起了相当大的作用。
细胞转化 篇4
Green Muscle由悬浮在矿物油中的绿僵菌真菌孢子组成, 这种真菌可以在蝗虫体内生长, 产生毒素, 削弱其活力, 从而使其成为鸟类和蜥蜴易于捕获的食物。大多数受真菌感染的蝗虫会在1周至3周内死亡, 死亡速度因温度和湿度条件不同而略有差异, 总的致死率为80%左右。与化学杀虫剂不同, Green Muscle只杀死蝗虫和蚱蜢, 对鸟类和蜥蜴等不会产生副作用。
从今年5月21日起, 世界粮农组织与中南部非洲蝗虫控制组织共同发起, 在坦桑尼亚对1万公顷的农作物喷洒了Green Muscle, 结果表明可以控制蝗灾暴发。这是Green Muscle首次大规模使用。在接下来的几个月中, 他们将斥资200万美元, 继续在坦桑尼亚、马拉维、莫桑比克进行Green Muscle喷洒行动。
专家指出, 由于从喷洒到蝗虫死亡需要一段时间, Green Muscle更适于预防蝗灾。 (科技日报)
将普通皮肤细胞转化为诱导多功能干细胞 (i PS细胞) 再进行克隆等研究, 是近年来干细胞研究的热点领域, 但是该领域一直受到细胞转化率太低的制约。英国《自然》杂志网站近期发表最新科研报告说, 科学家发现, 通过基因路径阻断可以将这一转化的成功率提高约百倍。
来自不同国家的5个科研小组同时报告了相关进展, 其中包括最先培育出i PS细胞的日本科学家山中伸弥的科研小组。科学家发现, 通过阻断一个名为“p53”的基因的路径, 可以将皮肤细胞转化为i PS细胞的成功率提高至10%左右, 是原有转化率的大约百倍。
目前, 将普通细胞转化为i PS细胞的常用方法是通过病毒载体将4个基因注入细胞内;其他一些方法可以只使用2个或3个基因, 或者不使用病毒载体, 获得的i PS细胞会更安全, 更少出现不良变异的可能, 但是转化率也更低。新发现可以提高所有转化方法的成功率, 更好地兼顾效率和安全。
细胞转化 篇5
1 材料与方法
1.1 菌种和质粒。
枯草芽孢杆菌BG2036、DB104 (his-npr R2npr E18Δapr A3, Kms) , 均为本实验室保存;p PR8是以p UB110为载体插入嗜麦芽假单胞菌的蛋白酶基因得到的重组质粒, 由本实验室构建。
1.2 培养基。
LB培养基 (%) :胰蛋白胨1.0, 酵母粉0.5, Na Cl 0.5, p H 7.2;Spizizen基本培养基 (Sp MM) (%) :葡萄糖0.5, Mg SO4.7H2O0.02, (NH4) 2SO40.2, K2HPO41.4, KH2PO40.6, 柠檬酸钠.2H2O 0.1。其中Mg SO4、葡萄糖单独灭菌, 冷却后再混合。
1.3 细菌间进行的自然遗传转化。
将BG2036、DB104/p PR8两菌株分别接种于Sp MM、Sp MM (Km+His) 液体培养基中, 培养至对数生长后期, 各取250μl新鲜菌液混合于Eppendorf管中, 振荡数秒混匀 (DNase I敏感性试验对照组在此时加入终浓度为100μg/ml的DNase I) , 37℃静置1h, 振荡数秒混匀, 取100μl涂布于Sp MM (Km) 平板上, 37℃培养36h后进行转化子检测和计数, 同时分别取上述二菌株菌液稀释后涂布于Sp MM、Sp MM、Sp MM (Km) 平板上, 进行供体和受体的活菌计数以及选择平板敏感性对照。
1.4 质粒的检测。
参照Hardwood等的方法, 将小量煮沸法略有改进, 即通过此法获得含有质粒DNA的上清后以饱和酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1) 溶液抽提一次, 经无水乙醇沉淀后, 溶于20μl TE Buffer中, 取15μl上样电泳。
2 实验结果
2.1 遗传工程微生物细胞的自然遗传转化过程。
可以说, 枯草芽孢杆菌作为遗传工程微生物中重要的受体细胞, 对于最终的自然遗传转化效果有着直接的关联, 其主要是在生长过程中通过主动和被动的分解方式, 对遗传工程微生物细胞外部的DNA分子进行活性释放, 促使遗传工程微生物细胞建立起自然感受态。那么, 本文就针对这一问题, 进行了相关的调查实验, 分别获取了两株不同DNA标记的枯草芽孢杆菌来进行细胞间的自然遗传转化实验研究, 通过一系列检测工作以以后, 实验人员发现, 若是枯草芽孢杆菌处于营养匮乏的生长条件时, 更容易产生自然感受态, 并且, 其自然感受态子在对数生长后期会逐渐出现高峰期阶段, 这时的活性DNA分子也会迅速的分泌。因此, 实验人员为了进一步验证枯草芽孢杆菌可以在不加外源的条件下, 也可能够进行自然遗传转化, 那么, 我们就可以将两株枯草芽孢杆菌分别放入到液体培养基中进行培养, 直到对数声场后期以后, 再将这两株枯草芽孢杆菌混合培养, 并认真做好观察记录。经由一系列的实验结果的得出, 加入混合培养液的Km选择平板表面, 生长了大量的菌落, 而将两株枯草芽孢杆菌的菌液分别涂抹的平板上, 并无任何菌落生长, 这就表明这两者之间是已经发生了遗传信息交换的过程。
2.2 转化体的检测。
随机挑选200个转化子进行了质粒检测, 结果发现具有相同表型 (his+, Kmr) 的200个转化子中有198个所含质粒的分子大小与原质粒p PR8相同, 另外两个转化体所含质粒则明显较小。根据染色体DNA和质粒DNA进行自然遗传转化的不同机制, 可以初步判断上述含有与p PR8同样大小质粒的198个转化体是染色体DNA转化的结果, 即含有质粒p PR8的DB104菌株 (his-Kmr) 作为受体, 通过转化获得了来自供体菌株BG2036 (his+Kms) 的his片段并获得表达的结果, 所以质粒的大小不发生变化, 这类转化体我们称为C型;而另外两个转化体所含较小的质粒则可能是由于质粒DNA转化的结果, 即菌株DB104的质粒p PR8通过转化进入菌株BG2036, 并使其获得Kmr表型。由于在自然转化过程中质粒DNA是以单链形式进入细胞, 在细胞内需通过重组环化才能形成能自主复制的质粒, 重组过程中可导致质粒DNA分子大小发生改变, 检测到的两个较小的质粒, 可能重组过程中发生缺失所致, 这类转化体我们称为P型。所检测的200个转化体中未发现所含质粒的分子大于原质粒p PR8的P型转化体, 这一方面可能是由于这类转化体出现的频率更低, 检测数量不够;另一方面也可能是大分子质粒的不稳定性所致。当然, P型转化体是否确为质粒p PR8自然转化的结果。
3 讨论
