心肌肥大

心肌肥大（通用4篇）

心肌肥大 篇1

醋柳黄酮 (total flavones of hippophae rhamnoides, TFH) 是以沙棘果实和叶为原料, 经提取加工而制成的天然成分制剂, 其主要包括槲皮素 (quercetin, Quer) 及其苷和异鼠李素 (isorhamnetin, Isor) 及其苷。心肌重塑是多种心脏疾病的共同病理过程, 而心肌肥大是心肌重塑中非常重要的表现形式。国内外的临床及实验研究提示TFH及其单体对心肌肥大有确切的抑制作用, 但是对其抑制心肌肥大作用的机制研究仍较少。有研究表明[1], 由Ca2+活化的、钙调神经磷酸酶 (calcineurin, Ca N) 介导的信号途径在心肌肥大发生发展中起着至关重要的作用。本实验旨在研究TFH及其单体对心肌肥大抑制作用的机制否与钙调神经磷酸酶信号通路相关, 以便为TFH及其单体的心血管保护机制提供合理解释和新的视野, 为其临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器

1~3 d清洁级新生SD大鼠 (泸州医学院实验动物房) , 高糖DMEM及胎牛血清 (Hyclone) , 血管紧张素II (angiotensin II, AngⅡ) (Sigma) , 醋柳黄酮 (四川美大康药业) , 槲皮素、异鼠李素、缬沙坦 (中国药检所) , 钙调神经磷酸酶测定试剂盒 (南京建成科技有限公司) , Rever Tra Ace组合型RT-PCR试剂盒 (成都博瑞克生物技术有限公司) , 紫外-可见分光光度计 (岛津) , 全自动酶标仪 (芬兰LABSYSTEM) , ND-1000核酸蛋白检测仪 (美国Nanodrop公司) , Mastercycler gradient PCR仪 (eppendorf) 。

1.2 心肌细胞培养与实验分组

无菌条件下取1~3 d新生SD大鼠心室肌, 0.125%胰酶+0.08%Ⅱ型胶原酶分次消化至单细胞悬液, 离心, 弃上清, 用10%完全培养基制成细胞悬液, 二氧化碳孵箱中差速贴壁1.5 h, 吸取未贴壁的心肌细胞进行计数, 然后按不同实验目的调节细胞接种密度接种培养。心肌细胞培养72 h, 换无血清培养基同步化24 h后, 各组加入不同药物孵育24 h。实验分组: (1) 对照 (Control) 组:不加任何处理因素, 与加入处理因素的组别共同进行换液处理; (2) AngⅡ10-6mol/L组[2]; (3) 槲皮素 (Quer) 组:槲皮素100μmol/L[3]+AngⅡ10-6mol/L; (4) 异鼠李素 (Isor) 组:异鼠李素100μmol/L[4]+AngⅡ10-6mol/L; (5) 醋柳黄酮 (THF) 组:醋柳黄酮100 mg/L[5]+AngⅡ10-6mol/L; (6) 缬沙坦 (Valsartan) 组:缬沙坦10-6mol/L[6]+AngⅡ10-6mol/L。

1.3 心肌细胞纯度检测与鉴定

倒置显微镜下, 通过形态和搏动情况判定心肌细胞与非心肌细胞的数量变化;然后取有心肌细胞生长的玻片进行抗α-actin免疫组化细胞学鉴定, 细胞质被染成棕黄色者为心肌细胞, 并照相保存。

1.4 细胞表面积测定

每孔细胞随机选取5个视野, 每个视野选取5~10个细胞, 重复8次。在400×显微镜视野下照相 (包括微标尺) 保存, 再应用Image-Pro Plus软件测量心肌细胞表面积。

1.5 心肌细胞总蛋白测定

心肌细胞消化、离心, 加入RIRA裂解缓冲液, 超声破碎细胞, 取细胞裂解液按考马斯亮兰蛋白浓度测定试剂盒说明书操作。

1.6 肌浆网钙泵 (SERCA) 活力测定

在波长410 nm处测定不同浓度PNP标准溶液的吸光度, 作标准曲线。细胞匀浆液冰上裂解细胞;向细胞裂解液中加入反应液, 37℃恒温水浴箱中预温10 min;再向管中加入100 mmol/L p NPP, 37℃恒温水浴箱中反应30 min;然后加入2倍反应体积的冷缓冲液终止反应, 在波长410 nm处测OD值。

1.7 钙调神经磷酸酶 (Ca N) 活性测定

先获取细胞裂解液, 然后取上清液按照钙调神经磷酸酶测定试剂盒说明书进行操作。

1.8 RT-PCR法检测Ca N m RNA的表达

按说明书操作提取纯化心肌细胞总RNA, 用RT-PCR试剂盒检测心肌细胞Ca N m RNA的表达情况。运用Primer 5.0和Olig 6.0软件分别在Ca N (XM_002745551.1) 和内参照GAPDH基因的CDS区内设计合成一对特异性引物, 送上海生物工程有限公司合成, 引物序列见表1。

(1) 逆转录反应条件:30℃10 min, 42℃20min, 99℃5 min。 (2) PCR反应条件:94℃2 min;94℃30 s, 65℃30 s, 72℃30 s 3个循环;94℃30 s, 64℃30 s, 72℃30 s 3个循环;94℃30 s, 63℃30s, 72℃30 s 3个循环;94℃30 s, 62℃30 s, 72℃30 s 21个循环;72℃2 min。将扩增产物, 进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳, 以DNA marker I为分子量参照标准, 凝胶成像系统下观察记录结果。用凝胶定量分析软件Gel-Pro analyzer 4.0检测RT-PCR扩增产物电泳条带的光密度值, 分析计算基因相对表达值, 实验重复6次。

1.9 统计方法

运用SPSS 13.0软件, 方差齐性检验后多组间的比较采用单因素方差分析法, 多组间的两两比较采用S-N-K法或Dunnett法, 实验结果以均数±标准差 (±s) 表示。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 心肌细胞纯度检测与鉴定

在培养3~5 d后, 相差显微镜下绝大多数为已搏动的心肌细胞和心肌细胞团, 成纤维细胞无明显增殖。细胞经抗α-actin免疫组化细胞学鉴定显示:细胞质内可见棕黄色丝状物者为抗α-actin免疫细胞化学染色阳性, 本实验细胞抗α-actin免疫组化均为阳性, 见图1A~C。

A:×200倍;B:×400倍;C:×100倍

2.2 心肌细胞表面积

与空白对照组相比, Ang II可以使大鼠心肌细胞表面积显著增加 (P<0.01) , 其他组与空白对照组的差异无显著性 (P>0.05) 。而应用TFH及其单体与缬沙坦等药物后, 可抑制Ang II诱导的心肌细胞表面积增大 (P<0.01) , 但TFH、Quer、Isor与Valsartan之间差异无显著性 (P>0.05) , 见表2。

