细胞凋亡相关研究（精选10篇）
细胞凋亡相关研究 篇1
肿瘤是一种常见的疾病,其中恶性肿瘤是危害人类健康最严重的疾病之一。研究发现,细胞凋亡异常与肿瘤的发生存在密切的关系,而细胞凋亡通常是受凋亡相关信号、凋亡相关因子调控,并通过特定途径发生的。肿瘤细胞是不死的细胞,肿瘤的发生通常与细胞分化、细胞异常增殖、细胞凋亡的异常等相关。细胞凋亡(apoptosis),又称程序性死亡(programmedcell death,PCD)。目前认为参与的通路至少有:线粒体通路、死亡受体通路、内质网通路[1]和PI3K-Akt信号通路,本文通过查阅国内外相关文献,对上述细胞凋亡途径进行归纳综述。
1 细胞凋亡相关蛋白
Caspase家族蛋白:Caspase是半胱氨酸基天冬氨酸-特异性蛋白酶,即半胱氨酸天冬氨酸酶[2]。同时,Caspase是一种凋亡活化基因,目前发现的该家族至少有14种成员,其中大多数参与了细胞凋亡。在凋亡的级联反应中,将Caspase家族分成了Caspase-8,9,10等启动子和Caspase-3,6,7等执行子。在正常细胞内,Caspase以无活性的酶原存在,而在凋亡信号刺激下,启动子通过自我切割,成为有活性的Caspase,活化其他的Caspase家族成员,引起Caspase级联反应。被激活的Caspase家族中的执行子切割与细胞凋亡相关的蛋白,从而抑制细胞凋亡[3]。
Bcl-2家族蛋白:Bcl-2可以与PT孔蛋白分子相互作用,通过调节PT孔的开放抑制细胞凋亡;凋亡蛋白前体Apaf-1等凋亡蛋白前体,可以通过Bcl-2定位至线粒体膜上,使其不能发挥凋亡作用[4]。
2 线粒体信号通路
线粒体在整个细胞生命活动的作用至关重要。它既是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心,同时还是细胞调亡调控的核心结构[5]。并且线粒体是细胞内产生能量的重要结构,许多因素都可以通过损伤线粒体功能诱导细胞凋亡,如死亡受体介导的信号、生长因子抑制剂等[6]。当线粒体发生凋亡后,线粒体膜的通透性(permeability transition,PT)随之升高,使得各种相关的凋亡因子相继释放到胞质内,激活Caspase,发挥凋亡作用[7]。线粒体膜的通透性,主要是通过线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)进行调控。而MPTP则是由外膜孔蛋白电压依赖性阴离子通道(voltagedependentanionchannel,VDAC),内膜腺苷转位酶(adenine nucleotide translotcase,ANT)以及基质的亲环素D(cyclophilin D)这三种所组成的蛋白复合体[8]。其主要通过升高胞内的Ca2+浓度,改变ANT的构象来进行调控。也可通过Bcl-2家族调控,Bcl-2家族中的Bax可以与ANT和VDAC相互作用,调控MPTP,导致PT孔开放。PT孔持续的不间断的开放,使得Δψm及ΔPH发生崩解,呼吸链解偶联,线粒体内渗透压升高,内膜肿胀,同时伴随着释放线粒体膜间隙的细胞色素c(cytochrome c,Cytc)、细胞凋亡诱导因子(apoptosis induced factor,AIF)、Smac/DIABLO、细胞凋亡诱导因子(apoptosis induced factor,AIF)、核酸内切酶G(endonuclease G,Endo G)等,发生级联反应,引起肿瘤细胞凋亡[9]。细胞色素c(cytochrome c,Cytc)在线粒体凋亡途径中起着重要的作用,Cytc释放到细胞质中,与Apaf1结合,活化Caspase-9,激活下游Caspase-3和Caspase-7,启动Caspase级联反应,引起细胞凋亡[10]。凋亡刺激信号可通过BH3-only蛋白,引起Bax蛋白(Bcl-2-asslciated Protein X)移位至线粒体外膜,使其发生多聚化,形成膜通道,刺激线粒体释放Cytc[11]。Bax经活化后,从胞质转入线粒体,线粒体膜的通透性被破坏,导致Cytc释放介导线粒体途径诱导细胞凋亡。近年研究表明,促凋亡转录因子p53蛋白可以从通过转录非依赖方式激活线粒体途径,诱导凋亡[12]。在凋亡信号刺激下,活化的p53还可以通过与Bcl-2蛋白相互作用,改变线粒体外膜的通透性[13]。此外,p53还可能激活胞质中的Bax蛋白转位,改变线粒体膜通透性,从而导致线粒体功能损伤[14]。
3 死亡受体信号通路
死亡受体途径又被称为细胞凋亡的外源性途径。死亡受体与相应的配体结合后被激活,通过一系列的下游信号级联反应,分步激活Caspase-8、Caspase-3、和Caspase-7等[15,16],使肿瘤细胞最终发生凋亡。
3.1 Fas信号转导通路
该途径由死亡受体Fas发起,当细胞受到某些凋亡信号刺激后,Fas受体与其配体结合后,导致Fas胞内的死亡结构域(death domain,DD)三聚体的形成和活化,并结合Fas相关死亡结构域蛋白(fas-associated death domain protein,FADD),然后结合pro Caspase-8。由此形成了死亡信号诱导复合体(deathinducing signal complex,DISC)[17]。DISC通过激活pro Caspase-8使Caspase-8产生活性,进而活化下游Caspase级联反应,导致细胞凋亡[18]。同时活化的Caspase-8可以剪切Bid转位于线粒体外膜上,释放Cytc,释放到胞浆的Cytc通过活化Caspase-9产生Caspase级联反应,导致细胞凋亡[19]。
3.2 TNFR-I信号转导通路
TNF主要通过受体TNFR-I和TNFR-II介导细胞凋亡,是由巨噬细胞和T细胞感染活化而产生。通过受体TNFR-I和TNFR-II介导细胞凋亡。当配体TNF与TNFRs结合后,TNFR-I三聚体化招募衔接蛋白TRADD(TNFR-I-associated death domainprotein)。TRADD可以激活两条信号转导通路[20]:1通过招募FADD诱导细胞凋亡:TRADD在胞浆区招募FADD,活化pro Caspase-8,引发Caspase的级联反应,诱导细胞凋亡。2通过TRAF2和RIP活化:肿瘤坏死因子受体相关蛋白2(tumor necrosis factor receptor-associated factors 2,TRAF2)和诱导转录因子RIP能够使NF-κB诱导激酶(NF-κB-inducing kinase,NIK)活化。使得IκB激酶IKK被NIK活化,IKK随即磷酸化IκB,导致NF-κB的降解和释放,活化的NF-κB进入细胞核,诱导基因表达,发生细胞凋亡[21]。TRAF2和RIP[22]还可以直接或间接地活化有丝分裂原/外信号调节激酶激酶-1(mitogen-activated protein kinase kinase 1,MEKKl)或相关的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated proteinkinase kinase kinase,MAPKKK),MAPKKK双磷酸化c-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-tenminal Kinase,JNK)和P38三肽区的苏氨酸/酪氨酸,进而激活JNK信号转导通路,释放Cytc激活线粒体通路,诱导细胞凋亡[23]。
4 内质网信号通路
内质网是细胞内蛋白质合成、修饰和折叠的主要场所,也是细胞内Ca2+的主要储存库,而且内质网还包含了Caspase-12、Bcl-2等凋亡蛋白。内质网通路诱导细胞凋亡主要是通过对Ca2+的调控和激活内质网上的凋亡酶[24]两方面发生。实验研究表明,细胞凋亡早期阶段,细胞外Ca2+的内流及细胞内钙库中Ca2+的释放,导致细胞内Ca2+浓度迅速升高,活化胞质中的钙依赖性蛋白酶,通过线粒体途径诱导凋亡。据目前的研究认为,内质网通路的作用机制是:当折叠或折叠的蛋白质分子在内质网中积累时,出现未折叠蛋白反应,即内质网应激。一方面Caspase-12位于内质网(ER)上,内质网中Ca2+浓度的升高,Caspase-12表达诱导内质网应激反应,也引起Caspase-7转移到内质网的表面,Caspase-7激活Caspase-12,Caspase-12激活Caspase-9启动Caspase级联反应,引发细胞凋亡[25]。另一方面,当钙离子在内质网中受损或内质网上的蛋白质积聚时,通过激活细胞凋亡酶来诱导细胞凋亡。
5 PI3K-Akt信号通路
在诱导肿瘤细胞发生凋亡中,除上述三条通路外,PI3K/Akt信号通路也起到重要作用[26]。PI3K-Akt信号通路主要通过以下几个作用机制抗细胞凋亡[27]:
(1)直接调节作用。Bcl-2家族成员BAD可与其结合形成复合体,或与Bcl-xl形成复合体,从而表达促凋亡活性。但在Serl12和Ser136位点磷酸化后,BAD的这种促凋亡作用被抑制。Akt是一种BAD激酶,而wortmannin和LY294002是两种特异的PI3K抑制剂。当用这两种特异的PI3K抑制剂处理后,Akt能够使BAD的磷酸化受阻,而发挥BAD本来的促凋亡作用[28]。Par-4是一种促凋亡蛋白,其与Akt结合后失去活性,抑制了它的促凋亡作用。而PI3K抑制剂PTEN、LY294002或DN-Akt1可以抑制Akt的活性,使其不能磷酸化Par-4,从而发挥Par-4的促凋亡作用,引起凋亡[29]。
(2)影响细胞增殖。主要是通过影响细胞周期进而影响细胞增殖。其中一个重要的作用靶点就是Akt下游的哺乳类动物雷帕霉素(the mammalian target of rapamycin,m TOR),它被Akt磷酸化激活后,启动了两条下游通路,即核糖体激酶p70s6k(ribosomal S6-kinase,RSK)下游通路和4E-BP-1下游通路,影响细胞的增殖。而m TOR的活性可以被PI3K的两种特异抑制剂抑制,即wortmannin和LY294002,致使其活性丧失,导致下游信号通路被阻断,即p70s6k和4E-BP-1,这两条信号通路。从而使G1期受到阻滞,抑制细胞增长[30]。3抑制线粒体释放凋亡因子。线粒体能够释放细胞色素c和相关的凋亡诱导因子,而BAD激酶Akt能够阻止线粒体的这种释放,抑制细胞凋亡[31]。
6 结语
细胞凋亡是一种复杂的生理现象和病理现象,并且能够通过多种信号转导途径发生,而这些途径彼此之间相互联系着,相互制约着,形成庞大的脉络体系。随着细胞凋亡在肿瘤细胞的进一步研究,除了上述的四类信号转导途径,未来将会发现更多、更有效的其他信号转导途径,诱导肿瘤细胞凋亡,尽可能的减少肿瘤的发生。
摘要：肿瘤是威胁人类生命健康主要疾病之一,据WHO数据显示,世界每年新增1400万癌症患者,且癌症的死亡率也逐年递增。研究发现细胞凋亡异常与肿瘤的发生存在密切的关系,而细胞凋亡通常是受凋亡相关信号、凋亡相关因子调控并通过特定途径发生的。本文通过查阅国内外相关文献,通过归纳总结细胞凋亡的相关途径的最新研究进展,为抗肿瘤新药的作用靶点,抗肿瘤新药作用途径提供理论基础。
关键词：抗肿瘤,细胞凋亡,信号转导,线粒体,内质网,死亡受体
细胞凋亡相关研究 篇2
【关键词】 芹菜素；膀胱癌；细胞增殖；细胞凋亡
【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）12-0047-03
Abstract：Objective To study the effects of apigenin on the apoptosis of human bladder cancer cell line 5637. Methods 5637 cells were cultured with different concentrations of apigenin， the MTT assay was used to evaluate the cell inhibition rates. Apoptosis of 5637 cells was observed under a fluorescence microscope using Hoechst 33258 staining， 5637 tumorigenicity was messaured by soft colony formation assay. Results Apigenin causes concentration-dependent inhibition of the proliferation of bladder cancer 5637 cells. 5637 cells treated with apigenin showed significant morphological changes of apoptosis， and the cell tumorigenicity was inhibited as apigenin concentration increased. Conclusion Apigenin can inhibit the proliferation and induce apoptosis of 5637 cells.