所谓的自然遗传转化主要是指感受态细胞通过对不同DNA或相同DNA分子的摄入, 以此来实现水平基因转移的目的。而在以往传统的自然遗产转化实验过程中, 实验人员通过都会采用游离式的遗传基因分子。但是, 随着科学技术的日益发展, 遗传工程微生物逐渐出现在当代市场中, 在我国工业、医学领域中都得到了十分广泛的应用, 实验人员通过将混合组成的遗传基因微生物释放到不同的生长环境中, 这些特殊的DNA微生物就会在细胞间进行水平交换, 然而, 由于这一交换过程中是实验人员完全无法控制的, 其对生态造成的不利影响也是无法预估的。因此, 人们越来越关注遗传工程微生物细胞中自然遗传转化。如今, 通过多次的实验表明, 如果只是利用转化等技术, 是无法直接检测到细胞外部的DNA分子。并且, 这些DNA分子可以与固形物很好的结合在一起, 从而起到一定的保护作用。与此同时, 其还能够在长时间的活动中保持较强的生物学活性, 让遗传工程微生物细胞外的DNA分子主动释放。此外, 在对自然遗传转化更进一步的研究得知, 转化不仅可以实现受体与供体之间的转化, 这两者之间的细胞在相互碰撞接触以后, 将会发生活性转化。由此, 我们可以看出, 自然遗传转化过程并不是由受体细胞而决定的, 在很大的程度上, 供体细胞也起到了关键性的作用。
通过本文试验研究可知, 自然遗传转化是当今遗传工程微生物中的核心组成部分, 其通过将两组不同的DNA分子进行重组, 实现自然遗传转化的过程中, 确保了遗传工程微生物的安全使用。通过相关的实验表明, 在遗传工程微生物细自然遗传转化过程中, 染色体DNA与质粒DNA之间是可以进行转化的, 细胞可以作为受体, 也可以作为供体, 并不会对自然遗传转化造成较大的影响。
摘要：笔者结合了多年的工作经验, 针对遗传工程微生物细胞间发生的自然遗传转化进行了初步探讨分析, 主要是将两株不同DNA的枯草芽孢杆菌进行分别培养, 认真观察其生长状态, 并通过质粒检测、经选择平板筛选等数据分析得知, 虽然这两株枯草芽孢杆菌的遗传基因不同, 但是可以进行自然遗传转化的, 实验证明, 自然遗传转化是在物细胞中进行遗传基因的转移, 这对于我国遗传工程微生物的使用质量有着至关重要的作用与意义。
关键词：遗传工程,微生物细胞,自然遗传转化
参考文献
[1]陈琪, 陈向东, 谢志雄, 沈萍.遗传工程微生物细胞间发生的自然遗传转化[J].遗传, 2000 (3) .
[2]谢志雄, 沈萍.细菌遗传转化与水平基因转移[J].中南民族大学学报 (自然科学版) , 2003 (4) .
细胞转化 篇6
血管平滑肌细胞在胚胎发生期来自中胚层, 在发育过程中, 逐渐分化为不同的细胞群, 并获得具有成年特征的分化表型。VSMC分化的特征是表达平滑肌特异的细胞骨架和可收缩蛋白变异体, 调节细胞外基质和细胞膜整合蛋白的构成。在高血压、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等血管病变, VSMC在新生内膜形成过程中暂时变成更接近胚胎期的未分化表型, 而在增厚的新生内膜中逐渐恢复为分化表型。在血管病变部位, 表型发生转化的VSMC在增殖的同时合成与分泌各种细胞因子和细胞外基质, 在AS斑块形成和RS发生过程中发挥重要作用。因此研究VSMC表型转化的分子机制, 对高血压RS和AS等血管疾病的防治具有重要意义。
正常的血管平滑肌细胞 (VSMC) 呈非增殖性的收缩表型, 在神经及激素的影响下调节血管壁张力、维持组织血流量。VSMC分化程度高, 呈典型的纺锤形或条带状, 胞质内有丰富的肌纤维, 可见致密体和致密斑, 粗面内质网和高尔基体等细胞器较少, 仅产生极微量的细胞外基质 (ECM) , 体积相对较小。主要通过表达一系列特异的收缩蛋白和骨架蛋白来维持收缩及调节血管张力、增殖、迁移能力。合成型VSMC分化程度低或未分化, 呈纤维母细胞样形态结构, 胞质内含极少肌丝, 但有大量粗面内质网、核糖体、高尔基体等细胞器, 具有强大的合成和分泌功能。细胞体积比收缩型大, 参与分泌细胞ECM和合成血管活性物质与血管壁的形成和损伤的修复以及在生长因子刺激下的分裂和增殖。
VSMC表型具有多样性和可变性的特点。在胚胎发育过程中, 由未分化表型逐渐分化为具有成年特征的分化表型。当血管受到损伤或体外培养的VSMC受到生长因子刺激时, VSMC又从分化型转化为去分化型并获得增殖能力, 这个过程称为表型转化。
2 影响VSMC表型转化的因素
血管平滑肌细胞 (VSMC) 的病理性增殖主要体现在其表型的转变, 即平滑肌细胞从收缩型向合成型的转变。VSMC表型受控于环境, 包括生长因子及其抑制剂、细胞外基质、机械性作用力、神经调节以及细胞间相互作用。
2.1 生长因子、细胞因子、心血管活性多肽和细胞外基质对VSMC表型转化的影响
血小板源生长因子就是一种较强的有丝分裂因子, 能促进平滑肌细胞的增殖和合成功能。有体外实验发现, 培养的平滑肌细胞由收缩表型转化为合成表型时, 合成胶原的量可增加20~30倍。研究发现, 血小板源生长因子作用后的平滑肌细胞含有更多的线粒体和粗面内质网, 表现为合成表型的平滑肌细胞, 细胞间质内有较多的胶原纤维分布。当肝素与血小板源生长因子同时作用于培养的平滑肌细胞时, 细胞浆内的肌丝成分较血小板源生长因子组的平滑肌细胞增多, 且线粒体、粗面内质网等减少, 细胞类同于收缩表型的特征。这提示血小板源生长因子能够促进平滑肌细胞向合成表型的转变, 而肝素可抑制此过程的发生。
2.2 收缩兴奋剂和神经递质对VSMC表型转化的影响
目前, 神经因素对VSMC表型转化的影响受到关注。去甲肾上腺素 (NE) 是交感神经的主要递质之一, 它作用于VSMC膜上的α1受体, 引起血管的收缩。刘斌等用NE分别作用于体外培养的和血清饥饿的血管平滑肌细胞, 用5-Brd U标记VSMC的增殖、RT-PCR检测VSMC表型标志基因SM22α和增殖负性调控基因高血压相关基因-1 (HRG-1) 的表达, 结果显示NE和OX-LDL分别作用血清培养的VSMC后, SM22α和HRG-1表达下降, 5-Brd U标记的阳性增殖细胞增多;NE分别与α1-肾上腺素受体拮抗剂 (α1-R-) 和β1-肾上腺素受体拮抗剂 (β1-R-) 共作用时, SM22α和HRG-1的表达明显上调。而当NE作用于血清饥饿VSMC时, NE上调, SM22α和HRG-1的表达。因此, NE对VSMC有促进表型转化和增殖的作用, 且这种作用呈现像神经样的可逆性调节作用, 其作用机制主要通过肾上腺受体α1和β1来实现。
2.3 机械性作用力对VSMC分化的影响
实验表明, 让VSMC在三维Ⅰ型胶原基质中伸展, 可使细胞内收缩性肌丝含量增加, 提示机械性作用力可促进VSMC分化。
3 VSMC表型转化的信号转导调节
目前研究最多的相关信号转导通路如下:磷脂酶C (PLC) /蛋白激酶C (PKC) 通路;Ca+/钙调蛋白 (Ca M) 依赖性蛋白激酶Ⅱ通路;丝裂原活化蛋白激酶通路;JAK/s TAT途径;NF-KB信号通路;磷脂酰肌醇3激酶 (PI3-K) /蛋白激酶B (PKB或AKT) 通路;TGF-β/Smad转导通路;环一磷酸腺苷通路。多条通路之间存在着广泛且复杂的交联机制, 形成一个复杂的信号网络。通过这一信号网络调控血管平滑肌细胞的增殖活动。
