干细胞心肌修复研究

干细胞心肌修复研究（共8篇）

干细胞心肌修复研究 篇1

近年来,随着心血管组织工程技术的发展,干细胞移植为心肌再生提供了良好的应用前景。然而,由于心肌梗死后局部组织缺血缺氧和氧化应激损伤导致移植干细胞的存活率低是目前干细胞移植遇到的主要困境[1,2,3]。大量研究显示,缺血预处理对心肌具有很强的保护作用,一般认为线粒体ATP敏感性钾通道(MitoKATP)是其终末效应器。二氮嗪(DZ)是线粒体ATP敏感性钾通道特异性开放剂[4]。有研究者用H2O2造成大鼠心肌细胞的氧化应激损伤,在损伤前应用DZ处理后可明显抑制细胞凋亡,结果表明,Mito KATP的开放提高了细胞的抗氧化应激能力。Niagara等[5]研究发现,DZ预处理骨骼肌成肌细胞可以提高细胞对氧化应激的耐受性,从而减少氧化应激对细胞的损伤。骨髓源性心肌干细胞(MCSCs)是利用干细胞表面标志c-kit以及早期心肌转录因子Nkx2.5的表达,从骨髓间充质干细胞(MMSCs)中筛选出具有心肌特异分化潜能的多能干细胞[6]。动物实验研究显示,心肌梗死后用MCSCs移植比MMSCs移植更有利于移植细胞的存活和向心肌细胞分化,心功能恢复明显优于MMSCs[7]。本课题利用DZ预处理的MCSCs治疗大鼠急性心肌梗死,探讨移植DZ预处理的MCSCs治疗心肌梗死的机制及效果。

1 材料与方法

1.1 MCSCs的培养和筛选

将新生1 d～3 d雄性SD大鼠拉颈处死,取双侧股骨和胫骨,暴露骨髓腔,用含有肝素的PBS冲洗骨髓腔。收集冲洗液,离心。用DMEM培养液混悬沉淀细胞。均匀接种到培养瓶中,培养箱中培养,当细胞达到70%～80%汇合时,用血细胞计数板计数细胞,根据细胞数目以等阶式稀释的方式将细胞悬液稀释至细胞密度为103个/mL。取0.1mL稀释后的细胞悬液加入10 mL培养液中,使最终细胞密度为10个/mL。将稀释后的细胞悬液加入96孔细胞培养板,每孔150μL,进行单细胞克隆培养。通过多能干细胞标志物c-kit的免疫荧光标记和早期心肌形成转录因子Nkx2.5的RT-PCR检测,从c-kit+MMSCs克隆中筛选出具有特异心肌分化潜能的MCSCs[6]。

1.2 实验分组与细胞移植

将心肌梗死模型大鼠随机分为对照组、MCSCs移植组、预处理MCSCs移植组。每组8只。各组分别在大鼠心肌梗死模型建立成功后30 min,在梗死区边缘设4点,用针头规格为29 G的胰岛素注射器注入MCSCs或200μmol/L二氮嗪预处理30 min的MCSCs,细胞的数目为107个/mL,用80μL PBS混悬,每点注射20μL。在对照组注射等量PBS。移植后逐层缝合,术后肌肉注射抗生素,连续注射1周。

1.3 细胞移植后大鼠心功能检测

在细胞移植后4周,将大鼠麻醉,呈仰卧位固定,剃去胸部毛发,将线阵探头置于左胸壁,进行超声检查获得M型超声心动图。测定左室舒张内径(LVDd)和左室收缩末期内径(LVDs)。应用Teichholz校正公式进行分析。

1.4 Masson染色和胶原纤维的测定

取近左冠状动脉前降支结扎处的心肌组织冰冻切片,每只大鼠6张。蒸馏水清洗后,用丽春红酸性品红液染色10 min。蒸馏水清洗后,用1%磷钼酸溶液染色2 min,再用苯胺蓝或亮绿染色液染色5 min。然后,蒸馏水清洗,无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。光镜下Masson染色心肌纤维着红色,胶原纤维着蓝色。用Image Pro Plus 6.0图像分析系统测量胶原纤维(蓝色区域)的比率。1.5移植细胞的Y染色体原位荧光杂交将各组的冰冻切片置于通风处干燥,然后置于甲醇和乙酸液中固定。取出晾干后,将25μL蛋白酶K滴加在切片上,在室温条件下消化30 min。用2×SSC清洗3次,每次5 min。将切片放入变形液中,在95℃条件下处理在条件下经梯度酒精脱水然后让切片自然干燥。将生物素标记的Y染色体特异DNA探针与杂交液HybrisolⅦ混合,在95℃水浴中变性5 min。将变性后的探针滴加在切片上,随后将切片放入湿盒中,置42℃恒温箱内杂交过夜。将切片取出,用已预热至42℃的2×SSC清洗2次,每次5 min。用0.1×SSC清洗2次,每次5 min。加入FITC标记的链霉亲和素,在37℃条件下孵育30 min。用PBS清洗3次,然后用DAPI复染细胞核。在显微镜下观察Y染色体在心肌细胞核内的分布。Y染色体阳性细胞呈绿色荧光,Y染色体阳性细胞数。

1.6 微血管密度分析

取各组冰冻切片,以小鼠抗大鼠vWF单克隆抗体作为第一抗体进行免疫组织化学检测,Cy3标记的驴抗小鼠IgG作为二抗,封片。每组取6张vWF染色切片。微血管密度(MVD)计数参照Weidner法进行。

1.7 统计学处理

采用SPSS 11.5统计软件处理,数据用均数±标准差表示,各组间的差别采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞移植后大鼠的心功能变化

在细胞移植4周时各组大鼠进行M型超声心动图检查,结果显示,两个细胞移植组与对照组相比,大鼠心功能都有明显改善,差异均有统计学意义(P<0.01),预处理MCSCs移植组大鼠心功能恢复优于MCSCs移植组(P<0.05)。详见表1。

%

2.2 细胞移植后梗死区组织结构的变化

细胞移植4周后,取各组大鼠心脏作组织切片进行Masson染色,光镜下观察到心肌纤维着红色,胶原纤维着蓝色。梗死区胶原纤维明显增多,呈条索状,分割包绕心肌束,部分胶原纤维融合。用Image Pro Plus 6.0图像分析系统测量各组大鼠左心室室壁胶原纤维的比率,用%表示。经统计学分析结果显示,两个细胞移植组与对照组相比,大鼠左心室室壁胶原纤维的比率都有明显减小,差异均有统计学意义(P<0.01)。预处理MCSCs移植组大鼠左心室室壁胶原纤维的比率小于MCSCs移植组(P<0.05),详见表2。2.3二氮嗪预处理对MCSCs存活的促进作用本实验是将雄性大鼠的MCSCs移植到雌性大鼠心肌梗死模型的心肌梗死区边缘,所以通过荧光原位杂交技术检测Y染色体阳性细胞,示踪移植细胞的存活和分化情况。荧光显微镜下,对照组没有观察到Y染色体绿色荧光信号。二个细胞移植组心肌组织内均有散在的呈现绿色荧光的Y染色体阳性细胞。经统计学分析显示,预处理MCSCs移植组大鼠Y染色体的阳性细胞数多于MCSCs移植组(P<0.05),详见表2。

2.4 微血管密度的变化

在细胞移植4周后,各组大鼠心脏梗死区和梗死区边缘的微血管密度分析显示,两个细胞移植组与对照组相比,大鼠心脏的微血管密度都有明显增高,差异均有统计学意义(P<0.01)。与MCSCs移植组相比,二氮嗪预处理细胞移植组大鼠心脏的微血管密度差异无统计学意义。详见表2。

3 讨论

移植细胞的选择是决定干细胞移植治疗效果的关键。MMSC因具有多向分化潜能和独特的低免疫原性,成为许多疾病细胞疗法研究的热点。实验和临床研究均证实MMSCs移植治疗心肌梗死的安全性和有效性。然而,由于MMSCs中含有多种具有不同分化潜能的干细胞,临床研究发现移植的MMSCs后向心肌细胞分化的效率很低。MCSCs是从骨髓间充质干细胞中筛选出的具有心肌特异分化潜能的多能干细胞,动物实验研究显示,MCSCs在心肌内可以定向分化为心肌细胞。MCSCs在受损心肌中的存活率是提高其治疗效果的重要保障。由于缺血心肌处于氧化应激状态是移植干细胞存活率低的主要原因之一,以及Mito KATP是缺血预处理对心肌具有保护作用的终末效应器[8],所以本实验利用Mito KATP特异性开放剂针对MCSCs干细胞进行预处理后再移植,目的就是增强细胞的抗氧化应激能力,提高供体细胞的存活率,从而提高MCSCs移植治疗心肌梗死的效果。

建立心肌梗死动物模型是研究心肌梗死病理生理变化的重要手段,本研究采用结扎雌性大鼠左冠状动脉前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型,其优点是心肌梗死的部位、面积比较固定,有助于客观地观察和评价心肌梗死后干细胞移植治疗效果。在干细胞移植研究方面,为了更好地评价移植细胞在体内的存活和分化情况,需要对细胞加以标记。细胞标记方法主要有荧光染料标记、基因标记和Y染色体标记。虽然用荧光染料标记方法简单方便,但荧光染料可能污染受体心肌,故可造成假阳性。在转染报告基因标记方面,基因表达稳定可靠,但是否影响移植细胞的生物学活性仍不清楚[9]。Y染色体是雄性特异性遗传标志,不受时间和细胞表型转化过程中基因沉默与激活的影响,同时可避免对细胞生物学活性的影响[10]。因此,本实验将雄性大鼠的MCSCs移植到雌性大鼠心肌梗死模型,并通过荧光原位杂交技术检测含有Y染色体的细胞,以更加客观地观察和分析移植MCSCs的分化状态,有助于研究MCSCs移植治疗心肌梗死的机制。