Keywords：Apigenin； Bladder cancer； Proliferation； Apoptosis
膀胱癌是最常见的泌尿系统肿瘤，其中移行细胞癌（Transitional Cell Carcinoma，TCC）占90%，又称为尿路上皮癌，其中70%～85%的移行细胞癌为表浅性膀胱癌[1]。临床中非肌层浸润性膀胱癌的常用治疗方法为经尿道膀胱肿瘤切除术[2]。然而，经尿道膀胱肿瘤切除术后的患者有50%～80%的复发，10%～25%的患者复发后发展为肌层浸润性膀胱癌[3]。为了抑制膀胱肿瘤的复发及进一步恶化，化疗以及免疫治疗被广泛用于浅表性膀胱癌患者的术后治疗中。较常用的膀胱内化疗及免疫治疗的药物包括顺铂、丝裂霉素 C、卡介苗以及干扰素-α[4-5]。这些方法虽然在一定程度上取得疗效，但是通常给患者带来不可逆转的系统毒性以及严重的膀胱局部刺激，例如出血性膀胱炎等[6]。因此，寻求无毒副作用且有效的膀胱癌治疗药物十分迫切。
芹菜素（5，7，4′-三羟基黄酮，Apigenin， API），又称芹黄素，是一种广泛存在于多种水果和蔬菜中的黄酮类化合物，具有多方面的药理作用[7-8]，以抗肿瘤作用最为突出。实验证明芹菜素在体外能够显著抑制多种类型的癌细胞的生长和诱导其凋亡，包括：宫颈癌[9]、卵巢癌[10]、结肠癌[11]、胃癌[12]等，而在膀胱癌中的作用研究鲜有报道。本实验观察了芹菜素对人膀胱癌5637细胞的生长抑制以及诱导凋亡作用。
1 材料与细胞
1.1 试剂 芹菜素（质量分数≥98%，批号：22806）购自阿拉丁公司；MTT，低熔点琼脂糖、二甲基亚砜（DMSO），蛋白酶抑制剂购自Sigma；Hoechst 33258，购置南京碧云天。RPMI 1640培养基，胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）均购自GIBCO公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 细胞株及细胞培养 人膀胱癌细胞株5637购自中国科学院上海细胞库；培养于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、5% CO2、95% O2细胞培养箱内常规传代培养，取对数生长期细胞用于实验。
2 实验方法
2.1 MTT法检测芹菜素对膀胱癌细胞5637增殖的影响 将5637细胞以3×103/孔接种于96孔板中，细胞贴壁后分别加入不同浓度的芹菜素（20、40、80μmol/L），每孔100μl，每个浓度设4个复孔，同时以不加芹菜素为空白对照组培养72h 后，向每孔中加入5.0g/L的MTT 20μl继续培养4h，弃上清，向每孔中加入DMSO 200μl溶解结晶体，置于摇床振荡30min，至蓝紫色颗粒完全溶解后，于酶标仪490nm波长处测定每孔吸光度值（A），并计算细胞增殖率（%）=（药物处理孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。实验重复3次，计算平均值。
2.2 Hoechst 33258 细胞核染色法观察细胞凋亡的形态学改变 将5637细胞以2×105/孔接种于6孔板中，80μmol/L芹菜素（以不加芹菜素为空白对照组）作用24h后，吸去培养液，用PBS清洗2次，迅即加入4%的多聚甲醛液固定10min后，吸去固定液，以PBS清洗1次，加入5.0mg/L的Hoechst 33258，染色10min，用PBS 清洗3次后，在Zeiss Axio Observer A1荧光倒置显微镜下以340nm 激发光观察细胞凋亡形态并随机拍照。
2.3 软琼脂克隆形成实验检测芹菜素对5637克隆形成能力的影响 将1×103个5637细胞悬浮液1ml RPMI 1640 （0.3%低熔点琼脂糖，10%FBS， 1%双抗）并加入不同浓度的芹菜素（40、80μmol/L），接种于预处理的6孔板中，同时以不加芹菜素为空白对照组。6孔板预先放入1ml RPMI 1640 （0.6%低熔点琼脂糖， 10%FBS， 1%双抗）。培养3周以后，细胞克隆形成，采用0.01%结晶紫染色，观察计数。实验重复3次。
2.4 统计学分析 采用SPSS 11.0统计软件进行数据处理，实验数据均以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，以P< 0.05表示差异具有统计学意义。
3 结果与分析
3.1 芹菜素对5637细胞增殖的抑制作用 不同浓度芹菜素处理的细胞的增殖均受到不同程度的抑制，与空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。芹菜素对5637细胞增殖的抑制作用呈一定的浓度依赖性，采用不同浓度（20、40、60、80μmol/L）处理后，随着浓度的增加，其抑制效果更明显。见图1。
3.2 芹菜素对5637细胞克隆形成能力的抑制作用 不同浓度芹菜素处理的细胞克隆形成能力均受到严重的抑制，与空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。芹菜素对5637细胞的克隆形成能力的抑制作用呈一定的浓度依赖性，采用不同浓度（40、80μmol/L）芹菜素处理后，随着浓度的增加，其抑制效果更明显。见图2。（图2左图为芹菜素对5637细胞克隆形成抑制作用的观察；右图为芹菜素对5637细胞克隆形成抑制作用的统计学分析。）
3.3 芹菜素诱导5637细胞凋亡的形态学变化 采用Hoechst 33258染色的细胞核结果显示，80μmol/L芹菜素处理后，大量的5637细胞出现核固缩、染色质凝集和核碎片化等典型的细胞凋亡特征；与此相比，对照组的活细胞，细胞核膜完整，核呈圆形或椭圆形，染色质分布较均匀，细胞核为蓝色均匀淡染，并未见凋亡细胞（图3左图为芹菜素对5637细胞凋亡诱导的细胞核形态观察；右图为芹菜素对5637细胞凋亡诱导的统计学分析）。以上实验结果表明芹菜素可诱导5637细胞凋亡。
4 讨论
芹菜素作为一种广泛存在于植物中的天然黄酮类化合物，近年来已成为研究的热点[13]，但有关芹菜素抗膀胱癌作用的实验研究比较少。逃逸了正常细胞增殖的调控体系而自主地无限生长是肿瘤细胞的典型特征。通过MTT实验实验结果显示，20、40、60、80μmol/L芹菜素对人膀胱癌5637细胞的增殖能力具有显著的抑制的作用，且随着浓度的增加抑制效果更加明显，呈现出良好的和量效关系。芹菜素抑制膀胱癌细胞增值的主要机制，可能与其直接抑制5637细胞生长，并诱导5637细胞凋亡等有关。
在有机体中，细胞凋亡是一个复杂的生理和病理过程，肿瘤的增值与凋亡是调控肿瘤的发生、发展的最重要的因素之一。研究肿瘤的发生发展机制，寻找抑制肿瘤细胞增值，增加肿瘤细胞凋亡的分子药物，是抑制肿瘤生长，阻碍肿瘤发生、发展的一个重要途径。我们通过Hoechst 33258细胞核染色结果显示，80μmol/L芹菜素处理人膀胱癌5637细胞，大部分细胞细胞出现核固缩、染色质凝集和核碎片化等典型的细胞凋亡特征。肿瘤的自我更新能力是肿瘤细胞一个重要特征，我们采用软琼脂克隆形成实验检测芹菜素对膀胱癌5637细胞自我更新能力的影响[14]，结果显示，40、80μmol/L芹菜素对人膀胱癌5637细胞的克隆形成能力具有显著的抑制的作用，且随着浓度的增加抑制效果更加明显，呈现出良好的和量效关系。
总之，我们的研究发现芹菜素作为一种植物提取的活性成分，能够抑制人膀胱癌5637细胞的增殖以及克隆形成，并诱导其凋亡，芹菜素有望成为无毒副作用且有效的膀胱癌治疗药物。
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细胞凋亡相关研究 篇3
1 材料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 病例来源
33例SLE患者来自2003-12～2004-09广东省中医院皮肤科门诊或住院病人, 所有患者均符合SLE病、证诊断标准。男2例, 女31例, 男女之比1∶16.5, 平均年龄34岁。其中阴虚内热证16例, 脾肾阳虚证10例, 热毒炽盛证7例;健康对照组10例来自广东省中医院皮肤科进修者及实习学生, 男1人, 女9人, 男女之比1∶9, 平均年龄32岁。
1.1.2 诊断标准
符合1997年美国风湿病学会修订的SLE诊断标准, 符合1993年国家卫生部颁布的《中药新药临床研究指导原则》中有关SLE阴虚内热证、脾肾阳虚证、热毒炽盛证的诊断标准。
1.1.3 排除标准
不符合SLE病证诊断标准者, 合并有其他严重脏器疾病者。
1.2 主要仪器及试剂
DNA Kit:BD公司。1m1401 Lysing Solution C :Beckman Culter。CALTAG LABORATORIES FIX & PERM CODE:CA5003 50 Tests。EB Permeabilization Buffer:BD 公司。EB IC Fixation Buffer: BD 公司。Human BCL-2FITC 120T:Ancell 公司。Anti-humanCD95 (FAS/APO-1) 100T:美国 eBioscience。DFSOO Human FAS (cd95) Quantikine ELISA KIT:Catalog Number DFSOO, R&D。PI染液:Beckman Culter。EPICS ELITE型流式细胞仪:美国COULTER公司。
1.3 方法
1.3.1 样本处理
用EDTA-K2抗凝试管肘静脉采血2ml, 摇匀备用。
1.3.2 外周血淋巴细胞凋亡的检测
取外周血50μl, 加溶血破膜剂30μl, 振荡, 混匀;加200μl PI染液, 4℃孵育30分钟;调整细胞数, 上机检测。