注:1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与Ang II组比较, P<0.01

2.3 心肌细胞总蛋白含量

与空白对照组相比, Ang II组心肌细胞总蛋白含量明显增加, 从 (2.63±0.79) ng/well升高到 (4.61±1.42) ng/well (P<0.01) ;其他组与空白对照组无显著性。与Ang II组相比, Valsartan组、TFH组心肌细胞总蛋白含量明显减少 (P<0.01) ;Isor组心肌细胞总蛋白含量从 (4.61±1.42) ng/well下降到 (3.25±0.94) ng/well (P<0.05) , Quer组心肌细胞蛋白含量从 (4.61±1.42) ng/well下降到 (3.41±0.75) ng/well (P<0.05) 。而Valsartan组、Quer组、TFH组及Isor组相互之间相比差异无显著性 (P>0.05) , 见表3。

注:1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与Ang II组比较, P<0.01;3) 与Ang II组比较, P<0.05

2.4 心肌细胞SERCA活力

与Control组相比, Valsartan组、TFH组、Quer组和Isor组心肌细胞SERCA活力的变化差异无显著性 (P>0.05) ;Ang II组心肌细胞SERCA活力明显下降了42.57%, 差异有显著的显著性 (P<0.01) 。与Ang II组相比, Valsartan组心肌细胞SERCA活力提高了56.36% (P<0.05) , TFH组SERCA活力提高了49.15% (P<0.05) , Quer组SERCA活力提高了50.42% (P<0.05) , Isor组心肌细胞SERCA活力提高了44.49% (P<0.05) 。而Valsartan组、TFH组、Quer组、Isor组各组两两相比心肌细胞SERCA活力的变化差异无显著性 (P>0.05) , 见表4。

注:1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与Ang II组比较, P<0.05

2.5 心肌细胞Ca N活性

与Control组相比, TFH组、Quer组、Valsartan组Ca N活性的升高差异无显著性 (P>0.05) , Ang II组的心肌细胞Ca N活性升高差异有显著性 (P<0.01) , Isor组心肌细胞Ca N活性升高了49% (P<0.05) 。与Ang II组相比, TFH组、Quer组、Valsartan组、Isor组Ca N活性下降差异有显著性 (P<0.05) , 但它们各组两两之间差异没有显著性 (P>0.05) , 见表5。

注:1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与对照组比较, P<0.05;3) 与Ang II组比较, P<0.05

2.6 心肌细胞Ca Nm RNA的表达

Ca N基因在不同组大鼠心肌细胞中的表达明显不同 (P<0.05) , Ang II组的表达量最高 (1.84±0.11) , 对照组组的表达量最低 (1.15±0.07) ;在分别预先加入不同TFH及其单体等药物后, 再加入Ang II处理, Ca N的表达与Ang II组相比均出现明显下降 (P<0.01) , 其中Isor组抑制效果最差, 与Valsartan组之间的差异存在显著性 (P<0.05) ;而其余各组两两比较抑制效果差异性不明显, 无显著性 (P>0.05) , 见图2和表6。

注:1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与Ang II组比较, P<0.01;3) 与Valsartan组比较, P<0.05

1:Control组;2:Ang II组;3:Isor组;4:Valsartan组;5:Quer组;6:TFH组;7:不加模板的阴性对照

3 讨论

实验显示TFH及其单体槲皮素与异鼠李素对血管紧张素II (Ang II) 诱导的新生大鼠的肥大心肌细胞有明显的抑制作用, 且与缬沙坦基本等效。实验结果与国内的报道相近:QIN TAI-CHUN等[3]在培养原代大鼠心肌细胞的基础上, 用血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌细胞肥大为模型, 发现1~100μmol/L的槲皮素可以按浓度依赖的方式抑制大鼠心肌细胞肥大。毛张凡等[7]通过Ang II制备心肌肥厚的SD大鼠模型, 研究发现五甲基槲皮素 (PMQ) 能明显抑制Ang II所致SD大鼠的左心指数并且能抑制与心肌肥厚相关的BNPm RNA表达上调;WU等[8]在研究槲皮素对心肌肥大的防治作用及其机制中发现:Ang II可诱导新生SD大鼠心肌细胞肥大, 与氧化应激有关, 而槲皮素可以抑制其肥大;高天林等[9]在研究醋柳黄酮对高血压大鼠心血管重塑的影响中发现TFH对高血压及其导致的心肌肥厚均有确切的逆转作用, 且与卡托普利等效。

国内外还暂无醋柳黄酮及其单体抑制心肌细胞肥大机制与Ca N信号通路有关的研究报道, 而本实验发现TFH及其单体对Ang II诱导新生大鼠心肌细胞肥大的保护作用可通过SERCA和Ca N相关路径来实现。Ca N信号通路在细胞内Ca2+增高诱导的心肌肥大发生发展过程中起关键性作用[10], Ca N是目前所知的体内受Ca2+/Ca M调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶[11], 而Ca N对舒张期持续升高的Ca2+浓度更敏感[12], 在胞内Ca2+增加时, Ca2+与Ca M结合, 激活Ca N。肌浆网是调节胞浆内Ca2+浓度变化的主要因素, 而其上的SERCA及其调节蛋白受磷蛋白 (Phospholamban, PLB) 的作用是调控细胞钙池内钙的摄取, 以SERCA为主[13,14]。实验发现Ang II可以引起SERCA活力显著下降、Ca N活性及Ca Nm RNA的表达增加, 这些与国内外报道相符[15,16,17]。实验还发现醋柳黄酮及其单体槲皮素与异鼠李素同缬沙坦相当, 都能使下降的SERCA活力部分恢复, 并且可以抑制Ca N的活性及Ca Nm RNA的表达。这些实验结果说明Ang II可使胞质内游离钙主动转运至肌浆网内贮存的能力下降, 从而可能造成[Ca2+]i在心肌细胞胞浆内浓度增加, 从而激发Ca2+-Calcineurin-NFAT信号通路, 最终导致细胞肥大;而醋柳黄酮及其单体可能通过提高SERCA活力来稳定细胞内游离Ca2+主动转运至肌浆网的能力, 这样可以使细胞内Ca2+浓度下降, 从而降低形成钙超载的风险, 这样可以抑制Ca N信号通路, 使Ca N活性及Ca Nm RNA的表达相应降低。总之, 该实验认为醋柳黄酮及其单体槲皮素与异鼠李素抑制心肌肥厚与提高肌浆网钙泵 (SERCA) 活力及Ca N信号通路有关, 这为醋柳黄酮及其单体的心血管保护作用及临床应用提供了理论基础。