心肌梗死后梗死区心肌细胞坏死崩解,心肌胶原网架破坏严重,大量成纤维细胞增生,产生并分泌大量胶原,其意义在于保持心肌结构完整。然而,由于胶原聚合成粗纤维,其硬度高,弹性差,因此增加了心肌的僵硬度,影响左室舒缩功能[11],因此,胶原纤维在心肌组织所占的比率是检测心脏功能的重要指标之一。为此,本实验除常规测量各组大鼠的心肌梗死面积外,还定量检测胶原纤维在心肌组织中的比率。结果显示,大鼠在心肌梗死4周后,心肌的胶原纤维比率明显增加,并且大鼠在心肌梗死4周时的左室功能与心肌的胶原比率成负相关,预处理MCSCs移植组大鼠左心室室壁胶原纤维的比率明显小于MCSCs移植组。

本课题采用二氮嗪预处理的MCSCs移植治疗大鼠心肌梗死,与单纯MCSCs移植组相比,Y染色体阳性细胞数增多,瘢痕面积、心肌胶原纤维含量减少,左室功能改善,差异均有统计学意义。然而,微血管密度变化不明显,以上结果提示,二氮嗪预处理能够增强MCSCs对缺血和氧化应激的耐受性,提高移植干细胞在受损心肌的存活率,但对病灶处的血管再生作用不明显,其作用机制有待进一步研究[12]。因此,本实验研究证实,二氮嗪预处理干细胞移植治疗缺血性心脏病可以增加提高移植供体细胞的存活率,改变心肌顺应性,延缓或阻止左室重构的发生,改善心脏功能,有望为缺血性心脏病的临床治疗提供新的思路和手段。

干细胞技术帮助修复受损角膜 篇2

研究人员希望可以找到一种治疗手段,让患者无须接受大型手术,也不用担心排斥反应,只要戴上特制的隐形眼镜,数周后因角膜病变致盲的眼睛就能重见光明。目前,借助干细胞技术,澳大利亚的科学家正使这变得可能。

最近发表在医学期刊《移植》(Transplantation)上的报告称,患者只需接受局部麻醉,手术两小时后就能够出院。由于治疗使用的是患者本身的干细胞,因此也不会出现排斥现象。这种治疗法不需要大型设备。“在第三世界地区,你只需一间手术室和细胞培育室便可以进行治疗了。”研究员吉罗拉莫表示,“过程绝对简易便宜。”疗法不一定使用角膜干细胞,也可用结膜干细胞。

吉罗拉莫说,同类疗法还可以应用到其他人体器官,包括与角膜非常相似的皮肤等。

◆ 用绒猴复制人类疾病

医学人员一直希望,能够获得一种在解剖学方面比啮齿类动物更接近人类的动物模型。目前在潜伏期研究中,科学家一般通过转基因老鼠测试他们的理论,而后再在人类志愿者身上验证实验结果。日本科学家近期的研究有可能给这一现状带来重要的变化。

庆应义塾大学实验动物研究中心的佐佐木惠里(Erika Sasaki) 带队的研究小组在产自巴西的一种小型长尾绒猴晶胚中引入了一种外来的基因(携带绿色荧光蛋白),他们在蔗糖溶液中培育这些晶胚,然后植入7 只代孕猴的子宫里。在生下的小猴当中,其中两只小猴体内的生殖细胞成功与这种基因融为一体,其中的一只随后又孕育了第二代。今后,研究小组准备继续培育转基因的绒猴,复制帕金森氏症和肌萎缩性脊髓侧索硬化癥等人类疾病。

美国灵长类动物专家杰拉尔德• 斯查顿(Gerald Schatten) 和舒克拉特• 米塔利波夫(Shoukhrat Mitalipov) 将这项成就称之为“一个毋庸置疑的里程碑”。

◆ 老鼠的脱发基因

日本的研究小组发现,过去认为与神经细胞增殖和分化相关的转录因子“Sox21”与脱发也有关系。日本国立遗传学研究所与庆应义塾大学组成的研究小组专门培育出了缺乏“Sox21”基因的实验鼠作为研究对象。他们发现,这些老鼠在刚刚出生时是能够长出毛发的,但是在出生15 天左右之后,它们的头部首先开始脱毛,随后脱毛部位就逐渐扩散到身体其他部位,经过一周时间,毛就会全部脱完。虽然这些脱掉的毛会再生,但是约25 天后会再次脱毛。研究人员说,这说明当“Sox21”基因不能发挥作用时,老鼠身上出现了异常的脱毛。研究人员还发现,如果没有这种基因,角蛋白的量就会明显减少,使老鼠的体毛结构出现缺陷——这种缺陷正是老鼠异常脱毛的原因。

◆ 抗疟疫苗III 期测试

2009 年5 月26 日,全世界最先进的疟疾候选疫苗的III 期临床试验启动。坦桑尼亚Bagamoyo 地区的5 名婴儿已经注射了葛兰素史克公司的RTS,S 疫苗,而1.6 万名2 岁或2 岁以下的儿童将在未来的几个月中注射该疫苗。

RTS,S 的研制超过20 年,投入总计达4 亿多美元。如果这些试验取得成功——如果它能阻止该研究中至少一半的婴儿和儿童出现疟疾症状,RTS,S 疫苗将有可能在2012 年上市。该项目的负责人Christian Loucq 说,很显然该疫苗将免费提供给非洲的婴儿和母亲。坦桑尼亚的这场试验的研究组长Salim Abdulla 说:“该疫苗有潜力挽救数十万生命。”

◆ 永久保存数据

就今天的存储技术而言,我们确实可以在更小的存储介质上保留下更多的信息了,但这并不意味着这些信息可以存得更久,比如,由柯达彩色胶卷拍摄的家庭照片能够在60 多年里保存下对亲情的记忆,但目前广泛使用的DVD、硬盘等却非常容易受到阳光等因素的影响,随着时间的流逝损失数据——多则20 年,少则10 年,数据就不在了。据《纳米快报》(Nano Letters)的报道,一个由物理学家和材料学家组成的研究小组开发出了一种技术,能够将只有几十亿分之一米宽的铁单晶放入一个空的纳米管的内部。就像钻石一样,纳米管是现有最稳定的结构之一。进入纳米管的铁纳米晶体能够起到数据位的作用。当电流接通,铁纳米晶体能够从纳米管的一端滑动到另一端,同时在计算机的二进制语言中寄存一个“1”或一个“0”。参与该项研究的美国加利福尼亚大学伯克利分校的物理学家Alex Zettl 表示,这种装置的商业化将挑战业已成熟的电子存储器产业。

◆ 南极冰层如何形成

南极的冰层到底是如何形成的?对这一问题一直存在着诸多猜测。来自几个方面的证据都表明,南极中部山系是最初冰层的所在地点,但我们关于当前冰层地貌的知识高度局限在冰层最初形成最可能发生的区域:位于当前冰层中心、沿冰川下的Gamburtsev 山系的地方。现在,研究人员根据在两个季节中所进行的一项能够穿透冰层的雷达研究,完成了对Gamburtsev 山系形态的详细勘查和分析。所获数据显示了一个最初被河流切割、然后又被冰的运动加深的山地景观。深至冰层下3000 米的地貌像是经典高山峡谷地貌发生爆炸后的版本,似乎是在距今3400 万年前形成的,当时的平均夏季气温约为3 摄氏度。

◆ “土卫六”的云活动

土星最大的卫星“土卫六”有一个复杂的气候系统,烃类在其中扮演的角色相当于地球上的水。“土卫六”的云是由甲烷和乙烷冷凝形成的。云活动目前主要出现在“土卫六”的南半球,但大气环流模型预测,这种分布应当随季节变化,变化的时间尺度为15 年。搭载在“卡西尼”探测器上的红外绘图光谱仪为近距离对云活动进行监测及用所获数据来优化环流模型和提高它们的预测准确性提供了一个机会。对在2004 年7 月和2007 年12 月间每月进行的39 次飞掠探测活动所获几百万光谱数据进行的整理显示,“土卫六”上的全球云覆盖模式与模型预测总体上是一致的,从而证实了云活动主要由全球环流控制。

◆ 用于净水的纳米技术

联合国的千年发展目标曾经提出,要确保所有人获取清洁的饮用水——到2015 年,要将不能在日常生活中获得安全饮用水的人口比例减半。这意味着改善15 亿地球人的饮水状况。

对此,技术手段的重点是应用纳米技术。磁性纳米颗粒相对其体积而言拥有很大的表面积,而且可以轻易地与化学物质结合。在水处理应用中,它们可以用于与污染物——诸如砷或者油结合,然后利用磁场把它们清除。几家公司正在把这些技术商业化,而科学家正在这一领域频繁公布新的发现。例如,美国赖斯大学的科学家正在利用磁性“纳米锈”(nanorust)去除饮用水中的砷。纳米锈很大的表面积意味着它能捕获的砷是更大尺寸的同类物质的100 倍。该研究组估计200 ～ 500 毫克的纳米锈可以处理1 升水。而且该研究组正在开发一种利用廉价的家用材料制造纳米锈的方法。这将显著减少生产成本,让它成为适用于各个发展中国家社区的产品。