1.3.3 外周血淋巴细胞表面Fas、Bcl-2的检测
外周血淋巴细胞表面Fas的检测:外周血50μl加10μlFas抗体, 孵育15分钟;加Optilyse C 500μl, 溶液完全透明;加1mlPBS混匀;1500r/min离心5分钟, 弃上清, 加350μlPBS;调整细胞数, 上机检测。外周血淋巴细胞表面Bcl-2的检测:外周血50μl, 加固定液100μl, 孵育15分钟;加1mlPBS混匀, 1500r/min离心5分钟;弃上清, 加入穿透剂100μl, 稀释好的抗体80μl, 避光, 冰浴45分钟;加5mlPBS混匀, 1500r/min离心5分钟;弃上清, 加入300μlPBS, 混匀;上机检测。
1.4 数据处理
采用SPSS11.5进行独立样本的t检验。
2结果
2.1 SLE中医辨证分型与外周血淋巴细胞凋亡率的相关性
见表1。
与健康组比较*P<0.05, **P<0.01;与阴虚内热证比较■P<0.05, ■■P<0.01;与脾肾阳虚证比较◎P<0.05, ◎◎P<0.01 (下同)
2.2 SLE中医辨证分型与凋亡调控蛋白Fas、Bcl-2的相关性
见表2。
3讨论
3.1 SLE中医辨证分型与外周血淋巴细胞凋亡的相关性
SLE的发病是由于机体淋巴细胞发育过程中细胞凋亡的异常, 导致自身耐受平衡被打破的结果。已有的研究表明[4]SLE患者淋巴细胞的凋亡率明显高于正常人, 且与疾病的活动度呈正相关。SLE中医辨证根据疾病急性期、缓解期、肾病综合证期多分为热毒炽盛、阴虚火旺、脾肾阳虚3型[5]。本研究表明, SLE热毒炽盛证和脾肾阳虚证细胞的凋亡率均高于正常人组及阴虚内热证, 热毒炽盛证和脾肾阳虚证之间亦有明显的统计学差异, 阴虚内热证患者的凋亡率略有升高, 但与正常人组无明显的统计学差异。因热毒炽盛证SLE患者处于急性活动期, 自身抗体阳性2种以上, 脾肾阳虚证SLE患者伴有严重的肾损害, 自身抗体也多2种以上阳性, 因而淋巴细胞凋亡率升高, 而阴虚内热证SLE患者多处于轻度活动期或稳定期, 淋巴细胞凋亡率改变不明显, 这与以往的研究类似。
3.2 SLE中医辨证分型与凋亡调控蛋白Fas、Bcl-2的相关性
Fas、Bcl-2 (基因) 蛋白在自身反应性淋巴细胞凋亡的信息传递中起着重要作用。Fas、Bcl-2的异常将导致自身反应性T、B淋巴细胞凋亡的异常, 引起自身免疫性疾病。SLE外周血淋巴细胞Fas的表达增加, Fas与其配体的结合诱导细胞发生凋亡。Badillo-Almaraz[6]对狼疮肾病患者的肾脏做了病理活检, 结果发现Fas/Fas L参与了SLE患者的肾损害, 且与疾病的活动度有关。而Bcl-2作为一种抗凋亡蛋白, 表达增加能防止或抑制多种因素或因子触发的细胞凋亡, 延长细胞的寿命。本研究显示:SLE患者热毒炽盛证和脾肾阳虚证外周血淋巴细胞Fas蛋白的表达均高于正常人组及阴虚内热证, 与此两型外周血淋巴细胞凋亡率的增高是一致的。而Bcl-2的表达在SLE患者3证的表达虽略有升高, 但与正常组比较无明显差异。
参考文献
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细胞凋亡相关研究 篇4
[关键词] 颅脑损伤；Pim-3；细胞凋亡
[中图分类号] R651.15 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2011）23-36-02
Study on the expression of Pim-3 after traumatic brain injury and the relationship between Pim-3 and apoptosis
WANG Xudong DAI Rufei HUANG Guangsu LI Ming HAN Dahe
Intensive Care Unit,the Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221006,China
[Abstract] Objective To investigate the expression of Pim-3 and the relationship between Pim-3 and apoptosis of cell after severe traumatic brain injury. Methods 48 SD rats were randomly divided into experimental group and control group. Animal models were established in experimental group,while the control group was dealed with sham-operation,the expressions of Pim-3 were detected at the time of 6,24,72 h and 7 d by immunostaining assay using Streptavidin-Peroxidase mothed,and apoptosis of cell was evaluated by TUNEL. Results After severe TBI,the expression of Pim-3 and apoptosis in experimental group were significantly higher than that of the control group,he peak showed up 24 h after TBI,and decreased after 7 d. Conclusion Pim-3 may play an important role on the apoptosis after TBI.
[Key words] Traumatic brain injury;Pim-3;Apoptosis
细胞凋亡在颅脑损伤致神经元损伤中占据重要地位，目前关于颅脑损伤后神经细胞凋亡的分子生物学机制仍未完全明确。Pim-3是新近发现的凋亡抑制因子，其在颅脑损伤后表达水平及其与细胞凋亡的关系尚未见报道。本实验建立重型颅脑损伤动物模型，免疫组化SP法检测Pim-3蛋白表达、TUNEL法检测细胞凋亡水平，以探讨Pim-3表达与颅脑损伤后神经细胞细胞凋亡的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物
成年雄性SD大鼠48只，体重200~250 g，由徐州医学院动物实验中心提供，采用随机数字表随机分为实验组与对照组，每组各24只。
1.2 主要试剂
羊抗大鼠Pim-3抗体（Santa Cruz公司），SP免疫组化试剂盒，DAB试剂盒（北京中山生物工程公司），TUNEL试剂盒（美国Promega公司）。
1.3 动物模型制作
采用Feeney法制作大鼠脑外伤模型。大鼠苯巴比妥麻醉后固定于立体定向仪上。头皮正中切口并暴露右顶骨。以冠状缝后2 mm、中线旁开3 mm为中心开5 mm×5 mm骨窗。保持硬膜完整，对骨窗下右顶叶脑组织施以40 g重物自25 cm高
处沿滑杆垂直落下撞击制作重型颅脑损伤模型。对照组只作开骨窗处理。
1.4 Pim-3蛋白表达检测
Pim-3蛋白表达检测采用免疫组化链霉素抗生素-过氧化物酶（SP）法，5 μm连续切片。操作中加入一抗前用微波處理以促使抗原暴露。Pim-3工作浓度为1︰100。每张切片随机选取3个高倍视野（×200倍），图象分析系统（NYD-1000）分别测得3个视野积分光密度（integrated optical density，IOD）值后取平均值。
1.5 TUNEL法测定细胞凋亡
在上述各时点两组处死大鼠，脑组织常规制片后石蜡包埋。按照试剂盒说明操作，细胞核呈棕黄色为凋亡细胞。每张切片随即选取计算3个高倍视野，计算细胞总数和凋亡细胞数目。凋亡指数（AI）＝凋亡细胞数/细胞总数×100%。
1.6 统计学处理
采用SPSS10.0 统计软件处理，实验数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）的LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组大鼠不同时间Pim-3表达水平
实验组大鼠颅脑损伤后6 h 即出现Pim-3的表达，72 h表达达到高峰，7 d后呈下降趋势，且各时点的表达水平均较对照组升高。见表1，图1~3。
2.2 两组大鼠不同时间细胞凋亡水平的比较
实验组大鼠颅脑损伤后6 h即出现细胞凋亡的显著上升，并在伤后72 h达到高峰，7 d后呈下降趋势，且各时点的表达水平均较对照组升高。见表2，图4~6。
3 讨论
颅脑外伤导致的神经细胞损伤机制可能包括细胞凋亡、生长相关蛋白生成减少等原因[1]。研究表明，颅脑损伤后神经细胞发生凋亡的机制如下：①Bcl-2/Bax家族的参与：Bcl-2是人体最主要的抗凋亡基因。Bax 属于Bcl-2 基因家族，编码的Bax 蛋白可与Bcl-2 形成异二聚体，对Bcl-2 产生阻抑作用。Bax/Bcl-2 之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素。研究表明，颅脑损伤后Bcl-2的表达下降而Bax的表达增加是导致细胞凋亡的重要原因，而减少Bax的表达可以起到神经保护的作用[2-4]；②细胞色素C的作用：Satchell 等[5]的研究表明颅脑损伤后细胞色素C大量释放可引起细胞凋亡的增加，并认为细胞色素C 可以作为颅脑损伤后细胞凋亡水平的生物学标志；③Caspase蛋白酶家族：研究表明颅脑损伤后Caspase蛋白酶家族如Caspase-3、Caspase-8的表达增加，并诱导神经细胞凋亡[6-7]。