4 VSMC表型转化在动脉粥样硬化中的调控机制
VSMC表型转化的神经调节机制越来越受到关注, 主要推测血管交感神经对VSMC的调控作用, 其中NE因能促进动脉VSMC的增殖而成为主要的研究切入点。
在动脉粥样硬化的不同阶段, VSMC表型的转换具有重要的病理生理学意义。VSMC表型转化是一个渐进的过程, 虽然整体上人们将之分为收缩表型和合成表型, 但这两种表型代表的仅是两个极端, 大量过渡状态的中间类型可共存于同一血管壁内。VSMC在增殖过程中其表型由收缩型向合成型转变。合成型的VSMC移向内膜并吞噬内膜下的脂质变成泡沫细胞;另一方面各种损失因素导致血管壁受损, 继而释放各种生长因子和细胞因子, 激活VSMC表面受体, 并引起细胞内信号转导, 最终导致细胞核内某些基因的表达, 使VSMC大量增殖。同时合成型的VSMC还分泌大量的细胞外基质。
5 结论
正常情况下, 血管平滑肌细胞接受合适的刺激, 增殖, 迁移, 并合成分泌细胞外基质, 通过存活因子, 丝分裂素, 细胞间接触抑制及细胞基质间的相互作用正常调节细胞的增殖和死亡, 正常动脉的平滑肌细胞更新率很低, 凋亡及分裂指数也很低。病理条件下, 局部因素如炎性细胞因子, 炎性细胞和修饰型胆固醇, 全身因素如高血压等, VSMC表型由收缩型向合成型转变, 打破了细胞增殖和凋亡之间的相对平衡, 使血管壁发生病理改变。因此, 控制和逆转VSMC表型转化成为控制细胞异常增殖的关键性措施, 也为动脉粥样硬化疾病的治疗提供了新的理论思路。
参考文献
[1]庞玲品, 黄石安.血管平滑肌细胞表型转化相关因素及机制的研究进展[J].广东医学院学报, 2010, 28 (3) :312-314.
细胞转化 篇7
1 材料和方法
1.1 试验动物
28日龄海蓝褐蛋鸡16只。
1.2 主要试剂
RPMI 1640, Gibco公司产品;ConA, Sigma公司产品;MTT和DMSO, 均为Amresco公司产品;淋巴细胞分离液, 中国医学科学院生物工程研究所生产。
1.3 方法
1.3.1 鸡外周血淋巴细胞的分离
无菌采取鸡心脏抗凝血2 mL, 沿试管壁缓缓加入含有2 mL淋巴细胞分离液的试管中, 1 500 r/min离心20 min;吸取淋巴细胞层移入无菌离心管中, 用RPMI 1640离心洗涤淋巴细胞3次 (2 000 r/min, 10 min) ;用台盼蓝拒染法检测细胞活率>95%, 同时进行细胞计数。用RPMI 1640 (含10%犊牛血清) 调细胞浓度至2.0×107个/mL [1]。
1.3.2 淋巴细胞浓度的选择
将淋巴细胞悬液作如下梯度稀释:2.0×107, 1.0×107, 0.5×107, 0.25×107个/mL, 分别加到96孔细胞培养板中, 每孔50 μL, 每个梯度作6个重复孔。
1.3.3 ConA浓度的选择
对照孔加RPMI 1640完全培养液50 μL, 试验孔加含不同浓度ConA的RPMI 1640完全培养液50 μL, 每个浓度设3个重复。分别对80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25 μg/mL ConA进行试验。
1.3.4 培养时间的选择
将上述细胞培养板置41 ℃、5%CO2、饱和湿度恒温培养箱中分别培养9, 21, 45, 69 h, 然后每孔加入5 mg/mL MTT 10 μL继续培养3 h。
1.3.5 淋巴细胞转化率的计算
细胞培养结束后, 每孔再加DMSO 100 μL, 于小型微量振荡器上轻轻振荡混匀约15 min, 溶解各孔中沉淀物;于酶联免疫吸附试验检测仪上检测590 nm波长下各孔的OD值, 按下式计算:淋巴细胞转化率 (%) =试验孔平均OD值/对照孔平均OD值×100%。
2 结果 (见表1)
由表1可知:浓度为2.0×107, 1.0×107, 0.5×107个/mL淋巴细胞悬液培养12小时时, 各浓度ConA对淋巴细胞的刺激指数较为相近, 且ConA浓度为40, 20 μg/mL时刺激指数较大;细胞浓度为0.25×107个/mL、ConA浓度为40, 20 μg/mL时的刺激指数较大。浓度为1.0×107个/mL的淋巴细胞悬液培养24小时时, 应用浓度为80, 40, 20 μg/mL ConA刺激淋巴细胞均可获得较为理想的淋巴细胞转化率。浓度为1.0×107, 0.5×107个/mL的淋巴细胞悬液培养48小时时, 在10～80 μg/mL ConA刺激下, 刺激指数均较为理想;当淋巴细胞浓度为1.0×107个/mL、ConA浓度为40 μg/mL时刺激指数最大。浓度为0.5×107个/mL的淋巴细胞悬液在培养72小时时, 各试验浓度ConA刺激下的淋巴细胞转化率均较为理想。
3 讨论
不同类型细胞具有不同的MTT代谢率, 即使同种类型细胞的MTT代谢率因试验条件的不同而不完全一致。因此, 在用不同种动物进行此试验时其试验条件不能简单地套用。此试验对影响鸡外周血淋巴细胞转化试验MTT检测法的主要因素 (细胞浓度、ConA浓度和培养时间) 进行了优化筛选。结果发现, 鸡血液淋巴细胞增殖功能呈现一定规律性:淋巴细胞浓度为1.0×107个/mL, ConA 浓度为40 μg/mL, 在41 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下, 细胞培养48小时时, 4周龄鸡外周血淋巴细胞对ConA的刺激指数最大;细胞浓度为2.0×107个/mL, 培养24小时时或48小时时, ConA刺激指数与未加入ConA的刺激物指数相近;无论细胞浓度及培养时间如何, ConA浓度为40 μg/mL和20 μg/mL时均可获得较好的淋巴细胞转化率, 此结果与Barta V等[2]报道的ConA最佳浓度为30～50 μg/mL基本一致。细胞浓度为1.0×107个/mL和0.5×107个/mL时, 淋巴细胞的转化效果较好;而培养48小时时的刺激指数较为理想。杨发龙等[3]利用MTT法筛选出15日龄鸡外周血淋巴细胞增殖反应最佳条件是ConA 浓度为15 μg/mL, 细胞浓度为1.0×107个/mL, 培养时间为48 h。李祥瑞等[4]对19～21周龄SPF鸡脾脏淋巴细胞转化效果进行了研究, 认为鸡脾脏淋巴细胞转化的最佳条件为ConA 2.5 μg/mL。吴建设等[5]采用全血培养法研究了鸡淋巴细胞转化试验的最佳条件, 结果发现ConA 浓度为45 μg/mL、培养时间为56 h的淋巴细胞转化能力最佳。本试验结果与以前的研究结果在某些方面不一致, 其原因是否与动物种属、日龄不同及淋巴细胞对ConA刺激的反应性存在差异有关还有待于进一步探讨。
参考文献
[1]李庆章, 刘忠贵.MTT比色分析法检测鸡T淋巴细胞体外增殖反应的研究[J].中国兽医杂志, 1994, 20 (9) :18-20.