◆ 乌贼的听觉很强

利用“听觉脑干反应电生理记录法”,台湾“中央研究院”细胞与个体生物研究所研究员严宏洋领导的研究团队发现,乌贼拥有宽广且灵敏的音频听觉。这意味着,渔民可以改良现有以灯色诱捕的方法,改以声音诱捕乌贼。

严宏洋指出,乌贼和章鱼是头足类动物最具代表性的两大族群,乌贼分布全球五大洋,被人类大量捕捞食用却从未因此面临枯竭危机,这表明它们一定有很好的“感觉系统”,才能在天敌和人类捕捞压力下仍繁衍不息。

过去,科学家对乌贼的听觉几乎一无所知,这是首次证实乌贼和章鱼均有听觉能力。乌贼的听觉介于400 ～ 1500 赫兹,章鱼是400 ～ 1000 赫兹,听觉音频虽然比人类差(人类听觉50 ～17000 赫兹),但在海洋生物中算听觉敏锐的动物。

◆ 善于学习的苇莺

布谷鸟会将自己的蛋偷偷放入其他鸟的窝里,让其他鸟帮助自己孵化后代,这种行为使它被称为托卵寄生鸟。研究人员最近发现,某些鸟类针对这种行为也会有一些反抗的举动。

英国的研究人员观察了苇莺的反应,发现它们会成群地攻击这些寄生的鸟。这种行为是受到生物学支配的——如果在窝边放置的是假鸟,它们就不会攻击。

干细胞心肌修复研究 篇3

目前, BMSCs在软骨损伤修复方面的研究比较深入, 本文对BMSCs修复关节软骨缺损的研究进展予以综述。

1 体外培养扩增BMSCs修复关节软骨缺损

早期曾采用调动软骨损伤区周围的间充质干细胞促进软骨修复, 如软骨下骨钻孔术, 但由于有效成分较少, 修复效果不明确。近年将体外纯化的骨髓间充质干细胞与支架结合植入患处, 显示出较好的效果。Wakitani等[1]最先报道了从兔骨髓和骨膜中分离出BMSCs, 经体外扩增后与Ⅰ型胶原凝胶混合形成复合物, 移植修复兔股骨内髁关节软骨缺损。术后2周, 观察到缺损处的BMSCs已分化成软骨细胞;4周时缺损深处有骨形成;12周时软骨下骨已修复良好, 且上层的新生软骨组织依然保留其生物学活性。力学测试数据显示, 术后24周的修复组织硬度比空白对照组强而稍弱于正常软骨。

Robinson等[2]将兔骨髓的BMSCs在体外培养扩增, 同样复合在生物材料上进行关节软骨损伤修复的实验研究。在术后6周和6个月时检测发现, 关节软骨损伤区有透明软骨形成。Caplan等[3]进行的类似研究同样证实, 体外培养扩增的BMSCs与载体结合可以修复兔股骨髁的全层关节软骨损伤。

Diduch等[4]研究比较了BMSCs与不同材料的结合情况, 发现在琼脂糖中培养的BMSCs产生Ⅱ型胶原以及aggrecan含量增长最快, 海藻酸盐其次。胶原凝胶-细胞复合物随培养时间延长会发生体积回缩, 而海藻酸盐不仅能促进BMSCs分化形成软骨, 而且长期培养中体积不会发生明显变化。动物实验进一步证实, 骨髓间充质干细胞-海藻酸盐复合物能有效地修复骨软骨缺损。Im等[5]模拟自体软骨细胞移植的方法, 将从兔骨髓中分离出的BMSCs体外培养扩增后, 再以一定的密度将BMSCs悬液注射到兔髌骨滑车的骨软骨缺损处, 表面以股四头肌筋膜覆盖。术后14周, 修复组织经免疫组化和PT-PCR等方法证实为软骨组织, 且组织学评分远高于对照组。

王万明等[6]用高密度传代培养的第3代BMSCs作为种子细胞, 以酸溶性Ⅰ型胶原为载体, 两者混合后形成凝胶样植入物 (其中细胞浓度为5×106/mL) 。然后于新西兰白兔股骨滑车关节面制造全层关节软骨缺损, 把凝胶样物植入缺损作为实验组;对照组为单纯胶原植入组和空白组。实验结果显示, BMSCs为种子细胞移值体内外形成透明软骨组织, 24周后新生软骨组织特性基本保持稳定, 48周时修复组织仍为透明软骨组织, 而且能够维持良好的关节功能。

2 体外诱导分化BMSCs修复关节软骨缺损

有人研究[7]用海藻酸盐载体材料负载体外扩增诱导分化后的自体骨髓间充质干细胞移植于关节软骨损伤区, 术后6周时, 实验组软骨损伤区域即由类似透明软骨样修复组织填充。修复组织内细胞形态类似于透明软骨细胞, 细胞周围有软骨陷窝形成。原位杂交实验证实细胞已开始表达Ⅱ型胶原mRNA, 透射电镜观察到细胞周围有胶原纤维的产生, 免疫组化结果显示这些胶原纤维为Ⅱ型胶原纤维, 证实修复组织为透明软骨。另外还有人研究[8]采用明胶海绵为载体, 实验组用诱导分化后的骨髓间充质干细胞移植修复兔自体股骨髁关节软骨缺损;对照组仅进行单纯明胶海绵移植。结果亦证实, 经诱导分化后的自体骨髓间充质干细胞移植于关节软骨缺损区, 可促进软骨缺损的快速修复, 恢复关节软骨的结构和功能。

3 基因工程技术转染BMSCs修复关节软骨缺损

目前, 用基因工程方法治疗关节软骨损伤的研究已取得了较快进展, 为关节软骨缺损的治疗开辟了新的途径。BMSCs不仅具有多向分化潜能, 近年还发现其易于外源基因的转染和表达。将B2-半乳糖苷酶基因和新霉素抗性基因导入BMSCs, 在植入后的受体骨和软骨组织检测到这些基因产物的表达, 提示BMSCs携带外源基因在体内可以表达正常产物。还有报道, BMSCs携带的外源基因表达具有组织特异性, 受所定位微环境的作用, 这些都为BMSCs应用于基因治疗提供了依据。因此, 骨髓BMSCs可能成为一种新型的基因治疗的靶细胞, 这样其再与骨髓BMSCs多向分化潜能相结合, 通过导入目的的基因, 将细胞治疗和基因治疗结合起来, 对人类疾病的治疗将具有更广阔的前景。

Mason等[9]以逆转录病毒为载体在体外将BMP-7基因转染兔间充质干细胞扩增培养后与生物材料聚乙醇酸一起植入兔关节软骨缺损, 8周后发现实验组软骨缺损表面有软骨组织覆盖, 经检测证实为透明软骨, 并且发现受损的软骨下骨结构也修复良好。由此说明, 基因工程技术转染BMSCs能够同时修复关节软骨缺损和软骨下骨缺损。类似的研究, 如Doherty等[10]发现, 转基因的软骨细胞可以粘附于关节软骨的表面存活, 并表达出相应的功能基因产物。Goomer等[11,12]证明, 将TGF-β1基因转染软骨细胞并注射入动物关节腔内, 可大大提高软骨细胞外基质中蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量, 并可减少软骨细胞凋亡的数量及比例。Nixon等[13]将转染了IGF-1基因的软骨细胞注射入动物的关节内, 发现软骨细胞能高效表达IGF-1, 且表达时间至少可维持4周。Fernandes[14]将重组有IL-1Ra的质粒VR1012直接注入兔膝关节腔内, 发现存在功能基因的表达, 且表达至少可维持4周。这些研究都证明了基因治疗技术与组织工程学相结合治疗软骨损伤具有良好前景。

4 BMSCs修复关节软骨缺损的临床应用

2002年, Wakitani等[15]首次报道了BMSCs的临床应用。他们从12 例骨关节炎患者的骨髓穿刺液中分离纯化出自体骨髓间充质干细胞, 体外扩增后与胶原凝胶结合, 在行胫骨高位截骨手术的同时, 移植到股骨内髁软骨缺损处, 并覆盖以自体骨膜。结果发现, 术后6周缺损处产生白色至粉红色的柔软组织, 其中有少量的异染组织;术后42周, 修复组织呈白色, 均一异染, 可见部分组织为透明软骨样组织。尽管临床表现无明显改善, 但组织学及关节镜评分均优于无细胞移植的对照组。

5 展望

干细胞心肌修复研究 篇4

干细胞是一种具有无限增殖潜能、并在一定条件下可被诱导定向分化的细胞类型。作为一种新型的细胞移植供体, 干细胞移植正成为一种新的策略, 为更好地治疗MI提供了诱人的前景。在深入开展基础和临床研究并获得成功后, 干细胞移植有可能成为治疗MI的理想手段。许多动物实验都已证实, 干细胞移植治疗心梗不仅能够取代受损的心肌细胞, 增加有功能的心肌细胞数量, 并建立新的血管来供应血运, 而且还能够抑制心室重构, 为MI的治疗开辟了一条新途径。尤其是新生儿, 胎儿和成体的心肌细胞 (cardiac stem cells, CSCs) [4], 骨骼成肌细胞 (skeletal myoblasts) [5], 人脐血细胞 (human umbilical cord stem cells, HUCBSCs) [6], 内皮祖细胞 (endothelial progenitor cells, EPCs) [7], 胚胎干细胞 (embryonic stem cells, ESCs) [8], 骨髓干细胞 (bone marrow stem cells, BMSCs) [9], 间充质干细胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) [10]和诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cells, i PS) 都被用于MI后的心肌再生。一些临床试验已经应用干细胞移植治疗心脏缺血性疾病。本文仅就国内外有关于干细胞移植治疗MI的研究进展及发展前景作一简要的综述。

