人心肌成纤维细胞

人心肌成纤维细胞（共9篇）

人心肌成纤维细胞 篇1

当今心血管疾病已经成为危害人类健康的头号疾病, 心力衰竭是心血管疾病走向终末期的共同表现。在生理条件下, 心脏由心肌细胞和间质组成。心肌细胞占有心脏2/3的体积, 但心脏细胞数量只占不到1/3。心脏间质包括非心肌细胞和细胞外基质, 约90%的非心肌细胞均为心肌成纤维细胞, 它占有接近2/3的心脏细胞数量, 是心脏中最具数量优势的细胞类型, 正常心脏功能由慢性高血压、心肌梗死、心功能衰竭等引起的心肌重构中都起着关键作用[1]。大约85%的细胞外基质是由Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白组成, 它们由心肌成纤维细胞合成。心肌重构是心力衰竭的重要病理生理基础, 缺血性心脏病引起的慢性心衰具有在梗死和临近的心肌中特征性的心肌重构, 由独特的纤维组织形成[2,3], 包括心肌细胞和心肌间质重构。其中心肌纤维化是间质重构的重要因素, 是心功能由代偿期向失代偿期转变的重要病理生理过程[5]。因此, 逆转心肌纤维化, 改善心肌重构对心力衰竭的防治具有重要意义。心肌纤维化主要包括心肌成纤维细胞增生和胶原合成增加2个部分[1]。研究表明心肌成纤维细胞的数量在心肌重构和修复中局部增高, 如在心梗后临近的心肌组织中成纤维细胞的密度增高[5]。细胞外基质的有害积聚增加了心肌的硬度, 持续的积聚进一步增加心肌的硬度并损害心脏的收缩性[6]。血管紧张素Ⅱ是肾素-血管紧张素系统的效应肽, 在心衰的发展过程中它是一种关键的致病因子[7]。血管紧张素Ⅱ诱导了心肌细胞肥大, 成纤维细胞增殖和胶原合成[7,8], 通过调节CF增殖和细胞外基质的代谢参与慢性高血压和心梗后的心肌重构的病理生理过程, 促进了间质纤维化[9,10]。故本实验采用血管紧张素Ⅱ刺激CF来建立纤维化模型[11]。

HardyR J在1996年首次报道了qking基因编码的3种QKI蛋白对于中枢神经系统髓鞘形成起到关键的调节作用[12]。最近的研究表明, QKI蛋白调节了髓鞘形成和/或对于髓磷脂本身都成熟产生少突胶质细胞和施万细胞也是必需的[13]。qking基因主要产生3种可替代的剪接转录物, 编码C-端氨基酸序列不同的亚型。QKI-5 (Q 5) 含有30个独有的氨基酸, 其中包含有核定位信号区, 所以QKI-5主要分布在细胞核内。QKI-6 (Q 6) 和QKI-7 (Q 7) 各自包含有8到14个单独的残基, 这2个亚型主要位于细胞质内[17]。QKI反应元件 (QRE) 是二联的共有序列NACUAAY-N (1—20) -UAAY, 最近的研究确定它有接近1 430个推定的mRNA靶点, 这其中就包括了p27, 一种细胞周期素依赖性激酶抑制因子[14]。研究表明, QKI在不同类型细胞中广泛表达[15,16], 包括了心肌细胞和心脏成纤维细胞。

因此, qking基因在心脏成纤维细胞中广泛表达其编码的RNA连接蛋白, 其推定的作用靶点又与细胞周期相关, 那么它与心脏成纤维细胞参与的心肌纤维化是否有什么相关性是值得我们研究的。为了解答上述疑问, 我们用AngII诱导心脏成纤维细胞的体外增殖模型, 并在其中研究了QKI的表达, 与心脏成纤维细胞增殖和胶原合成的相关性, 为心肌纤维化的发生提供新的认识。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

出生 (1～3) d的SD大鼠乳鼠, 第四军医大学实验动物中心提供。Anti-p27从SantaCruzBiotechnology (SantaCruz, CA) 获得。兔抗QKI蛋白多克隆抗体和小鼠抗QKI单克隆抗体由本实验室生产。FITC或Cy3结合抗原抗小鼠/兔IgG第二抗体来自Sigma (St.Louis, MO) 。青霉素/链霉素, 胰蛋白酶/EDTA, ulbeccoSmodifiedEagleS培养基 (DMEM) 和磷酸盐缓冲液 (PBS) 获自Gibco (Carlsbad, CA) 。新生牛血清购自杭州四季清公司。A蛋白琼脂糖从Amersham PharmaciaBiotech (Sunnyvale, CA) 获得。二硫苏糖醇购自Invitrogen (Carlsbad, CA) 。硝酸纤维素滤膜为invitrogen公司产品。蛋白浓度按照厂商使用说明用PierceBCA试剂盒 (PierceBiotechnology, 罗克福德Rockford, IL) 测定。所有其他的试剂除非有特殊说明都从本国声誉良好的公司购买。

