心肌细胞（精选9篇）
心肌细胞 篇1
摘要：中药的保护作用有多方面, 这里主要对缺糖缺氧损伤、对缺氧再给氧损伤和对病毒、化疗药物损伤的保护作用做以简要分析。
关键词：中药,心肌,保护
0 引言
近年来有关中药保护心肌细胞的研究有发较大发展, 下面从三个方面进行分析:
1 对缺糖缺氧损伤的保护作用
大量实验研究表明, 培养的心肌细胞如缺糖缺氧6小时, 则迅速引起细胞内能量耗竭, 导致细胞功能受损, LDH等酶溢出, 并伴有细胞超微结构损害。研究发现, 中药能有效地对上述损害起保护作用。研究发现:在LDH酶水平显著高于正常对照组 (P<0.01) 的缺糖缺氧心肌细胞培养液中, 加入玫瑰茄提取液后, 培养液中的LDH显著低于未加药物的缺糖缺氧组 (P<0.05) , 提示该药物能较好的对缺糖缺氧损伤起保护作用。研究人员将中药提取物酸枣仁总皂甙分别用两种浓度 (33μg/ml和11μg/ml) 加入模型组中, 结果发现高浓度组可减轻缺糖缺氧心肌细胞LDH的释放, 低浓度组则没有这样的作用, 说明该药对心肌细胞的保护作用存有量效关系。值得一提的是:培养的心肌细胞对不同中药的浓度反应也有较大差异, 研究发现, 100μg/ml与250μg/ml的三七总皂甙均能减少缺糖缺氧组心肌细胞的LDH与α-羟丁酸脱氢酶 (α-HBD) 的释放, 但作用以100μg/ml浓度为明显, 250μg/ml的浓度反有减弱的趋势, 提示中药保护心肌细胞与适宜的浓度相关, 过大过小均不能达到最大效应。
有关中药保护心肌细胞缺糖缺氧损伤机理的研究, 近年来也取得了长足的进展。洪行球采用中药复方何氏心悸方 (党参、五味子、麦冬等) 观察其对细胞内琥珀酸脱氢酶 (SDH) 活性的影响, 该酶是三羧酸循环及线粒体氧化磷酸化有关的主要酶。实验发现, 缺糖缺氧组细胞内SDH染色示活性明显降低, 加入该药抽滤液后可明显提高SDH的活性, 且使细胞搏动恢复, 说明何氏心悸方是通过改善心肌细胞内代谢起到保护心肌细胞作用。研究人员采用计算机技术和SDH染色相结合的方法。将该酶活性量化, 并检测LDH.心肌细胞内总磷酯和总胆固醇含量以及Ca2+—Mg2+ATP酶活性进行综合分析发现, 大豆磷脂脂质体可抑制心肌细胞培养液中LDH的活性和心肌细胞内SDH的反应性增加, 减轻心肌细胞Ca2+—Mg2+ATP酶活性的降低, 提高心肌细胞总磷脂和总胆固醇的含量, 说明大豆磷脂脂质体减轻培养心肌细胞缺糖缺氧性损伤, 可能与其作用于细胞膜脂质有关。近年来, 有关中心肌细胞保护作用机理研究已达到分子水平。用同位素标记法研究发现, 三七总皂甙可以减少缺糖缺氧心肌细胞DNA合成的降低。用精制血府胶囊 (柴胡、赤芍、红花、桃仁等) 取药给兔灌胃后, 心脏采血, 分离含药血清, 研究其对缺糖缺氧心肌细胞的保护作用, 发现该药可以提高缺糖缺氧心肌细胞的3H—urid (尿嘧啶核苷) 及3H—Leu (亮氦酸) 的掺入率, 提示中药能够减轻缺糖缺氧心肌细胞的DNA、RNA、蛋白质等大分子物质的合成, 起到保护心肌细胞的作用。进一步研究显示, 该药能够改善心肌细胞-氧化氦合成酶 (NOS) 基因的表达, 可能亦是精制血府胶囊保护心肌细胞的重要机理之一。
心肌细胞超微结构的研究, 进一步对中药保护心肌细胞提供形态学依据。研究发现缺糖缺氧6小时的心肌细胞核畸形, 染色体边缘浓缩, 线粒体肿胀, 嵴消失, 甚至出现空泡变性, 此外, 肌原结构破坏, 有些区域偶见Z膜和A带, I带模糊不清或消失。有些肌原纤维有断裂和破碎, 分别加用黄芪、当归, 当归养血汤等后, 大部分细胞核正常、染色质均一, 肌原纤维内粗细肌丝排列整齐, Z膜、A带和I带清楚。局部未见肌原纤维断裂破碎, 说明上述中药有较好的抗心肌细胞缺糖缺氧损伤作用。熊胆能够明显恢复缺糖缺氧心肌细胞的核畸形、线粒体及肌浆网肿胀, 并与对照组比较, 糖元增加, 分布均匀。另外, 中药对缺氧再给氧对心肌细胞结构性损伤也有很好的保护作用。正常细胞超微结构清晰, 缺氧15分钟心肌细胞结构基本正常, 仅偶见线粒体嵴变平、消失, 而缺氧复氧组心肌线粒体损伤明显, 肿胀、嵴溶解消失, 并可见致密体, A带和I带消失。加入酸枣仁皂甙组及SOD组细胞超微结构明显改善, 仅见部分线粒体肿胀, 肌原纤维排列整齐, A带、I带清晰可见。提示:酸枣仁总皂甙有明显的抗缺氧复氧损伤作用。
2 对缺氧再给氧损伤的保护作用
现代病理生理学研究提示:缺氧再给氧损伤主要表现在自由基损伤及钙超载两个方面。研究发现:缺氧再给氧时, 心肌细胞内超氧化构歧化酶 (SOD) 活性降低, 过氧化产物丙二醛 (MDA) 升高, 细胞膜脂质流动性下降, 酸枣仁总皂甙能够剂量依赖地显著降低缺氧再给氧心肌细胞MDA的含量。提高SOD活性。增加细胞膜流动性。说明其具有抗自由损伤的作用。外源性自由基损伤黄嘌呤一次黄嘌呤氧化酶 (x-xo) 系统, 损伤的心肌细胞, 发现损伤后细胞起搏比例明显降低, 电参数 (动作电位幅度、超射、阈电位及最大除极速度) 等均变小, 呈膜损伤改变, 加入西洋参茎叶皂甙后细胞起搏比例及电参数与正常组对比改变不明显, 说明该药有抗外源性自由基损伤的作用。在众多抗自由基损伤中药中, 人参的研究尤为深入。应用电子自旋共振法 (ESR) 检测人参各组份抗外源性自由基损伤 (x-xo系统) 时, 心肌细胞内自由基的含量, 发现11种人参皂戒单体中, 有8种单体 (Rg1、Rb1、Re、Rb2、RL、Rg2、Rb3、Rk1) 可使心肌细胞内自由基明显少于对照组, 有一种单体Rd对自由基含量无明显影响, 另二组单体Rf、R0使细胞内自由基数量明显高于对照组。提示:人参皂甙净效应有良好的抗自由基损伤作用, 但不同组份可出现效应迥异。作者认为, 这主要取决于与甙元相连的糖基链, 其中达玛烷型四环三萜被认为是抗自由基作用最主要的甙元基团。
近年来, 应用膜片钳技术成功地观察到心肌细胞膜上不同离子电流进行离子通道的研究。应用该技术确证了人参二醇组、人参三醇组单体有钙通道阻滞作用, 表现为钙离子通道的开放时间及开放频率减少。进一步研究人参皂甙单体Rh1等, 结论基本相同, 表明人参保护心肌细胞的另一可能机理为钙阻滞。
3 对病毒、化疗药物损伤的保护作用
应用45Ca示踪发现, 黄芪能够减轻柯萨其病毒B3 (CB3) 感染心肌细胞的继发性钙超载, 并对细胞内病毒的RNA复制具有抑制作用。研究证实:牛磺酸可保护CB3病毒感染的心肌细胞, 其作用可能与Ca2+阻滞有关。近年来, 中药复方制剂抗病毒感染也出现了可喜的苗头, 研究发现心肌宁可明显抑制CB3吸附细胞表面, 并直接灭活病毒, 为临床中药抗病毒性心肌损伤提供可靠的实验依据。
在临床中观察到, 生脉散可以减轻化疗病人的心肌受损, 但在培养的心肌细胞实验中并未发现生脉散有直接心肌细胞保护作用。提示中药抗化疗损伤心肌作用, 体液因素不可忽视。
心肌细胞 篇2
厄贝沙坦对离体大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的影响
目的` 观察厄贝沙坦对离体大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的影响,并初探其机制.方法 应用Langendorff装置采用完全停灌复灌的方法制作离体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型.将48只SD大鼠随机分为3 组:对照组(K-H缓冲液持续灌流110 min)、缺血再灌注组(K-H缓冲液持续灌注至各项指标稳定后,约20 min,停灌30 min,再灌60 min)、厄贝沙坦组(灌注方法同缺血再灌注组,但将K-H缓冲液内加厄贝沙坦10-6 mol/L).(1)取每组8只观察心肌组织氧化物歧化酶活性,丙二醛含量变化.(2)每组其余8只:①对照组K-H缓冲液持续灌流170 min.②缺血再灌注组和厄贝沙坦组持续灌注至各项指标稳定后停灌30 min,再灌注120 min.观察对细胞凋亡的影响.结果 (1)缺血再灌注组大鼠心肌组织中丙二醛含量较对照组明显升高(P<0.01),总超氧化物歧化酶活性较对照组明显降低(P<0.01).(2)厄贝沙坦组与缺血再灌注组比较,总超氧化物歧化酶活性明显升高(P<0.01),丙二醛含量明显降低(P<0.01).(3)缺血再灌注组细胞凋亡指数显著高于对照组(P<0.01).(4)厄贝沙坦组细胞凋亡指数与缺血再灌注组比较显著降低(P<0.01).结论 厄贝沙坦有抑制心肌缺血再灌注损伤中心肌细胞凋亡的作用.其机制可能与厄贝沙坦清除氧自由基,减少脂质过氧化有关.