1 目前研究较多的干细胞

目前已有多种干细胞应用于MI治疗的临床前动物实验和临床试验研究中, 比较集中的有以ESCs、iPS为代表的全能干细胞和以MSCs、CSCs等代表的成体干细胞。

1.1 全能干细胞

全能干细胞具有发育上的全能性, 能够分化成各种组织细胞类型, 因而在再生医学研究领域倍受关注, 目前根据其来源和获得方法主要分成ESCs、iPS和孤雌胚胎干细胞 (parthenogenetic embryonic stem cells, pESCs) 。

1.1.1 胚胎干细胞

ESCs来源于囊胚期的内细胞团, 具有自我更新和无限增殖的能力。它是典型的全能干细胞, 具有分化为任意体细胞的潜能, 正因为如此, 基于ESCs的组织工程及干细胞治疗一直是近年来再生医学领域的研究热点。研究证实, 将ESCs移植到缺血心肌中虽然能再生心肌细胞并发挥对损伤心肌的修复作用, 但是有生成畸胎瘤的危险。

1.1.2 诱导型多能干细胞

ESCs是可以发育为体内各种器官和组织的干细胞类型, 过去只能从胚胎中获得。2006年, Yamanaka[11]首先证明, 终末分化的成体细胞可以重新编程为具有类似于ESCs的多向分化潜能的干细胞, 即i PS。简而言之, Yamanaka将ESCs中特异性表达的转录因子的基因转到小鼠成纤维细胞中去, 成纤维细胞逐步去分化, 最后不论在形态上、基因谱上、还是分化全能性上, 都与ESCs有着惊人的相似之处。从此证实, 既往认为处于终末分化的成熟细胞可通过外源转录因子基因的导入而重新编程, 恢复多分化潜能。这一成果引起了整个生命科学领域的广泛关注。此后的几年, 关于i PS的研究如雨后春笋般层出不穷[12], 经过这些年的发展, iPS的诱导效率、生物安全性都得到了显著的改善, Yamanaka等也因为关于i PS开创性的工作获得了2012年的诺贝尔奖。

1.1.3 孤雌胚胎干细胞

孤雌生殖 (parthenogenesis) 现象是自然界中一些植物和低等动物中普遍存在的生殖现象, 即生物不需要雄性个体, 单独的雌性也可以通过复制自身的DNA进行繁殖。卵母细胞不经过精子受精, 只是被人工激活进而发育成孤雌囊胚, 从囊胚中分离内细胞团 (ICM) 即可分离得到与ESCs接近的一种干细胞, 称为pESCs。孤雌来源的pESCs与受精的ESCs表现出相同的性质, 即具有无限增殖和多向分化潜能, 可在体内外诱导分化成各种细胞[13,14], 因而可作为获得多能的ESCs的另一有效来源。由于缺乏父本基因, 孤雌胚胎不能发育成个体, 因而获取pESCs不需要破坏活的胚胎, 故而可以避免受精卵来源ESCs引发的宗教、道德和伦理等方面的争议, 有助于进一步推动ESCs的研究和应用[13,15]。

1.2 成体干细胞

成体干细胞来源有胎盘、脐带血、脑、骨髓、骨骼肌、外周血、皮肤及其他各种组织, 其中骨髓中含有干细胞的种类比较丰富, 研究的也最为充分, 来源于骨髓的干细胞主要包括MSCs、EPCs、造血干细胞 (hemopoietic stem cells, HSCs) 等, 此外来源于脑的神经干细胞 (neural stem cells, NSCs) 、来源于皮肤的皮肤干细胞也是常见的成体干细胞类型。成体干细胞具有获取相对容易、移植一般无致瘤风险、无伦理学争议等优点, 因而用途非常广泛, 涉及损伤性疾病修复、器官再生等多个研究领域。

1.2.1 间充质干细胞

MSCs是各种间质细胞的前体细胞, 它作为成体干细胞, 在细胞治疗领域以其来源广泛、获取简便、易于体外扩增、具有多向分化潜能、免疫原性低且具有免疫调节功能等诸多优点而备受关注。目前, 我们几乎可以从任何组织中都能分离得到MSCs, 如骨髓、脂肪、肺、脐带血、脑、脾、肝、肾、胰等, 其中骨髓和脂肪来源的MSCs由于其分离的简便性得到广泛的研究和应用[16,17]。MSCs并不是单一的一种细胞, 相反它是一个异质细胞群, 不同来源的MSCs的增殖能力可能会存在差异, 但是它们都具有中胚层分化潜能及相似的表面标志分子。关于MSCs的鉴定标志, 学术界一直争论不休, 但目前主流的标准认为, 人的MSCs在体外培养条件下应该是贴壁生长;表达CD73、CD90、CD105、CD44, 不表达CD34、CD45、CD14、CD11b、CD79a等;能分化成为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞等[16]。

MSCs向心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞的分化潜能, 旁分泌及免疫调节的能力使得它成为MI治疗的热门细胞来源。为了增强MSCs的治疗效果, 往往在MSCs中过表达一种或几种基因, 以提升MSCs的旁分泌能力, 或是促进其在梗死区极端环境的存活, 亦或是有利于促进MSCs分化为心肌细胞或是内皮细胞[18,19,20], 如Mangi等[20]在骨髓来源的MSCs中过表达Akt, 有效的促进了MSCs在梗死区的存活;Cho等[19]在骨髓MSCs中过表达GSK-3β, 一定程度上提升了MSCs的旁分泌效应, 同时也促进了MSCs向心肌细胞分化。

1.2.2 心脏干细胞

CSCs是心脏自身的多能干细胞, 具有特异性心肌分化的潜能, 在体内外特定地诱导条件下, 可直接向心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞等定向分化, 从而可以推断它们在心脏组织的再生修复中具有重要的应用前景。Matsuura K[21]等人根据CSCs特有的蛋白质Sca-1, 用酶从实验鼠心脏细胞中间筛选出了干细胞, 然后利用缩宫素进行培养, 4周后培养皿中出现了有规律地搏动的细胞, 对这些细胞表明的蛋白质进行的研究证实, 它们是心肌细胞。目前, 已有许多研究观察到CSCs移植到心肌梗死动物模型后能分化成心肌细胞及血管细胞, 可促进血管新生, 减小梗死面积, 延缓心室重构, 改善心脏功能。总之, CSCs的发现打破了传统的心肌不可再生的观点, 其应用为MI治疗注入了新的潜力, 也给研究者一个新的视角, 并且使受损心脏的逆转在理论上成为可能。

1.2.3 造血干细胞

HSCs是迄今应用最成熟的一类成体干细胞, 包括功能和表型各不相同的多个类群, 可以通过其表面表达的特殊抗原组合利用选择性分选的方法由骨髓中分离得到。HSCs具有较强的自我更新和造血分化潜能, 可分化成所有的血细胞类型, 易于表征鉴定且来源丰富, 并且在体外培养中可分化为心肌细胞, 因而被视为治疗心脏疾病的良好的干细胞来源[22,23]。

1.2.4 内皮祖细胞

EPCs又称为成血管细胞, 是从HSCs发育而来, 存在于骨髓和外周血中, 并表达成熟内皮细胞的表型[24]。分离自外周血的人EPCs与新生心肌细胞共培养后可获得一些心肌细胞的生物化学和功能特性[25], 还有研究表明, EPCs能直接分化成血管内皮细胞, 可参与血管生成和机体局部缺血组织的修复[26], 因此一直是移植治疗MI的细胞来源之一。有研究报道EPCs能定向迁移到缺血部位, 促进血管新生, 从而改善缺血心肌的血供并改善心脏功能[27], 这可能是EPCs移植治疗缺血性MI的重要机制。

2 干细胞治疗心梗的机制

2.1 诱导分化机制

有很多报道证实, Wnt信号通路在胚胎心脏发育过程中, 起着至关重要的作用。科学家们模拟心脏发育各个阶段的关键信号通路的调节情况, 在体外通过生长因子或化学小分子的作用, 调控Wnt等信号通路, 诱导ESCs向心肌细胞方向分化[28,29,30]。Kattman等利用BMP4、Activin A、DKK1、VEGF等生长因子, 成功将小鼠和人来源的ESCs诱导成心肌样细胞, 无论是心肌细胞一系列关键的标志分子 (如Nkx2.5, Isl 1, cTnT等) , 还是电生理功能, 诱导得来的心肌样细胞都与成熟的心肌细胞相似[30]。张强哲[31]在此基础之上, 进一步细化诱导条件, 利用BMS-189453小分子, 诱导得到电生理功能与心室肌细胞更为接近的心肌样细胞, 以摒除细胞不均一可能带来的对治疗效果不利的影响。