1.2 方法

1.2.1 CF培养

无菌取出生后 (1～3) d的SD大鼠心室, 剪碎, 1g/L胶原酶Ⅰ型在37℃下用磁力搅拌器辅助分离细胞, 每隔5min收集一次细胞, 所得细胞消化液离心800r/min×10min, 将所得细胞重悬于含10%FBS的DMEM培养液中, 通过200目不锈钢滤网过滤, 在5%CO2, 37℃, 饱和湿度条件下培养60min, 根据CF较心肌细胞贴壁速度快的原理, 采用差速贴壁法, 倾去上清液, 剩下的细胞即为CF, 加入含10%FBS的DMEM继续培养。在倒置显微镜下观察培养的细胞呈梭形, 无自主搏动。波形蛋白染色阳性, 纤连蛋白染色阳性, 这些特征与心肌成纤维细胞一致, 纯度达98%以上。生长近融合时按1:3传代, 实验采用2～4代细胞。

1.2.2 实验分组

实验分组:设立不加药物的含血清培养及无血清培养对照组, 处理组分为 (1) AngⅡ处理组, 分别接受AngⅡ10-6mol/L处理3、6、12、24、48h; (2) 过表达QKI组, 以Q 5、Q 6重组腺病毒0.5μL/cm 2对CF进行预处理, 孵育24h后, 无血清培养24h使细胞处于增殖停止期, 再用AngⅡ10-6mol/L处理24h, 使用EGFP预处理作为对照组。

1.2.3 RT-PCR法检测CF增殖及胶原合成功能

用Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 法提取总RNA。简要步骤:将细胞与1mLTrizol混匀, 室温静置10min, 加入200μL三氯甲烷混匀, 4℃离心12 000g×15min, 将上清液与同体积异丙醇混匀, 4℃离心12 000g×15min, 弃上清。加入500μL0.1%diethylpyrocarbonatetreated (DEPC) 70%乙醇, 混匀, 离心12 000g×5min, 吸弃上清。将沉淀在室温晾干10min, 加入20μLDEPC水溶解沉淀按厂商的说明使用DNA抽提试剂盒 (天庚, 中国北京) 通过逆转录作用获得cDNA。将cDNA样本加入各含有10pmol引物和0.5μL耐热性DNA聚合酶 (invitrogen) 的反应缓冲液中进行PCR。PCR产物混入含溴酚蓝的加样缓冲液, 在1%琼脂糖凝胶电泳分离。总QKI, collagen1a, collagen3a, -actin的引物列出在列表1。AlphaImagerv5.1系统扫描。各条带数据通过相应的β-actin数据进行标准化。

1.2.4 western-blot法检测CF的增殖变化

将CF以5×105细胞接种于6孔板中, 在不同处理组干预结束后收集蛋白样本。细胞裂解液 (RIPA) 冰上静置10min裂解细胞, 收集裂解液, 加入6×loadingbuffer混匀, 煮沸5min, 离心12 000g×5min, -20°C冻存。12%十二烷基硫酸钠 (SDS) 聚丙烯酰胺凝胶电泳后, 转到硝酸纤维素膜 (nitrocellulosefilter membrane, NC膜) 上。封闭液室温封闭2h, 一抗4°C孵育过夜, 相应二抗室温避光孵育1h, TBS—T洗脱。Odssey红外荧光扫描系统扫描条带。

1.2.5 流式细胞术检测CF的增殖变化

将CF以5×105细胞接种于6孔板中, 在不同处理组干预结束后用胰酶消化, 收集细胞到1.5mL EP管中, 离心350g×5min, 弃上清, 加入流式固定液1mL/管重悬细胞, 流式细胞术检测细胞周期。

1.4 统计学方法

实验结果中数据用内参进行标准化处理后, 以均数±标准差 (x±s) 表示, 显著性检验采用单因素方差分析 (One-wayANOVA。P<0.05为差异有统计学意义, P<0.01为差异有非常显著意义。