作 者：张博 ZHANG Bo 作者单位：锦州市中心医院心内科,辽宁,锦州,121001刊 名：辽宁医学院学报英文刊名：JOURNAL OF LIAONING MEDICAL UNIVERSITY年，卷(期)：30(1)分类号：Q954.56关键词：再灌注损伤 细胞凋亡
心肌细胞 篇3
[关键词] 血管内皮生长因子；急性心肌梗死；单个核细胞
[中图分类号] R542.22 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2012）01-22-03
Study of the expression of vascular endothelial growth factor by peripheral blood mononuclear cells in patients with acute myocardial infarction
HONG Canghao TANG Guofa LIU Xiaohong
Department of Cardiology,E'gang Hospital,Wu Iron and Steel Group,E'zhou 463002,China
[Abstract] Objective To investigate the clinical significance of VEGF levels in the supernation of cultured peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in AMI.We also explored the relationship between VEGF and left ventricular systolic function in AMI. Methods 28 patients with AMI and 12 controls were used for this study.PBMCs were isolated from perispheral blood on days 1,5,10 and 15 after the onset of AMI.PBMCs were cultured for 24h.VEGF levels in the culture media were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results (1)VEGF levels in the cultured medium of PBMCs after incubation of 24 h (PBMC-VEGF) were elevated gradually and reached a peak on day 5, which was significantly higher than that of control (343.2±82.5pg/mL vs 143.3±24.2pg/mL,P＜0.05).(2)Peak PBMC- VEGF levels showed no correlation with peak creatine phosphokinase (CK) levels.(3)Improvement of left ventricular systolic function during the course of AMI showed significantly higher PBMC-VEGF levels than patients without improvements (P＜0.05). Conclusion PBMC-VEGF played an important role in the improvement of left ventricular systolic function by promoting angiogenesis and reendothelialization after AMI.
[Key words] Vascular endothelial growth factor;Acute myocardial infarction;Peripheral blood mononuclear cells
血管内皮生长因子在缺血性心脏病发病机制中起着重要作用，动脉粥样硬化的形成，冠状动脉成形术后再狭窄都与生长因子参与的细胞增殖、迁移、分化与凋亡有密切关系。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种特异作用于血管内皮细胞（vascular endothelial cell，VEC）强有力的有丝分裂原，在缺血、缺氧及血管损伤时能促进VEC增殖、迁移及诱导血管生成，是迄今所发现最强的一种血管内皮生长因子。由于冠心病是以心肌缺血为主要特征，外源性VEGF已成为目前促血管生成、重建冠状动脉侧枝循环的研究热点。目前，在应用外源性VEGF基因转染治疗心肌缺血方面研究很多，而对不同来源的内源性VEGF在心肌缺血时所起的作用研究甚少。本研究通过观察AMI患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分泌的VEGF水平的动态变化来探讨不同来源的内源性VEGF在AMI患者中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
患者为2010年1月～2011年6月笔者所在医院心血管内科住院确诊的急性心肌梗死患者28例，其中男20例，女8例，平均年龄（58.7±7.9）岁。12例正常体检者作对照，其中男9例，女3例，平均年龄（55.6±6.3）岁。28例AMI患者均进行了冠脉造影（coronary angiography，CAG），并实施经皮腔内冠状动脉球囊扩张和支架植入术（percutaneous transluminal coronary angioplasty and stent，PTCA+stent），所有患者均常规服用阿司匹林和氯吡格雷，并根据医生建议服用β-受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂等药。28例患者CAG检查结果：单支血管病变11例，2支血管病变9例，3支血管病变8例。合并高血压病的有15例（54%），高脂血症23例（82%），糖尿病7例（25%），18例患者有吸烟史（64%），8例有冠心病家族史（28%）。
1.2 急性心肌梗死的诊断
根据WHO标准持续典型的胸痛30 min以上；典型心电图动态变化；心肌酶（肌酸磷酸激酶及其同工酶MB或肌钙蛋白）动态变化。具有以上中任何2项即可确诊。
1.3 正常对照者入选条件
对照组与AMI组进行性别、年龄配对，经病史询问无心血管疾病史，体格检查无阳性体征，胸片、心电图、肝肾功能、生化常规检查无异常者。合并严重心衰、肝、肾功能衰竭、感染性疾病、肿瘤、外周血管病、脑卒中者予以剔除。
所有患者在发病2 d内进行床旁心脏彩色多普勒超声检测左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF），半月后（出院时）复查LVEF（由心脏彩超室专人质控检测）。
1.4 主要仪器和试剂
CO2培养箱：美国Formal Scientific公司；Lympus倒置显微镜：日本；酶联免疫检测仪：美国EL312eVEGF酶联免疫检测试剂盒：北京晶美生物工程有限公司（进口分装），检测灵敏度为30 pg/mL，批内、批间误差均＜9.5%；淋巴细胞分离液：Ficoll-Hypaque液，中科院血液研究所；PBS液：新鲜配制；RPMI-1640：GIBCO，美国；小牛血清：笔者所在医院中心实验室制备；双抗：青霉素100 IU/mL，链霉素100μg/mL。
1.5 研究方法
1.5.1 外周血单个核细胞（PBMCs）的分离和培养及标本的提取
1.5.1.1 PBMCs的分离 （1）在AMI患者发病的第1、5、10、15天分别抽取20 mL静脉血放入肝素抗凝离心管内，摇匀，用PBS液稀释血液1倍，对照组仅抽1次静脉血。（2）取淋巴分离液4 mL，放入15 mL离心管中。（3）将稀释全血沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于淋巴分离液上，稀释血液与分离液体积之比约为2∶1。（4）用水平离心机以2 000 rpm离心20 min，离心后，单个核细胞位于血浆和淋巴分离液界面层。（5）吸取界面单个核细胞层，用PBS洗涤3次，每次1 500 rpm离心10 min，吸弃上清，加入1 mL RPMI 1640，混匀，细胞计数，用苔盼蓝染色，计算活细胞数，均＞95%。
1.5.1.2 PBMCs的培养 （1）用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液重悬单个核细胞，并将细胞浓度调节至5×106/mL。（2）取1 mL浓度为5×106/mL PBMCs悬液放入24孔培养板中，在37℃，5%CO2条件下于培养箱中进行细胞培养。