[2]BARTA V, BARTA O, PIERSON F W.Chicken lymphocyte trans-formation test[J].Budapest, 1992, 36 (2) :945-955.
[3]杨发龙, 岳华, 罗薇, 等.MTT法检测鸡外周血淋巴细胞增殖性反应的最佳条件探讨[J].西南民族学院学报, 2002, 28 (2) :214-215.
[4]李祥瑞, 金红, 王秀丽, 等.以MTT比色法检测鸡脾淋巴细胞转化效果[J].畜牧与兽医, 1996, 28 (1) :3-4.
细胞转化 篇8
1 材料与方法
1.1 实验动物
100 g左右4周龄雌性F344大鼠18只[购自北京维通利华实验动物中心, 许可证号SCXK (京) 2012-0001]。随机分为三组, 正常对照组、D-半乳糖诱导衰老组和雌激素诱导垂体瘤组, 每组各6只。本研究经牡丹江医学院动物伦理委员会批准, 严格按照NIH实验动物伦理原则进行操作。
1.2 主要试剂及设备
≥98%的β-雌二醇 (Sigma公司) , ≥98%的D-半乳糖 (Sigma公司) , 医用硅胶管 (内经2 mm, 外径3 mm, 济南晨生医用导管公司) , 鼠抗鼠单克隆PTTG抗体 (ab cam公司) , 鼠抗鼠单克隆P16抗体 (abcam公司) 。SYBR green master rox (Roche公司) , transcriptor first strand c DNA Synthesis Kit (Roche公司) 。
1.3 构建大鼠衰老模型及垂体泌乳素腺瘤模型
10%水合氯醛按0.2 m L/100g腹腔注射麻醉, 将含有10 mg E2无菌硅胶管植入雌激素诱导垂体瘤组大鼠背部皮下, 正常对照组及D-半乳糖诱导衰老组植入含有生理盐水的硅胶管。D-半乳糖诱导衰老组于术后7 d连续腹腔内注射D-半乳糖200 mg/ (kg·d) , 造成亚急性衰老;正常对照组、雌激素诱导垂体瘤组术后7 d腹腔内注射同等量生理盐水对照。观察各组大鼠的精神状态、体重、进食及尿量、肌肉是否有萎缩、毛发光泽度及有无脱毛等。术后第8周, 断头处死全部大鼠。解剖垂体, 观察垂体形状、大小、质地及颜色, 同视神经及颈内动脉比邻关系, 观察垂体窝鞍底形状, 骨质是否破坏。
1.4 垂体病理学检测
垂体标本常规HE染色, 采用S-P法进行免疫组化染色, 一抗为大鼠PRL单克隆抗体 (murine, Dako公司, 美国) 。用PBS代替一抗平行染体做阴性对照。
1.5 RT-PCR检测垂体组织中PTTG、P53、P21、P16m RNA表达
PTTG、P53、P21、P16基因的引物由生工生物工程 (上海) 有限公司合成。按照93℃, 3 min;95℃, 1 min, 60℃30 s, 72℃30 s, 72℃30 s, 72℃4 min;30 cycle扩增目的基因, 对每个基因设β-actin做内参, 内参基因为Rps16。
1.6 Western-blot检测垂体组织中PTTG、P16、P21表达
每组取3只大鼠垂体组织, 提取垂体组织总蛋白, 进行SDS-PAGE电泳, 滴加稀释的Anti-p16 antibody、Anti-p21 antibody, Anti-PTTG antibody, DAB显色。照相记录图像, 蛋白感光条带用Kodak Carestream Molecular Imagine软件测量积分灰度值, 以各组蛋白表达量与β-Action比值进行半定量分析, 显示目的基因的蛋白表达水平。
1.7 统计学方法
实验数据采用Graph Pad Prism 5.0进行分析, 正态分布计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 多组间比较采用方差分析, 两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 动物一般状态
6周后, D-半乳糖诱导衰老组大鼠出现精神萎靡、毛色晦暗, 背部及面颊部脱毛;与正常对照组比较, 尿量有所增加, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。与正常对照组比较, 雌激素诱导垂体瘤组大鼠尿量明显增加, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。见表1。
注:与正常对照组比较, *P<0.05, **P<0.01;与雌激素诱导垂体瘤组比较, ▲P<0.01
2.2 解剖学观察
雌激素诱导垂体瘤组大鼠垂体重量高于正常对照组, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。D-半乳糖诱导衰老组大鼠垂体重量小于正常对照组大鼠, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;D-半乳糖诱导衰老组大鼠垂体重量明显小于雌激素诱导垂体瘤组, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。见表1。正常对照组垂体粉红色, 位于鞍内, 双侧视神经之间, 其上覆盖鞍隔。D-半乳糖诱导衰老组垂体明显缩小, 表面皱缩, 质地较韧。雌激素诱导垂体瘤组垂体窝明显扩大, 形成大于正常对照组数倍体积的肿瘤, 鞍底骨质受压变薄, 视神经移位, 鞍隔上抬, 肿瘤有假包膜存在, 质地软, 分离肿瘤易出血。
2.3 垂体组织学观察
雌激素诱导垂体瘤组细胞排列紊乱, 正常垂体腺管样结构消失, 核大小不一致, 可见不典型性增生呈肿瘤样改变;D-半乳糖诱导衰老组垂体细胞明显减少, 细胞间隙扩大, 血管网稀疏, 部分细胞浆内出现空泡样改变, 细胞膜皱缩, 异染色质形成存在于细胞内。D-半乳糖诱导衰老组内PRL基本没有表达, 无明显细胞内颗粒染色, 正常对照组有PRL低表达, 镜下阳性细胞占比例很少, 雌激素诱导垂体瘤组大于80%细胞内表达阳性。见图1 (封三) 。
2.4 RT-PCR检测垂体组织内PTTG、P53、P16、P21m RNA表达
RT-PCR显示雌激素诱导组PTTG m RNA表达最高为 (12.99±1.86) , D-半乳糖诱导衰老组PTTG表达最低为 (2.10±0.23) , 差异有高度统计学意义 (P<0.01) ;D-半乳糖诱导衰老组P53、P16、P21 m RNA表达最高为 (113.51±23.87) 、 (29.26±4.44) 、 (67.21±10.08) , 在雌激素诱导垂体瘤组中表达略升高, 分别为 (83.26±8.06) 、 (9.83±2.13) 、 (28.19±2.01) , 两组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图2。