摘要：目的 研究醋柳黄酮 (TFH) 及其单体槲皮素 (Quer) 和异鼠李素 (Isor) 抑制心肌细胞肥大的机制是否与钙调神经磷酸酶 (CaN) 信号通路相关。方法 在培养原代大鼠心肌细胞的基础上, 实验采用血管紧张素Ⅱ (AngⅡ) 诱导新生大鼠心肌细胞肥大为模型, 分别加入TFH、Quer、Isor和缬沙坦 (Valsartan) 进行预防性治疗。鉴定心肌细胞, 检测心肌细胞表面积及总蛋白含量, 测定心肌细胞肌浆网钙泵 (Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPases, SERCA) 活力、CaN活性及CaN mRNA表达。结果 实验培养的心肌细胞抗α-actin免疫细胞化学染色均为阳性;AngⅡ组细胞表面积增大, 总蛋白含量增加, 与对照组相比差异有显著性 (P<0.01) ;TFH组、Quer组、Isor组和Valsartan组均能显著降低心肌细胞肥大 (P<0.01或P<0.05) 、提高SERCA活力 (P<0.05) 、降低CaN活性 (P<0.05) 及CaN mRNA (P<0.01) 表达, 而这四组之间差异无显著性 (P>0.05) 。结论醋柳黄酮及其单体 (槲皮素和异鼠李素) 与缬沙坦一样, 对AngⅡ诱导心肌细胞肥大有明显的抑制作用, 其作用机制可能与心肌细胞肌浆网钙泵活性及钙调神经磷酸酶信号通路有关。

关键词：醋柳黄酮,血管紧张素Ⅱ,心肌肥大,钙调神经磷酸酶

心肌肥大 篇2

关键词：心肌肥厚,L-精氨酸,一氧化氮

心肌肥大是高血压常见的并发症, 心力衰竭发生的结构基础, 也是心律失常等多种心血管疾病的独立危险因素。 一氧化氮 (NO) 是多种细胞均可以产生的自由基, 在全身各处广泛存在。 作为NO的前体L-精氨酸可通过拮抗氧自由基、 增加心肌组织能量代谢、增加冠脉血流量和抑制中性粒细胞聚集等对心血管系统发挥保护作用[1]。 本研究的主要目的是研究L-精氨酸干预对心肌肥大和细胞损伤的影响, 及NO和一氧化氮合酶 (NOS) 的变化, 以探讨L-精氨酸对心肌肥大的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性Wistar大鼠36 只, 体重 (200±20) g, 齐齐哈尔医学院动物中心提供。 平衡饮食一周后, 将大鼠随机分3 组, 每组各12 只:①对照组:给予0.9%氯化钠注射液[5 m L/ (kg·d) ] 皮下注射; ②模型组 (ISO组) :ISO皮下注射5 m L/ (kg·d) , 连续7 d;③L-精氨酸治疗组:ISO皮下注射5 m L/ (kg·d) 的同时给予L-精氨酸800 mg/ (kg·d) , 腹腔注射, 常规给水, 连续给药7 d[2,3]。

1.2 试剂与设备

L-精氨酸, 异丙肾上腺素 (ISO) 购于美国Sigma公司, Trizol和逆转录试剂盒购于Takala公司, Leica切片机, Leica显微镜, 电子天平;紫外-可见分光光度计 (岛津) , 乳酸脱氢酶 (LDH) 、丙二醛 (MDA) 、NO和NOS检测试剂盒购于南京建成生物公司。

1.3 样本采集

末次给药后次日, 称量大鼠体重 (BW) 后, 2%乌拉坦腹腔注射麻醉后, 取心脏组织, 称全心重 (HW) 和左室重 (LVW) , 立即投入液氮中保存。

1.4 胶原纤维染色

取心肌组织左室游离壁, 10%甲醛固定, 石蜡包埋, 常规HE和胶原纤维染色 (VG) 。 图像分析系统分析心肌间质胶原含量。

1.5 生化指标检测

剥离左侧颈总动脉, 取血。4℃, 3000 r/min离心后取上清。 用NO、NOS、MDA和LDH试剂盒测定血清中相应酶的活性或含量。 步骤完全按照试剂盒说明操作。

1.6 RT-PCR反应检测大鼠心肌组织ANP基因表达

RT-PCR按TRIzol试剂盒说明书抽提心肌组织总RNA, 紫外测定OD260/OD280的比值。 参照Takala公司说明书将RNA逆转录成c DNA, 以合成好的c DNA为模板进行PCR扩增反应。 ANP上游引物:5'-GGCTCCTTCTECATGACCAA-3';下游引物:5'-TGTTATCTTEGGTACCG-3';产物长度458 bp。 PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离, 并应用凝胶成像系统分析, 以目的片段ANP带的灰度与内参照 β-actin带的灰度之比表示ANP m RNA的表达水平。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0 对数据进行分析, 正态分布计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较采用t检验;重复测量的计量资料多组间比较采用方差分析, 两两比较采用LSD-t检验。 以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心脏重量参数的变化

大鼠心肌重量参数即心重 (左室重) 与体重的比值可作为评价大鼠心肌肥大的指标。 ISO组与对照组比较, ISO诱导大鼠心肌重量参数增加显著, 心重/体重比值为 (3.89±0.25) mg/g, 左室重/体重比值为 (2.67±0.26) mg/g, 均明显高于对照组[心重/体重比值 (3.39±0.25) mg/g, 左室重/体重比值 (2.33±0.11) mg/g], 差异有统计学意义 (P < 0.01 或P < 0.05) 。 见图1。

L-精氨酸治疗组与ISO组比较, L- 精氨酸可抑制心肌重量参数, L-精氨酸治疗后, 心重/体重比值 (3.52±0.21) mg/g和左室重/体重比值 (2.39 ±0.23) mg/g均低于ISO组 (P < 0.05) 。

注:与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01;与ISO组比较, #P<0.05;HW:心重;BW:体重;LVW:左室重

2.2 心肌组织ANP m RNA表达水平的变化

ISO组与对照组比较, ISO组心肌组织ANP基因的表达水平相对值 (1.5) 明显高于对照组 (1.0) , 差异有高度统计学意义 (P < 0.01) ;L-精氨酸治疗组与ISO组比较, L- 精氨酸治疗组ANP基因表达水平相对值 (1.2) 低于ISO组, 差异有统计学意义 (P < 0.05) 。见图2。

注:A:ANP基因表达电泳图;B:各组ANP基因水平相对值图;与对照组比较, **P<0.01;与ISO组比较, #P<0.05

2.3 心组织胶原含量的变化

心肌组织经Van Gieson染色后, 光镜下见心肌细胞呈橘黄色, 间质胶原纤维呈红色。 病理图像分析系统分析显示, ISO组与对照组比较, ISO组心肌组织间质胶原含量[ (35.24±4.78) %]明显高于对照组[ (7.02±2.13) %], 差异有高度统计学意义 (P < 0.01) ;L-精氨酸治疗组与ISO组比较, 胶原含量[ (14.52±3.09) %]低于ISO组, 差异有高度统计学意义 (P < 0.01) 。 见图3。

注:与对照组比较, **P<0.01;与ISO组比较, ##P<0.01

2.4 L- 精氨酸干预对心肌组织NO、NOS、MDA和LDH水平的影响

ISO组NO含量[ (20.96 ±5.06 ) μmol/L] 和NOS活性[ (16.58±3.12) U/m L]与对照组[NO含量 (36.72±5.32) μmol/L, NOS活性 (24.96±3.59) U/m L] 比较, 明显降低, 差异有高度统计学意义 (P < 0.01) 。 见图4。