ESCs的体外培养, 往往需要来源于异种生物的营养物质, 如来源于胚鼠的滋养层细胞和来源于胎牛的血清等;同时, 上文中提到的用于诱导分化的生长因子也多纯化自于非人生物, 使得很多人担忧这种条件下培养的细胞的生物安全性, 加之生长因子的成本高、诱导效率低, 越来越多的科学家努力开发新的更安全的诱导途径。Lian等[29]利用两种调节Wnt通路的化学小分子CHIR99021和IWP2/IWP4成功高效的诱导人源ESCs分化为心肌样细胞 (效率约98%) 。Minami等用KY02111[28]亦成功诱导出心肌样细胞。这种小分子诱导方法, 不但较传统的诱导策略更安全, 同时还具有诱导效率高、成本低廉等优点, 大大增强了ESCs用于临床治疗MI的可能性。

MI导致心室重构甚至心衰的本质是心肌缺血, 故恢复梗死区血供便成为治疗心梗的基本策略之一。李宗金等[32]将ESCs诱导成为有功能的内皮样细胞移植到梗死区, 并通过分子影像技术监测移植细胞在体内的存活情况, 发现移植细胞后梗死区血管密度显著增加, 并有效的缓解了MI的症状, 提高了小鼠的生存质量。

上述ESCs诱导治疗策略虽然在一定程度上有效缓解了MI带来的伤害, 但其潜在的问题仍然不能忽视。首先, 由于目前的诱导效率不可能达到百分之百, 未分化的ESCs移植到体内便有形成畸胎瘤的风险;其次, ESCs来源于异体, 免疫排斥反应会影响其在受体体内的存活;最后, 由于ESCs来源于囊胚期的内细胞团, 所以从ESCs研究的起始就备受伦理争议[33,34]。

随着iPS的诱导技术日臻成熟, 其在再生医学领域也逐步被广泛应用。由于iPS是由成体细胞诱导而来, 利用患者少量的成体细胞即可诱导成iPS, 然后再将其分化成所需的细胞或组织, 从而进行移植治疗。由于iPS是自体细胞, 故与胚胎干细胞相比, 它能有效地降低免疫排斥反应。正因为如此, iPS已被用来参与多种疾病模型的治疗, 如糖尿病、老年痴呆、心肌梗死等等[33,35]。

鉴于iPS的多向分化潜能与ESCs基本相似, 其在治疗MI的策略也与ESCs基本无异, 即诱导分化成特定细胞 (如心肌细胞、内皮细胞等) 再移植, 但同时iPS也具有同ESCs相似的形成畸胎瘤的风险, 制约了其在临床上的应用[30]。

由于MSCs具有多向分化的潜能, 可将其诱导分化成为心肌细胞再移植便成为利用MSCs治疗心梗的基本策略之一。将小鼠的MSCs和大鼠的心室肌细胞共培养, MSCs细胞开始表达肌动蛋白α、与心肌细胞建立起缝隙连接并能与大鼠心肌细胞同步收缩, 说明MSCs可分化成为有功能的心肌样细胞。但是MSCs的分化是基于与心肌细胞的直接接触还是成熟心肌细胞的旁分泌作用尚存在很多争论[36], 值得进一步深入探索。除共培养策略外, 还可利用小分子调节MSCs关键信号通路, 促使其向心肌样细胞分化[37,38,39], 如Cai等[39]利用小核酸链AMO-124下调骨髓MSCs内源性microRNA-124的表达, 调节STAT3所在的通路, 促使骨髓MSCs分化成为心肌样细胞。

2.2 旁分泌机制

研究表明, 旁分泌作用干细胞移植治疗心梗的一种非常重要的修复机制[40,41], 有学者甚至认为它可能发挥着决定性的作用。大量研究人员发现, 将MSCs移植到心梗区后, MSCs分化成心肌细胞并与宿主心肌细胞整合的比例非常低, 另一方面, MSCs却能比较显著的改善梗死后的心脏功能, 这让人不禁怀疑分化途径并不是MSCs参与MI修复的主要机制。现已证实, MSCs具有很强大的旁分泌能力, 它们在心肌微环境中能分泌多种促血管新生的细胞因子, 如血管内皮生长因子VEGF、FGF-2、MCP-1、PDGF等, 移植MSCs能显著增加梗死区内血管密度, 重建梗死区的血液供应系统;MSCs分泌的SDF能有效募集自体干细胞向梗死区迁移, 参与损伤修复;此外, MSCs还能分泌一系列促生长抗凋亡的细胞因子, 如bFGF、IGF、SFRP-2等, 他们能促进CSCs的再增殖分化, 并且能阻止梗死区内的细胞凋亡。另外一个支持旁分泌机制的重要实验研究是注射干细胞培养上清也能重复干细胞移植对缺血心肌的治疗修复作用。已有研究表明, 应用MSCs的上清, 尤其是经过遗传修饰过表达Akt基因的细胞培养上清在梗死心脏组织中表现出较好的心肌保护的作用[42,43]。目前, 越来越多的研究者认识到, MSCs可能主要通过旁分泌机制来影响MI后的心功能和心室重构的过程。

除MSCs外, EPCs也可分泌一些抗心肌细胞凋亡和促进血管生长的细胞因子如VEGF、bFGF等, 这些局部释放的因子也可以促进血管新生[44]。

2.3 免疫调节机制

除旁分泌作用外, 目前许多研究结果已经证实, MSCs还具有很强的免疫调节能力[45]。它们可分泌一些具有免疫调节活性的蛋白因子来实现对免疫细胞活化和免疫活性分子表达的影响[46]。移植后MSCs可调节受体的免疫炎症反应, 延缓心梗后的心室重构[47,48]。

通常来讲, 抗CD3和CD28的抗体可以诱导T淋巴细胞增殖, 然而, 某研究者在体外将MSCs与T细胞混合培养, 不论是CD3、CD28抗体还是同种异体抗原, 都不能触发T细胞的增殖。将MSCs与外周血单核细胞共培养, 会诱导MSCs分泌CCL1和s HLA-G从而抑制细胞毒T淋巴细胞介导的细胞裂解作用。除此之外, MSCs与免疫细胞相互作用, 还会促使其分泌诸如PGE-2、IDO、TGF-β等抑制T细胞激活和功能的抑制因子。一些相关动物实验还证实, MSCs能抑制记忆T细胞对相应抗原的应答。

此外, 研究表明, MSCs对其它免疫细胞也有一定的调节作用。比如, MSCs可以通过分泌INF-γ来抑制B细胞的增殖, 还可以削弱B细胞分泌抗体以及迁移的能力;再如, MSCs通过分泌TGF-β、s HLA-G和PGE-2来抑制白介素-2介导的自然杀伤 (NK) 细胞的增殖, 亦能干扰NK细胞的细胞杀伤功能;MSCs还能抑制CD14阳性的单核细胞和CD34阳性的祖细胞分化成树突状细胞, 而树突状细胞恰好是初级免疫系统的重要成员。我们知道, 在心梗的初期, 梗死区的心肌细胞会大量死亡, 诱发免疫细胞浸润以清除死亡细胞的碎片, 但这种免疫反应往往能造成对正常细胞的伤害, 使得心梗症状进一步加重, 所以抑制过分的炎症反应也成为缓解心梗症状的关键之一。MSCs的免疫调节功能使得其在体内不但能缓解免疫系统对自身的攻击, 也能缓解炎症反应对周边组织的侵扰。

3 目前临床应用的比较成熟的干细胞

基础研究的目的是为了给临床诊治提供更可靠可行的治疗策略和方法。很多科研小组已经开始着手进行临床研究。由于全能干细胞的伦理争议以及安全性因素, 对于干细胞的临床应用主要集中在成体干细胞, 尤其是骨髓源性的干细胞。

2002年, Strauer等[49]在Circulation上最早公开发表了临床上应用BMSCs移植治疗MI的文章。他们首次[49]向10位严重MI患者的冠状动脉内注射自体骨髓单核细胞, 3个月的随访显示患者的心梗面积均有不同程度的减小。同年, 另一组研究人员率先开展了EPCs的临床应用研究 (即TOPCARE-AMI临床试验) , 通过冠状动脉移植骨髓或外周血来源的EPCs对20例AMI患者进行治疗, 术后随访4个月的结果表明两种来源的EPCs对AMI的疗效相似, 左心室射血分数随时间延长而改善, 并且未引起炎症反应或心律失常[50], 1年后接受治疗的患者增加到59例, 治疗组的心功能有显著改善, 梗死面积缩小, 其中只有1例患者死于心源性休克, 其他未发现有心律失常、心肌肥大等症状[51]。对55例临床试验患者进行长达5年的随访发现, 期间有3例患者去世, 未发现心肌钙化或肿瘤生成, 存活的患者心功能改善依然明显, 并且其中一部分成功实现了血管化, 为冠脉移植干细胞治疗MI具有长期有效性和安全性提供了非常可靠的证据[52]。目前有四组正在进行的CSCs自体移植治疗缺血性心肌病或MI的临床试验, 细胞来源为心脏活检组织或右心耳培养得到的祖细胞, 初期结果显示有16例患者的心功能得到改善, 梗死面积也有所下降[53]。某临床试验已证实利用骨骼肌成肌细胞治疗缺血性心力衰竭患者方法的可行性[54]。