2.5 Western-blot检测垂体组织中PTTG、P16、P21蛋白表达
Western-blot条带积分灰度值显示D-半乳糖诱导衰老组PTTG、P21、P16蛋白表达为 (0.198±0.032) 、 (1.239±0.051) 、 (1.673±0.055) , 雌激素诱导垂体瘤中表达为 (1.002±0.041) 、 (0.202±0.055) 、 (0.409±0.059) , 两组比较差异有统计学意义。其中雌激素诱导垂体瘤组PTTG表达最高, D-半乳糖诱导衰老组垂体中表达最低。P16、P21在D-半乳糖诱导衰老组垂体表达最高, 在雌激素诱导垂体瘤组中表达最低。见图3。
3 讨论
组织学上大多数垂体腺瘤是良性肿瘤, 虽然部分垂体瘤表现侵袭性生长, 但很少有恶变和远处转移。部分垂体微腺瘤表现为停止生长, 微小泌乳素腺瘤能够进行自我消除, 说明在垂体瘤发生中存在内在的衰老机制[6]。不可逆的生长抑制和具有代谢活性是细胞衰的老两个标志性特征, 表现为半乳糖苷酶 (β-galactosidase, SA-β-GAL) 活性增加和异染色质凝聚 (senescence-associated heterochromatic foci, SAHF) , 研究发现DNA损伤和癌基因活化均可诱导细胞衰老[5,7]。癌基因诱导衰老是癌基因突变所产生的异常增殖信号, 通过P16INK4A-Rb, ARF-P53-P21信号通路激活衰老, 造成癌基因不稳定性增加, 恢复和提升肿瘤抑制基因活性, 使细胞处于生长停滞状态, 抑制肿瘤细胞增殖, 是预防肿瘤发生及恶变的重要保护屏障[7,8,9]。所以对垂体泌乳素腺瘤的癌基因———PTTG进行研究, 探讨其是否参与垂体细胞的早熟及增殖衰老中, 有助于重新认识垂体瘤的发生机制, 为垂体瘤治疗提供新的思路和方法。
PTTG是有丝分裂中的安全素样蛋白具有分离蛋白抑制酶活性, 能阻断有丝分裂过程中姐妹染色体的分离, 引起非整倍体出现, 导致基因不稳定和细胞恶性转化, 同时PTTG有效调控下游目标靶基因, 如成纤维细胞生长因子2 (b FGF-2) 及C-myc、P21、MMP2、cyclin D3等表达, 导致肿瘤血管形成、转移、侵袭力增强等, 与肿瘤的转移、预后密切相关[10,11,12]。近期研究发现PTTG能够干扰P53与DNA的结合能力, 抑制P53下游基因P21的转录活性和蛋白表达, 从而抑制P53介导的细胞凋亡, 促进肿瘤增殖, 在垂体腺瘤的形成和生长过程中起重要的作用。PTTG发挥调节衰老和凋亡主要通过蛋白-蛋白之间相互作用、细胞因子旁分泌-自分泌刺激和激活靶基因三条途径完成[13,14,15]。本次实验结果显示在雌激素诱导垂体瘤组大鼠中PTTG m RNA表达水平较其他组明显增高, 在D-半乳糖诱导衰老组垂体中PTTG表达明显降低, 所以PTTG可以看作垂体瘤的癌基因, PTTG的持续作用可以促进肿瘤细胞增殖。
癌基因诱导衰老能抑制肿瘤细胞增殖, 主要是通过P16INK4A-p Rb和ARF-P53这两条信号通路发挥作用, P16和P21-P53是衰老信号通路网络中的两个重要的控制节点[13,16]。对垂体瘤细胞衰老的研究发现, 敲除PTTG的垂体细胞启动了依赖P53-P21的衰老途径, 抑制了细胞周期进展所需的CDK2活性、Rb基因磷酸化等, 从而抑制肿瘤增殖[4,17]。研究发现PTTG基因缺失裸鼠中表现明显垂体衰老特点, 触发ARF-P53-P21衰老信号通路, 使凋亡阻滞, 诱导衰老产生, 阻止垂体瘤产生。PTTG主要通过调控P21的表达而影响细胞衰老的进程。但是奇怪的是, 在GH3细胞系中, 过表达PTTG反而会上调P21的表达, 从而促进衰老的发生。PTTG表达与P21呈负相关, 调节P21会减弱PTTG表达, 抑制肿瘤增殖。此研究同时指出PTTG表达水平过低诱发垂体细胞衰老, PTTG表达过高, 绕过衰老, 形成肿瘤。说明PTTG的表达失衡, 诱发和绕过衰老, 本实验也证实垂体内PTTG表达失衡导致垂体瘤生成[15,17]。
细胞衰老及凋亡都是通过激活P53下游靶基因P21而触发。本实验发现亚急性衰老大鼠垂体P53蛋白表达明显增高, 研究也指出P53仅仅在肿瘤生长早期 (未成熟衰老) 表达升高[13,18], 本实验也发现P53在雌激素诱导垂体瘤中表达比正常对照组高, 说明垂体细胞在经历了癌基因刺激后, 产生DNA损伤突变, 肿瘤生成过程中存在P53蛋白参与的细胞衰老, 引进并保持垂体肿瘤细胞一定程度的衰老, 抑制垂体瘤细胞进一步增殖, 说明在垂体衰老中P53蛋白参与调控衰老和维持衰老。
P21是P53的一个经典靶基因, 同时也是细胞周期负性调控因子, 与细胞凋亡和衰老密切相关[19]。本实验发现P21在衰老组垂体细胞中的表达是肿瘤细胞组的3倍, 提示垂体细胞衰老与P21的诱导密切相关。衰老组PTTG表达水平降低, 癌基因表达失衡能激活P53使P21表达增加, 引起细胞衰老, 表明P21参与诱发垂体细胞衰老与癌基因刺激的丧失密切相关。当癌基因表达水平下降的时候, P21由于失去癌基因刺激产生早熟衰老, 引起细胞生长停滞, 设想提高P21表达能够诱导衰老和限制垂体瘤细胞增殖和恶变[13]。
P16基因是细胞周期依赖性激酶CDK4抑制剂, P16INK4A同CDK4结合调控视网膜母细胞瘤Rb蛋白磷酸化水平, 使Rb基因与转录因子E2F相结合, 处于非磷酸化状态, 进而抑制细胞由G1期进入S期, 导致细胞生长停滞, 产生衰老, 因此又称为衰老相关基因[20]。P16有特异的自我更新功能, 能够持续的表达, 维持衰老通路的完整性[19,20]。本实验发现正常对照组内P16水平也较垂体瘤组内升高, 也行正常垂体内存在一定程度的衰老, 正常的垂体衰老是抑制内分泌细胞过度增殖导致分泌激素过量, 是机体的一种平衡和保护机制。垂体瘤内P16水平下降并与P21表达正相关, 说明大鼠在雌激素及癌基因的持续刺激下, P16表达下降, 早熟衰老消失, 肿瘤增殖。所以如何提高肿瘤进展期衰老相关基因表达, 诱导衰老限制肿瘤增殖和恶性变, 是将来研究的重点。