ISO组MDA含量[ (389.63±42.85) nmol/L]和LDH水平[ (3582.89±364.51) U/L] 与对照组[MDA含量 (240.72±26.63) nmol/L, LDH水平 (1328.62±206.35) U/L]比较显著增加, 差异有统计学意义 (P < 0.05 或P <0.01) 。 与ISO组比较, L - 精氨酸治疗组NO含量[ (34.15±6.12) μmol/L]和NOS水平[ (23.99±3.12) U/m L]均增加, 差异有统计学意义 (P < 0.01 或P < 0.05) , MDA水平[ (308.73±37.48) nmol/L] 和LDH水平[ (2065.35±347.46) U/L]均降低, 差异有统计学意义 (P < 0.05 或P < 0.01) 。 见图5。

注:与对照组比较, *P<0.05, *P<0.01;与组虽ISO组比较, #P<0.05, ##P<0.05;NO:一氧化氮;NOS:一氧化氮合酶

注:与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01;与ISO组比较, #P<0.05, ##P<0.01

3 讨论

心肌肥大既是压力负荷增加时心肌组织代偿性增生的结果, 又是高血压、心律失常、心力衰竭等心血管疾病的独立危险因素。 严重影响患者的预后, 并增加死亡率[4]。 因此, 探讨心肌肥大的发病机制, 寻找有效的防治措施, 具有重要的临床意义。

ISO通过激活 β - 肾上腺素受体诱导的心肌肥大, 被认为是研究心肌肥厚的重要模型[5]。 ISO皮下注射7 d后, 心脏重量参数明显增加, ANP基因表达增高, 同时心肌间质胶原增加, 这些均表明心肌肥大模型复制成功。 LDH是催化L-乳酸与丙酮酸之间可逆反应的脱氢酶。 广泛存在于心肌、肝、骨骼肌、肺等各种组织中。 当心肌细胞受到损伤时, LDH等心肌酶从胞浆中漏出, 测定血清和组织中LDH活性可反映心肌损伤程度, 并已成为反映心肌损伤程度的敏感指标被广泛采用。MDA对心肌的毒性损伤主要与氧自由基损伤、钙超载、细胞凋亡、ADM继发代谢产物等有关。 二者联合可反映心肌组织损伤程度。 实验结果显示, ISO诱导心肌肥大的同时, 增强了血清中LDH活性和MDA含量, 表明ISO诱导心肌肥大的同时, 引发心肌组织强烈的脂质过氧化反应, 产生大量的自由基, 严重损伤心肌组织。

近年, L-精氨酸对心肌疾病的作用研究开展较多, 有助于进一步解释心肌疾病的机制, 寻找新的治疗靶点。L-精氨酸在NOS的作用下, 生成NO和L-瓜氨酸, 即L-精氨酸—NO通路。 目前认为L-精氨酸—NO通路所产生的NO主要通过自分泌和 (或) 旁分泌的方式发挥其生理效应。目前研究表明, NO供体具有减轻缺血再灌注引起的心肌细胞损伤和减轻腹主动脉缩窄大鼠心肌肥厚的作用[6,7]。 本研究结果表明, L-精氨酸干预后明显降低心脏重量参数和ANP基因表达水平, 同时又减少心肌间质胶原含量, 对心肌肥大有明显的抑制作用。同时发现, 心肌肥大时, NOS活性和NO含量均降低, L-精氨酸干预后, 显著逆转了上述改变。 在生理情况下, 心肌中可以表达内皮型一氧化氮合酶 (e NOS) 和神经元型一氧化氮合酶 (n NOS) , 二者以精氨酸为底物生成NO, 参与心肌收缩的调整。不同亚型的NOS在心肌中的位置不同, 从而对心肌的收缩产生不同的影响[8,9]。 Ganzinelli等[10]研究表明NO弥散进入细胞核后, 影响c-fos, c-myc相关基因转录水平, 进而抑制心肌肥大。 与对照组比较, ISO增强了LDH活性和MDA含量。 L-Arg显著降低MDA含量和LDH活性。推测L-精氨酸通过促进NO的产生, 减少过氧亚硝酸阴离子 (ONOO-) 生成, 直接中和氧自由基, 消除氧自由基对心肌的损害, 并增强膜稳定, 从而减轻细胞损伤。

综上所述, L-精氨酸干预, 通过激活L-精氨酸—NO通路, 促进体内NO浓度增加, 可减轻心肌肥大和保护心肌细胞。 随着今后的深入研究, 将为L-精氨酸的临床应用提供广阔前景。

参考文献

[1]王天辉, 刘洪涛, 佘晓俊, 等.L-精氨酸对大鼠心肌相对缺血/再灌注损伤保护作用的研究[J].中国应用生理学杂志, 2005, 21 (3) :266-269.

[2]Stanton HC, Brenner G, Mayfield ED.Studies on isoproterenol induced cardiomegaly in rats[J].Am Heart J, 1969, 77 (1) :72-80.

[3]林岩, 徐长庆, 赵雅君, 等.多胺在异丙肾上腺素所致大鼠心肌肥厚中的作用及意义[J].中国病理生理杂志, 2009, 25 (3) :417-421.

[4]Dirkx E, da Costa Martins PA, De Windt LJ.Regulation of fetal gene expression in heart failure[J].Biochim Biophys Acta, 2013, 1832 (12) :2414-2424.

[5]Chowdhury D, Tangutur AD, Khatua TN, et al.A proteomic view of isoprterenol induced cardiac hypertrophy:prohibitin identified as a potential biomarker in rats[J].J Transl Med, 2013, 24 (11) :13-16.

[6]Takimoto E.Cyclic GMP-dependent signaling in cardiac myocytes[J].Circ J, 2012, 76 (8) :1819-1825.

[7]Vignon-Zellweger N, Relle K, Rahnenführer J, et al.Endothelin-1 overexpression and endothelial nitric oxide synthase knock-out induce different pathological responses in the heart of male and female mice[J].Life Sci, 2013, 12 (3) :24-27.

[8]Jeong MY, Walker JS, Brown RD, et al.AFos inhibits phenylephrine-mediated contractile dysfunction by altering phospholamban phosphorylation[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2010, 298 (6) :1719-1726.

[9]Hunter JC, Zeidan A, Javadov S, et al.Nitric oxide inhibits endothelin-1-induced neonatal cardiomyocyte hypertrophy via a RhoA-ROCK-dependent pathway[J].J Mol Cell Cardiol, 2009, 47 (6) :810-818.