1.5.1.3 标本的提取 分别于6、12、24 h收取PBMCs培养的上清液，置-70℃冰箱保存待测。
1.5.2 血清肌酸磷酸激酶（CK）最大值的测定 AMI患者发病后每4 小时测1次CK直到最大值（由检验科专人质控检验）。
1.5.3 VEGF的测定 外周血单个核细胞培养分泌的VEGF量均采用双抗夹心酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定，浓度单位为pg/mL。按试剂盒说明进行操作。
1.6 统计学处理
应用SPSS17.0软件包进行统计分析，主要统计指标均进行正态性检验，对于偏态分布的计量资料，对数转换达到近似正态分布后，再进行比较。各统计指标均以（）表示。采用直线相关分析法分析相关指标间相关性，计量资料的组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PBMCs产生的VEGF水平的动态变化
PBMCs培养产生的VEGF水平在不同培养时间段呈动态变化，用“PBMC-VEGF”表示PBMCs培养产生的VEGF水平。为了便于观察，首先对AMI发病第1天分离的PBMCs培养产生的VEGF进行统计分析。见表1。从表中可见PBMC-VEGF水平随着培养时间的延长而逐渐增加，在12 h和24 h时均显著高于对照组（P＜0.05）。取培养24 h的PBMCs产生的VEGF量作为观察PBMCs分泌VEGF能力的统计指标。AMI患者从发病第1～15天，PBMC-VEGF水平呈动态变化。见表2。从表中可见，AMI组PBMC-VEGF水平从发病第1天开始升高，在第5天达峰值为（343.2±82.5）pg/mL，显著高于对照组的（143.3±24.2）pg/mL（P＜0.05）。随后呈下降趋势，但仍显著高于对照组，到发病第15天PBMC-VEGF水平仍显著高于对照组（P＜0.05）。
2.2 VEGF与心肌酶CK的相关性
AMI患者心肌酶峰值CK为929.8～3 827.2 IU/L，平均（2 185.9±320.3）IU/L。为了探讨VEGF水平与急性心肌梗死时心肌酶升高的关系，对外周血单个核细胞PBMC-VEGF水平与CK峰值进行线性相关分析，PBMC-VEGF峰值与CK无显著相关性。
2.3 VEGF水平与左室收缩功能的关系
为了探讨VEGF水平与左室收缩功能（LVEF）的关系，将入院时LVEF水平（52.3±2.6）%与半月后（出院时）复查的LVEF水平（52.7±2.8）%进行比较，结果两者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。将LVEF水平分成两组，A组为AMI患者半月后复查时LVEF水平不低于入院时LVEF水平，有12例，B组为AMI患者半月后复查时LVEF水平低于入院时LVEF水平，有16例，然后分别比较A、B两组PBMC-VEGF水平之间的关系。见表3。
3 讨论
VEGF是现今发现的众多血管生长因子中最有力的血管生成因子，VEGF通过与细胞表面的特异受体结合而发挥作用，目前发现有3种特异受体分别为flt-1、flk-1/KDR和flt-4，属酪氨酸激酶受体家族第三亚型[1]，其中flt-1和flt-1/KDR主要在血管内皮细胞表达，在人的冠状动脉内皮细胞和心肌细胞中均有高水平表达，提示VEGF在心血管系统的功能主要以旁分泌和自分泌的形式实现[2]。
本研究发现，从AMI患者外周静脉血中分离出的单个核细胞能分泌VEGF，PBMCs分泌的VEGF在AMI后即呈上升趋势，于心梗后第5天上升到最高峰，随后10 d内仍维持高值状态，且显著高于对照组，但PBMCs分泌VEGF的高峰值与心肌酶CK高峰值无显著相关性。从以上结果可见，AMI后，由PBMCs产生的VEGF水平迅速上升，目前，鲜有此类报道，其发生机制尚不清楚，可能与AMI发生后，产生VEGF的PBMCs的种类发生改变和（或）其分泌VEGF的功能得以加强有关，其发生机制有待进一步研究。Zhao等[3]发现，心肌梗死处VEGF mRNA基因表达在AMI后2 h就迅速增高，12 h达高峰。引起VEGF表达增加的原因是多方面的。以上结果显示，心肌缺血、缺氧可能是刺激心肌细胞VEGF迅速高表达并在特定时间内持续的主要始动因素，AMI后分泌的生物活性物质可能是AMI亚急性期VEGF持续高表达，并维持一定时间的原因之一[4]。
在研究VEGF水平与AMI患者左室收缩功能关系时发现，左室收缩功能有改善的AMI患者，其PBMC-VEGF水平显著高于左室收缩功能下降的AMI患者。推测AMI患者左室收缩功能的改善可能与PBMCs产生的内源性VEGF在参与修复损伤血管内皮和促进血管生成方面有密切关系。VEGF是迄今所发现最强的一种血管内皮生长因子，能特异地作用于靶细胞－VEC，促进其有丝分裂及血管形成。Zhao等[3]发现，梗死区有VEGF mRNA的表达，同时伴有血管密度高水平表达可持续7 d以上，提示VEGF可能参与心肌梗死的血管重建。Wu等[5]研究发现重组VEGF基因能改善AMI患者的左室收缩功能，局部梗死区心肌室壁异常运动也明显改善。以上结果显示，通过有效方法使特定部位的内源性VEGF基因和蛋白表达升高到一定程度，就能充分发挥其促血管生成，增加缺血心肌灌注，改善AMI患者左室收缩功能。
单个核细胞不但能分泌VEGF，且能介导VEGF对炎性细胞的趋化反应，与炎性细胞在血管生成中的作用有关[6]。Ripa等[7]发现，冠心病患者建立侧支循环以改善进行性冠脉狭窄的能力与单核细胞缺氧时产生的VEGF mRNA的能力有关，建立侧支循环的患者与没有建立侧支循环的患者相比，单核细胞缺氧时VEGF mRNA表达水平有显著差异。以上结果提示，急性心肌梗死时，单个核细胞趋化、粘附在损伤的血管内皮部位，促使内源性VEGFm RNA高表达及VEGF蛋白大量生成，发挥VEGF促内皮细胞分裂、增殖、修复血管内皮和促进缺血区侧枝循环的建立等作用，增加缺血区血流灌注，抑制缺血、梗死范围的进一步扩大，达到改善心脏收缩功能的作用。推测在AMI发生时，通过促进粘附在冠状动脉内皮损伤处PBMCs产生的VEG FmRNA高表达，可达到改善AMI患者心功能目的，详细的机制有待更深入的研究。
在AMI患者急性期，由PBMCs产生的VEGF在改善左室收缩功能方面可能起重要作用。
[参考文献]
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心肌细胞 篇4
1材料和方法
1.1 对象
1.1.1 病例组
冠心病的诊断依据WHO标准并经PTCA、超声心动图、MR、CT等证实, 其中48例AMI (男28例, 女20例) , 年龄 (58.3±10.1) 岁。其中20例下壁梗死 (男12例, 女8例) , 28例前壁梗死 (男16例, 女12例) 。81例不稳定型心绞痛 (UAP) (男56例, 女25例) , 年龄 (61.0±7.4) 岁, I级15例, II级28例, III级38例。
1.1.2 对照组
健康查体者40例 (男30例, 女10例) , 年龄 (41.0±11.3) 岁。经病史、体检、心电图、心肌酶谱、超声心动图等检查, 除外器质性心脏病。
1.2 方法
1.2.1 样本采集
对照组体检时静脉采血1次, AMI组和UAP组分别于入院时静脉采血1次。4℃3000转/min离心分离血清, Backman-counit公司生产的Access全自动微粒与化学发生免疫分析仪, 测定血清cTnI和SF。β2 MGRIARit由北京原子原研究所提供, HS-CRP采用超敏免疫片浊法。
1.2.2 统计学方法
数据以
2结果
2.1 正常对照组与AMI、UAP患者血清HS-CRP、SF、β2
MG和cTnI的检验结果 (详见表1) 。
2.2 HS-CRP、SF、β2 MG和cTnI的特异性与AMI出现症状后3、6、9
h的敏感性 (详见表2) 。
注:与对照组比较, *P<0.01, **P<0.001
48例AMI的血清HS-CRP、SF、β2 MG和cTnI的水平较之正常对照组明显增高, 而81例UAP较之正常对照组为增高。
cTnI的特异性明显高于HS-CRP、SF、β2 MG, 而AMI出现症状后, 9 h敏感性亦明显高于HS-CRP、SF和β2 MG。
3讨论
AMI是临床常见的多发病, 如何及时正确地诊断和救治对挽救濒死心肌、改善预后、降低急性期病死率和死亡率具有重要意义。由于急性冠脉综合征 (ACS) 临床和病理生理研究的深入, 炎性反应在ACS发生发展中的作用已引起人们的关注。而HS-CRP是常见的炎性反应指标, HS-CRP水平增高与动脉样硬化形成过程密切相关。HS-CRP被视为粥样病灶不稳定的标志之一, 故能以HS-CRP评估心肌损伤的程度, 判断预后的病程变化。48例AMI和81例UAP的HS-CRP水平明显高于正常对照组 (P分别<0.001和<0.01) , 肌损伤的程度与HS-CRP的增高水平密切相关, 从而表明HS-CRP是动脉粥样硬化病变进展过程中, 反应疾病演变的一个重要标志之一, 随着AMI入院后病情逐渐平衡, 动脉粥样斑块趋于稳定, HS-CRP水平逐渐下降[1]。