2 结果

2.1 QKI在AngII诱导的CF细胞增殖和胶原

合成中的变化

在CF中加入AngⅡ1μmol诱导, 根据AngII作 (A) QKI的表达水平在AngⅡ诱导的CF中下调。CF无血清处理24h后, 加入AngⅡ1μmol作用不同时间随时间延长QKI的表达水平逐渐降低, 在AngⅡ作用24h后, QKI表达水平降至谷底。 (B) AngⅡ诱导胶原蛋白1a合成增加。CF中加入AngⅡ1μmol作用24h后, 通过RT-PCR法定量比较胶原蛋白1a/3aRNA表达水平的变化, 其中胶原蛋白1a的表达较对照组增高 (n=3, P<0.05) , 而胶原蛋白3a增高不显著。 (C) AngⅡ诱导CF增殖。通过western-blot法定量比较PCNA在AngⅡ诱导后蛋白表达水平的变化, AngⅡ作用24h后, PCNA表达水平较对照组明显增高 (n=3, P<0.05) 。用的不同时间段获取蛋白样本, western-blot法观察QKI表达水平的变化, 发现随AngⅡ作用时间的延长, QKI的表达水平逐渐降低, 并在24h降至谷底。在以后的实验中, AngⅡ作用时间如无特殊说明, 均采用变化较明显的24h。经AngⅡ诱导后, CF中PCNA的表达较无血清对照组明显升高 (P<0.05) , collagen1a的表达增加 (P<0.05) , 提示AngII诱导的CF增殖及胶原合成模型成功建立。QKI在含血清对照组及AngⅡ诱导组较无血清对照组均低表达 (P<0.05) , 提示CF中QKI的表达可能与增殖负相关, 如图1。

2.2 过表达QKI对AngII诱导的CF细胞增殖和

胶原合成的影响

CF中0KI的表达既然与细胞增殖和胶原合成负相关, 那么QKI的变化是否对CF的增殖和胶合成有所影响引起了我们的注意。我们使用Q 5Q 6重组腺病毒感染细胞24h, 经荧光显微镜观察感染效率约30%左右, 再加入AngII诱导增殖模型用EGFP预处理作为对照组。流式细胞术结果证了过表达Q 6抑制了细胞周期向G 2、S期转化, 发了抗增殖的作用。Western-blot结果表明表明, 过达Q 6显著抑制AngII诱导的PCNA高表达 (n=3, <0.01) , 也证实了其抗增殖作用, 如图2。RT-PC结果显示过表达QKI的2个亚型对胶原蛋白1a/3在RNA表达水平的增高并无明显抑制作用 (n=3P>0.05) , 如图3。

(A) 通过流式细胞术测量过表达Q 6对细胞周期的影响, CF经AngⅡ作用后处于G 2+S期的细胞所占总细胞数百分比较无血清对照明显升高 (n=3, P<0.01) 过表达Q 6后G 2+S期细脆百分比较对照组显著降低 (n=3, P<0.01) 。 (B) 过表达QKI不同亚型对PCNA在CF中蛋白表达水平的影响, 通过western-bolt法定量检测后发现过表达Q 5对PCNA的表达并无明显抑制作用 (n=3, P>0.05) , 而过表达Q 6能明显降低PCNA的表达水平 (n=3, P<0.01) , 提示过表达Q 6具有抑制CF增殖的效果。

。QKI重组腺病毒感染CF 2h, 含血清孵育24h, 无血清培养24h, 加入AngⅡ处理24h后收细胞RNA样本, 通过RT-PCR法观察胶原蛋白1a/3aRNA表达水平的变化。结果显示, 过表达OKI对CF胶原蛋白1a/3a的合成无明显抑制作用 (n=3, P>0.05) 。

3 讨论

心血管疾病严重危害着人类的健康, 而心功能衰竭则是大部分心血管疾病的终末期表现。作为间质重构的重要因素, 心肌纤维化是心功能从代偿期像是代偿期转化的重要病理过程。心肌纤维化主要包括心脏成纤维细胞增殖及胶原合成增加二部分, 如果能打断或逆转心肌纤维化的进程, 对心衰的治疗有着重要意义, 但目前对于心肌纤维化尚无明确特效的疗法, 一些经典的心血管方面的药物, 如ACEI、血管紧张素受体阻断剂、β受体阻断剂、降脂药及降低胰岛素抵抗药物等, 也是通过对CF施加多效性才影响发挥了部分改善心肌重构的影响[2]。因此, 加深对心肌纤维化的认识, 探讨能对心肌纤维化发生作用的新物质, 新方法, 对找到能有效逆转心肌纤维化的综合疗法, 改善心血管病人的健康状况有着重要意义。

qking基因编码的QKI蛋白是翻译后修饰使之信号转导活化的RNA连接蛋白。既往的研究表明QKI蛋白是STAR蛋白家族的一员, 对于髓鞘形成的调节和/或对于髓磷脂本身都成熟产生少突胶质细胞和施万细胞也是必需的[13], 而且广泛表达与不同类型的细胞中[15,16], 包括心肌细胞和心肌成纤维细胞。目前对于qkingI在心血管系统方面作用的研究还少之又少, 我们假设qking基因编码QKI蛋白对心肌成纤维细胞的增殖和胶原合成产生了影响, 并进行相关实验来验证。