Pim（proviral integration of MMLV，Pim）蛋白家族因在莫罗尼鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus， MMLV的前病毒整合过程中被发现而得名，后被证实它是一组与钙/钙调蛋白调节激酶（calcium/cal-modulinre-gulated ki-nase，CAMK）相关的蛋白激酶家族。研究证实Pim蛋白家族对可以调节细胞的增殖和和凋亡，并可通过对Pim蛋白的调节而达到治疗某些肿瘤的作用[8]。
Pim蛋白家族有3個亚型，其中Pim-3最初由Feldman等以大鼠细胞系PC12去极化诱导的基因而被首先报道。Liu D 等[9-10]研究证明，Pim-3可通过多种途径如P38信号途径、TNF的调节等而增强细胞抗凋亡作用。
本研究结果显示颅脑损伤后实验组大鼠颅脑损伤后6 h 即出现Pim-3的表达，72 h表达达到高峰，7 d后呈下降趋势，且各时点的表达水平均较对照组升高。实验组大鼠颅脑损伤后6 h即出现细胞凋亡的显著上升并在伤后72 h达到高峰，7 d后呈下降趋势，且各时点的表达水平均较对照组升高。Pim-3的表达与细胞凋亡的表达有一定的时相相关性，笔者分析其原因是随着细胞凋亡的增加，机体动用自我调节机制，上调Pim-3的表达，以增强抗细胞凋亡的功能，从而减少神经细胞凋亡，保护神经组织。
通过实验，笔者认为Pim-3在颅脑损伤细胞凋亡机制中发挥重要的作用，调节Pim-3的表达有可能达到治疗颅脑损伤的目的。
[参考文献]
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细胞凋亡相关研究 篇5
1 资料与方法
1.1 AD与炎症的关系
AD的病原学特征包括β-淀粉样蛋白-42和Tau蛋白的磷酸化 (p-Tau) 。由于这些病理变化成为刺激神经胶质细胞产生发病机制的分子机制未完全确认, 但中枢神经系统的炎症被认为是重要的因素[4]。实验表明, 外周炎症能加速AD的发作和进程, 但作用机制尚不明确。目前被提出的主要有两点
1.1.1 炎症可被AD病理学特征诱导[5,6,7]
AD的病理学特征产生促进炎症因子。如肿瘤坏死因子β (TNF-β) 、白细胞介素-1 (IL-1) 、白细胞介素-6 (IL-6) 以及炎症反应蛋白, 例如C反应蛋白 (CRP) , 及补体蛋白的免疫反应。
1.1.2 局部炎症因素导致AD产生[6]
AD的一个标志是出现活化的神经胶质细胞, 产生大量的炎症因子。低水平这些分子可能有保护作用。然而当高水平表达时, 如AD, 可能导致神经衰弱, 应验该假设:炎症因子上调的表达过程促成AD的发展。基于外周的促炎症因子外周促进炎症因子可能通过多种途径增加大脑炎症因子库。一旦进入大脑, 促炎症细胞分子将直接增加局部炎症细胞分子库或间接刺激神经胶质细胞合成额外的促炎症细胞分子。如果神经胶质细胞在AD中已经处于待发状态或者被激活, 被外周促炎症细胞分子刺激后将会放大反应, 过度表达促炎症细胞分子。
1.2 方法
1.2.1 阿尔兹海默病动物模型的建立
APP 695 swe转基因鼠来自北京维通利华实验动物技术有限公司。研究表明该种转基因鼠在3个月时认知功能正常, 9个月时出现认知障碍, 伴脑组织Aβ斑块形成。
1.2.2 ELISA法检测CRP、IL-1、IL-6、TNF-α
取月龄为9个月的转基因鼠, 实验组6只, 对照组6只正常大鼠。用4%水合氯醛麻醉后, 股动脉抽血以血液:抗凝剂=9:1的比例加入肝素钠生理盐水钠抗凝, 3500 r/min, 离心10 min, 取上清。断头处死转基因鼠, 迅速在生理盐水冰面上取脑, 用4℃的生理盐水将脑组织冲洗干净, 分离海马、皮质、纹状体、小脑等各部分组织, 将各个组织称重后放入9倍遇冷的lysisbuffer, 冰浴中手动匀浆器匀浆10次, 3000 r/min, 离心10 min, 取上清移至新管, 取2μL上清BCA比色法测蛋白浓度。上清液置于-70℃的冰箱中保存, 待测CRP、IL-1、IL-6、TNF-α含量。分别检测大脑皮质、纹状体、海马、小脑、血清各部分的CRP、IL-1、IL-6、TNF-α含量。绘制标准曲线,
1.3 统计学方法
利用SPSS 20.0线性相关分析求出回归方程, 将OD值带入回归方程即可得到CRP、IL-1、IL-6、TNF-α含量[8,9]。
2 结果
通过比较得出, 模型组9个月鼠大脑海马, 纹状体中的CRP、IL-1、IL-6、TNF-α含量显著高于对照组鼠 (P<0.05) , 差异有显著统计学意义, 见表1。
注:**P<0.05, *P<0.01
模型组9个月鼠大脑海马, 纹状体中的CRP含量与对照组相比有统计学差异, 但不显著。而IL-1、IL-6、TNF-α表达显著增加有统计学意义, 见表2。
注:**P<0.05, *P<0.01
模型组纹状体中各种炎症因子也是存在差异的。与对照组相比CRP、IL-6含量明显增加, 差异有显著统计学意义, 而IL-1、TNF-α的差异有统计学意义, 见表3。
注:**P<0.05, *P<0.01
小脑中各炎症因子比较中, 模型组只有CRP的含量与对照组相比有显著统计学意义, 其他差异均无统计学意义, 见表4。
注:**P<0.05, *P<0.01
3 讨论
实验研究表明, AD的发病因素可能与脑内的炎性反应有关[10,11]。已经有大量的研究文献证实一些细胞因子在AD的发病机制中的作用, 发生AD的脑组织中细胞因子表达上调, 尤其在AD的病灶区尤其明显。现已报道的炎症因子有IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-8、IL-10、IL-13和肿瘤坏死因子α (TNF-α) [5,6,7], 可能由激活的星形胶质细胞或者小胶质细胞分泌产生的。炎症反应的生物标志是C-反应蛋白 (C-reactive protein) 。很多临床研究也为炎症在AD发病中的作用提供了支持依据, 并且研究了CRP (急性期蛋白, 合成与促炎症细胞因子有关) 和其他标志性炎症因子与AD发病期之间的关系。CRP的水平提高增加AD的病情发展和认知下降的危险[12]。随着对AD免疫炎症机制的研究, 及流行病学和动物模型的建立及临床研究取得的成果, 流行病学研究证实非甾体抗炎药可以明显使AD的发病率降低[13]。
本研究发现, 模型组大鼠炎症因子的表达量升高。基于对AD神经免疫炎症发病机制的研究, 对由Aβ沉淀诱导的神经免疫炎症反应的各个通路进行干预措施, 可以防止Aβ沉淀的生成, 对已经沉积的Aβ沉淀进行清除和对炎症反应进行抑制是治疗AD的关键所在。
摘要：本研究针对神经胶质细胞在阿尔兹海默病 (AD) 发病过程中的重要作用, 结合基因工程, 光感基因神经调控技术、在体多电极记录及光纤纤维成像体系、病理组织学技术, 在阿尔兹海默症的不同阶段对转基因鼠脑内不同部位神经元及星型胶质细胞进行活性调节, 动态观察细胞离子通道, 神经细胞受体, 细胞因子, 神经递质, 神经元内纤维缠结, 脑内β淀粉样蛋白 (Aβ) 沉淀, 神经细胞数目的变化, 探讨炎症形成和Aβ沉淀与AD治疗的关系。
细胞凋亡相关研究 篇6
1 ER应激和未折叠蛋白反应
当大量未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网堆积时,细胞的正常生理功能便会受到严重地影响。不过,细胞内存在的一种被称为未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR)的机制可以有效调整内质网折叠蛋白数量和加强内质网折叠能力,减少未折叠或错误折叠蛋白的进一步生成,缓解内质网压力。具体来说,未折叠蛋白反应是一种通过减少内质网中新合成蛋白转运,增加分子伴侣与折叠酶,提高内质网折叠能力,借助内质网相关性蛋白质降解(ER-Associated Degradation,ERAD)从内质网中排出已发生不可逆损伤蛋白在内的一种综合性反应;是一种能在一定程度上减轻或消除内质网内蛋白质折叠功能负荷的细胞适应性保护机制。需要注意的是,当适应性反应仍不能缓解应激状况时,最终,受损细胞会由于发生内质网相关性细胞凋亡而被清除[2]。
活化转录因子6(Activating Transcriptionfactor 6,ATF-6)、肌醇需酶1(Inositol Requiringenzyme1,IRE-1)以及PKR样ER调节激酶[Pancreatic ER Kinase(PKR)2like ER Kinase,PERK]是哺乳动物中,感受ER应激并负责传递信号的三种跨膜蛋白。
1.1 活化转录因子
ATF-6是90kDa的内质网Ⅱ型跨膜蛋白[3],它由670个氨基酸组成,有ATF-6α和ATF-6β两种构型。其N端和C端分别位于细胞质和内质网腔中。其中N端包含一个碱性亮氨酸拉链(basic—leucine zipper)家族的转录因子结构域。在对于ER应激后抗凋亡基因的调节功能上,ATF-6α起到了主要的作用[4]。
1.2 BiP
免疫球蛋白重链结合蛋白(Immunoglobulin Heavy Chain Binding Protein,BiP)又称葡萄糖调节蛋白78(Glucose Regulated Protein 78kD,GRP78),在UPR过程中起到了重要的作用。它位于内质网上,属热休克蛋白70(Heat Shock Protein 70)家族的一员,是十分重要的分子伴侣。BiP分子及其DNA分子序列结构在许多物种中高度保守。BiP在内质网中参与阻止内质网新生肽聚集、抗内质网相关性细胞凋亡、调节内质网钙稳态以及启动未折叠蛋白反应等细胞生命过程。无ER应激时,ATF-6与BiP结合而处于无活性状态[5]。
1.3 ATF-6途径