心肌肥大 篇3

1 材料和方法

1.1 动物

出生1~3 d的SD大鼠,雌雄兼用,由辽宁医学院动物中心提供,动物合格证号:SCXK(辽)2003-0007。

1.2 药品与试剂

AngⅡ,环孢素A(cyclosporine A,CsA)(均购自Sigma公司);辛伐他汀(默沙东公司提供);低糖DMEM培养基、胰蛋白酶(HyClone公司);新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);考马斯亮蓝试剂盒(南京建成生物工程研究所);CaN抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.3 乳大鼠心肌细胞原代培养

在无菌条件下,取出生1~3 d的SD乳鼠,开胸取心尖组织,用D-Hanks液冲洗3次后剪成约1mm×1 mm×1 mm大小的碎块,加入0.8 g/L胰蛋白酶,消化完毕后将细胞置入含有10%小牛血清和90%培养基的100 m L培养瓶中,送入通以体积分数为5%二氧化碳(CO2)孵箱中培养60~90 min。本实验采用差速贴壁法纯化心肌细胞,非心肌细胞贴壁的速度较快,首先附在瓶底,而心肌细胞仍存在于细胞悬液中,将细胞悬液吸出,吹打均匀后以5×108/L的密度接种于24孔培养板,每孔加入1 m L,送于二氧化碳孵箱中培养。

1.4 分组及给药方法

取常规培养48 h后的心肌细胞分为对照组、AngⅡ组、Sim+AngⅡ组、CsA+AngⅡ组、Sim组和CsA组。对照组、Sim组和CsA组不加其他处理因素,AngⅡ组只加入AngⅡ(10-7mol/L)处理,Sim+AngⅡ组和CsA+AngⅡ组分别用Sim(0.1μmol/L)和CsA(5μg/m L)预处理60 min,再加入AngⅡ(10-7mol/L),48 h后进行各项指标的测定。

1.5 培养心肌细胞蛋白含量的测定

取各组培养的细胞,用PBS缓冲液快速冲洗3次,加入1 g/L胰蛋白酶裂解细胞,并计数,每孔细胞数约为5.0×105。将细胞离心后,弃上清,超声破碎细胞,冰上操作。取上清液根据蛋白检测试剂盒说明书测定每孔细胞蛋白质含量。

1.6 培养心肌细胞体积的测量

细胞体积是通过测量细胞直径获得的。用D-Hanks液快速冲洗长满细胞的培养孔3次,每孔加0.3 m L胰蛋白酶(1 g/L),放入37℃恒温箱中30 min后,再加入0.2 m L含有体积分数为0.1血清的培养基终止消化,收集细胞注入一细胞室内(该细胞室底部是一经硅化的盖玻片,以防心肌细胞贴壁),在放大400倍的倒置显微镜下观察细胞,几乎均呈球形。用计算机CIAS大恒细胞图像分析系统测量单个细胞的直径,进而计算出细胞的体积(V=4/3πR3)。每孔随机选择4个视野,每个视野测20个细胞。

1.7 Western-blotting检测Ca N的表达

细胞加药作用48 h后,用PBS冲洗,1 000 r/min,15 min,弃上清,把细胞沉淀置于-70℃冰箱备用,测定指标时,取出样品放入RIPA缓冲液,并加入10mg/m L PMSF,超声裂解后离心提取上清液。BCA法进行蛋白浓度测定,分取50μg加等体积的2×SDS上样缓冲液并煮沸,然后各取10μL样品以及蛋白质标准物点样。Tris-SDS聚丙烯酰胺凝胺垂直电泳3~5 h,转膜8~12 h;封闭,洗膜,然后以稀释后的兔抗大鼠CaN室温反应2 h,再和二抗反应1 h,Supel Signal West Pico试剂盒中反应5 min。显影条带经1200 Pro型图像扫描仪扫描,CAMIAS008图像分析系统处理,根据积分吸光度值对比分析条带的强弱。

1.8 培养心肌细胞[Ca2+]i瞬间变化的测定

将长有自发性搏动的心肌细胞的盖玻片从培养皿中取出置于含有Fura-2/AM的DMEM培养基中,其中含有白蛋白0.2%,在37℃水浴中孵育30 min,取出盖玻片,用HEPES缓冲液冲洗后放于荧光显微镜下的灌流槽中,恒温37℃,用HEPES缓冲液灌流,灌流速度为1 m L/min,所有药物均在指定时间加入灌流液中。所用的测定仪器为Till阳离子测定系统(德国),采用DM3000软件。激发光波长分别为340及380 nm,发射光波长为505 nm,采样间隙为300 ms。每次选取5~10个细胞,测量心肌细胞[Ca2+]i的瞬间变化,连续记录心肌细胞在给药前后的荧光强度[5]。

1.9 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件分析数据,实验数据用均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Sim对AngⅡ处理的心肌细胞总蛋白的影响

与对照组相比,AngⅡ组心肌细胞蛋白含量明显增加(P<0.01),Sim组和CsA组心肌蛋白含量无差异(P>0.05),与AngⅡ组相比,Sim+AngⅡ组、CsA+AngⅡ组、Sim组、CsA组心肌细胞蛋白含量均明显减小(P<0.05),与CsA+AngⅡ组相比,Sim+AngⅡ组细胞蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05),Sim和CsA对正常细胞总蛋白含量无影响(见图1)。

A:对照组;B:AngⅡ组;C:Sim+AngⅡ组;D:CsA+AngⅡ组;E:Sim组;F:CsA组。1)与对照组比较,P<0.01;2)与AngⅡ组比较,P<0.05

2.2 Sim对AngⅡ处理的心肌细胞体积的影响

与对照组相比,AngⅡ组心肌细胞体积明显增加(P<0.01),Sim组和CsA组心肌体积无差异(P>0.05),与AngⅡ组相比,Sim+AngⅡ组、CsA+AngⅡ组、Sim组、CsA组心肌细胞体积均明显减小(P<0.05),与CsA+AngⅡ组相比,Sim+AngⅡ组细胞体积无差异(P>0.05),Sim和CsA对正常心肌细胞体积无影响(见图2)。

2.3 Sin对AngⅡ处理的心肌细胞[Ca2+]i瞬间变化的影响

与对照组相比较,AngⅡ组[Ca2+]i瞬间变化幅度增高,频率加快,但不影响基线水平,与AngⅡ组相比较,Sim+AngⅡ组、CsA+AngⅡ组、Sim组和CsA组[Ca2+]i瞬间变化幅度明显降低,频率减慢,基线水平不受影响。Sim+AngⅡ组与CsA+AngⅡ组比较差别无统计学意义,Sim和CsA对正常心肌细胞[Ca2+]i瞬间变化无影响(见图3)。

A:对照组;B:AngⅡ组;C:Sim+AngⅡ组;D:CsA+AngⅡ组;E:Sim组;F:CsA组。1)与对照组比较,P<0.01;2)与AngⅡ组比较,P<0.05

A:对照组;B:AngⅡ组;C:Sim+AngⅡ组;D:CsA+AngⅡ组;E:Sim组;F:CsA组。1)与对照组比较,P<0.01;2)与AngⅡ组比较,P<0.05

2.4 Western-blotting检测Ca N蛋白的表达

与正常组对比,AngⅡ组CaN蛋白表达明显增加;与AngⅡ组相比,Sim+AngⅡ组、CsA+AngⅡ组、Sim组和CsA组CaN蛋白表达水平明显降低;Sim+AngⅡ组、CsA+AngⅡ组之间的差异无统计学意义,Sim和CsA对正常心肌细胞CaN蛋白表达无影响(见图4)。