4 问题与展望

虽然干细胞移植策略在MI治疗的基础研究上取得了一些令人兴奋的进展, 但距离其在临床上大范围应用仍有很长一段路要走。目前为止, 已发现的可用于治疗MI的干细胞都有其自身难以逾越的障碍限制其在临床上的应用。MSCs治疗MI已经在临床上得到应用, 部分患者在接受MSCs移植后MI症状得到一定的缓解, 正如前文所述这种改善效果多来自于MSCs强大的旁分泌功能, 由于其自身的分化能力较弱, 它在恢复患者心功能发面表现不佳。ESCs具有最为强大的分化能力, 但由于其潜在的形成畸胎瘤的风险以及免疫排斥效应, 限制了其在临床上的应用[55]。相比之下, 由患者自身的细胞重编程得到的iPS能较好的解决免疫排斥的问题, 但其潜在的安全风险亦不容忽视。除此之外, 还有前文介绍的一些其它成体干细胞被用来治疗MI, 如CSCs、EPCs、HSCs等, 亦能在一定程度上缓解MI症状, 但都存在自身难以克服的弊端, 如CSCs虽然可分化多种细胞 (如心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等) , 但较难以获得;EPCs只能有助于恢复梗死区血供而对心功能恢复无能为力[56];骨骼肌成骨细胞可部分恢复心功能但亦能造成心律不齐[34]。

此外, 移植途径也是关乎干细胞能否充分发挥治疗功能的关键因素。目前, 干细胞移植治疗MI的方法主要有三种:静脉注射、冠状动脉注射以及心肌注射。移植途径的选择关乎细胞移植后在梗死区的存留率, 如心肌原位注射, 许多细胞会进入循环系统而丢失。此外, 由于梗死区内缺乏血液供应, 且有大量炎性细胞浸润, 这种极端的环境对移植细胞的生存是极为不利的。有研究表明多达90%以上的移植干细胞在1周内死亡。因此重建梗死区血供、减少梗死区炎性细胞浸润成为提高干细胞移植治疗MI治疗效果的首要问题。目前, 将细胞和生物材料共移植或是细胞和某些生长因子联合移植可显著提高细胞在梗死区的存活率, 进一步增强干细胞的治疗效果。

干细胞心肌修复研究 篇5

1 骨髓间充质干细胞 (MSCs)

MSCs是存在于骨髓中的非造血干细胞, 是中胚层发育的早期细胞, 具有多向分化潜能, 不仅能分化为造血实质, 支持造血, 还可分化为多种造血以外的组织细胞, 特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞。在实验条件控制下能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞和心肌细胞[1,2]。

2 MSCs的分离方法

2.1 贴壁筛选法

抽取骨髓后直接加入培养基, 制成细胞悬液, 以合适的细胞浓度接种培养。培养在早期可混杂多种细胞, 红细胞由于不贴壁随着换液不断被清除;混杂的巨噬细胞、造血细胞、脂肪细胞等可以在传代时利用其与培养介质贴附牢固而MSCs在消化酶的作用下较快与培养皿分离的特点进行纯化。此法虽相对粗糙, 但操作简便, 分离到的细胞分化潜能较好。

2.2 梯度离心法[3]

根据骨髓中细胞成分比重的不同, 分离含有MSCs的单个核细胞群, 再在塑料培养瓶中贴壁培养。但是, 不同密度的分离液比重的微小差别可能筛选不同的细胞群, 对MSCs的纯度影响亦较大。Manas等[4]比较Percoll和Ficoll分离的骨髓标本, 结果表明在外观上Percoll分离者形态均匀, CD14/CD34/CD45均阴性, Ficoll分离者CD34阴性、而CD14/CD45均阳性。国内也有研究发现, 用Ficoll (1.077 g/m L) 分离人骨髓后, 相当部分细胞呈现CD44-/HLA-DR+, 表明有成纤维细胞混入到单核细胞中;而用Percoll (1.073 g/m L) 分离, 细胞较为均一, 具有独特的表型及化学特征[5]。

2.3 免疫或流式细胞分离法

通过MSCs表面带有或缺失的抗原成分进行正选或负选, 从而获得相对较纯的MSCs。有研究用CD105包被免疫磁珠, 经双抗体程序 (DAP) 和单抗体程序 (SAP) 分别分选人CD105+MSCs, 表明SA法分选效率较高[6]。Kopen等[7]用免疫磁珠分选小鼠CD11b+MSCs, 亦获得较高的分选效率。Orilic等[8]用免疫磁珠结合流式细胞仪, 从骨髓分选Linc-kit+细胞获得更高的效率和专一性, 但分选过程中的机械剪切力和高能激光可能对MSCs有一定损伤。Vlasselaer等[9]发现经流式细胞仪分离到的Sca-1阳性MSCs, 培养过程中大多数不贴壁, 并在24 h内死亡, 且成骨分化活性很低。

3 将MSCs诱导分化为心肌细胞的方法

3.1 化学试剂诱导

Makino等[10]在体外实验中利用5-氮胞苷将永生型骨髓间充质干细胞诱导分化为成心肌细胞系细胞。发现当用3 mol/L的5-氮胞苷诱导细胞24 h后, 即可在显微镜下观察到能够自发性跳动的细胞亚克隆, 这些亚克隆被命名为成心肌细胞系细胞。国内学者多数认为10 mol/L 5-氮胞苷诱导分化的阳性率最高。此外, Shim等[11]利用含有抗坏血酸、胰岛素和地塞米松的培养基培养骨髓间充质干细胞5～6代后, 亦将骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞。

3.2 体外微环境培养

3.2.1心肌细胞培养液:

龚觉晓等[12]将新生1～3 d内的SD大鼠乳鼠用胰蛋白酶解法将心室肌消化成细胞悬液, 差速离心分离出心肌细胞培养液成功诱导MSCs分化成为心肌样细胞,

3.2.2心肌细胞裂解液:

吕学翔等[13]将生长较好的第1、2代心肌细胞制成106/m L的细胞悬液, 迅速置于-70℃冰箱中, 4～5 h后取出融化, 用吸管反复吹打细胞悬液, 如此反复3次后将细胞裂解液在2 000 r/min的条件下离心10 min, 将上清用0.45μm的滤器过滤后在其内成功诱导MSCs分化成为心肌样细胞。

3.3 心肌细胞培养液与化学诱导剂相结合

Cheng等[14]将人心肌细胞条件培养基与普通的细胞生长培养基按一定比例配制成心肌细胞分化诱导培养基。在利用心肌细胞分化诱导培养基开始对脐带血中的MSCs进行诱导分化培养时, 同时给予10μmol/L的5-氮胞苷进行诱导24 h, 结果14 d后, MSCs分化为心肌细胞的比例较上述几种办法明显增高, 转化率高达70%左右。

4 诱导后MSCs的细胞形态学变化及心肌特性检测

4.1 形态学变化

MSCs诱导分化培养基刺激孵育24 h, 一般从第3 d开始, 可见MSCs的自我修饰现象, 即细胞的伪足渐渐回缩, MSCs由螃蟹样的多伪足形态逐渐转变为橘子样形态。随着诱导时间的延长, 逐渐转变为纺锤形、梭形的心肌纤维样细胞。

4.2 免疫组化检测

用免疫组化方法检测心肌的一些特异性蛋白, 如横纹肌肌动蛋白, 是分布于肌节Z线处的细胞骨架蛋白, 主要存在于胚胎及新生动物心肌中, 具有收缩功能, 分布广泛;c Tn T是心肌特异性肌钙蛋白T, 是心肌细胞中一种调节蛋白, 在钙离子参与下调节、控制收缩蛋白的舒缩活动。此外细胞心肌特异性结构蛋白还有Troponin-T、Connexin 43, 心钠素 (Atrial Natriuretie Peptide, ANP) 、脑钠素 (Brain Natriuretie Peptide, BNP) 等。

4.3 RT-PCR检测

主要是检测一些心肌特异性基因的表达情况, 如ANP基因、BNP基因、p-MHC基因、a-心肌肌动蛋白基因和a-骨骼肌肌动蛋白基因等, 以及GATA4、TEF-1和Nkx 2.5/Csx等心肌特异性转录因子。

干细胞心肌修复研究 篇6

关键词：干细胞,胚胎干细胞,心肌细胞,定向分化,分子机制,临床应用

心血管病被称为人类健康的“三大杀手”之一,发病率逐年提高,是目前全球发病率最高的疾病。由于成年心肌细胞再生能力有限,心脏移植成为治疗慢性心力衰竭的唯一有效手段。但由于供体有限、免疫排斥、手术及术后维护价格昂贵等原因,使得心脏移植手段不能在患者中大规模实行。因此,临床上迫切需要一种更好的治疗方法。 人类胚胎干细胞( hESCs) 的研究使心脏病患者看到了希望,是近年来医学及生物研究领域的热点和前沿。目前,胚胎干细胞可以被诱导分化为心肌细胞［1］,移植到体内具有很强的扩增能力并能够行使一定的生理功能［2］,而基于细胞的心脏治疗已经进入二期和三期临床试验。人类胚胎干细胞系的建立及向心肌细胞诱导分化的研究为再生医学的临床应用提供了新的细胞来源,为hESCs分化为心脏的基因表达和功能研究奠定了基础。

1 hESCs定向分化为心肌细胞的分子机制

由hESCs诱导为心肌细胞时可通过多种途径,包括生长因子诱导分化、转基因分化、END - 2 细胞共培养等。通常以悬滴培养制备拟胚体( EBs) ,然后经过贴壁培养诱导得到具有自主节律收缩的EBs和心肌细胞,见表1。