与BiP解离后的ATF-6α和ATF-6β在ER应激情况下转运到高尔基体内,借由高尔基体膜蛋白S1P(Site1Protease)和S2P(Site2Protease)水解为活性片断N-ATF-6α与N-ATFβ,进而发挥自身活性。转运入细胞核后,作为转录因子的活性N-ATF-6α与N-ATF-6β与通用型转录因子NF-Y相互作用,以异二聚体或同二聚体的形式结合于ER,借助应激基因启动子ERSE元件来诱导应激基因进行转录与表达。这些包括增强内质网折叠能力的蛋白,如BiP和钙网膜蛋白等伴侣蛋白以及CHOP/GADD153[6]。2 CHOP
CHOP(Growth Arrest and DNA Damage-inducible Gene 153,GADD153),亦称生长停滞与DNA诱导损伤基因,是C/EBP家族的成员之一。这个29kD的因子在无应激细胞中呈现出很低的水平,但是在ER应激反应中会呈现大幅度增长。CHOP的促凋亡作用与下调Bcl-2的表达和增强ROS的产物有很大的关系[3]。Caspase-11已经被证实在CHOP下游起作用,通过激活死亡因子caspase-1和caspase-3介导细胞凋亡[7]。CHOP也可与BIM(Bcl-2 interacting mediator of cell death)的增强子区域结合,提高BIM的表达,同时下调Bcl-2的转录,使细胞谷胱甘肽耗竭引起细胞凋亡[8]。CHOP的激活是ER应激反应的直接结果。
3 引起的相关疾病
3.1 神经退行性疾病
神经元对蛋白质聚集很敏感。许多研究证明,神经退行性疾病和ER应激有关。BiP的辅助分子伴侣BAP的裂解,导致蛋白质聚集,引起神经元变性。阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD是最常见的神经退行性疾病,以β-淀粉样蛋白肽的脑神经炎性斑块为特征[9]。研究结果显示,β-淀粉样蛋白肽的积累是AD产生的主要原因之一。通过对常染色体显性家族病的研究已经确定了三种基因———淀粉样前体蛋白(APP)基因,PS1和PS2。有趣的是,表达PS1突变的细胞显示出减弱的ER应激反应且对ER应激敏感[10]。ATF-6,IRE1和PERK也分布在这些细胞中。另外,与ER应激引起的凋亡相关的蛋白质,如PKR和caspase-4,也参与了AD阿尔茨海默病的启动机制中[6]。
3.2 躁郁症
躁郁症是一类情绪异常疾病,患者会经历周期性、阵发性的躁狂症和忧郁症[11]。遗传连锁研究表明,这种疾病与遗传因子有关。对患者的细胞进行的微阵列分析显示,XBP1和BiP表达不足。近年来的报道表明,XBP1和BiP的增强子区域具有多态性,并且在患者的体内相似[12]。虽然这一说法还存在争议,但是一些能稳定情绪且在躁郁症治疗过程中起显著疗效的药物的确能够增加内质网分子伴侣,如BiP,GRP94和钙网蛋白的表达[13]。
3.3 缺血性疾病
大脑缺血可以引起神经细胞的ER应激,激活ATF-6,IRE1和PERK通路,导致CHOP介导的神经细胞的凋亡。缺血还可以引起心肌细胞的ER应激和内质网分子伴侣的表达,导致心肌细胞的退化,表明ER应激参与了缺血性心脏病的发展。实验发现,表达突变KDEL受体(一种在早起分泌途径中内质网分子伴侣的修复受体)的转基因老鼠,由于内质网管理机制的功能障碍,发展成为扩张性心肌病[14]。同时,内质网分子伴侣的上调可以保护心肌细胞免受ER应激引起的凋亡[15]。这些发现表明,ER应激对于心肌细胞的稳态的维持至关重要。
3.4 PTSD
创伤后压力心理障碍症(Post-traumatic Stress Disorder;PTSD),指人在遭遇或对抗重大压力(如地震[16]、海啸等)后,其心理状态产生失调之后遗症。这些经验包括生命遭到威胁、物理性伤害和身体或心灵上的胁迫等。神经解剖学表明,PTSD会导致脑形态上的变化。在关于越战退伍军人的研究中发现,比起没有PTSD的军人,PTSD者的海马体积相对缩小。海马结构是与学习记忆等高级功能具有密切关系的重要成分,在条件性惊恐反射的消退过程中也起重要作用。实验证明,单次与反复惊厥均可诱导发育期大鼠的海马神经细胞发生ER应激。反复惊厥后的海马神经纤维出现了ER过度应激及特异凋亡通路的激活,所以ER应激很可能参与了反复惊厥所致的海马神经元的丢失。ER应激激活的信号通路中重要一条是未折叠蛋白反应,哺乳动物未折叠蛋白反应的启动主要依赖于ATF-6酶解成为转录因子与ERSE结合,激活ERSE,产生生物学效应。所以,我们有理由预想,PTSD的产生与ATF-6调节细胞凋亡有密切联系[17]。
从以上可以得知,PTSD等疾病可引起ER应激,而ER应激中ATF-6参与引起细胞凋亡可以造成多种精神性疾病和其他方面的疾病,这与PTSD患者的表现症状有很大关系。在临床治疗过程中,可以针对细胞凋亡调控机制中出现的问题加以解决,达到从本质上治疗疾病的目的,从而造福于饱受PTSD精神疾病困扰的患者。
摘要：许多异常反应都会引起内质网应激,进而激活未折叠蛋白反应。当未折叠反应仍不能缓解内质网蛋白负荷时,就会通过多条途径引起细胞凋亡,并引起相关疾病,如糖尿病,躁郁症,神经退行性疾病和创伤后应激反应PTSD等。该文主要论述活化转录因子6在ER应激中调控细胞凋亡的机制以及引起的相关疾病。
细胞凋亡相关研究 篇7
本研究以二倍体虹鳟为对照,利用光镜、电镜切片和TUNEL染色观察三倍体虹鳟卵巢中卵原细胞的发育情况,利用荧光定量PCR分析180 dpf(6月龄)至300 dpf(10月龄)时期二、三倍体虹鳟卵巢中的GDF9、BMP4和BMP7基因表达情况,探讨三倍体虹鳟卵巢中卵母细胞发育停滞后的最终去向,并分析其原因。
1 材料
试验中所有程序都严格遵守东北农业大学的动物保护和使用委员会的规定,并严格遵守动物福利。本次试验所用二、三倍体全雌虹鳟发眼卵(全雌三倍体虹鳟由全雌四倍体虹鳟与全雌二倍体虹鳟杂交而成)购于美国,置于水族箱中,孵化过程水温恒定为8℃,待鱼苗体重达50 g后饲养于养殖基地,养殖水温恒定为12℃。180 dpf(6月龄)起每30 d采集一次二、三倍体虹鳟的卵巢组织,共采集5次,采集的卵巢样本分三组:两组用p H值为7.2的磷酸缓冲液(PBS)清洗后,分别放入4%多聚甲醛和2.5%戊二醛中固定用于组织学观察;另外一组迅速放入液氮中暂存,然后转入超低温冰箱进行保存。
2 方法
2.1 组织学观察
2.1.1 光镜切片
将固定的卵巢组织从4%多聚甲醛中取出,从70%的乙醇开始进行梯度乙醇脱水,二甲苯透明,常规石蜡包埋与切片,切片厚度为5μm,H.E.染色,中性树胶封片,用Carl Zeiss显微镜观察,Motic Images plus 2.0系统拍照。
2.1.2 透射电镜切片
将固定的卵巢组织从2.5%戊二醛中取出,用锇酸再固定,Epon812包埋,在恒温培养箱中聚合,用Ultracut E型超薄切片机切片,经恒温培养后用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色,用JEM-1200EX型电子显微镜观察拍照。
2.1.3 细胞凋亡的TUNEL法检测
将固定的卵巢组织从4%多聚甲醛中取出,进行脱水、透明、浸蜡、包埋,制作石蜡切片。脱蜡后采用末端脱氧核苷酸转移酶(Td T)介导的原位末端标记法(TUNEL)测定凋亡率,按照细胞凋亡检测试剂盒(罗氏公司)说明书进行,将10月龄三倍体虹鳟设为阴性对照组,采用PBS代替一抗,最后经脱水、透明、封片,在光镜下观察、拍照,细胞核呈棕黄色为凋亡细胞。
2.2 总RNA的提取及c DNA的合成
使用TRIzol试剂(购自Invitrogen公司)按照说明书进行总RNA的提取。琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,紫外分光光度计检测RNA浓度与质量。使用Prime ScriptTM第一链c DNA合成试剂盒(购自Ta KaRa公司)进行c DNA的合成,并保存于-20℃。
2.3 Real-Time实时荧光定量PCR
根据已经公布的虹鳟GDF9、BMP4和BMP7基因序列,应用Primer Premier 5.0软件设计实时荧光定量PCR引物(由华大基因公司合成),序列见表1。以β-actin为内参基因,分析各受体基因的相对表达水平。Real-Time实时荧光定量PCR反应体系(20μL):SYBR premix Ex Taq(购自Ta KaRa公司)10μL,5倍稀释的c DNA模板2μL,上、下游引物各0.4μL,dd H2O 7.2μL。PCR反应条件:95℃30 s;94℃5 s,60℃30 s,共40个循环。PCR反应结束后,对扩增产物进行熔解曲线分析,检测反应的特异性。采用2-△△Ct法分析各基因的相对表达量。
2.4 数据的处理与分析
试验数据采用SPSS 17.0进行统计处理,利用One-way方差分析进行差异显著性检验,分析后的结果均表示为“平均数±标准差”,P<0.05为差异显著。
3 结果
3.1 组织学观察结果
3.1.1 光镜切片观察结果
观察180~300 dpf时期二、三倍体虹鳟的性腺组织切片观察结果见287页彩图1。二倍体全雌虹鳟的卵巢发育正常,卵巢中以初级卵母细胞为主,卵母细胞体积增大,大多数为圆形,结构完整,核仁多个并移至核膜内侧(见287页彩图1A中箭头所示),而后外排,随着发育出现皮质泡(见287页彩图1B、1C箭头所示),卵母细胞由Ⅱ时相发育至Ⅲ时相。三倍体卵巢发育明显迟于二倍体,180 dpf时期卵巢中主要以卵原细胞为主,并且发生卵原细胞囊泡化现象,表现为数个卵原细胞外被一层膜结构包裹,形成卵原细胞簇(见287页彩图1D中箭头所示)。随着日龄增加卵原细胞簇数目减少,卵原细胞未发育成初级卵母细胞,并发生染色质固缩现象,疑似发生细胞凋亡(见287页彩图1E、1F中箭头所示)。
3.1.2 透射电镜切片观察结果