3 讨论

钙调神经磷酸酶(calcineurin CaN)是迄今发现的惟一受Ca2+/钙调素(CaM)调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶,各种刺激引起的细胞内[Ca2+]i升高,CaN活化,继而使其下游信号因子NFATs活化转位入细胞核,调节心脏肥大基因特异性表达,形成心肌肥大;细胞内Ca2+浓度升高是心肌肥大发生发展的中心环节,在该信号通路上对心肌肥大的发生、发展中起到至关重要的作用[6,7,8]。

本实验表明AngⅡ诱导心肌细胞后,心肌细胞体积和总蛋白含量明显增加,由此证明心肌细胞肥大建模成功。CsA(CaN特异性抑制剂)和Sim对正常心肌细胞无影响,CsA预处理的心肌细胞与对照组相比,心肌细胞的体积和总蛋白差异无统计学意义,与MOLKENTIN等[6]通过转基因技术,CsA可减弱转染表达有CaN的腺病毒表现肥大反应实验结果一致。CsA抑制心肌细胞体积的增大和总蛋白含量增加,同时对胞内升高的[Ca2+]i瞬变有抑制作用,曾有实验推测CsA抑制心肌肥厚作用可能通过调节胞内Ca2+稳态而实现的[9]。心肌肥厚时心肌CaN水平增高,启动一系列下游反应使心肌细胞内钙超载,致使细胞Ca2+蓄积,Ca2+稳态遭到破坏。Ca2+作为一个细胞信号转导过程中的主要信使,介导了心肌肥大的发生和发展。国外研究显示[10,11],苯肾上腺素(phenyl ephrine,PE)或大动脉结扎诱导的心肌肥厚中游离细胞内钙离子增加,与Na-H交换体(NHE-1)的基因和蛋白的表达增加有关,增强了NHE-1的活性,细胞内Ca2+浓度增加,增强了CaN的活性,从而增加了NFAT3向核内的转位和GATA-4的活性,Ca2+作为细胞内信号转导的第二信使,在调节心肌细胞肥厚中起着关键的作用,这些效应与Ca2+依赖的CaN的活性相关,在肥厚刺激6 h达到高峰。本实验中,在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型中,心肌细胞内Ca2+水平显著升高,当用Sim处理时心肌细胞内Ca2+瞬间变化幅度和频率降低,且与CsA的降低程度相似,提示Sim对心肌肥大的抑制作用可能是通过调节细胞内Ca2+的稳态实现的,该稳态的调节可能与细胞内Ca2+的相关基因和蛋白表达有关,继而抑制Ca2+/CaN而启动一条向核内传递的信号通路。本实验中AngⅡ诱导的心肌细胞肥大与RANA等[12]研究结果一致,说明AngⅡ/Ca N/NFAT通路是心肌肥厚发病机制中具有特征性的级联反应,本实验中Sim能够抑制AngⅡ诱导的心肌细胞体积的增大和总蛋白的增加,同时抑制细胞内Ca2+瞬间变化,CaN蛋白的表达也明显减少,Sim和CsA抑制AngⅡ诱导的CaN蛋白的表达相似,CsA通过阻断上述通路影响心肌肥厚的进展,显示Sim可能是通过抑制此级联反应通路保护心肌细胞肥大。

综上所述,Sim可能通过Ca2+/CaN信号通路抑制AngⅡ诱导的心肌肥大,Sim与细胞内Ca2+瞬间变化及Ca2+稳态之间的关系有待进一步探讨,具体机制尚需进一步研究。

参考文献

[1]DIEDRICHS H,HAGEMEISTER J,CHI M,et al.Activation ofthe calcineurin/NFAT signalling cascade starts early in humanhypertrophic myocardium[J].J Int Med Res,2007,35:803-818.

[2]赵勇,王建春,王传霞,等.左室构型与钙调神经磷酸酶表达之间的关系[J].医学影像学杂志,2010,20(1):39-42.[2]ZHAO Y,WANG JC,WANG CX,et al.Relationship betweenleft ventricular geometry and expression of calcineurin[J].Journalof Medical imaging,2010,20(1):39-42.Chinese

[3]TAKAYAMA N,KAI H,KUDO H,et al.Simvastatin preventslarge blood pressure variability induced aggravation of cardiachypertrophy in hypertensive rats by inhibiting Rho A/Ras-ERKpathways[J].Hypertens Res,2011,34(3):341-347.

[4]苏菲菲,郑强荪,尚福军,等.辛伐他汀对大鼠急性心肌梗死后心室重塑的保护作用[J].第四军医大学学报,2009,30(23):2802-2804.[4]SU FF,ZHENG QS,SHANG FJ,et al.Protective effect of sim-vastatin against ventricular remodeling in postinfarc-tionheart fail-urerats[J].Journal of the Fourth Military Medical University,2009,30(23):2802-2804.Chinese.

[5]WANG HX,KWAN CY,WONG TM.Electrically induced intra-cellular Ca2+transient in single ventricular myocytes:a usefulparameter for the study of cardiac drugs[J].Clin Exp PharmacolPhysiol,1999,26(10):835-836.

[6]MOLKENTIN JD,LU JR,ANTOS CL,et al.A calcineurin-de-pendent transcriptional pathway for cardiac hypertrophy[J].Cell,1998,93(2):215-228.

[7]WILKINS BJ,DAI YS,BUENO OF,et al.Calcineurin/NFATcoupling participates in pathological,but not physiological,car-diac hypertrophy[J].Circ Res,2004,94:110-118.

[8]MOLKENTIN JD.Calcineurin and beyond:cardiac hypertrophicsignaling[J].Circ Res,2000,87:731-738.

[9]鲁美丽,王洪新,杨育红,等.κ阿片受体激动通过钙调神经磷酸酶和胞外信号调节激酶信号抑制异丙肾上腺素诱导的乳鼠心肌肥大[J].中华高血压杂志,2010,18(3):273-278.[9]LU ML,WANG HX,YANG YH,et al.Kappa-opioid receptorstimulaion inhibites isoproterenol induced cardiomyocytes hyper-trophy through calcineurin,extracellular signal-regulated kinasepathway in neonatal rats[J].Chinese Journal of Hypertension,2010,18(3):273-278.Chinese.

[10]GUO J,GAN XT,HAIST JV,et al.Ginseng inhibits cardiomy-ocyte hypertrophy and heart failure via NHE-1 inhibition andattenuation of calcineurin activation[J].Circ Heart Fail,2011,4(1):79-88.

[11]KILIC A,RAJAPUROHITAM V,SANDBERG SM,et al.Anovel chimeric natriuretic peptide reduces cardiomyocyte hyper-trophy through the NHE-1-calcineurin pathway[J].CardiovascRes,2010,88(3):434-442.