本实验证实在衰老垂体呈中PTTG表达水平明显下降, 与P53、P21、P16表达负相关, 说明D-半乳糖激活垂体细胞ARF-P53-P21/PRb-P16衰老通路, P53、P21表达提升, 抑制PTTG的表达, 引起细胞生长停滞。而雌激素作用引起PTTG表达增高, 导致姐妹染色体分离受限, 细胞周期停滞, 非整倍体形成, 发生了癌基因表达水平失衡诱发的早熟衰老, 但是由于雌激素持续释放, PTTG明显升高产生衰老绕过, 进一步引起细胞损伤, 产生垂体瘤细胞增殖。设想通过调控PTTG诱发衰老, 使垂体瘤细胞增殖停滞、侵袭性降低、激素异常分泌, 有较大临床应用前景。
细胞转化 篇9
关键词：活性氧,卵巢上皮性癌,SKOV3细胞,间充质转化,E钙黏蛋白
卵巢上皮性癌是来源于卵巢上皮组织的恶性肿瘤,发病率占女性生殖系统恶性肿瘤的第3位。恶性程度高,不易早期发现,75% 的患者就诊时为Ⅲ期或Ⅳ期,是死亡率最高的女性生殖系统肿瘤。活性氧( reactive oxygen species,ROS) 是真核细胞有氧呼吸时的产物。大量研究表明,ROS与肿瘤的发生、发展以及转移有关[1,2],包括参与上皮间充质转化等复杂过程[2],成为基础医学和生命科学的研究热点。但是,在卵巢癌患者中,ROS是否参与及其作用机制目前仍不清楚。E钙黏蛋白( E-cadherin) 是上皮间充质转化的Ⅰ型标志性分子,可维持细胞间紧密连接,阻止细胞活动侵袭及转移扩散[3]。目前在肿瘤转移通路上,有学者提出缺氧诱导因子-1α( HIF-1α) 及赖氨酰氧化酶( LOX) 可能是E-cadherin的上游分子[4,5],因而本研究大胆假设并验证,HIF-1α、LOX参与ROS介导的卵巢上皮性癌间充质转化通路。本研究在调节ROS水平情况下,检测相对应卵巢上皮性癌E-cadherin水平,以研究ROS水平高低是否影响卵巢上皮性癌上皮间充质转化发生,并进一步探讨其影响机制。
1 材料与方法
1. 1 细胞和试剂
1. 1. 1细胞株人卵巢上皮性癌SKOV3细胞株购自中国科学院细胞库。细胞用含10% 胎牛血清的McCoy's 5 A培养基,按1% 体积分数加入双抗贮存液( 青霉素+链霉素) ,置于5% CO2、37℃条件下培养传代。0. 25% 胰蛋白酶消化传代,在37℃、饱和湿度、5% CO2、95% 空气恒温培养箱中常规培养。
1. 1. 2试剂ROS生成剂大黄素( Emodin,美国Sigma公司) ,ROS清除剂二硫苏糖醇 ( DTT,德国Merk公司) ,LOX的不可逆性抑制剂β-氨基丙腈( β-APN,美国sigma公司) 。HIF-1α山羊抗 人多克隆 抗体( Y-15,美国Santa Cruz公司) ,LOX兔抗人多克隆抗体( H-140,美国Santa Cruz公司) ,E-cadherin兔抗人多克隆抗体( H-108,美国Santa Cruz公司) ,山羊抗兔二抗、驴抗山羊二抗( 美国Santa Cruz公司) 。GAPDH及兔抗鼠二抗由上海交通大学医学院细胞生物学教研室提供。细胞蛋白抽提液Ripa购自Invitrogen公司,BCA法测蛋白浓度试剂盒购自碧云天。Trizol为invitrogen公司产品。
1. 2 方法
1. 2. 1测定不同方法干预下SKOV3细胞内的ROS水平采用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐法( DCFH-DA法) 进行测定。将处于对数生长期的SKOV3细胞悬液以每孔5×105个/ml密度接种于12孔板中,每孔1ml,置37℃、5% CO2培养箱内过夜。实验分为3组( Emodin组、DTT组、对照组) ,Emodin组予ROS生成剂Emodin( 50μmol/L,4小时) 处理,DTT组予清除剂DTT( 5 mmol / L,2小时) 处理,对照组未予药物干预仅加入同体积的培养基。实验均设3个复孔,细胞在10μmol / L的DCFH-DA溶液中,置于孵箱中避光孵育15分钟。在冰磷酸盐缓冲液( PBS) 洗2次后,收集细胞,即刻于流式细胞仪上进行检测。
1. 2. 2小干扰RNA( small interfering RNA,SiRNA) 的转染化学合成SiRNA购自广州锐博公司,同时合成阴性对照SiRNA( 碱基顺序随机排列,与人类基因的外显子没有同源性) ,序列如下: si-HIF-1α正义链:5'-CTGATGACCAGCAACTTGA-3',si-HIF-1α反义链:5'-TCAAGTTGCTGGTCATCAG-3'。转染前24小时,将SKOV3细胞传代至12孔培养板,用不加抗生素的培养基孵育过夜,当细胞汇合度达到40% 时转染,参照Invitrogen公司Lipofectamine TM2000转染试剂说明将SiRNA按50 nmol / L的终浓度转染SKOV3细胞,在24小时、48小时收集细胞,采用Trizol一步法提取细胞总RNA,RT-PCR分析SiRNA对HIF-1αmRNA的干涉效果。收集抑制作用较为显著的48小时细胞进行实验。
1. 2. 3检测不同ROS水平及β-APN干预前后细胞HIF-1α、LOX及E-cadherin蛋白的表达采用蛋白印迹法检测不同ROS水平( Emodin组、DTT组、对照组)E-cadherin蛋白的表达,及β-APN干预前后 ( β-APN组、Emodin+β-APN组、对照组) 细胞HIF-1α、LOX及E-cadherin蛋白的表达。将上述各组细胞置于冰上,弃培养液,PBS洗2次,每次5分钟,每106细胞加入0. 1 ml Ripa裂解液,冰上充分裂解30分钟,离心后取上清液,BCA法测蛋白浓度,-80℃保存。取40 pg蛋白于7. 5% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS—PAGE) ,分离后将蛋白转移至PVDF膜,室温封闭2小时。HIF-1α多抗1∶200; LOX多抗1∶200; E-cad多抗1∶200; GAPDH单抗1∶10000,4℃湿盒过夜。次日以相应二抗1∶2000,37℃湿盒孵育,ECL法显影。取各蛋白质实际灰度值与同一张膜上内参照GAPDH的条带灰度值的比值表示对应蛋白的相对表达水平。