透射电镜下观察可见:与发育正常的二倍体相比,三倍体虹鳟性腺中的卵原细胞出现细胞膜空泡化、细胞质浓缩、染色质固缩(见图2A中箭头所示),以及卵原细胞膜内陷、染色质边聚(见图2B中箭头所示)等典型的细胞凋亡现象,并能观察到凋亡小体(见图2C中箭头所示)。
3.1.3 TUNEL染色观察结果
采用TUNEL法检测二、三倍体全雌虹鳟性腺细胞凋亡,结果见287页彩图3。二倍体卵巢阴性对照未出现阳性结果(见287页彩图3A)。180~300 dpf时期二倍体卵巢中的初级卵母细胞未见凋亡,卵母细胞呈蓝色(阴性),随着卵母细胞发育,个体逐渐增大,部分滤泡细胞和间质细胞发生凋亡,其细胞核呈黄褐色(阳性),为卵巢发育过程中自然凋亡(见287页彩图3B、3C、3D);180~300 dpf时期三倍体卵巢中的卵原细胞发生凋亡则为普遍现象,180 dpf卵原细胞簇内的卵原细胞簇内还存在部分未凋亡的卵原细胞,随着发育凋亡的加剧,卵原细胞簇数目减少,大部分卵原细胞均呈阳性,部分滤泡细胞和间质细胞也发生凋亡(见287页彩图3E、3F、3G)。
3.2 二、三倍体虹鳟GDF9、BMP4、BMP7基因在卵巢中的表达结果
提取的二、三倍体虹鳟5月龄的性腺组织RNA经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测,RNA完整性良好,反转录得到的c DNA经内参基因β-actin检测发现可以用于实时荧光定量PCR试验。
试验结果表明,随着卵巢发育,三倍体虹鳟卵巢中的GDF9、BMP4和BMP7基因表达水平均显著低于同时期二倍体(P<0.05),并大体呈不规则的下降趋势。但240 dpf时BMP4在三倍体虹鳟卵巢中的表达显著高于二倍体(P<0.05)。见图4。
4 讨论
注:*表示二、三倍体虹鳟比较差异显著(P<0.05)。
4.1 二、三倍体虹鳟性腺组织学观察结果
细胞凋亡是1972年由Kerr教授根据形态学特征首先提出的,是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式,也是一种主动的、程序性的、细胞固有的生物学过程,是为更好地适应生存环境而主动争取的死亡过程,普遍存在于动植物中,又称细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)。细胞凋亡是最基本的生物现象,是机体生存和发育的基础,具有清除多余细胞、无用细胞、发育不正常的细胞和完成正常使命的衰老细胞等生物学意义[11]。光镜切片、透射电镜切片和TUNEL染色结果表明,在180 dpf至300 dpf时期,二倍体虹鳟卵巢中的卵母细胞并未发生凋亡,只有部分间质细胞因性腺发育而发生正常的凋亡现象[12]。而发育异常的三倍体虹鳟卵原细胞最终去向是发生了凋亡。在180 dpf时,三倍体虹鳟卵巢中的卵原细胞簇数目较多,其中仍有部分未发生凋亡,随着性腺发育,卵原细胞簇数目减少,绝大部分卵原细胞发生凋亡,几乎观察不到发育正常的卵母细胞。之前对于三倍体在生长过程中较二倍体显示出明显的生长优势,一直被认为是奇数染色体组会导致减数分裂的失败和性腺发育的失败,在二倍体鱼类中用来促进性腺发育的能量在三倍体鱼类中被用来生长[13]。结合以上观点,笔者认为三倍体虹鳟卵巢中卵原细胞凋亡为其后性腺的重组或重新分化奠定了物质基础,发育不正常的卵原细胞通过细胞凋亡的途径,使机体获得更强的生存能力和更优良的生长特性。
4.2 二、三倍体虹鳟GDF9、BMP4、BMP7基因在卵巢中的表达
对鱼类的研究表明,GDF9在异育银鲫卵细胞的发育过程中具有重要作用,尤其是参与调控卵母细胞的早期发育[9]。在60 dpf和100 dpf时均检测出GDF9和BMP7在虹鳟卵巢中的表达,GDF9、BMP4、BMP7在不同发育阶段的虹鳟卵母细胞中均有表达,在Ⅰ时期卵母细胞中表达量最高,随着发育在卵母细胞中的表达量逐渐降低[14]。本研究也发现,180 dpf至300 dpf期间,二倍体虹鳟卵巢中GDF9和BMP7基因随着月龄的增加呈上升趋势,在10月龄达到最高,可见GDF9、BMP4和BMP7在鱼类卵巢发育过程中的作用。
三倍体虹鳟卵巢中GDF9、BMP4和BMP7基因的表达量显著低于卵巢发育正常的二倍体虹鳟,整体呈不规则下降趋势。羊GDF9和BMP15基因表达异常会导致母羊产仔数目减少。人类多种卵巢疾病,如卵巢早衰(POF)、卵巢功能缺陷(POI)、多囊卵巢综合征(PCOS)都与GDF9和BMP15(GDF-9B)的突变和表达异常有关[15]。GDF9基因敲除的小鼠缺乏生育能力,卵泡发育停留在初级卵泡阶段,即使有GDF9的同系物BMP15的表达也不能弥补GDF9的缺失[16]。因此,笔者认为随着卵巢发育,三倍体虹鳟GDF9、BMP4和BMP7的表达量过低,可能不足以维持卵原细胞的正常发育,最终导致卵原细胞发生凋亡。
240 dpf时三倍体虹鳟卵巢中的BMP4表达量突然升高,并高于同时期二倍体虹鳟的表达量,随后表达水平恢复至显著低于二倍体,结合TUNEL染色结果可知,240 dpf三倍体虹鳟卵巢中卵母细胞凋亡程度加剧。有研究表明,BMP4已经被证实不仅能够促进大鼠原始卵泡的发育,还能作为存活因子抑制细胞凋亡[17]。因此可以推测BMP4在虹鳟中的功能可能与在鼠中的相似,不仅可以调节卵母细胞的发育,还能抑制卵原细胞的凋亡。
5 结论
1)三倍体虹鳟中发育不正常的卵原细胞最终去向为发生细胞凋亡。2)三倍体虹鳟中性腺发育相关因子GDF9、BMP4和BMP7的低表达可能诱导卵原细胞发生凋亡,且BMP4可能同时具备抑制卵原细胞凋亡的功能。
摘要：为了研究三倍体雌性虹鳟在生长过程中出现的性腺发育停滞、卵原细胞发育异常的原因,试验采集180300 dpf时期二倍体和三倍体虹鳟的性腺组织,利用光镜、电镜切片和TUNEL染色进行组织与细胞学对比研究,利用实时荧光定量PCR分析对卵巢发育和配子发生过程发育具有调节作用的生长分化因子9(GDF9)、骨形态发生蛋白4(BMP4)和骨形态发生蛋白7(BMP7)在二、三倍体相同时期的表达差异。结果表明:180300 dpf虹鳟三倍体卵巢中的卵原细胞发生凋亡,除240 dpf三倍体虹鳟BMP4表达量显著高于二倍体外,三倍体虹鳟中GDF9、BMP4和BMP7表达量显著低于同时期二倍体。说明三倍体虹鳟卵原细胞发育异常,最终发生凋亡,可能与GDF9、BMP4和BMP7的低表达有关,BMP4在调节卵母细胞发育的同时可能有抑制细胞凋亡的作用。
细胞凋亡相关研究 篇8
1材料与方法
1.1主要试剂
p-AMPK抗体和p-m TOR抗体购自Cell Sig- naling Technology公司,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G和羊抗鼠Ig G购自Snata Cruz公司,Cyto- Buster蛋白提取试剂购自Novagen公司,蛋白酶和磷酸酶抑制剂购自Thermo公司。
1.2婴幼儿血管瘤内皮细胞获取及鉴定
婴幼儿血管瘤内皮细胞获取及鉴定方法参见文献报道[1]。
1.3细胞处理
采用0、5、10、20和40μg/ml的肿瘤抑素及40μg/ml的肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞0、12、24和48 h。
1.4 MTT方法检测细胞增殖能力
上述肿瘤抑素处理的细胞培养至对数生长期, 接种于96孔培养板中,采用不同浓度和不同时间的肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞后,每孔中加入20μl的MTT溶液,作用4 h后吸出上清,加入150μl的二甲基亚砜(DMSO) 溶液,低速震荡10 min后,波长490 nm处测定OD值。
1.5凋亡检测
收集上述肿瘤抑素处理细胞离心,1 000×g离心5 min,以含1% BSA的磷酸缓冲液(PBS)洗涤1次。用100μl Binding缓冲液将细胞重悬,加入2μl Annexin V染料和0.1μl PI染料,避光15 min,以含1% BSA的PBS洗涤2次。
1.6细胞总蛋白提取
上述细胞采用冰PBS洗涤2次,400×g离心,5min;弃去细胞上清,于沉淀中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂和Cyto Buster蛋白提取试剂,吹打混匀,室温放置15 min;4℃,12 000×g离心15 min;所得上清部分即细胞总蛋白,留部分细胞总蛋白检测蛋白浓度,其余每管15μl分装,-80℃冻存。
1.7 BCA法测定蛋白浓度
严格按BCA试剂盒说明书进行标准品BSA的稀释;按体积比为50∶1混合试剂盒中的试剂A和试剂B,即为工作液;96孔板中每孔加入200μL的工作液,随后加入25μl倍比稀释的标准品或待测样品,每种样品设置3个复孔。37℃孵育30 min后波长562 nm处测定OD值;根据标准品的光密度值和浓度梯度绘制出标准曲线,根据标准曲线及待测样品的OD值推算出样品浓度。
1.8 Western blot
等量的提取上述蛋白经8%~10% SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶分离后,半干转印至硝酸纤维素膜上,采用含5% BSA的TBST室温孵育封闭2 h, 加入鼠抗人p-AMPK抗体或p-m TOR抗体,4℃过夜孵育。次日以0.1%TBST洗膜3次,每次5 min,加入相应种属的HRP标记二抗,室温孵育1 h。0.1% TBST洗膜后, 采用Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化学发光底物对条带进行显色。Actin作为内参对照。所有实验至少重复3次。使用Image J软件进行定量分析。