心肌肥大 篇4

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

Trizol Reagent,RNase-free的DNase I,Ta Ka RaEx Taq TM(Ta Ka Ra),Reverse Transcription System(Ta Ka Ra);DEPC;异丙醇、无水乙醇、苯甲酰氯、甲醇(国产分析纯),氯仿(国产色谱级)、i NOS抗体(Santa公司)、e NOS抗体(Santa公司)。

1.2 实验动物和模型复制

健康Wistar大鼠,体重0.20~0.25 kg,雌雄不拘,由哈医大附属二院动物研究所提供。参照文献[2]制备大鼠心肌肥厚模型:大鼠背部皮下注射ISO 5mg/kg·d,连续7 d,自由进食,给水;对照组大鼠背部皮下注射等体积的生理盐水。

1.3 实验分组

(1)对照组(Control);(2)异丙肾上腺素给药组(ISO);(3)L-精氨酸干预组(ISO+L-Arg);(4)L-精氨酸对照组(L-Arg)。各组按照给药时间不同又分为1 d、3 d、5 d和7 d组。

1.4 心脏重量参数的测定

分别在ISO注射后1 d、3 d、5 d和7 d后处死各组大鼠,处死前每只大鼠称量体重(body weight,BW),3%戊巴比妥钠(ip)麻醉,迅速开胸取出心脏,剪去心脏周围组织和血管,称全心重(heart weight,HW)。沿冠状沟将左心房剪下,沿室间沟将右心室游离壁去除称左室重(left ventricular weight,LVW),计算HW/BW、LVW/BW并以此判断心肌肥厚的程度。取心肌组织左室游离壁,10%福尔马林固定,石蜡包埋,常规HE染色和胶原纤维染色(Van Gieson,VG),光镜下观察心肌细胞及心肌间质的变化。将左心室置于液氮中保存备用。

1.5 ANP m RNA表达水平的RT-PCR检测

应用Trizol提取心脏总RNA。依A260和A280数据判断RNA的纯度及含量。RNA 15μL;DNase I1μL;10×DNase I缓冲液5μL;DEPC-H2O 29μL;37℃水浴30 min;加入Trizol reagent及氯仿重新提取总RNA。用AMV逆转录酶逆转RNA,合成第一链c DNA,取RNA 1μL,Random 9mers 0.5μL,RNase Free d H2O 3.75μL,总体积10μL。30℃,10min,42℃,30 min,99℃,5 min,5℃,5 min。-20℃冰箱保存。依据文献的大鼠心肌组织中ANP c DNA序列合成引物(Ta Ka Ra)。正义链5'-ggctccttctccatgaccaa-3',反义链5'-tgttatcttcggtaccg-3',引物长度458bp。ANP扩增条件:首次循环为94℃,2 min,随后进行32次如下循环:94℃,30 s,59℃,30 s,72℃,1min,最后于72℃延伸5 min。取8μL产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统下拍照,并用ANP和β-actin扩增条带的信号面积之比评定其m RNA水平[3]。

1.6 心肌组织总蛋白的提取和蛋白质免疫印迹检测

取大鼠左心室样品,液氮内研磨,加入全细胞裂解液,将匀浆冰上处理30 min,4℃,12 000×g离心15 min,取上清进行蛋白质定量。取50μg总蛋白样品于10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,随后转印至PVDF膜,10%无脂肪牛奶封闭后,用1∶500抗e NOS和i NOS抗体4℃孵育过夜。用二抗(碱性磷酸酶标记,稀释度1∶1 000)室温孵育1 h,最后用AP法显色,光密度扫描半定量分析显影条带[4,5]。

1.7 统计学处理

实验数据用平均数±标准差(±s)表示,统计学处理使用SPSS统计软件,采用方差分析方法判断其差异显著性。

2 结果

2.1 L-精氨酸干预对心脏重量参数的影响

与正常对照组相比,异丙肾上腺组(ISO)HW/BW和LVW/BW都显著增加(P<0.01),L-精氨酸干预组(ISO+L-Arg)与ISO组比较,HW/BW和LVW/BW降低(P<0.05),L-精氨酸干预组与L-精氨酸对照组(L-Arg)比较,HW/BW变化不明显,LVW/BW增加明显(P<0.05)。(表1)

注:1)ISO组与对照组比较,P<0.01;2)ISO+L-Arg组与ISO组比较,P<0.05;3)ISO+L-Arg组与L-Arg组比较,P<0.05

2.2 L-精氨酸干预对心肌细胞胶原含量的影响

心肌组织经苦味酸酸性品红染色后,光镜下见心肌细胞呈橘黄色,间质胶原纤维呈亮红色。病理图像分析系统(北京航空航天大学图像中心)分析显示(图1),异丙肾上腺素组与正常对照组比较,心肌细胞增大,排列紊乱,小血管周围有大量亮红色胶原沉积,并较多地延伸至心肌细胞间隙(P<0.01);L-精氨酸干预组与异丙肾上腺素组比较,心肌间质胶原含量显著减少(P<0.01),但L-精氨酸干预组与L-精氨酸对照组比较,胶原含量增加(P<0.01)。

1)ISO组与对照组比较,P<0.01;2)ISO+L-Arg组与ISO组比较,P<0.01;3)ISO+L-Arg组与L-Arg组比较,P<0.01

2.3 L-精氨酸干预对心肌组织ANP m RNA表达的影响

RT-PCR结果表明,与正常对照组比较,异丙肾上腺素组ANP m RNA的表达水平明显增高(P<0.01),L-精氨酸干预组与异丙肾上腺素组比较,ANP m RNA的表达水平显著降低(P<0.05)。L-精氨酸干预组与L-精氨酸对照组比较,ANP m RNA的表达变化无统计学差异(P>0.05)。(图2)

1)ISO组与对照组比较,P<0.01;2)ISO+L-Arg组与ISO组比较,P<0.05

2.4 L-精氨酸干预对血清NOS活性和NO含量的影响

与正常对照组相比,ISO组NO(NO2-/NO3-)含量和NOS活性明显降低(P<0.01,P<0.05)。与ISO组比较,L-精氨酸干预组NO含量和NOS活性升高(P<0.01,P<0.05)。L-精氨酸干预组NO含量低于L-精氨酸对照组(P<0.05),见表2。

注:1)ISO组与对照组比较,P<0.05;2)ISO组与对照组比较,P<0.01;3)ISO+L-Arg组与ISO组比较,P<0.05;4)ISO+L-Arg组与ISO组比较,P<0.05;5)ISO+L-Arg组与Arg组比较,P<0.05

2.5 L-精氨酸干预对心肌组织e NOS和i NOS蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示,与正常对照组比较,ISO 7 d时e NOS蛋白表达下降了13%(P<0.05),i NOS蛋白表达上升了28%(P<0.01)。与ISO组比较,L-精氨酸干预7 d后,e NOS蛋白表达上调了18%(P<0.05),而i NOS表达下调12%(P<0.05)。L-精氨酸干预组与L-精氨酸对照组比较,5 d时iNOS表达显著上升(P<0.01),而e NOS蛋白表达无差异(图3,4)。