1. 2. 4检测不同ROS水平及HIF-1αSiRNA干预前后细胞HIF-1α、LOX及E-cadherin mRNA的表达采用反转录PCR检测不同ROS水平( Emodin组、DTT组、对照组) E-cadherin mRNA的表达,及HIF-1αSiRNA干预前后 ( HIF-1αSiRNA组、DTT组、对照组) 细胞HIF-1α、LOX及E-cadherin mRNA的表达。按照Trizol试剂抽提说明书提取各组细胞的总RNA,逆转录合成c DNA。采用Primer 5. 0软件设计引物,由上海生工公司设计合成,引物序列如下: E-cadherin正义链为5'-TGAAGGTGACAGAGCCTCTGGAT-3',反义链为5'-TGGGTGAATTCGGGCTTGTT-3',扩增片段长度为200 bp; LOX正义链为5'-GCATACAGGGCAGATGTCAGA-3',反义链为5'-GGCATCAAGCAGGTCATAGTG-3',扩增片段长度为183 bp; HIF-1α正义链为5'-TCCAGCAGACTCA-AATACAAGAAC-3',反义链为5'-GTATGTGGGTAGGAGATGGAGATG-3',扩增片段长度为138 bp; 内参照GAPDH基因的引物序列: 正义链5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3',反义链5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3',扩增片段 长度为138 bp。PCR反应体系为10μl。PCR反应条件为: 95℃预变性10分钟后,95℃10秒,60℃15秒,72℃20秒,共45个循环。反应结束后取适量PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,GAPDH作为内参照。各样本均设3个复管,实验重复3次。Tocan凝胶成像系统拍照成像。取HIF-1α、LOX及E-cadherin扩增条带的实际灰度值与GAPDH扩增条带的实际灰度值的比值,表示HIF-1α、LOX及E-cadherin mRNA的相对表达水平。
1. 2. 5细胞侵袭能力测定采用改良的Transwell侵袭小室方法检测各组( 对照组、Emodin组、DTT组、HIF-1αSiRNA组、Emodin + HIF-1αSiRNA组、β-APN组、Emodin+β-APN组) 细胞的侵袭能力。Transwell小室购自美国Costar公司,上、下室之间经聚碳酸酯膜隔开( 孔径8μm,购自美国Millipore公司) ,朝上室方向的上膜面( 光滑面) 铺0. 5μm/μl人工重组基底膜Matrigel( 购自美国BD公司) ,将上述各组药物刺激细胞分别消化后孵育于上室中,48小时后甲醛固定,PBS漂洗,用棉签擦掉上膜面的Matrigel及未穿过膜的细胞,结晶紫染色,并于400倍显微镜下观察,每膜计数上、中、下、左、右5个不同视野的背面透过的细胞数作为侵袭细胞数,计算平均值。每组细胞重复3孔,后取平均数,计算侵袭率,计算方法为侵袭细胞数/细胞总数×100% ,以此代表每组细胞的侵袭能力。
1. 2. 6划痕实验用marker笔在6孔板背后均匀划横线,每隔1 cm划1道,横穿过孔。在孔中加入2 ml约5×105/ ml细胞,于培养箱中孵育过夜,次日用枪头垂直于背后横线划痕。PBS漂洗3次,置入37℃,5%CO2培养箱中培养,按12小时、48小时取样,并测量划痕间距。
1. 3统计学处理数据分析采用SPSS 10. 0统计分析软件包,以±s表示。多组间均数比较采用方差分析,两组均数间比较采用t检验。P<0. 05为差异有统计学意义。
2 结 果
2. 1 SKOV3细胞中ROS的水平变化流式细胞学检测显示,Emodin组和DTT组ROS相对值分别为( 164. 85±8. 93) % 和 ( 61. 23±16. 30 ) % ,与对照组( 97. 42±6. 47) % 比较,差异均有 统计学意 义 ( t =47. 48,P <0. 01; t = 2. 753,P <0. 05) 。
2. 2 ROS 水平与 SKOV3 细胞上皮间充质转化及其侵袭性
2. 2. 1不同ROS水平的SKOV3细胞中E-cadherinmRNA和蛋白的表达RT-PCR检测结果显示,Emodin组SKOV3细胞的E-cadherin mRNA表达水平显著降低,与对照组比较差异有统计学意义( P <0. 05) 。DTT组mRNA表达显著升高,与对照组比较,差异有统计学意义( P <0. 05) 。Western blotting检测结果显示,ROS组SKOV3细胞的E-cadherin蛋白表达水平降低,与对照组比较差异有统计学意义( P<0. 05) 。DTT组蛋白表达水平升高,与对照组比较差异有统计学意义( P<0. 05) 。见表1。
P1: Emodin组与对照组比较; P2: DTT组与对照组比较
2. 2. 2不同ROS水平的SKOV3细胞侵袭能力的比较Transwell实验结果显示: Emodin组细胞侵袭率( 19. 48±0. 49 ) % 和DTT组细胞侵 袭率 ( 3. 56±2. 06) % 与对照组( 10. 74±2. 38) % 比较,差异均有统计学意义( P =0. 008,P =0. 029) 。
2. 3 SKOV3 细胞 HIF-1α、LOX、E-cadherin mRNA 及蛋白表达
2. 3. 1 HIF-1α基因沉默后的mRNA表达化学修饰HIF-1α基因SiRNA( HIF-1αSiRNA组) 和使用DTT单药( DTT组) 作用于SKOV3细胞后,与对照组比较,HIF-1αmRNA表达明显下降,LOX的表达也明显下降,而E-cadherin mRNA表达则明显增加,差异均有统计学意义( P<0. 05) 。而DTT组的作用效果较HIF-1αSiRNA组更为显著,两组比较,差异均有统计学意义( P<0. 05) 。见表2。
P1: HIF-1α SiRNA 组与对照组比较; P2: DTT 组与对照组比较; P3:DTT 组与 HIF-1α SiRNA 组比较
2. 3. 2干预ROS水平及LOX表达水平后的蛋白表达Western blotting检测结果显示,上述各组均能测得HIF-1α、LOX、E-cadherin蛋白的表达。Emodin组与对照组比较,HIF-1α、LOX蛋白表达水平增加,Ecadherin表达减少,差异有统计学意义 ( P < 0. 05 ) 。DTT组结果与之相反( P <0. 05) 。见表3。
P1: Emodin组与对照组比较; P2: DTT组与对照组比较