1.9统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。两组数据间比较采用t检验,P <0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖的影响
如图1所示,随着肿瘤抑素浓度的升高和处理时间的延长,婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖能力逐渐降低(P <0.01)。
2.2肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞凋亡的影响
如图2所示,随着肿瘤抑素浓度的升高和处理时间的延长,婴幼儿血管瘤内皮细胞凋亡水平逐渐升高(P <0.01)。
†与0μg/ml组比较差异有统计学意义;A:不同浓度肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞后,采用MTT方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖能力;B:40μg/ml肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞不同时间,采用MTT方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖能力
†与0μg/ml组比较差异有统计学意义;A:不同浓度肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞后,采用FCM方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞凋亡水平;B:40μg/ml肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞不同时间,采用FCM方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞凋亡水平
A：不同浓度肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞后，采用 Western blot 方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞中 AMPK 蛋白磷酸化水平；B：40μg/ml 肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞不同时间，采用 Western blot 方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞中 AMPK 蛋白磷酸化水平
2.3肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞中AMPK蛋白磷酸化水平的影响
如图3所示,随着肿瘤抑素浓度的升高和处理时间的延长,婴幼儿血管瘤内皮细胞中AMPK蛋白磷酸化水平逐渐升高。
2.4肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞中m TOR蛋白磷酸化水平的影响
如图4所示,随着肿瘤抑素浓度的升高和处理时间的延长,婴幼儿血管瘤内皮细胞中m TOR蛋白磷酸化水平逐渐降低。
A:不同浓度肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞后,采用Western blot方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞中m TOR蛋白磷酸化水平;B:40μg/ml肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞不同时间,采用Western blot方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞中m TOR蛋白磷酸化水平
3讨论
细胞凋亡相关研究 篇9
[关键词] 姜黄素；黑色素瘤；B16—F10细胞株；线粒体凋亡
黑色素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的常见的皮肤肿瘤，其特点是恶性程度高、进展快、死亡率高［3］。临床恶性黑色素瘤的治疗常采用手术结合联合化疗方案［4］。本研究以黑色素瘤细胞株B16—F10为实验材料，观察姜黄素体外抑瘤作用。同时，以活性氧激活线粒体凋亡途径为切入点，探讨姜黄素抗黑色素瘤的可能分子机制［5］，进而推断姜黄素的分子药理学作用。
1 材料与方法
材料：姜黄素（纯度≥98%）；RPMI1640、胎牛血清、HEPES、EGTA、BSA、DMSO等；MTT；DCFH—DA活性氧探针；线粒体提取试剂盒；Caspase—9（p—35，sc—8355）兔抗小鼠多克隆抗体；Caspase—4（ab—25898）兔抗小鼠多克隆抗体；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒；常规生化试剂；B16—F10小鼠皮肤黑色素瘤细胞株。
方法：①细胞培养：B16—F10细胞常规培养，每3天传代一次，实验时取对数生长期细胞，用0.25%Trypsin—EDTA液消化后，用培养基制成细胞悬液。②细胞生长活力测定：细胞于96孔板培养24、36、72小时；向待检测的细胞培养板中加入MTT溶液（每孔20μl），于CO2培养箱中孵育4小时；吸出培养板中的液体，加入100μl DMSO溶液，置于振荡器混匀10分钟，酶标仪在450nm波长下测OD值；采集数据，依照下列公式计算细胞生长抑制率：（1—实验组OD值/对照组OD值）×100%。③DCFH—DA活性氧检测：实验方法依照试剂盒说明进行，采用激光共聚焦显微镜观察，530nm发射波长附近激发为绿色。④细胞涂片TUNEL染色、荧光显微镜观察：细胞接种于6孔板（3ml/孔），细胞接种密度4×105 cells/ml，被试药物干预24、48小时后收集细胞、预冷的0.1M PBS洗3次，用细胞离心涂片机将细胞甩到多聚赖氨酸包被的载玻片上；4%多聚甲醛固定30分钟、风干；1% Triton X—100 PBS透膜；加入TdT酶、荧光标记液及TUNEL检测液、孵育60分钟；抗荧光淬灭液封片、荧光显微镜观察、摄片。⑤细胞涂片Caspase—4，9抗体免疫组织化学显色、光镜观察：细胞接种于6孔板（3ml/孔），细胞接种密度4×105 cells/ml，被试药物干预24、48小时后收集细胞、预冷的0.1M PBS洗3次，用细胞离心涂片机将细胞甩到多聚赖氨酸包被的载玻片上；4%多聚甲醛固定、风干；1%Triton X—100 PBS透膜；正常动物血清封闭抗原；加一定稀释度的Caspase—4，9一抗（50μl/片），4℃湿盒孵育、过夜；加入通用型2抗PV—6001；AEC显色（红色）、光镜观察、摄片。
统计学处理：定量数据采用SPSS11.0软件包进行统计学分析，结果以X±S表示，组间比较采用单因素方差分析，t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
姜黄素对B16—F10细胞生长抑制率的影响：用12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml四个浓度姜黄素孵育B16—F10细胞24、48和72小时，倒置显微镜下可观察到随着药物作用时间的增加B16—F10细胞形态学的变化：细胞变圆、体积缩小、悬浮细胞（脱落）显著增多。MTT法检测，数据换算、统计分析结果表明姜黄素对B16—F10细胞的生长抑制存在时间和剂量的依赖性。
姜黄素对B16—F10细胞氧化损伤：依照前期实验的结果，本实验选择50μg/ml的给药剂量作用体外培养的B16—F10细胞。分别在孵育24、48小时采集细胞，采用DCFH—DA活性氧检测试剂盒，在激光共聚焦显微镜下观察姜黄素对B16—F10细胞活性氧水平的影响。结果表明姜黄素孵育48小时，能显著增高B16—F10细胞内活性氧水平，引起细胞形态改变。与对照组比较，姜黄素孵育48小时，B16—F10细胞内活性氧自由基水平显著增高（P＜0.01）。
姜黄素对B16—F10细胞凋亡的影响：一步法TUNEL染色，荧光显微镜观察，绿色荧光示凋亡细胞。实验结果表明姜黄素作用24小时可诱导少量B16—F10细胞凋亡，作用48小时可诱导大量B16—F10细胞凋亡，图像分析结果显示与空白对照组比较，姜黄素作用48小时B16—F10凋亡细胞显著增多（P＜0.01）。
姜黄素对B16—F10细胞线粒体凋亡相关蛋白Caspase—4，9的影响：已知Caspase—9是诱发线粒体凋亡过程的关键蛋白，位于细胞的胞浆内；而Caspase—4同样是诱发细胞凋亡的起始因子，位于内质网膜上，二者共同介导氧化应激作用诱导的线粒体凋亡过程。依照前期实验的数据，本实验选择50μg/ml的给药剂量作用体外培养的B16—F10细胞。分别在孵育24、48小时采集细胞，用离心法制备细胞涂片，行常规免疫组织化学染色，测定姜黄素对B16—F10细胞Caspase—4，9表达的影响，结果表明姜黄素干预B16—F10细胞，可显著上调细胞内Caspase—4，9水平。
3 讨论
姜黄素通过诱导细胞凋亡发挥体外抗肿瘤作用：本实验观察到，姜黄素能够显著抑制黑色素瘤B16—F10细胞生长，且呈剂量和时间依赖性。该结果与桂飞等［6］的研究结果一致。细胞凋亡实验结果表明，姜黄素具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物活性，作用B16—F10细胞48小时可探测到大量的凋亡细胞；与线粒体凋亡相关因子caspase—4，9检测结果表明，姜黄素作用B16—F10细胞48小时能显著升高细胞内caspase—4，9的水平。该实验结果初步提示姜黄素不仅直接杀伤肿瘤细胞，而且能通过诱导细胞凋亡表现为显著的抑瘤活性。