3 讨论

心肌肥大是多种心脏疾病患者发展为心功能衰竭甚至死亡的常见合并症,其发生机制的研究对于进一步预防或逆转心肌肥大有着非常重要的意义。本研究运用在体手段,在异丙肾上腺素诱导大鼠心肌肥大模型上观察L-精氨酸-一氧化氮途径对病理性心肌肥大的抑制作用及其机制,为临床病理性心肌肥厚的治疗提供新的思路和实验依据。

NO是由血管内皮细胞或心肌细胞合成和释放的血管舒张因子,可维持血压的稳定和心脏的生理功能,同时参与高血压心肌肥大的调控。L-Arg是一种碱性氨基酸,可在体内多种细胞所表达的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化下,生成NO及L-瓜氨酸,该过程即L-Arg-NO途径[6]。

目前认为,L-Arg-NO途径所产生的NO主要通过自分泌和(或)旁分泌的方式作用于邻近的相关细胞,从而发挥其生理效应。体内NOS分三种亚型[7,8]:神经元型(neuronal NOS,n NOS)、内皮型(endothelial NOS,e NOS)及诱导型(inducible NOS,i NOS)。血管内皮细胞中存在e NOS和i NOS,而神经系统的多种细胞主要表达n NOS。心脏内细胞成分复杂,含有丰富的微血管及多种间质细胞,在体心肌组织于生理状态下即表达e NOS及i NOS,且e NOS及i NOS在心脏中的表达模式具有同步化的特点。

本研究发现,与ISO组比较,外源性L-Arg干预后,大鼠心肌肥大指数明显下降,且心肌组织ANP m RNA的表达水平下调。更有意义的是,我们还观察到经L-Arg干预后,心肌间质胶原沉积大大减少。由于病理性心肌肥大不仅包括心肌细胞的肥大,还包括间质和血管周围胶原沉积。心脏胶原网络的重塑可增加心肌僵硬度,直接影响心脏舒张功能。所以,对心肌间质胶原沉积的抑制作用对防止心功能恶化具有重要意义。

实验中我们观察到,心肌肥大时e NOS蛋白表达减少,i NOS蛋白表达增加,NOS活性与正常对照组比较降低了18%,NO含量比正常对照组减少了43%,提示ISO诱导心肌肥大过程中通过下调e NOS,上调i NOS,降低总NOS活性,从而减少血清NO含量。外源性L-Arg干预可增加e NOS蛋白表达(P<0.05),减少i NOS蛋白表达(P<0.01),显著增加血清NO含量(P<0.01),增加NOS活性(P<0.05)。这些结果提示,L-精氨酸干预后,可通过提供NOS的底物,增加NO含量,进而使心肌肥大减轻。

一氧化氮合酶是机体中一种以精氨酸为底物的酶。一般认为,n NOS和e NOS在生理状态下即可催化NO的基础释放,发挥生物效应并传递细胞间的信息。由e NOS催化产生的适量NO具有心血管保护作用,它能够维持血管张力、增强心肌的舒张功能并对心脏收缩功能有利[9]。肥厚心肌中e NOS的减少可导致心肌舒张和收缩功能障碍,改变心肌对β2肾上腺素刺激的反应性,以及增加心肌耗氧量进而打破机体中氧的供需平衡。同时NO还能和超氧阴离子生成细胞毒过氧化亚硝基(ONOO-),提示了NO作用的双向性。i NOS在正常条件下不存在,无活性表达,当有内毒素或其他细胞因子刺激时,才可迅速而大量地诱导其基因表达,经数小时就可产生大量NO,以杀死微生物甚至肿瘤细胞,由其产生的细胞毒性也同样可以损伤组织。研究认为,心肌细胞中P42/P44MAPK级联反应的激活可以诱导NOS转录,进而可能通过凋亡的途径致使心肌细胞死亡和丢失,参与各种心肌疾病的恶性发展[10]。

综上所述,我们认为异丙肾上腺素诱导的心肌肥大与NO代谢密切相关,L-Arg通过增强心肌e NOS表达,减少i NOS表达致NO生成增加,抑制病理性心肌肥大的形成。

参考文献

[1]付春景,郭龙辉,申琦,等.心肌肥大和心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及Bax和Bcl-2的表达[J].郑州大学学报(医学版),2005,40(3):500-502.[1]FU CJ,GUO LH,SHEN Q,et al.Cardiomyocyte apoptosis and the expression of Bax,Bcl-2in cardiamyocyte hypertrophy and heart failure rats[J].Journal of Zhengzhou University(Science Medical),2005,40(3):500-502.Chinese

[2]STANTON HC,BRENNER G,MAYFIELD ED J R.Studies on isoproterenol induced cardiomegaly in rats[J].Am Heart J,1969,77(1):72-80.

[3]赵赫男,李玲,季晓鹏,等.信号转导通路在心肌营养素-1调解心肌转录因子GATA4表达中的作用[J].中国现代医学杂志,2006,16(22):3434-3437.[3]ZHAO HN,LI L,JI XP,et al.Cardiotrophin-1(CT-1)raises expression of rat s cardiac transcription factor GATA4mRNA[J].Journal of Dalian Medical University,2006,16(22):3434-3437.Chinese

[4]王建刚,江凤林,冯俊,等.丹参酮IIA对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大与凋亡干预的研究[J].中国现代医学杂志,2007,17(18):2202-2204.[4]WANG JG,JIANG FL,FENG J,et al.Study of inhibition of Tanshinone IIA on hyper trophy and apoptosis of cardiomyocytes induced by AngII[J].China Journal of Modern Medicine,2007,17(18):2202-2204.Chinese

[5]林岩,徐长庆,赵雅君,等.多胺在异丙肾上腺素所致大鼠心肌肥厚中的作用及意义[J].中国病理生理杂志,2009,25(3):417-421.[5]LIN Y,XU CQ,ZHAO YJ,et al.Effect of polyamine on cardiac hypertrophy induced by isoproterenol in rats[J].Chinese Journal of Pahophysiology,2009,25(3):417-421.Chinese

[6]MONCADA S,HIGGS A.The L-arginine-nitric oxide pathway[J].N Engl J Med,1993,329(27):2002-2012.

[7]KONE B C,KUNCEWICZ T,ZHANG W,et al.Protein interac-tions with nitric oxide synt hases:Controlling the right time,the right place,and the right amount of nitric oxide[J].Am J Physi-ol,Renal Physiol,2003,285(2):F178-F190.

[8]ZHENG H,LI Y F,CORNISH K G,et al.Exercise training improves endogenous nitric oxide mechanisms with in the par-avent ricular nucleus in rats with heart failure[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005,288(5):H2332-H2341.

[9]SUN Y,CARRETERO OA,XU J,et al.Lack of inducible NO synthase reduces oxidative stress and enhances cardiac response to isoproterenol in mice with deoxycorticosterone acetate2salt hy-pertension[J].Hypertension,2005,46(6):1355-1361.