我们将AngⅡ加入原代乳鼠心肌成纤维细胞中, 并在其中检测QKI的表达, 结果表明, 随AngⅡ作用时间的延长, QKI在CF的表达逐渐降低, 在24h后降至谷底, 这表明CF中QKI可能与AngⅡ具有相拮抗的功能。然后我们用AngⅡ诱导了CF增殖及胶原合成的模型, 并发现AngⅡ诱导的PCNA表达增高与胶原蛋白1a合成增加相应的QKI条带表达下调。为了进一步明确qking基因对CF增殖及胶原合成的影响, 过表达QKI不同压型 (Q 5、Q 6) 后我们通过western-blot法检测了CF中增殖指标PC-NA蛋白水平的变化, PT-PCR法检测了胶原蛋白1a/3a在RNA表达水平的变化, 流式细胞术观察细胞周期, 数据表明, Q 6的过表达能明显抑制CF的增殖 (P<0.01) , Q 5的抑增殖作用并不明显 (P>0.05) ;二种QKI亚型的过表达对CF中胶原合成未见显著影响。上述结果初步证明了qking基因在CF中发挥了其抗增殖作用, 但QKI具体通过什么机制作用与MAPK-ERK信号通路还需进一步的研究和探讨。

我们的实验首次发现qking基因对大鼠原代心脏成纤维细胞增殖的负性调节作用, 并发现了影响心肌纤维化的新的因素, 深化了对心肌纤维化的认识, 为治疗心脏纤维化提供了新的切入点。

人心肌成纤维细胞 篇2

早期研究使用的成纤维细胞生长因子(FGFs)主要来自牛脑和脑垂体的提取液，是大约150个氨基酸结构的酸性或碱性成纤维细胞生长因子(aFGF：FGF1或bFGF：FGF2)。其后分离的癌基因产物的细胞增殖因子与上述FGFs结构类似，也被分类在FGFs家族，并依次命名为FGF3~9〔1〕。目前已发现23种FGFs。现主要就多能FGFs结构和相关功能机制的研究进展进行综述。?

1发现和鉴定新的FGFs结构?

FGFs作为细胞间信号分子在胚胎发生和分化过程中起重要作用。FGFs是由约150~200氨基酸组成的多肽，相互之间的氨基酸序列有20%~50%是相同的〔2,3〕。其中心区域有大约120个氨基酸序列存在高度的同源性(30%~70%)。利用该区域的同源性，以人、小鼠或大鼠cDNA和基因组DNA为模板、采用同源序列PCR法进行新FGFs基因检测。当然，还可以采用T7噬菌体?cDNA显示法鉴定新FGFs。FGFs受体(FGFRs)是典型的膜结合酪氨酸激酶型受体。将FGFRs的胞外结构域在杆状病毒群(baculovirus)表达株表达，制成重组的细胞外结构域(可溶性FGF受体)。进而利用可溶性FGFRs与配体结合的特性，通过T7噬菌体cDNA显示法对互补cDNA文库进行筛选。?

通过同源序列PCR法，已经发现了6种新的FGFs基因(FGF10、FGF16、FGF17、FGF18、FGF20、FGF21)〔4〕。虽然T7噬菌体cDNA显示法能获得较多的阳性克隆，但不能确认是新发现的FGFs。随着人类基因组结构的解析及其DNA数据库被公开，通过基因检索进而又发现3种新的FGFs基因(FGF19、FGF22、FGF23)〔5,6〕，并发现FGF-22mRNA选择性表达于皮肤毛囊的内毛根鞘〔7〕。加上在探索视网膜特异性表达基因的过程中所发现的4种新的FGFs基因(即FGF11、FGF12、FGF13和FGF14)〔1〕，以及McWhirter等〔8〕在探索嵌合体同源结构域癌蛋白(chimerichomeodomainoncoprotein)E2A-Pbx1下游目标过程中发现的FGF15，迄今共鉴定出23种人或鼠FGFs。但是人FGF15和小鼠FGF19尚未被证实。人FGF19与小鼠FGF15显示很高的同源性(约50%)，且这两种基因都跟FGF3、FGF4基因的染色体邻接〔3〕，由此推断人FGF19是小鼠FGF15的相同体。由于人与小鼠其他FGFs结构之间的同源性达90%以上，因而除非FGF15和FGF19在进化过程中意外地发