细胞凋亡相关研究 篇10
Ⅱ型糖尿病胰岛病变的特点之一是β细胞数量不足, 凋亡增加[4], 最终导致胰岛素分泌不足, 血糖代谢失常。Su等[5]研究发现, 在肥胖大鼠模型中, 牙周炎可以促进胰岛素抵抗的发展, 并且胰岛结构紊乱与胰岛素抵抗指数正相关。对Ⅱ型糖尿病患者的临床观察也发现, 胰岛素抵抗与慢性低度炎症相关[6], 这提示牙周炎可能通过促进胰岛细胞的破坏而影响其功能。因此, 本实验拟通过研究患牙周炎Ⅱ型糖尿病大鼠胰岛细胞凋亡相关蛋白的表达, 初步探讨牙周炎对糖尿病大鼠胰腺病变的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂和仪器
Bax、Bcl-2、Caspase-3兔抗鼠多克隆抗体 (均购自美国SANTA CTUZ) , GTVision TMIII型免疫组化检测试剂盒 (基因科技上海有限公司) , 苏木精、伊红 (广州秀威贸易有限公司) , 小动物Micro-CT系统ZKKS-MCT-SHARP (广州中科恺盛医疗科技有限公司) , 3D-Med图像分析软件 (广州中科恺胜医疗科技有限公) , 光学显微镜BX41TF (日本Olympus公司) , 自动显微镜控制系统Micro PublisherTM5.0 RTV (加拿大Q Imagin公司) , 自动显微镜拍摄软件Image Pro Plus 6.0 (美国Media Cybernetics公司) 。
1.1.2实验动物来源
自发Ⅱ型糖尿病OLETF大鼠30只, 4周龄, 雄性;同种系同周龄糖耐量正常LETO大鼠20只, 日本大冢制药株式会社德岛研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 实验分组和设计
OLETF大鼠和LETO大鼠每4周行1次糖耐量检测, 36周龄时, 将到达糖耐量受损期的26只OLETF大鼠随机分为2组, 一组行牙周炎造模 (复合组, n=13) , 另一组为对照 (糖尿病组, n=13) ;LETO大鼠亦按是否行牙周炎造模随机分牙周炎组 (n=10) 和正常组 (n=10) 。
1.2.2 牙周炎模型建立
采取丝线结扎联合涂菌建立牙周炎模型。将4.0丝线分别结扎于上颌双侧第一、第二磨牙牙颈部并将丝线完全压入龈沟内, 将密度为109CFU/ml的4种标准菌 (牙龈卟啉单胞菌、伴放线嗜血杆菌、中间普氏菌、具核梭杆菌) 混合悬液接种于龈沟内。
1.2.3 组织取材及处理
牙周炎建模20周后处死大鼠, 剔除意外死亡及合并其它脏器感染的大鼠, 每组取8只 (n=8) 。取全部大鼠上颌第一、二磨牙的颌骨组织块, 放入4%多聚甲醛溶液中固定48 h后进行组织修整。胰腺组织取材后立即放入4%多聚甲醛溶液中, 固定24 h后脱水包埋, 制成3μm切片。
1.2.4 牙周炎模型评价
每组随机选3个上颌骨标本进行Micro-CT扫描和三维重建, 计算结扎牙齿周围牙槽骨吸收体积。4组大鼠上颌骨标本EDTA脱钙后脱水包埋, 切片, HE染色, 观察牙周组织炎症。
1.2.5 胰腺组织病理学改变及凋亡相关蛋白表达
大鼠胰腺组织切片行HE染色, 观察组织病理学改变;Bax、Bcl-2和Caspase-3免疫组化染色, 半定量分析, 用Image Pro Plus 6.0软件分析胰岛的平均光密度值。
1.2.6统计分析
应用SPSS 13.0进行统计分析, 4组之间的整体比较采用析因设计资料的方差分析, 同一处理因素两个不同水平之间以及同一水平不同处理因素之间的比较采用独立样本的t检验, P<0.05认为有统计学意义。
2 结果
2.1 牙周炎模型评价
2.1.1 牙槽骨吸收情况
4组大鼠牙槽骨Micro-CT三维重建, 发现行牙周炎造模后大鼠牙槽骨吸收明显, 复合组牙槽骨吸收体积16.357±1.062, 糖尿病组牙槽骨吸收体积10.828±1.643 (t=4.296, P=0.013) , 牙周炎组牙槽骨吸收体积14.340±1.064, 正常组牙槽骨吸收体积9.663±0.845 (t=5.963, P=0.004) 。
2.1.2 牙周组织炎症情况
4组大鼠牙周组织切片分别行HE染色, 结果如图1所示, 正常组及糖尿病组大鼠牙龈上皮极少量炎细胞浸润, 结缔组织胶原排列有序, 牙周炎组和复合组大鼠牙龈上皮及结缔组织炎细胞浸润, 上皮钉突变长甚至呈条索状, 胶原纤维排列紊乱、破坏, 证明大鼠慢性牙周炎模型建模成功。
2.2 胰腺组织病理学改变
如图2所示, 正常组牙周炎组大鼠和牙周炎组大鼠胰岛结构正常, 胰岛与外分泌腺边界清楚。糖尿病组大鼠胰岛出现病变, 胰岛细胞排列紊乱, 与外分泌腺边界不清 (图2C箭头) 。复合组大鼠胰岛病变进一步加重, 胰岛被增生纤维分割 (图2D箭头) , 外分泌腺中出现脂肪异位沉积 (图2E箭头) 。
2.3 胰岛细胞凋亡相关蛋白的表达
糖尿病组和复合组大鼠胰岛中Bax和Caspase-3蛋白都表达明显增强 (图3~4) 。统计分析4组大鼠Bax和Caspase-3蛋白表达的平均吸光度值 (图6) , 4组间有差异 (F=76.826, P=0.000;F=152.456, P=0.000) , 复合组表达量对比糖尿病组显著增加 (t=-7.123, P=0.000;t=-8.743, P=0.000) , 而牙周炎组与正常组之间表达没有显著差异 (t=-1.022, P=0.324;t=-0.190, P=0.852) 。糖尿病组和复合组大鼠胰岛中Bcl-2蛋白表达减弱 (图5) , 4组大鼠间Bcl-2蛋白表达的平均光密度值如图6, 4组间差异具有统计学意义 (F=157.273, P=0.000) , 复合组表达量显著低于糖尿病组 (t=-2.565, P=0.022) , 牙周炎组与正常组之间表达没有差异 (t=1.814, P=0.091) 。
A:正常组;B:牙周炎组;C:糖尿病组;D:复合组 (注:d:牙本质;ct:结缔组织) A:Control group;B:Periodontitis group;C:Diabetes group;D:Combination group;d:Dentin;ct:Connective tissue
A:正常组;B:牙周炎组;C:糖尿病组;D、E:复合组A:Control group;B:Periodontitis group;C:Diabetes group;D、E:Combination group
A:正常组;B:牙周炎组;C:糖尿病组;D:复合组A:Control group;B:Periodontitis group;C:Diabetes group;D:Combination group
3 讨论
Bax蛋白是Bcl-2家族中的促凋亡成员, 当它从细胞质迁移到线粒体时会导致Caspase级联系统活化, 引起凋亡[7];相反, 抗凋亡成员Bcl-2, 则通过阻碍促凋亡成员聚集到线粒体中, 钝化死亡信号[8];Caspase-3 参与细胞凋亡的执行阶段。
A:正常组;B:牙周炎组;C:糖尿病组;D:复合组A:Control group;B:Periodontitis group;C:Diabetes group;D:Combination group
A:正常组;B:牙周炎组;C:糖尿病组;D:复合组A:Control group;B:Periodontitis group;C:Diabetes group;D:Combination group
单纯牙周炎可以引起血清中促炎症介质升高[9], 对牙周炎患者实施牙周干预措施可以降低其血清炎症因子水平[10]。β细胞的凋亡与多种促炎症因子有关。华坚等[11]发现在糖尿病大鼠模型中, TNF-α (tumor necrosis factor-α) 可能直接作用于胰岛细胞凋亡。IL-1β (interleukin-1β) 会导致Fas表达的增加, 促进β细胞凋亡[12];IL-1β还能促进蛋白激酶C的活化, 通过凋亡机制引起胰岛β细胞的破坏[13]。当β细胞暴露在促炎症因子中时, Bax从细胞液迁移到线粒体, 细胞色素C释放并激活Caspase-9, 触发Caspase-3、-7活化[14]。Mehmeti等[15]发现在促炎症因子介导的胰岛β细胞死亡中, 这些细胞因子引起的Bcl-2表达下降和随之的Bax/Bcl-2比值改变, 导致线粒体中促凋亡因子的释放, 活化Caspase-9, 并最终激活Caspase-3。
本研究观察到在正常组和牙周炎组大鼠中, 胰腺的组织结构基本正常, 糖尿病组和复合组大鼠胰腺结构明显异常, 提示合并牙周炎时, 糖尿病大鼠的胰岛细胞的形态及功能遭到进一步破坏。对胰岛细胞凋亡相关蛋白进行检测, 发现复合组相比糖尿病组, 胰岛Ba和Caspase-3蛋白表达量显著上升, Bcl-2蛋白表达量显著下降;正常组和牙周炎组大鼠之间的表达没有差异, 根据课题组的前期研究结果[5], 提示在健康机体中, 牙周炎引起的系统炎症水平尚不足以引起胰岛细胞破坏, 但是在糖尿病造成的机体低度慢性炎症状态下, 牙周炎通过累计加重机体炎症, 引起Bax表达显著上升, Bcl-2表达显著下降, 提示在糖尿病合并牙周炎状态下, 促进和抑制细胞凋亡的平衡被打破, 胰岛细胞向凋亡增加的方向发展。
细胞凋亡受多因子多信号通路调节, 信号通路之间存在复杂的交叉作用。本研究通过选取最具代表性的凋亡相关蛋白进行研究, 为从胰岛细胞凋亡的角度出发探讨牙周炎与糖尿病之间的相关关系提供了初步的依据, 课题组进一步的深入研究, 将为牙周局部炎症是否能够通过影响胰岛细胞凋亡及分泌功能, 从而影响糖尿病的发生及发展提供进一步的实验依据。
4 结论