冠心病 (CHD) 是指冠状动脉样硬化 (AS) 引起的管腔狭窄和阻塞所致的病变, Sullivan认为:铁催化LDL的氧化是斑块形成的主要原因, 氧化的LDL引发巨噬细胞, 将脂质大量内吞, 产生泡沫细胞, 在血管内皮下, 聚集形成斑块, 引起血管损伤。这一假说被大量的研究证实。48例AMI, SF明显增高 (P<0.001) , 而81例UAP, SF增高 (P<0.01) 。SF水平较低者, AS进展缓慢, SF持续高水平者AS进展较快, 说明CHD的发生、发展过程中, SF和LDL起着协调促进作用[2]。
β2 MG在AMI发病机制中的作用可能是与其他大分子物质形成复合物, 循环中的β2 MG-IgG复合物易被某些器官, 如心脏 (包括心内膜) 所截留, 为心脏的局部病变提供了重要基础, 最终使冠状动脉痉挛, 导致心肌缺血、梗死。由于β2 MG对心肌的损害, 可使心肌变性成为自身免疫损害, 使心肌的损伤进一步加重。所以, 81例UAP血清β2 MG为 (4.83±1.57) μg/L, 明显高于正常对照组 (P<0.01) , 而48例MAI血清β2 MG为6.01±1.83 μg/L, 增高更明显 (P<0.001) 。随访中发现AMI和UAP血清β2 MG水平>5.2 μg/L, 再次发生心肌梗死;<5.2 μg/L的AMI和UAP治疗明显好转, 无1例发生梗死。总之, 血清β2 MG水平增高导致血管内膜损伤, 血小板聚集和血管痉挛, 三者的相互作用导致心肌梗死。
cTnI是一种特异心肌收缩调节蛋白, 位于心肌纤维蛋白中, 在心肌细胞膜完整的情况下, 不能透过膜进入循环, 所以正常人血清cTnI水平很低。40例正常对照血清cTnI为 (0.011±0.006) ng/ml, 心肌细胞早期损伤时, 游离于膜浆内的cTnI快速释放入血循环, 血清cTnI水平于3～5 h增高, 肌原纤维不断崩解破坏, 以固定形式存在的cTnI不断释出, 血清水平于24 h达高峰, 5～10 d后降至正常。48例AMI血清cTnI为 (0.090±0.028) ng/ml (P<0.001) , 而81例UAP血清cTnI为 (0.058±0.012) ng/ml (P<0.01) 。AMI是心肌的急性缺血性坏死, 在冠状动脉病变的基础上, 发生冠状动脉供血急剧减少或中断, 使相应的心肌严重而持久地急性缺血所致, 病理表现为心肌细胞凝固性坏死、嗜酸性增强, 出现肌浆凝聚和肌原纤维溶解[3]。
从表2说明, AMI时HS-CRP、SF、β2 MG和cTnI的特异性分别为55.8%、50.4%、61.3%和98.2%, 以cTnI为最高;而敏感性虽然HS-CRP、SF、β2 MG和cTnI随AMI持续而增高, 但以cTnI为最高。因此, 笔者认为:血清cTnI不愧是MAI诊断和治疗、随访的新方法, 应以推广。
摘要：目的研究心肌细胞损伤标志物与急性心肌梗死的关系。方法检测并分析急性心肌梗死 (AMI) 患者血清心肌细胞损伤标志物HS-CRP、SF、β2MG和cTnI水平改变。结果①AMI患者血清HS-CRP、SF、β2MG和cTnI水平较正常对照组明显增高, UAP患者血清HS-CRP、SF、β2MG和cTnI水平较正常对照组增高;②血清CTnI水平诊断AMI的特异性明显高于HS-CRP、SF、β2MG, AMI出现症状后9h血清cTnI诊断敏感性明显高于HS-CRP、SF和β2MG。结论AMI患者血清HS-CRP、SF、β2mg和cTnI水平升高, 血清cTnI水平是AMI诊断和随访较好指标。
关键词：急性心肌梗死,心肌细胞损伤标志物,肌钙蛋白I
参考文献
[1]Braunwald E, Antman EM, BeasleyJW, etal.ACC/AHAguide-lines for the management of patients with unstable angina and non-st-segement elevation myocardial infarction a report of American College of Cardiology/American Heart Association task force or parcitce guideline.J Am Coll Cariol, 2000, 36 (3) :970.
[2]肖创清, 何云南.血清铁蛋白放射免疫分析的临床应用价值.放射免疫学杂志, 2005, 18 (1) :60.
心肌细胞 篇5
1 材料和方法
1.1 材料:
选择雄性SD大鼠15只,清洁级,由中山大学实验动物中心提供。18～251饲养,正常进食及水。大鼠体质量200～250g,动物随机分为假手术组、模型组和实验组,每组5只。实验第七天处死大鼠,实验组取注射Ang-2部位及周围心室组织,假手术组和模型组取相应部位组织,迅速冷冻在液氮中做检测用。
1.2 方法:
动物模型构建:建立大鼠心肌梗死模型按照文献上的方法[1],将大鼠用水合氯醛腹腔注射麻醉。气管插管后接人工呼吸机辅助呼吸。在左胸第四肋骨～第五肋骨间做横切口,在肺动脉圆锥与左心耳交界稍下一处用无创缝线结扎左冠状动脉前降支,以结扎部位以下心肌变白,搏动减弱,心电图出现段弓背向上明显抬高为造模成功。在心肌变白边缘及结扎部位与心尖连线中点交汇处模型组注射50μl生理盐水,实验组注射100ng (50μL) Ang-2。假手术组的大鼠于开胸后不结扎冠状动脉,仅在相应部位用无创针空穿一次,关胸。开胸前后即时记录导联心电图。
1.3 心肌细胞的凋亡情况检测:
①原位末端脱氧核昔酸转移酶介导的生物素脱氧尿嗜Ni核昔酸原位缺口末端标记法,采用Roche公司检测试剂盒,按试剂盒说明书操作,镜下观测阳性标记的细胞数,即凋亡细胞数。②流式细胞仪Annexin V/P1双标检测法:取各鼠心肌组织50mg,机械破碎,加人D-Hank's液500μL,振荡器混匀,过35μm尼龙网,用D-Hank’s液调整细胞量至2x106,加人稀释的由异硫氰酸荧光素标记的Annexin V (购于Coulter公司)5μL和稀释的PI 5μL,冰孵育10 min,上机。AnnexinⅤ阳性细胞即凋亡细胞。
1.4 Bcl-xl和Caspase-3的mRNA表达
Trizol法提取总RNA进行RT-PCR检测。Bcl-xl和caspase-3mRNA引物由上海博亚生物技术公司合成,引物序列分别如下:bcl-xl:正链5'TTCGGGATGGAGTAAACTGG3';负链5'TGTCTGGTCACTTCCGACTG3';318 bp;Caspase-3:正链5'CAC GAGCAGAGT CAA AGG3'负链5'TTC AAC AAGCCA ACC AAG3',206 bp。RT反应体系:42℃90 min合成cDNA第1链,75℃15 min灭活逆转录酶。PCR反应体系热循环参数:变性94℃,30s;退火59℃,1 min;延伸72℃,1min;共30个循环,末次循环后72℃延伸7 min。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统成像,用各条带的OPTDI(面积与平均光密度之乘积)与β-actin OPTDI的比值作为其相对表达量。
1.5 统计学分析:
计量资料用means±SD表示,采用SPSS11.0软件进行单因素方差分析比较,P<0.05表示两组差异有统计学意义。
2 结果
心肌细胞凋亡情况的原位缺口末端标记结果见图1:如图Ⅰ 所示,假手术组见少许标记的凋亡阳性细胞,模型组出现较多阳性标记细胞,实验组原位缺口末端标记法阳性细胞数最多,明显高于假手术组和模型组。各组之间比较差异有显著性意义。
A:假手术组,可见少量凋亡细胞;B:模型组,凋亡细胞明显比假手术组多;C:实验组,可见凋亡细胞最多。箭头所指为凋亡细胞。
心肌细胞凋亡情况的流式细胞仪Annexin V/PI双标检测结果见表1:如表1所示,假手术组细胞凋亡(Annexin V阳性细胞)数约为于5%,模型组凋亡细胞数目明显增加,约为12%,实验组凋亡细胞数目最多,约为18%。各组相比差异具有显著性。
n=5,与假手术组比较*P<0.01,与模型组比较##P<0.01。
心肌组织bcl-xl及Caspase-3 mRNA表达。各组心肌组织Bcl-x1和Caspase-3 mRNA的相对表达见图2。从图2可以看出Bcl-xl mRNA表达在假手术组最高,实验组表达最低,他们之间的比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。Caspase-3 mRNA的表达则正好与Bcl-xl mRNA表达相反,在假手术组最低,实验组表达最高,它们之间的比较差异有统计学意义(P<0.01)。