人心肌成纤维细胞 篇3

关键词：中药复方；鸡胚成纤维细胞；生长；安全浓度

中图分类号：S853.74文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）06-0149-03

收稿日期：2013-09-06

基金项目：国家科技支撑计划（编号：2008BADB4B06）；江苏青蓝工程骨干教师资助项目。

作者简介：邢玉娟（1964—），女，山东济南人，副教授，主要从事中药药理研究。E-mail：1903048595@qq.com。

通信作者：胡元亮，教授，博士生导师，主要从事中兽医学研究。E-mail：ylhu@njau.edu.cn。有研究证明，中药为一种免疫增强剂，具有来源广泛、效果显著、无毒副作用等优势，不仅能克服油乳类和铝胶类化学佐剂副作用大、局部刺激性强、致癌、制备和使用麻烦或不能足够提高弱抗原的免疫原性等弊病[1-2]，而且能显著增强机体的细胞免疫和体液免疫功能，促进免疫器官的发育和细胞因子的分泌[3-4]。

有试验证明，氧化苦参碱（oxymatrine，OM）和黄芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）在先于病毒加入细胞、后于病毒加入细胞和与病毒同时加入细胞等3种方式加入后均能抑制病毒生长，甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）在先于病毒加入和与病毒同时加入时有抑制病毒生长作用，栀子苷（geniposide，GP）只有在先于病毒加入时才能显现出一定的抑制病毒感染细胞能力的作用[5-6]。本试验选用体外试验对鸡新城疫病毒（NDV）呈现抑制作用的OM、APS、GP和GA，按一定比例分别组成OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP等4个中药复方，通过MTT（四唑溴盐）法[7-11]测定4个中药复方对鸡胚成纤维细胞（chickembryo fibroblast，CEF）增殖的影响，为下一步体内试验作准备。

1材料与方法

1.1试验药物

根据以前的试验结果[5]，将OM、GA、GP、APS 等4种中药按一定比例组成OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS和GA-APS-GP等 4个复方，分别用MEM培养液溶解稀释成1 000 μg/mL，高压灭菌，4 ℃冰箱保存备用。临用前吸取各药0.5 mL至24孔细胞培养板第1孔中，加入细胞维持液 0.5 mL，倍比稀釋至10孔。

1.2主要试剂

MEM细胞培养液，Gibco公司产品，按说明书配制，再加入犊牛血清（5%为细胞生长液、2%为细胞维持液），再按常规量加入0.03%谷胺酰氨和双抗（各100 IU/mL）；胰蛋白酶，进口分装，用PBS（pH值7.4）配制成0.25%的溶液，0.22 μm 混合纤维素酯微孔滤膜过滤除菌，分装，-20 ℃保存备用；MTT溶液，Sigma公司产品，用pH值为7.4的PBS液配制，使终浓度为2 mg/mL，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装，4 ℃冰箱保存，1 周内用完；裂解液二甲亚砜（DMSO），分析纯，江苏苏州工业园区正兴化工研究院生产。

1.3主要仪器

CO2培养箱，美国Revco公司生产；XSZ-DZ型倒置显微镜，重庆光学仪器厂生产；DG3022型酶联免疫检测仪，国营华东电子管厂制造；75-2A型微量振荡器，上海医用分析仪器厂生产；96 孔细胞培养板和24 孔细胞培养板，德国 Nunclon 公司生产。

1.4试验方法

按文献[12-13]的方法制备CEF。用细胞生长液调整细胞数至100万个/mL，在96 孔细胞培养板中加入 100 μL/孔，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，待CEF刚形成单层时加药。试验组分别加入不同浓度的中药复方 100 μL/孔，每个浓度重复4 孔，每2种中药成分复方共用一块细胞板并重复2块细胞板；对照组4 孔，仅加细胞维持液；另设无细胞孔为测定时的空白调零孔，继续培养。加药后 48 h 测定细胞增殖情况。

1.5细胞增殖测定

用MTT法测定细胞增殖的情况：测定前4 h加入 50 μL/孔 MTT溶液；测定时快速翻转培养板，甩去孔内培养液，加入100 μL/孔裂解液，室温下振荡5 min使结晶物溶解；然后用酶联免疫检测仪测定D570 nm，作为细胞增殖的指标。D570 nm与活细胞的增殖呈正比，即D570 nm越大，细胞增殖越旺盛。