注: 资料来源于参考文献[3]。

心肌细胞的搏起频率在不同时期存在变化,直接贴壁法诱导分化的心肌细胞在第11 ~ 15 d是细胞团出现跳动的主要时间区,平均跳动频率为( 63. 0 ±7. 0) 次/ min,持续跳动时间能维持3 个月以上［4］。对小鼠胚胎干细胞分化的研究发现,贴壁时间是影响分化的重要因素,4 d内贴壁可以显著抑制其向心肌分化,其机制可能是EBs贴壁激活了酪氨酸蛋白激酶( Src)［5］。

hESCs的分化还受离子通道、收缩反应、细胞受体、电刺激等因素协同作用。在研究周期性拉伸对心肌细胞作用时发现,钠离子电压门控通道Nav1. 5 表达上调5. 25 倍,钾离子通道Kir2. 1 则上调3. 23倍［6］。说明功能性心肌细胞的形成与离子通道和细胞收缩现象的出现密不可分。肾上腺素的刺激效应能够被其受体阻滞剂所阻断,乙酰胆碱能降低心肌细胞的搏起频率并且高浓度时能使心肌细胞停搏,因此心肌细胞的搏动频率能够被不同受体所控制［7］。此外,在一定电刺激环境下可以促进心肌细胞特异性基因HCN1、MLC2V、SCN5A、SERCA、Kv4. 3 和GATA4的表达,从而促进心肌细胞的分化和成熟［8］。

2 hESCs及来源于hESCs的心肌细胞在药物发现、筛选和毒性检测中的作用

药物开发中毒性检测是必要步骤,而对心肌细胞毒性的检测是极其重要的一个环节。人类胚胎干细胞诱导的心肌细胞( hESC - CMs) 在体外培养条件下,功能性离子通道数目增加,心肌细胞特异性基因MLC - 2a、ANF、α - MHC等表达量增加,在肌动蛋白和电生理特性上相当于幼稚型心肌细胞,能够用于药物的筛选,并且不存在伦理问题,试验周期短,成本低,容易建立体外模型。心肌药物筛选着重于对心肌细胞电生理、收缩特性及心肌损伤标志物的检测。

心肌细胞的电生理现象主要包括动作电位、离子电流、细胞耦联等。通常通过对最大舒张电位、极化速率、动作电位时程、动作电位振幅、搏动频率、去极化速率等研究来反映心肌细胞的生理状态。其中离子电流是hESC - CMs搏动的基础,任何影响离子通道的药物均可引起心律失常。如L - 型钙离子通道阻滞剂硫氮酮能够降低hESC - CMs的搏动频率甚至使其停搏［9］。hERG ( IKr) 通道在动作电位复极时起着重要作用,E - 4031 是该通道抑制剂,可以使场电位时程( FPD) 延长,降低hESC - CMs的搏动频率［10］。此外还有研究发现,某些心脏药物如奎尼定、丙胺苯丙酮可以增加搏起频率,而普鲁卡因、美西律、氟卡尼则没有类似的效用。由此可见,hESC - CMs对心率不齐药物敏感,可用来评价药物导致的心律不齐等毒性。

而对我国传统中药的研究发现,黄芩、葛根、丹参、银杏等中药的有效成分黄酮苷可以改善小鼠心脑血管系统,促进hESC - CMs的形成; 人参、三七等中药的有效成分皂苷可以抗心肌缺血,促进心肌局部糖皮质激素的分泌,从而诱导胚胎干细胞分化为心肌样细胞［11］。因此,由我国传统中药提取的有效成分可以作为现在流行西药的发展和补充。

3 hESCs及其诱导的心肌细胞在再生医学研究中的应用

hESCs具有分化的全能性,在体外可以被诱导分化为多种类型的心脏细胞,包括心室肌、心房肌、结细胞及浦肯野细胞,因此hESCs在心肌修复及心肌再生方面有重要应用价值。基于hESCs、hESCs源性心肌细胞的细胞治疗及体外构建三维组织,经组织移植进行心肌的修复与再生。细胞移植受到普遍关注,如在心肌梗死动物模型中,患心肌梗死的猪在第14 天通过胸腔镜引导注射hMSCs至梗死边缘区,进行心脏梗死面积和血流动力等方面的观测研究,结果一段时间后心梗面积减少,心脏收缩和舒张恢复良好［12］。心肌组织移植是将hESCs与具有良好的生物相容性和一定生物力学特性的支架材料复合,在体外或者体内构建出可供移植的组织物。因此,得到良好的支架材料是其应用的重点,而腹膜高度血管化,经适当处理后得到的大网膜可以作为心肌细胞的支架,其保留的血管网、黏附分子及糖胺聚糖有利于心肌细胞血管网的重建。最近研究发现,将新生大鼠的心肌细胞接种到经过低渗、冷冻、解冻、脱水、脱脂、水化等步骤处理的猪大网膜基质上,在第3 天进行肌钙蛋白和胶原蛋白双染色,其共聚焦图像能够发现细胞和基质已经存在相互作用,第7 天发现组织细胞存在收缩能力,并且细胞与支架之间的间隙被逐渐填补［13］。不管对于细胞移植还是心肌组织移植,它们在试验中的良好表现均预示了其在将来临床应用中具有美好的前景。

4 hESCs及其诱导的心肌细胞在应用过程中所面临的问题

干细胞心肌修复研究 篇7

1 材料与方法

1.1 中药川芎含药血清的制备

选取健康未交配过的SD雄鼠30只[许可证编号:syxk (粤) 2013-0085, 广州中医药大学实验动物中心], 个体质量 (200±10) g, 适应性饲养3 d后进行实验。将其随机分为空白对照组、低剂量组及高剂量组, 每组10只。给予大白鼠川芎水煎液灌胃 (取一定量川芎饮片置容器中, 加水没过药面, 浸泡30 min后, 煎煮3次, 60 min/次, 合并水煎液, 过滤, 浓缩至含生药1 g/m L备用) , 低剂量组的剂量约为正常用量 (0.8 g/kg) 的5倍, 为4 g/kg, 2次/d, 连续3 d;而高剂量组则为正常用量的30倍, 为24 g/kg, 2次/d, 连续3 d, 空白对照组灌生理盐水 (4 m L/kg) 。人与大鼠动物等效剂量系数由《实验动物学》可知为6.3。每次给药10 min后, 对其进行取血, 将血液静置2 h后离心 (离心条件:3000 r/min, 离心10 min) , 离心后取上清液56℃加热30 min, 过滤, 保存于-20℃。体外含药血清按20%计算[7,8,9,10]。

1.2 胚胎干细胞培养

1.2.1 来源与试剂

小鼠胚胎干细胞选自中科院生化细胞研究所[11,12];DMEM高糖培养基、胎牛血清 (FBS) 、胰蛋白酶、明胶、β-巯基乙醇 (β-ME) 、丝裂霉素C、非必需氨基酸 (NEAA) 购自美国GIBCO公司, 白血病抑制因子 (LIF) 购自法国Millipore公司。

1.2.2 胚胎干细胞培养与诱导分化

将冻存在液氮罐中的胚胎干细胞取出, 于37℃水浴锅中迅速融化, 将细胞立即转移至10 m L的ep管中, 加入适量的培养基, 采用300 rcf, 10 min离心, 去除上清液, 加入1 m L培养基吹打, 转移细胞并进行培养, 当细胞生长至70%左右时, 对细胞进行传代。培养液分四组, 即:川芎血清低剂量组、川芎血清高剂量组、大鼠血清组、胎牛血清组, 将收集到的川芎含药血清和大鼠血清、胎牛血清, 配制成10 m L备用, 各组培养液终浓度为20%。 (1) 悬滴培养:ES细胞中加入20%川芎含药血清 (低剂量组和高剂量组) 的分化培养液, 将细胞密度设置为3.75×104/m L。细胞培养在6 cm培养皿中, 取1.6 m L细胞置于10 cm的培养皿内盖上, 将内盖翻转使其生长, 加入5 m L PBS, 孵育1 h。 (2) 悬浮培养:细胞孵育后对细胞进行观察, 控制细胞悬滴液中细胞个数为1, 第2天于倒置显微镜下观察, 每个悬滴内均含有1个, 吸去PBS, 加入分化培养基, 移至6 cm中培养, 孵育2 h。 (3) 贴壁培养:细胞培养2 d后, 观察细胞个数, 大约为10个, 接种至4孔板, 第3天时肉眼观察每个培养皿中均可见数十个EBs。分别接种至事先用明胶包被的24孔板内, 每孔中加入2 m L分化培养液。

1.3 实时定量PCR检测心肌细胞特异基因β-MHC的表达

实验细胞分四组, 即川芎血清低剂量组, 川芎血清高剂量组, 大鼠血清组和胎牛血清组, 每组6孔。提取总RNA并测定浓度, 分析其完整性, 进而合成c DNA, β-MHC Forward:5’-AGAGCTCATCCTTTCTGGTCAT-3’, Reverse:5’-ACCATCTGACATTCTACAGTCT-3’;GAPDH Forward:5’-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’Reverse:5’-ATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3’[4,5]。PCR体系为:12.5μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix, 2.5μL样品溶液, 1.0μL引物加水至25μL。反应条件:95℃下加热60 s, 进行预变性;95℃变性15 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸30 s, 如此循环40次。扩增后的产物主要是采用荧光检测, 用ABI 7500 Software v2.0软件对其进行分析, 绘制曲线表, 计算Ct值, 对系统数据处理后可以得出不同浓度对于细胞分化的影响。

1.4 统计学处理

使用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计学分析, 计量资料以表示, 比较采用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 比较采用字2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 川芎诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化