A:Ang-2对心肌组织Bcl-xl及Caspase-3 mRNA表达的影响;B:Bcl-x1及Caspase-3 mRNA表达半定量结果。n=5,与假手术组比较*P<0.01,与模型组比较#P<0.05,##P<0.01。
3 讨论
治疗性血管新生是近年来缺血性疾病治疗的研究热点,为急性心肌梗死的积极治疗提供了新思路。血管生成素(angiopoietin,Ang) 家族是近年来发现的一个既含受体激动剂又含受体抑制剂的促血管生成家族,他们在新生血管萌芽、形成过程中其重要作用[2]。然而,MaisonpieITe等[3]在Ang-2转基因的小鼠胚胎模型中发现,过表达Ang-2的小鼠胚胎的心血管缺陷表型比Ang-1及Tie-2受体敲除的小鼠更严重,特别是血管壁的不完整性及不连续性尤为明显,因此推测其机制可能与Ang-2直接促进内皮细胞凋亡等有关。我们以前的研究结果也显示通过小干扰RNA抑制内皮细胞Ang-2的表达可抑制H2O2诱导的细胞凋亡[4]。Ang-2参与了细胞凋亡和死亡的调节。Ang-2是否会诱导缺血部位心肌细胞凋亡呢?我们通过在心肌缺血部位直接注射Ang-2来对心肌细胞凋亡进行观察,结果发现Ang-2具有促进缺血部位心肌细胞凋亡作用,Ang-2干预组心肌细胞凋亡数明显多于假手术组和单纯缺血组。由此, 利用Ang-2诱导新生血管生成来改善心肌缺血,可能会因为Ang-2对心肌细胞的损伤作用而影响心功能,从而对患者不利。最近, Winston等[5]研究也发现联合血管内皮生长因子与Ang-2治疗心肌缺血,缺血部位血管生成增多,但心功能不能改善,甚至恶化。 这也支持我们的观点,其机制可能与Ang-2具有促进缺血部位心肌细胞凋亡作用有关。
大量的研究表明,细胞凋亡受基因调控,并发现了许多与细胞凋亡密切相关的调控基因,主要有Caspase家族、Bcl-2蛋白家族、 HSP、IEGs和p53基因等[6]。凋亡发生是一个复杂的由Caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程。首先活化不同的Caspase起始因子,再由启始因子激活级联下游的Caspase效应分子,最终由效应分子特异地水解细胞中的一系列底物而导致细胞解体,并包裹形成凋亡小体。因此,Caspase家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白系统,在细胞凋亡的分子机制网络中居中心地位,其活化是细胞凋亡通路的中心环节。我们的研究结果表明Ang-2有诱导Caspase-3表达作用,Ang-2干预组Caspase-3mRNA表达明显高于假手术组和缺血模型组。此外,Bcl-2基因家族也与凋亡密切相关,在细胞凋亡的调节中,Bcl-xl是凋亡抑制基因,其表达增加可抑制细胞凋亡[7]。我们的研究结果也显示在Ang-2促进缺血部位心肌细胞凋亡作用中,Ang-2干预的实验组,Bcl-xl表达明显低于单纯的缺血组。因此,Ang-2促进缺血部位心肌细胞凋亡机制可能与其增加Caspase-3表达及抑制Bcl-xl基因表达有关。
总之,我们的研究结果表明单纯的Ang-2治疗心肌缺血,它可通过诱导心肌细胞凋亡而对心脏产生有害作用;其作用机制可能与促进Caspase-3表达及抑制Bcl-xl表达有关。要让Ang-2有效治疗缺血心肌病尚需进一步研究。
摘要：目的探讨血管紧张素对缺血部位心肌细胞凋亡的影响及可能机制。方法实验动物分假手术组、模型组和实验组。细胞凋亡情况采用原位缺口末端标记法及流式细胞仪Annexin V/PI双标检测法,检测心肌细胞凋亡情况,并通过TR-PCR法检测Bcl-xl和Caspase-3的mRNA表达。结果与假手术组比较模型组凋亡细胞增多,实验组凋亡的细胞数进一步增加。模型组Bcl-xl的mRNA表达下降,实验组下降更明显及模型组Caspase-3的mRNA表达增高,实验组表达最高。结论血管生成素2促进缺血心肌细胞凋亡,其机制可能与抑制Bcl-xl表达及促进Caspase-3表达有关。
关键词：血管生成素2,心肌细胞,凋亡
参考文献
[1]JOHNS TN,OLSON BJ.Experimental myocardial infarction.I.A method of coronary occlusion in small animals[J].Ann Surg, 1954,140(5):675-682.
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[3]Maisonpirre PC,Suri C,Jones PF,et al.Angiopoietin-2,a natural antagonist for Tie-2 that disrupts in vivo an giogenesis[J].Science, 1997,277(5322):55-60.
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心肌细胞 篇6
1材料与方法
1.1实验材料SD大鼠(180g~200g)购自上海莱斯克动物有限公司;Bax一抗购自美国Abcam公司; HRP-羊抗鼠二抗购自santa cruz公司;脂质体和Tri- ozol购自Invitrogen公司;SYBR Green通用型qPCR Master Mix购自罗氏生物;Real-time PCR扩增仪购自Applied Biosystems;逆转率试剂盒购自TAKARA公司;经修饰的Bax-siRNA由吉玛生物合成;;TUN- NEL试剂盒购自罗氏生物;TTC染液购自南京森贝伽生物科技有限公司。
1.2急性心肌梗死大鼠模型构建及治疗45只大鼠随机分为假手术组、心梗组和Bax干扰组。所有大鼠采用10%的水合氯醛麻醉,固定大鼠并打开胸腔,假手术组不做左冠状动脉前降支结扎。心梗组和Bax干扰组大鼠开胸后行左冠状动脉前降支结扎术。模型构建成功标志为:大鼠左心室前壁苍白,多导生理记录仪显示大鼠心电标准 Ⅱ 导联,ST段抬高和(或)T波抬高。手术结束后所有大鼠关闭胸腔,手术切口注射青霉素抗感染。假手术组和心梗组在术前12h心肌组织内注射100μL脂质体,Bax干扰组大鼠术前心肌注射脂质体与Bax siRNA的混合物100μL。术后72h处死大鼠,取心肌组织进行指标分析。
1.3大鼠心肌组织Bax mRNA表达水平变化大鼠心肌组织0.1g加入1 mL riozol中匀浆,然后加入2 0 0μL三氯甲烷振荡混匀,冰上静置分层,1 2 0 0 0 r/min离心15min,上清加入等体积的异丙醇中,冰上放置30min使RNA沉淀,然后12 000r/min离心15 min,弃上清,沉淀部分用预冷的75%乙醇溶液洗涤2次,8 000r/min离心10min,沉淀用DEPC水处理的双蒸水溶液中。 分光光度仪测量RNA浓度采用TAKARA逆转录试剂转录成cDNA。
设计大鼠Bax的PCR引物,引物序列如下:Bax- F:5′-GGCGATGAACTGGACAAC-3′;Bax -R:5′- CCGAAGTAGGAAAGGAGGC-3′。引物由上海英俊生物公司合成。对引物特异性和退火温度进行优化。 然后按照下述反应体系制备反应混合物:2×SYBR Green通用型qPCR Master Mix 10μL,上游/下游引物各(10μmmol/L)各1μL,cDNA 1μL,补双蒸水至终体积为20μL。根据检测样本的数量配制相应的体积,对应加入PCR板中,每孔20μL。1 500r/min离心将反应混合物甩至管底,根据下列反应条件进行PCR:预变性:95 ℃,30s;变性:95 ℃,3s;退火延伸: 60 ℃,30s;构建溶解曲线。 最后从实时荧光定量PCR仪上直接读取数据。
1.4大鼠心肌组织Bax蛋白质表达水平变化大鼠心肌组织取出后用10%甲醛固定,石蜡包埋,切片,经抗原修复后,切片用3%过氧化氢-甲醇液室温处理20 min,清除内源性的过氧化氢酶,PBST洗涤3次,每次5min。用10%山羊血清37℃封闭30min,然后滴加一抗工作液4 ℃孵育过夜;次日37 ℃回温30min后用PBST洗涤3次,每次5min;在切片上滴加二抗工作液37℃孵育30 min,然后PBST洗涤3次,每次5 min;DAB显色,苏木精复染,盐酸酒精返蓝。然后梯度脱水,中性胶封片。评定方法:每张切片随机选取10个视野,放大400倍,采用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对免疫组化进行半定量分析。
1.5大鼠心肌组织梗死范围分析大鼠心肌组织切成厚度2mm的薄片,置于1%的TTC磷酸缓冲液中37 ℃染色20min。理论上正常组织应该为红色,梗死组织为白色。然后再显微镜下将梗死组织与正常心肌组织分开,用分析天平称取正常组织和梗死组织的湿重,梗死范围为梗死组织重量占左心室总质量的百分数。