1.6中药对CEF安全浓度的判定

根据D570 nm测定结果判定中药对CEF的安全浓度，选择D570 nm与对照差异不显著的试验组的最高中药浓度作为安全浓度的上限[14]。

1.7数据处理

计算4 孔平均值和标准差，数据以“x±s”表示，用SPSS统计分析软件进行方差分析和多重比较，并比较各中药组分对CEF增殖率的差异性。增殖率=（各组加药后的D570 nm-对照的D570 nm）/对照的D570 nm×100%。

nlc202309012353

2结果与分析

2.14个中药复方对CEF增殖的影响

3.91～31.25 μg/mL OM-APS 的D570 nm显著高于对照（P<0.05），1.95、62.50～500.00 μg/mL OM-APS 的D570 nm高于对照但不显著（P>0.05），1 000.00 μg/mL OM-APS的D570 mm低于对照但不显著（P>0.05）。说明OM-APS浓度在3.91～3125 μg/mL时对细胞增殖有显著的促进作用。综合以上结果可知，OM-APS的最大安全浓度为1 000.00 μg/mL（表1）。表14个中药复方对CEF增殖的影响

浓度

（μg/mL）D570 nmOM-APSOM-APS-GPGA-APSGA-APS-GP1 000.000.305±0.005d0.313±0.015c0.332±0.009e0.325±0.020d500.000.345±0.051bc0.367±0.015b0.365±0.019cd0.372±0.017bc250.000.370±0.014abc0.388±0.013ab0.365±0.012cd0.375±0.023bc125.000.370±0.008abc0.387±0.006ab0.366±0.015cd0.388±0.017ab62.500.373±0.015abc0.383±0.015ab0.380±0.010abcd0.412±0.009a31.250.380±0.01ab0.380±0.010ab0.376±0.015bcd0.392±0.005ab15.620.380±0.010ab0.400±0.010a0.386±0.015abc0.382±0.026abc7.810.382±0.020ab0.370±0.010b0.403±0.005a0.360±0.008bc3.910.393±0.017a0.380±0.010ab0.400±0.008ab0.372±0.017bc1.950.372±0.012abc0.366±0.005b0.375±0.012bcd0.347±0.053cd对照0.336±0.028cd0.336±0.028c0.356±0.022d0.356±0.022bcd注：同列数据后不同字母者表示差异显著（P<0.05）。

1.95～500.00 μg/mL OM-APS-GP的D570 nm均显著高于对照，1 000.00 μg/mL OM-APS-GP的D570 nm低于对照但不显著（P>0.05）。说明OM-APS-GP在1.95～500.00 μg/mL 时对细胞增殖有促进作用，OM-APS-GP的最大安全浓度为1 000 μg/mL（表1）。

3.91～15.62 μg/mL GA-APS的D570 nm显著高于对照（P<0.05），1 000.00 μg/mL GA-APS的 D570 nm显著低于对照，1.95、31.25～500.00 μg/mL GA-APS的D570 nm高于对照但不显著（P>0.05）。说明GA-APS在3.91～15.62 μg/mL能显著促进细胞增殖，但随浓度升高，促进增殖作用逐渐减弱，1 000.00 μg/mL 对细胞增殖有抑制作用。综合以上结果可知，GA-APS最大安全浓度为500.00 μg/mL（表1）。

62.50 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm显著高于对照（P<0.05），125.00～500.00、3.91～31.25 μg/mL 的 D570 nm高于对照但不显著（P>0.05），1.95、1 000.00 μg/mL 的 D570 nm 低于对照但不显著。说明62.50 μg/mL GA-APS-GP对细胞增殖有显著的促进作用，且随浓度的升高或降低，促进增殖作用逐渐减弱。综合以上结果可知，GA-APS-GP最大安全浓度为1 000.00 μg/mL（表1）。

2.24个复方对CEF增殖率的影响

对CEF增殖率最高的是OM-APS-GP，当其浓度为 15.62 μg/mL 时增殖率达到19.05%。OM-APS有8个浓度、OM-APS-GP有7个浓度、GA-APS和GA-APS-GP各有2个浓度使CEF增殖率达到了10%以上（表2）。

OM-APS促进CEF生长的作用曲线呈马鞍形，有2个峰值，分别是3.91、250.00 μg/mL；OM-APS-GP的促生长曲线呈驼峰形，有3个峰值，分别是3.91、15.62、250.00 μg/mL；GA-APS的促生长曲线呈驼峰形，有3个峰值，分别是7.81、62.50、500.00 μg/mL；GA-APS-GP 的促生长曲线呈单峰状，在62.50 μg/mL达到峰值。