使用了β-APN作用于SKOV3细胞后,与对照组比较,HIF-1α蛋白表达未见明显减少,差异无统计学意义( P>0. 05) ; 而LOX蛋白表达减少,E-cadherin蛋白表达增加,差异有统计学意义 ( P < 0. 05) 。联合β-APN与Emodin作用于SKOV3细胞后,HIF-1α表达较对照组明显增加( P<0. 05) 。见表4。
P1: β-APN组与对照组比较; P2: Emodin+β-APN组与对照组比较
2. 3. 3干预后各组细胞侵袭能力变化划痕实验结果显示: HIF-1α的SiRNA沉默HIF-1α表达,β-APN抑制LOX使SKOV3细胞侵袭性及转移性下降。各组与对照组比较,差异均有统计学意义( P<0. 05) 。见图1。
3 讨 论
卵巢上皮性癌因卵巢位于盆腔深部,起病隐匿,缺乏特异性的早期诊断方法,且极易发生转移,临床发现时多为中晚期,腹腔内播散和远处转移是其主要转移途径,临床上虽然采用“肿瘤细胞减灭术”加化疗,目前整体中位生存率还是较低( 24 ~ 60个月)[1]。因此,研究卵巢癌的转移机制以及针对这些机制的靶向治疗对于提高治愈率显得尤为重要。
3. 1 ROS水平与卵巢上皮性癌转移ROS是真核细胞有氧呼吸时的产物,产生于正常的生理过程,是需氧细胞在代谢过程中产生的各种形式氧自由基和不以自由基形式存在的含氧化合物的总称。大量研究表明,ROS可介导细胞信号转导,参与肿瘤的发生、发展以及转移过程[2,6],成为近年来基础医学和生命科学的研究热点。在癌症患者中,氧化应激水平高,肿瘤组织自发生成过氧化氢,并且此过程与肿瘤的临床分期有关,这一结果在多 种肿瘤细 胞上获得 验证[7],并且肿瘤的侵袭性与ROS的水平呈正相关[8]。然而ROS水平的高低与卵巢上皮性癌之间的关系尚未见报道,本研究以人卵巢上皮性癌细胞株SKOV3为切入点,探索ROS水平与卵巢上皮性癌转移的相关性以及其可能的分子机制。
3. 2上皮间充质转化与肿瘤侵袭研究发现,上皮间充质转化是肿瘤侵袭的关键步骤,是因为肿瘤细胞在发生间充质改变上皮间充质转化后,移行至周围组织从而发生转移。而E-cadherin是细胞黏附分子的重要成员之一,主要分布于上皮组织。卵巢上皮性肿瘤起源于卵巢表面上皮,正常卵巢表面上皮无E-cadherin表达; 卵巢肿瘤细胞常常E-cadherin表达阳性。经研究证实,E-cadherin可维持细胞间紧密连接,阻止细胞活动侵袭及转移扩散[9]。相反地,培养的上皮细胞E-cadherin转基因小鼠模型或表达敲除证实了低Ecadherin表达可诱导上皮间充质转化发生[3]。本研究采用ROS生成Emodin,一种蒽醌成分,显著提升细胞ROS水平,此外还选用ROS清除剂DTT作为对照,Emodin和DTT处理SKOV3细胞后的ROS相对值分别为( 164. 85±8. 93) % 和( 61. 23±16. 30) % ,与对照组( 97. 42±6. 47) % 比较,差异有统 计学意义 ( P <0. 01,P <0. 05) ,说明通过以上手段我们可以有效干预ROS水平。而当提升ROS水平后,Emodin组卵巢癌SKOV3细胞的E-cadherin mRNA表达水平显著降低,降低其水平后,DTT组中E-cadherin mRNA表达上升。Western blotting检测结果同样显示,Emodin组卵巢癌SKOV3细胞的E-cadherin蛋白表达水平显著降低,DTT结果亦与之相反。这些结果都证实当ROS大量表达时,E-cadherin蛋白及mRNA表达均受到抑制; 由Transwell实验( 侵袭能力) 结果显示可见,当ROS生成剂Emodin组、活性氧清除剂DTT组分别与对照组比较,ROS生成可促进细胞株SKOV3侵袭能力增强,ROS清除则可降低细胞株SKOV3侵袭能力,差异均有统计学意义( P<0. 01,P<0. 05) 。以上结果均提示ROS水平上升,E-cadherin下调后,卵巢癌细胞转移能力增强。
3. 3 HIF-1α、LOX分子参与ROS介导的卵巢上皮性癌间充质转化的分子机制HIF是在人肝癌Hep3B细胞中发现的,由α亚单位和β 亚单位组成异源二聚体,β亚单位常氧条件下在细胞中呈稳定表达,a亚单位是目前发现的唯一的氧调节亚单位,决定HIF-1的活性[10]。HIF-1α在多种肿瘤中高表达,卵巢上皮性癌中也有高表达,并与肿瘤的分期、侵袭力及转移种植呈正相关,随着临床分期的上升表达显著增加[10]。研究发现,肿瘤细胞的慢性缺氧能产生ROS,并以此激活HIF-1α,并激活下游通路,从而转移[11]。本试验研究证实了HIF-1α为ROS与E-cadherin间的关键分子,并发现沉默HIF-1α表达后,LOX表达下降,E-cadherin表达增加,细胞侵袭性下降,推测LOX可能为HIF-1α的下游分子。
LOX是一种铜依赖性单胺氧化酶,最近研究发现,细胞外基质中的LOX的表达异常与肿瘤发育、进展,黏附性、恶性转化和侵袭性等有着密切的关系[11]。Kirschmann等[12]发现,在高侵袭转移性乳腺癌细胞株MDA-MB-231中LOX mRNA的表达水平明显高于低侵袭非转移乳腺癌细胞株MCF-7中的水平,在使用β-APN处理过的mda-MB-231细胞株后,侵袭性较未处理的细胞株明显下降。我们在干预ROS水平后( 见表3) ,Emodin组HIF-1α、LOX蛋白表达水平增加,Ecadherin表达减少,划痕间距差增加,差异有统计学意义( P<0. 05) 。DTT组结果与之相反( P<0. 05) 。在使用β-APN后,HIF-1α未见明显减少 ( P > 0. 05) ,而LOX蛋白表达减少,E-cadherin表达增加,差异均有统计学意义( P <0. 05) 。以上结果证实ROS的水平影响HIF-1α、LOX、E-cadherin这一系列分子的表达。而当我们沉默HIF-1α基因后可以使ROS诱导表达丢失的E-cadherin上调,并可下调LOX的表达,提示LOX及Ecadherin受HIF-1α调控可能。同时,在使用β-APN后,HIF-1α未见明显减少( P >0. 05) ,联合Emodin +β-APN组,可见HIF-1α明显增加( P<0. 05) ,提示当在运用βAPN不可逆性地下调LOX表达水平,HIF-1α表达无明显变化,而同时使用Emodin生成ROS联合β-APN逆转了结果,提示LOX分子为HIF-1α调节的下游分子。且LOX表达抑制,E-cadherin表达明显增加,划痕间距差减少,进而其细胞株体外运动及侵袭性显著下降,提示LOX参与E-cadherin介导的上皮间充质转化,进而影响肿瘤细胞侵袭转移能力。