1.6大鼠心肌细胞凋亡指数心肌组织切片经抗原修复脱蜡后,PBST洗涤3次,每次5min。此后步骤严格按照TUNEL试剂盒操作说明进行操作。观察时标本放大400倍,随机选取梗死区和周边区域10个视野,计算凋亡细胞占总细胞的比例作为心肌细胞的凋亡指数。
1.7统计学处理采用SPSS 17.0统计学软件分析, 计量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组计量资料采用方差分析,组间两两比较采用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1大鼠心肌组织Bax mRNA和蛋白质水平变化(见图1) 与假手术组比较,心梗组和Bax干扰组大鼠心肌组织中Bax mRNA和蛋白质水平明显升高(P<0.05)。Bax干扰组大鼠心肌组织中Bax mRNA和蛋白质水平较心梗组明显下降(P<0.05)。
2.2大鼠心肌组织梗死范围比较(见图2) 采用TTC染色法分析了大鼠心肌梗死模型不同处理后大鼠心肌组织梗死范围变化,心梗组和Bax干扰组大鼠心肌组织梗死范围较假手术组明显增加(P<0.05)。 而Bax干扰组大鼠心肌组织梗死范围较心梗组明显下降(P<0.05)。
2.3大鼠心肌细胞凋亡指数比较大鼠心肌细胞的凋亡主要存在于梗死边缘,而远离梗死区细胞凋亡水平较低。假手术组大鼠心肌凋亡指数仅为(3.54± 1.02)%,而心梗组和Bax干扰组大鼠心肌细胞的凋亡指数分别为(51.32±7.02)%和(20.45±6.77)%。心梗组和Bax干扰组心肌细胞凋亡指数明显高于假手术组(P<0.05)。Bax干扰组大鼠心肌细胞凋亡指数明显低于心梗阻(P<0.05)。
3讨论
急性心肌梗死发生后除了心肌坏死外,心肌细胞凋亡也是急性心肌梗死后心肌发生的另一重要的生物学过程,急性心肌梗死后心肌细胞凋亡主要位于缺血坏死边缘,而远离梗死区心肌细胞凋亡较少［８］。这一结果与本研究相一致。心肌细胞凋亡可导致心肌细胞的大量丢失,进一步增加心肌损伤,促进了疾病的发展。因此有效的降低心肌细胞凋亡对降低急性心肌梗死患者疾病进展,争取更多的治疗时间有着重要的意义。细胞凋亡是一个高度调控的过程,此过程受到诸多的细胞因子和调节蛋白的参与,其中Bax蛋白是细胞凋亡途径中重要的分子。Bax蛋白是Bcl-2家族成员之一,其与Bcl-2的比例直接决定着细胞的命运。 近年来,临床研究显示在急性心肌梗死后数小时内,心肌组织中的Bcl-2表达量会有一定程度的增加,其可抑制心肌细胞的凋亡,起到保护心脏的作用,但是这种高表达只能短暂的,在疾病进展数小时后,心肌细胞中Bcl-2蛋白很快消失,继而出现Bax蛋白的高表达, Bax蛋白高表达使细胞命运趋于凋亡,其可通过与Bcl-2形成异源二聚体或者自身形成同源二聚体,介导细胞的凋亡,在急性心肌梗死组织中则而表现出心肌细胞大范围凋亡［９，１０］。因此有效的预防急性心肌梗死患者心肌组织中Bax蛋白的高水平表达可能对急性心肌梗死患者心肌组织具有一定的保护作用。RNA干扰技术是利用双链RNA高效、特异性降解细胞内同源信使RNA,从而阻断特定基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型方法［１１，１２］。
本研究采用RNA干扰技术沉默了急性心肌梗死大鼠心肌组织中的Bax,分析其在急性心肌梗死大鼠心肌保护中的作用。
本研究设计的并经特殊修饰的Bax siRNA可在体内起到抑制Bax表达的作用,结果显示,在经Bax siRNA处理后大鼠心肌组织中Bax mRNA和蛋白质水平较心梗组明显下降。实验进一步分析了Bax沉默对急性心肌梗死大鼠心肌梗死范围的影响,显示经Bax siRNA处理的大鼠心肌梗死范围较心梗组大鼠明显下降,但是仍然高于假手术组,提示Bax沉默可降低急性心肌梗死大鼠心肌梗死范围,起到保护心肌功能的作用。在心肌细胞凋亡方面,Bax siRNA明显降低了急性心肌梗死大鼠心肌细胞的凋亡,与心梗组比较具有统计学意义。Bax基因沉默可显著降低急性心肌梗死大鼠心肌组织的梗死范围,同时降低心肌细胞的凋亡指数,对心脏功能具有一定的保护作用。
摘要：目的 探讨RNA干扰Bax对急性心肌梗死大鼠心肌细胞的保护作用。方法 采将45只大鼠随机分为假手术组、心梗组和Bax干扰组,采用结扎左冠状动脉前降支建立急性梗死大鼠模型,术后假手术组和心梗组心肌内注射脂质体,Bax干扰组心肌注射脂质体与Bax siRNA的混合物。治疗后72h处死大鼠,取心肌组织,采用荧光定量PCR和免疫组化分析心肌组织中Bax mRNA和蛋白质水平,采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色法测定心肌梗死范围,并用TUNEL染色法分析心肌细胞凋亡指数。结果 与假手术组比较,心梗组大鼠Bax mRNA和蛋白质明显增加(P<0.05)。与心梗组比较,Bax干扰组大鼠Bax mRNA和蛋白质水平明显下降(P<0.05)。与假手术组比较,心梗组和Bax干扰组心肌梗死范围明显增加(P<0.05)。与心梗组比较,Bax干扰组大鼠心肌梗死范围明显下降(P<0.05)。与假手术组比较,心梗组和Bax干扰组大鼠心肌细胞的凋亡指数明显增加(P<0.05)。与心梗组比较,Bax干扰组大鼠心肌细胞凋亡指数明显下降(P<0.05)。结论 Bax基因在大鼠心肌梗死模型心肌组织中的沉默可明显降低心肌梗死范围,降低心肌细胞的凋亡,对心肌具有很好的保护作用。
心肌细胞 篇7
关键词：干细胞,胚胎干细胞,心肌细胞,定向分化,分子机制,临床应用
心血管病被称为人类健康的“三大杀手”之一,发病率逐年提高,是目前全球发病率最高的疾病。由于成年心肌细胞再生能力有限,心脏移植成为治疗慢性心力衰竭的唯一有效手段。但由于供体有限、免疫排斥、手术及术后维护价格昂贵等原因,使得心脏移植手段不能在患者中大规模实行。因此,临床上迫切需要一种更好的治疗方法。 人类胚胎干细胞( hESCs) 的研究使心脏病患者看到了希望,是近年来医学及生物研究领域的热点和前沿。目前,胚胎干细胞可以被诱导分化为心肌细胞［1］,移植到体内具有很强的扩增能力并能够行使一定的生理功能［2］,而基于细胞的心脏治疗已经进入二期和三期临床试验。人类胚胎干细胞系的建立及向心肌细胞诱导分化的研究为再生医学的临床应用提供了新的细胞来源,为hESCs分化为心脏的基因表达和功能研究奠定了基础。
1 hESCs定向分化为心肌细胞的分子机制
由hESCs诱导为心肌细胞时可通过多种途径,包括生长因子诱导分化、转基因分化、END - 2 细胞共培养等。通常以悬滴培养制备拟胚体( EBs) ,然后经过贴壁培养诱导得到具有自主节律收缩的EBs和心肌细胞,见表1。
注: 资料来源于参考文献[3]。
心肌细胞的搏起频率在不同时期存在变化,直接贴壁法诱导分化的心肌细胞在第11 ~ 15 d是细胞团出现跳动的主要时间区,平均跳动频率为( 63. 0 ±7. 0) 次/ min,持续跳动时间能维持3 个月以上［4］。对小鼠胚胎干细胞分化的研究发现,贴壁时间是影响分化的重要因素,4 d内贴壁可以显著抑制其向心肌分化,其机制可能是EBs贴壁激活了酪氨酸蛋白激酶( Src)［5］。
hESCs的分化还受离子通道、收缩反应、细胞受体、电刺激等因素协同作用。在研究周期性拉伸对心肌细胞作用时发现,钠离子电压门控通道Nav1. 5 表达上调5. 25 倍,钾离子通道Kir2. 1 则上调3. 23倍［6］。说明功能性心肌细胞的形成与离子通道和细胞收缩现象的出现密不可分。肾上腺素的刺激效应能够被其受体阻滞剂所阻断,乙酰胆碱能降低心肌细胞的搏起频率并且高浓度时能使心肌细胞停搏,因此心肌细胞的搏动频率能够被不同受体所控制［7］。此外,在一定电刺激环境下可以促进心肌细胞特异性基因HCN1、MLC2V、SCN5A、SERCA、Kv4. 3 和GATA4的表达,从而促进心肌细胞的分化和成熟［8］。
2 hESCs及来源于hESCs的心肌细胞在药物发现、筛选和毒性检测中的作用
药物开发中毒性检测是必要步骤,而对心肌细胞毒性的检测是极其重要的一个环节。人类胚胎干细胞诱导的心肌细胞( hESC - CMs) 在体外培养条件下,功能性离子通道数目增加,心肌细胞特异性基因MLC - 2a、ANF、α - MHC等表达量增加,在肌动蛋白和电生理特性上相当于幼稚型心肌细胞,能够用于药物的筛选,并且不存在伦理问题,试验周期短,成本低,容易建立体外模型。心肌药物筛选着重于对心肌细胞电生理、收缩特性及心肌损伤标志物的检测。