表24个中药复方对CEF增殖率的影响

浓度

（μg/mL）增殖率（%）OM-APSOM-APS-GPGA-APSGA-APS-GP1 000.00-9.23-6.85-6.74-8.71500.002.689.232.534.49250.0010.1215.482.535.34125.0010.1215.182.818.9962.5011.0113.996.7415.7331.2513.1013.105.6210.1115.6213.1019.058.437.307.8113.6910.1213.201.123.9116.9613.1012.364.491.9510.718.935.34-2.53對照0000

3结论与讨论

3.1中药复方对CEF的安全浓度

根据D570 nm测定结果可知，1 000.00 μg/mL OM-APS 的D570 nm低于对照但不显著（P>0.05）；500.00～1.95 μg/mL OM-APS-GP的 D570 nm均显著高于对照（P<005），1 000.00 μg/mL OM-APS-GP的 D570 nm低于对照但不显著（P>0.05）；500.00 μg/mL GA-APS的D570 nm高于对照但不显著（P>0.05），1 000.00 μg/mL GA-APS的D570 nm显著低于对照（P<0.05）；500.00 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm高于对照但不显著（P>0.05），1 000.00 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm低于对照但不显著。综合以上结果可知，OM-APS、OM-APS-GP、GA-APS、GA-APS-GP 对CEF的安全浓度分别为1 000.00、1 000.00、500.00、1 000.00 μg/mL。

nlc202309012353

3.2中药复方对CEF增殖的影响

D570 nm能直接反映被测样品中活细胞的增殖情况，两者呈正相关。本试验中3.91～31.25 μg/mL OM-APS、1.95～500.00 μg/mL OM-APS-GP、3.91～15.62 μg/mL GA-APS、6250 μg/mL GA-APS-GP的D570 nm显著高于对照（P<0.05），说明这4个中药复方在一定的浓度范围内均能促进CEF增殖。其中，OM-APS-GP促进CEF增殖的浓度范围最大，所选浓度范围对细胞生长均无抑制作用。综合增殖率和D570 nm 结果可知，这4 个中药复方促进CEF增殖作用的强弱依次为OM-APS-GP>OM-APS>GA-APS-GP>GA-APS。

3.3中药复方促进CEF生长的量效关系

从试验结果还可以看出，4个中药复方在高浓度（1 000.00 μg/mL）时对细胞生长均起抑制作用，随着浓度的降低，表现出促进生长的作用，但这种促进增殖的作用在达到峰值后又逐渐减弱，说明中药复方促进细胞增殖要有合适的浓度[15]。

本试验中OM-APS有8 个浓度、OM-APS-GP有7 个浓度、GA-APS和GA-APS-GP各有2 个浓度对CEF增殖率达到了10%以上，在前面的试验中，APS、OM、GA和GP只有GA有2 个浓度达到10%以上，说明复方促进细胞生长作用优于单体，发挥了协同作用，这和王德云等的研究结果[16-17]一致。

参考文献：

[1]韩庆功，崔艳红，赵玉军.免疫增强剂在鸡疫病防治中的应用[J]. 兽药与饲料添加剂，2006，11（2）：19-22.

[2]龚晓明，吴耀妹. 免疫佐剂研究的现状与趋势[J]. 中国兽药杂志，1996，30（1）：41-44.

[3]郭振環，胡元亮，马霞，等. 硫酸化香菇多糖对新城疫疫苗免疫效果的影响[J]. 南京农业大学学报，2010，33（1）：76-80.

[4]Ma X，Guo Z H，Wang D Y，et al. Effects of sulfated polysaccharides and their prescriptions on immune response of ND vaccine in chicken[J]. Carbohydrate Polymers，2010，82（1）：9-13.

[5]陈玉库，邢玉娟，蔡丙严，等. 氧化苦参碱等七种中药成分对单层鸡胚成纤维细胞增殖的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医，2009（8）：103-105.

[6]邢玉娟，陈玉库，胡元亮，等. 7种中药成分对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响[J]. 中国兽医杂志，2011，9（9）：46-49.

[7]刘钊，杨占秋，肖红，等. MTT法在抗病毒药物筛选中的应用[J]. 武汉大学学报：医学版，2004，25（3）：332-334，348.

[8]许斌，周双宬，黄玉仙，等. 氧化苦参碱在鸭原代肝细胞中抗鸭乙肝病毒（DHBV）作用的研究[J]. 病毒学报，2006，22（5）：369-374.