细胞培养2 d后呈密集状态, 一般为圆形, 细胞界限和形态不明显 (图1) ;体外细胞个头小, 但生长速度快 (图1~2) 。川芎分化液培养3 d的胚胎干细胞会收缩配体, 导致培养时间增加, 收缩越明显, 则时间越长。自发节律性收缩区域较大, 且细胞形态较单一 (图3~4) 。于细胞培养的第3 d可见零星EB球发生自发性节律性跳动, 5 d时约有70%的EB球出现节律性跳动, 低、高剂量川芎血清组 (图3~4) EB球发生自发性节律性跳动的细胞数量明显多于胎牛血清 (图1) 和大鼠血清组 (图2) 。

2.2 实时定量PCR检测心肌细胞特异基因β-MHC的表达

川芎低、高剂量含药血清组β-MHC表达量均明显高于胎牛血清组和大鼠血清组, 比较差异均有统计学意义 (P<0.05) ;川芎低剂量组β-MHC分化率明显高于高剂量组, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

* 与胎牛血清组和大鼠血清组比较，P<0.05；△与川芎高剂量组比较，P<0.05

3 讨论

随着人们生活水平的进步, 大部分人均处于亚健康状态, 心血管疾病是临床上常见的疾病。心血管疾病的临床突破主要来自胚胎干细胞的发展, 胚胎干细胞会根据诱导自发分化成多种细胞, 如心肌细胞和血管内皮细胞等[13,14,15]。心肌细胞对于恢复正常供血、免疫功能均有重要的意义[16,17]。一般情况下, 胚胎干细胞能够自然分化, 但分化率低, 因此提高分化率显得至关重要。临床上对于胚胎干细胞的研究较为广泛, 但是研究方向各不相同, 关于中药的研究更是凤毛麟角, 因为涉及人体、细胞、动物等各个方面, 给研究工作带来了一定的困难, 但也有部分学者取得了可喜的成果[18,19]。有研究方向为将细胞采用不同密度制成悬浮液, 采用不同的方法和改变环境进行培养, 分析其分化成心肌细胞的分化率。最后对具有促进分化功能的中药进行相关的安全性评价, 致力应用于临床。川芎是伞形科藁本属植物, 经研究表明, 其具有多种临床功效, 如使血管扩张、增加脑部血流量、改善供血、降低血液黏稠度及改善心肌缺血[20]。本课题组在研究川芎含药血清的胚胎毒性时发现川芎含药血清对胚胎干细胞转化为心肌细胞有促进作用 (P<0.05) , 而且尤以低剂量组为明显, 遂建立川芎诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化方法, 可以提高胚胎干细胞的分化率, 有利于体外获得相关的大量心肌细胞, 将其应用于临床研究以及药物的研发和筛选。

摘要：目的:探讨川芎含药血清诱导小鼠胚胎干细胞 (ES) 分化为心肌细胞的特征, 建立简便、高效的定向诱导ES细胞向心肌细胞分化的体系。方法:观察川芎含药血清作用下ES细胞活性, 诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的类胚体出现, 第5天达到高峰, 约有70%的拟胚体产生跳动。用RT-PCR法在跳动的拟胚体中检测心肌细胞特异性标志物β-MHC的表达。结果:川芎含药血清培养下的细胞β-MHC的表达水平和分化率均明显升高, 与大鼠血清组和胎牛血清组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。结论:川芎含药血清可明显提高体外诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化的效率。

干细胞心肌修复研究 篇8

1 资料与方法

1.1 一般资料

新生乳鼠 (北京大学深圳医院动物中心) ;胎牛血清;DMEM培养基;HGF;H2O2;凋亡试剂盒;5-溴脱氧尿嘧啶;一抗;二抗;α-sarcomeric actin。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞分离培养

分步消化、差速贴壁、化学抑制法分离纯化新生SD大鼠心肌细胞后代作原代培养;已培养48h的心肌细胞饥饿处理8 h后, 分为两组:对照组加入终浓度为0.5 mmol/L的H2O2培养4 h, 研究组加入终浓度为0.5 mmol/L的H2O2和40 ng/ml HGF培养4 h。

1.2.2 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率

根据Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒使用说明, 贴壁的心肌细胞经胰酶消化后, PBS洗涤2次, 收集1×105个细胞, 加入5000μl L1x Binding buffer重悬细胞, 再加入5μl Annexin V-FITC与5μl Propidium Iodide (PI) 充分混匀, 室温避光孵育15min, 流式细胞仪分别检测对照组和试验组心肌细胞凋亡率, 每组各检测5个样本。

1.2.3 Western-bolt法观察细胞信号转导相关蛋白表达

获得的各组细胞分别提取总蛋白, 取适量 (约20μg) 蛋白, 98℃变性5 min, 12%SDS-PAGE分离, 电转移到聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上。含5%脱脂奶粉缓冲生理盐水 (TBS/T) 封闭1 h, 加入一抗 (1:1000) , 4℃过夜, TBS/T洗3次, 加入二抗 (1:2000) 孵育1 h, TBS/T洗3次, 加入HRP化学发光底物, 压胶片曝光。

1.2.4 使用lipofectamin2000转染

转染前1 d, 将0.5×105~2×105个细胞接种于培养板中, 每孔中加入约1 ml无抗生素的培养基, 使转染时的细胞密度能够达到30%~50%;取5μl/孔Lipofectamine2000, 100μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀释。轻轻混和后在室温孵育5 min;取5μl FAM-si RNA, 稀释, 轻轻混和均匀;稀释的经过5 min的孵育后, 与稀释FAM-si RNA轻轻混和, 室温静置20 min, 形成FAM-si RNA-转染试剂混和物。将FAM-si RNA-转染试剂混和液, 加入含有细胞及培养液 (约含1 ml) 的孔中, 轻轻摇晃孔板, 使混和;转染6 h后即可检测转染效率:流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等。

1.3 统计学方法

采用SPSS18.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 实施t检验;计数资料以率 (%) 表示, 实施χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

与对照组相比, 研究组HGF可以显著减少 (P<0.05) , H2O2处理引起的心肌细胞凋亡, 检测显示心肌细胞内FOXO3a含量基本无变化, 磷酸化的FOXO3a的含量随时间变化有所增加, 提示HGF的保护作用可能与FOXO3a的磷酸化增加有关。敲除FOXO3a基因后, HGF抑制心肌细胞凋亡的能力与显著减低, 进一步表明HGF抑制心肌细胞凋亡的作用机制可能主要通过PI3K/Akt/FOXO3a途径, 磷酸化心肌细胞中FOXO3a, 使其活性减低, 从而抑制心肌细胞凋亡发生, 而起到对心肌细胞的保护作用。

3 讨论

FOX各家族功能多种多样, 包括各种转录因子、参与细胞增殖、转化及分化过程。作为FOX家族的亚组, FOXO在新陈代谢、细胞增殖、细胞存活及对氧化应激的反应等生物进程中起重要作用。哺乳动物FOXO蛋白质家族有4个成员:FOXO1、FOXO3A、FOXO4和FOXO6。其中FOXO3A在细胞、组织与胚胎的发育、体内葡萄糖内稳态、卵泡的成熟、细胞增殖、细胞凋亡、对DNA的损伤反应等过程中发挥重要作用。心脏组织以FOXO3A分布为主, 在心肌细胞凋亡中发挥重要作用[2]。活化FOX03A能抑制血管平滑肌增殖, 抑制心肌细胞增生肥大及抗氧化应激等。非磷酸化状态的FOXO3A为活性转录因子, 主要存在心肌细胞核中, FOXO3A磷酸化后与细胞核内的结构蛋白结合, 由细胞核内转移到核外, FOXO3A丧失转录活性, 其抗细胞增殖, 抗心肌肥厚等作用均被抑制[3]。研究发现HGF抑制心肌细胞凋亡损伤, 使心肌细胞中的FOXO3A磷酸化增加, 提示HGF促进FOXO3A的磷酸化可能与其对心肌细胞凋亡的保护作用相关。

摘要：目的 分析肝细胞生长因子 (HGF) 对于心肌细胞凋亡的保护作用机制。方法 分离培养乳鼠心肌细胞, 将培养的乳鼠心肌细胞饥饿处理8 h后, 采用流式细胞仪观察HGF减少过氧化氢 (H2O2) 引起的心肌细胞凋亡的保护作用, 计算凋亡细胞百分率;采用蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白FOXO3a变化;并观察使用lipofectamin2000转染技术敲除FOXO3a基因后, HGF对H2O2引起心肌细胞凋亡保护作用的变化。结果 与对照组相比, 研究组HGF可以显著减少, H2O2处理引起的心肌细胞凋亡, 检测显示心肌细胞内FOXO3a含量基本无变化, 磷酸化的FOXO3a的含量随时间变化有所增加。而在敲除FOXO3a基因后, HGF抑制心肌细胞凋亡的能力显著减低。结论 HGF抑制心肌细胞凋亡损伤, 使心肌细胞中的FOXO3a磷酸化增加, 提示HGF促进FOXO3a的磷酸化可能与其对心肌细胞凋亡的保护作用相关。

关键词：肝细胞生长因子,心肌细胞凋亡,保护作用

参考文献

[1]刘峰.高血压的心脏并发症.中国实用内科杂志, 2002, 22 (4) :11.

[2]姜勇, 罗深秋.细胞信号转导的分子基础与功能调控.北京:科学出版社, 2005:74.