心肌细胞的电生理现象主要包括动作电位、离子电流、细胞耦联等。通常通过对最大舒张电位、极化速率、动作电位时程、动作电位振幅、搏动频率、去极化速率等研究来反映心肌细胞的生理状态。其中离子电流是hESC - CMs搏动的基础,任何影响离子通道的药物均可引起心律失常。如L - 型钙离子通道阻滞剂硫氮酮能够降低hESC - CMs的搏动频率甚至使其停搏［9］。hERG ( IKr) 通道在动作电位复极时起着重要作用,E - 4031 是该通道抑制剂,可以使场电位时程( FPD) 延长,降低hESC - CMs的搏动频率［10］。此外还有研究发现,某些心脏药物如奎尼定、丙胺苯丙酮可以增加搏起频率,而普鲁卡因、美西律、氟卡尼则没有类似的效用。由此可见,hESC - CMs对心率不齐药物敏感,可用来评价药物导致的心律不齐等毒性。
而对我国传统中药的研究发现,黄芩、葛根、丹参、银杏等中药的有效成分黄酮苷可以改善小鼠心脑血管系统,促进hESC - CMs的形成; 人参、三七等中药的有效成分皂苷可以抗心肌缺血,促进心肌局部糖皮质激素的分泌,从而诱导胚胎干细胞分化为心肌样细胞［11］。因此,由我国传统中药提取的有效成分可以作为现在流行西药的发展和补充。
3 hESCs及其诱导的心肌细胞在再生医学研究中的应用
hESCs具有分化的全能性,在体外可以被诱导分化为多种类型的心脏细胞,包括心室肌、心房肌、结细胞及浦肯野细胞,因此hESCs在心肌修复及心肌再生方面有重要应用价值。基于hESCs、hESCs源性心肌细胞的细胞治疗及体外构建三维组织,经组织移植进行心肌的修复与再生。细胞移植受到普遍关注,如在心肌梗死动物模型中,患心肌梗死的猪在第14 天通过胸腔镜引导注射hMSCs至梗死边缘区,进行心脏梗死面积和血流动力等方面的观测研究,结果一段时间后心梗面积减少,心脏收缩和舒张恢复良好［12］。心肌组织移植是将hESCs与具有良好的生物相容性和一定生物力学特性的支架材料复合,在体外或者体内构建出可供移植的组织物。因此,得到良好的支架材料是其应用的重点,而腹膜高度血管化,经适当处理后得到的大网膜可以作为心肌细胞的支架,其保留的血管网、黏附分子及糖胺聚糖有利于心肌细胞血管网的重建。最近研究发现,将新生大鼠的心肌细胞接种到经过低渗、冷冻、解冻、脱水、脱脂、水化等步骤处理的猪大网膜基质上,在第3 天进行肌钙蛋白和胶原蛋白双染色,其共聚焦图像能够发现细胞和基质已经存在相互作用,第7 天发现组织细胞存在收缩能力,并且细胞与支架之间的间隙被逐渐填补［13］。不管对于细胞移植还是心肌组织移植,它们在试验中的良好表现均预示了其在将来临床应用中具有美好的前景。
4 hESCs及其诱导的心肌细胞在应用过程中所面临的问题
心肌细胞 篇8
1 材料和方法
1.1 材料
选用普通级SD雄性成年大鼠 (重庆市中药研究院实验动物中心提供, 生产许可证号:SCXK (渝) 2007-0006) 50只, 体重250～280 g。
1.2 仪器
BSM-7105K 床边监护仪 (上海光电医用电子仪器有限公司) ;动物人工呼吸机 (浙江大学医学仪器厂DH150) ;UV751GD紫外/ 可见分光光度计 (上海分析仪器厂) ;J E M-1200EX型透射电子显微镜 (日本电子公司) ;LKB 超薄切片机 (LEICA EMC6型LEICA公司) ;流式细胞仪 (美国贝克曼库尔特有限公司) 。
1.3 试剂
葡萄糖酸锌: 天津市光复精细化工研究所 (批号: 2010-05-10) ;肌酸激酶试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒: 南京建成生物工程有限公司。Annexin-V- FITC∕ PI细胞凋亡检测试剂盒 :北京宝塞生物技术有限公司。
1.4 方法
1.4.1 心肌缺血再灌注损伤模型制备
大鼠心肌缺血再灌注损伤实验模型[1]:取雄性SD大鼠, 以乌拉坦 (1 g/kg) 腹腔注射。描记肢体Ⅱ导联心电图。气管插管, 自左侧第1～3肋开胸, 采用人工呼吸机正压呼吸。暴露大鼠心脏后, 拉紧结扎线, 使硅胶管压迫冠状动脉左前降支而致闭塞, 切断结扎线再通。①假手术组, 只穿线不结扎;②葡萄糖酸锌167 (1/15LD50) , 250 (1/10LD50) , 357 (1/7LD50) mg/kg剂量组, 分别以相应剂量葡萄糖酸锌 (溶于蒸馏水中, 2 ml) 灌胃, 2 ml/次, 上下午各1次, 依据葡萄糖酸锌的半衰期:t1/2= (2.46±0.30) h[2], 故两次灌胃给药间隔时间为2.5 h。于末次灌胃1 h后行冠状动脉左前降支结扎30 min, 再灌注60 min;③缺血再灌注模型组, 给予葡萄糖酸锌各剂量组等容量的0.9%氯化钠注射液灌胃, 其他处理同上。
1.4.2 CK和LDH活性测定
于实验结束后立即于左颈总动脉取血5.0 ml, 待测血清肌酸激酶和乳酸脱氢酶活性。
1.4.3 流式细胞仪检测细胞凋亡
于实验结束后立即取心尖及左室心肌组织5 mm3, 4℃冰0.9%氯化钠注射液洗去血污, 用Annexin-V-FITC/PI流式细胞仪检测细胞凋亡。将心肌组织制成细胞悬液, 细胞浓度为1×109/L。取1 ml细胞, 1000 r/min, 4℃离心10 min, 弃上清。加入1 ml冷的磷酸盐缓冲液, 轻轻震荡使细胞悬浮。重复上述步骤2次。将细胞重悬浮于200 μl BindingBuffer。加入10 μl AV和5μl PI, 轻轻混匀, 室温避光反应15 min。加入300 μl Binding Buffer, 在1 h内上机检测。
1.4.4 电镜观察心肌细胞超微结构
于实验结束后立即取心尖及左室心肌组织1 mm3, 4℃冰0.9%氯化钠注射液洗去血污, 常规电镜样品包埋, 半薄切片, 光镜选区定位, 超薄切片, 铀、铅双染, 透射电镜下观察心肌细胞超微结构变化。
1.5 统计学分析
采用SPSS 12.0软件进行统计学处理。所有数据以
2 结果
2.1
各组大鼠心肌缺血再灌注心律失常发生率及ST段指标的变化, 见表1。
2.2
各组大鼠血清中CK、LDH活性及心肌细胞凋亡指数的变化, 见表2。
注:与假手术组相比aP< 0. 01; 与缺血再灌注模型组相比bP< 0. 01
注:与假手术组相比aP< 0. 01; 与缺血再灌注模型组相比bP<0. 01
2.3
各组大鼠心肌细胞超微结构的变化, 见图1。
2.3.1 假手术组
心肌细胞肌丝排列整齐, 粗细肌丝清晰可见, 肌节明暗带清楚, 线粒体结构正常, 嵴排列规则, 核膜清晰完整。
2.3.2 缺血再灌注模型组
心肌细胞肌丝排列疏松、紊乱, 局部肌丝断裂、溶解, 肌丝明暗带模糊不清, 线粒体嵴部分断裂, 有空泡, 核膜不清晰。
2.3.3 葡萄糖酸锌低剂量组
较模型组心肌纤维超微结构损伤程度有所减轻, 心肌细胞肌丝排列较规则, 肌丝明暗带欠清楚, 局部肌丝断裂、溶解, 线粒体肿胀减轻, 嵴部分断裂, 有空泡, 核膜不清晰。
2.3.4 葡萄糖酸锌中剂量组
心肌细胞肌丝排列较规则, 肌丝明暗带较清楚, 线粒体肿胀, 嵴部分断裂, 有空泡, 核膜较清晰。
2.3.5 葡萄糖酸锌高剂量组
心肌细胞肌丝排列规则, 肌丝明暗带清楚, 线粒体肿胀, 嵴部分断裂, 有空泡, 核膜较清晰。
3 讨论
细胞凋亡是缺血再灌注 (I/R) 损伤早期细胞死亡的主要方式。其发生机制包括氧自由基学说、钙超载学说、凋亡学说等。研究者在心、脑、肝、肺、肾、肠等多种器官缺血再灌注损伤模型上均观察到细胞凋亡[3,4]。Rentsch[5]等研究证实随着冷灌注保存及再灌注时间的延长大鼠移植肝细胞凋亡数显著增加, 而且bax表达增强。张浩[6]等研究表明大鼠冷灌注保存及再灌注后肝脏均有肝细胞凋亡发生, 且呈阶段性。在冷灌注保存肝组织中可检测到Bax及Fas, 未检测到Bcl-2, 肝移植再灌注后肝组织中可检测到Bax、Fas及Bcl-2。许多研究表明, 锌可调控细胞凋亡。多数学者认为锌可抑制细胞凋亡, 其机制可能与其阻断Ca2+凋亡信号的传导系统、影响蛋白激酶C信号系统以及抑制核酸内切酶等有关[7]。有研究表明补充携硒、锌、维生素E的大豆磷脂脂质体可通过保护生物膜尤其是线粒体膜而减少心肌细胞的凋亡和坏死, 发挥保护缺血心肌的效应[8]。
本实验研究结果表明, 与模型组相比, 补锌组心律失常发生率、CK和LDH活性、细胞凋亡指数均降低, 电镜观察显示补锌组心肌细胞超微结构损伤明显减轻, 心肌细胞肌丝排列规则, 肌丝明暗带清楚, 线粒体肿胀, 嵴部分断裂, 有空泡, 核膜较清晰。本研究证实葡萄糖酸锌具有保护缺血再灌注损伤心肌的作用, 其机制可能通过抑制心肌细胞凋亡和减轻心肌细胞超微结构损伤实现的。传统的补锌剂硫酸锌不易吸收, 对消化系统有副作用, 而葡萄糖酸锌则具有显效快, 生物利用度高, 副作用小, 使用方便等优点。本实验结果可为临床应用锌制剂治疗心血管疾病提供一定的理论基础。
参考文献
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[3]Jones BA, Gores GJ.Physiology and pathophysiology of apoptosis in epithelial cells of the liver, pancreas, and intestine.AmJ Physiol, 1997, 273 (6) :1174-1188.
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[5]Rentsch M, Beham A, Iesalnieks I, et al.Impact of prolonged cold ischemia and reperfusion on apoptosis, activation of caspase3, and expression of bax after liver transplantation in the rat.Transplant Proc, 2001, 33 (12) :850-1.
[6]张浩, 钱建民, 王学浩.大鼠肝脏移植再灌注细胞凋亡与凋亡调控的研究.中华实验外科杂志, 2002, 19 (4) :352-353.
[7]Muschel RJ, Bernhard EJ, Garza L, etal.Induction ofapoptosis at different oxygen tensions:evidence that oxygen radicals do not me-diate apoptotic signaling.Cancer Res, 1995, 55 (5) :995-998.
心肌细胞 篇9
1 资料与方法
1.1 一般资料
新生乳鼠 (北京大学深圳医院动物中心) ;胎牛血清;DMEM培养基;HGF;H2O2;凋亡试剂盒;5-溴脱氧尿嘧啶;一抗;二抗;α-sarcomeric actin。
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞分离培养
分步消化、差速贴壁、化学抑制法分离纯化新生SD大鼠心肌细胞后代作原代培养;已培养48h的心肌细胞饥饿处理8 h后, 分为两组:对照组加入终浓度为0.5 mmol/L的H2O2培养4 h, 研究组加入终浓度为0.5 mmol/L的H2O2和40 ng/ml HGF培养4 h。
1.2.2 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率
根据Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒使用说明, 贴壁的心肌细胞经胰酶消化后, PBS洗涤2次, 收集1×105个细胞, 加入5000μl L1x Binding buffer重悬细胞, 再加入5μl Annexin V-FITC与5μl Propidium Iodide (PI) 充分混匀, 室温避光孵育15min, 流式细胞仪分别检测对照组和试验组心肌细胞凋亡率, 每组各检测5个样本。
1.2.3 Western-bolt法观察细胞信号转导相关蛋白表达
获得的各组细胞分别提取总蛋白, 取适量 (约20μg) 蛋白, 98℃变性5 min, 12%SDS-PAGE分离, 电转移到聚偏二氟乙烯 (PVDF) 膜上。含5%脱脂奶粉缓冲生理盐水 (TBS/T) 封闭1 h, 加入一抗 (1:1000) , 4℃过夜, TBS/T洗3次, 加入二抗 (1:2000) 孵育1 h, TBS/T洗3次, 加入HRP化学发光底物, 压胶片曝光。
1.2.4 使用lipofectamin2000转染
转染前1 d, 将0.5×105~2×105个细胞接种于培养板中, 每孔中加入约1 ml无抗生素的培养基, 使转染时的细胞密度能够达到30%~50%;取5μl/孔Lipofectamine2000, 100μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀释。轻轻混和后在室温孵育5 min;取5μl FAM-si RNA, 稀释, 轻轻混和均匀;稀释的经过5 min的孵育后, 与稀释FAM-si RNA轻轻混和, 室温静置20 min, 形成FAM-si RNA-转染试剂混和物。将FAM-si RNA-转染试剂混和液, 加入含有细胞及培养液 (约含1 ml) 的孔中, 轻轻摇晃孔板, 使混和;转染6 h后即可检测转染效率:流式细胞仪、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等。
1.3 统计学方法
采用SPSS18.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 实施t检验;计数资料以率 (%) 表示, 实施χ2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
与对照组相比, 研究组HGF可以显著减少 (P<0.05) , H2O2处理引起的心肌细胞凋亡, 检测显示心肌细胞内FOXO3a含量基本无变化, 磷酸化的FOXO3a的含量随时间变化有所增加, 提示HGF的保护作用可能与FOXO3a的磷酸化增加有关。敲除FOXO3a基因后, HGF抑制心肌细胞凋亡的能力与显著减低, 进一步表明HGF抑制心肌细胞凋亡的作用机制可能主要通过PI3K/Akt/FOXO3a途径, 磷酸化心肌细胞中FOXO3a, 使其活性减低, 从而抑制心肌细胞凋亡发生, 而起到对心肌细胞的保护作用。
3 讨论
FOX各家族功能多种多样, 包括各种转录因子、参与细胞增殖、转化及分化过程。作为FOX家族的亚组, FOXO在新陈代谢、细胞增殖、细胞存活及对氧化应激的反应等生物进程中起重要作用。哺乳动物FOXO蛋白质家族有4个成员:FOXO1、FOXO3A、FOXO4和FOXO6。其中FOXO3A在细胞、组织与胚胎的发育、体内葡萄糖内稳态、卵泡的成熟、细胞增殖、细胞凋亡、对DNA的损伤反应等过程中发挥重要作用。心脏组织以FOXO3A分布为主, 在心肌细胞凋亡中发挥重要作用[2]。活化FOX03A能抑制血管平滑肌增殖, 抑制心肌细胞增生肥大及抗氧化应激等。非磷酸化状态的FOXO3A为活性转录因子, 主要存在心肌细胞核中, FOXO3A磷酸化后与细胞核内的结构蛋白结合, 由细胞核内转移到核外, FOXO3A丧失转录活性, 其抗细胞增殖, 抗心肌肥厚等作用均被抑制[3]。研究发现HGF抑制心肌细胞凋亡损伤, 使心肌细胞中的FOXO3A磷酸化增加, 提示HGF促进FOXO3A的磷酸化可能与其对心肌细胞凋亡的保护作用相关。
摘要：目的 分析肝细胞生长因子 (HGF) 对于心肌细胞凋亡的保护作用机制。方法 分离培养乳鼠心肌细胞, 将培养的乳鼠心肌细胞饥饿处理8 h后, 采用流式细胞仪观察HGF减少过氧化氢 (H2O2) 引起的心肌细胞凋亡的保护作用, 计算凋亡细胞百分率;采用蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白FOXO3a变化;并观察使用lipofectamin2000转染技术敲除FOXO3a基因后, HGF对H2O2引起心肌细胞凋亡保护作用的变化。结果 与对照组相比, 研究组HGF可以显著减少, H2O2处理引起的心肌细胞凋亡, 检测显示心肌细胞内FOXO3a含量基本无变化, 磷酸化的FOXO3a的含量随时间变化有所增加。而在敲除FOXO3a基因后, HGF抑制心肌细胞凋亡的能力显著减低。结论 HGF抑制心肌细胞凋亡损伤, 使心肌细胞中的FOXO3a磷酸化增加, 提示HGF促进FOXO3a的磷酸化可能与其对心肌细胞凋亡的保护作用相关。
关键词：肝细胞生长因子,心肌细胞凋亡,保护作用
参考文献
[1]刘峰.高血压的心脏并发症.中国实用内科杂志, 2002, 22 (4) :11.
[2]姜勇, 罗深秋.细胞信号转导的分子基础与功能调控.北京:科学出版社, 2005:74.