[9]程宝莺. 动物细胞培养技术[M]. 广州：华南理工大学出版社，2000.

[10]任宇皓，胡元亮，刘家国，等. 黄芪多糖、淫羊藿多糖和淫羊藿总黄酮对新城疫病毒感染细胞的影响[J]. 南京农业大学学报，2001，24（2）：102-105.

[11]孔祥峰，胡元亮，王德云，等. 中药成分与新城疫病毒感作后对病毒感染活性的影响[J]. 南京农业大学学报，2004，27（2）：90-93.

[12]斯佩克特D L，戈德曼R D，莱因万德L A.细胞实验指南：上册[M]. 黄培堂，译.北京：科学出版社，2001.

[13]辛华. 细胞生物学实验[M]. 北京：科学出版社，2001.

[14]殷震，刘景华. 动物病毒学[M]. 北京：科学出版社，1997.

[15]胡元亮，孔祥峰，李祥瑞，等. 10种中药成分对CEF的增殖和抵抗NDV感染的影响[J]. 畜牧兽医学报，2004，35（3）：301-305.

[16]王德云，胡元亮，孙峻岭，等. 复方中药成分对新城疫疫苗免疫雏鸡外周血T淋巴细胞转化和血清抗体效价的影响[J]. 中国兽医学报，2006，26（2）：194-196.

[17]孙峻岭，薛家宾，胡元亮，等. 中药成分复方的佐剂作用及其与中药复方的功效比较[J]. 南京农业大学学报，2005，28（4）：109-112.金穗华，王振云，李慧. 家畜精子形态的判别与描述[J]. 江苏农业科学，2014，42（6）：152-156.

人心肌成纤维细胞 篇4

1材料与方法

1.1主要实验材料

水溶性固体蜂胶:上海辰蜂生物技术公司提供, 氢氧化钙粉:上海二医张江生物材料有限公司生产。

1.2主要试剂与仪器

DMEM细胞培养基(Hyclone)、澳洲胎牛血清(普飞)、0.5 g/L胰蛋白酶(Hyclone)和96孔细胞培养板均由诺贝生物科技有限公司提供。MTS(普洛麦格生物技术有限公司),二氧化碳培养箱(美国Therm- Fisher Forma 3111),超净工作台(SW-CJ-1D型,苏州净化设备有限公司),高速低温离心机(日本HI- TACHI集团CR22G),小鼠抗人波形丝蛋白单克隆抗体(福州迈新公司),小鼠抗人角蛋白单克隆抗体(福州迈新公司),酶标仪(ST360,上海科化实验系统有限公司)。

1.3人牙髓成纤维细胞的培养及传代

牙髓标本取自昆明医学院附属口腔医院颌面外科门诊,取临床青少年因正畸减数需要拔除的健康恒前磨牙4~5颗,立即置入含有3%双抗的DMEM培养液中带回。在科室用碘酊、乙醇依次消毒牙冠, 无菌高速涡轮机头除去表面牙周组织,裂钻环形切割牙颈部至近髓后立即置入培养液中带到实验室。 在超净工作台内,骨凿劈开牙冠,用无菌的K锉谨慎从根管中抽出牙髓迅速剪去根尖1/3,置入浸有培养液的培养皿中,用无菌眼科剪剪成0.5 mm3组织块,然后用DMEM培养液冲洗3次,探针将组织块挑入培养瓶底部,以0.5 mm的间距均匀铺置,对侧壁滴入培养液,瓶底向上置入二氧化碳培养箱中,静置4 h贴壁后翻转,再加入适量培养液静置于培养箱中培养,组织块未游出细胞前每周换液一次,细胞游出后每3天换液一次,在倒置显微镜下观察细胞游出及生长情况,待细胞达到汇合点时,用0.5 g/L的胰酶消化,按1∶2传代,原代培养的人牙髓细胞传至第4代后,免疫组织化学染色鉴定细胞的组织来源。 细胞继续传代至第5代,取生长良好的第5代牙髓细胞进行细胞接种备用。

1.4蜂胶水溶剂的配制

取国产水溶蜂胶用三蒸水将其配成1 g/10 ml的蜂胶溶液,0.2μm的无菌过滤器滤后再用含有10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成4、2、1、0.6和0.2 g/L 5个浓度备用。对照的氢氧化钙溶液配制: 将200 mg氢氧化钙干粉剂溶于50 ml的三蒸水中, 3 000 r/min条件下离心10 min,取上清液,0.2μm的无菌过滤器滤后用含有10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成10%、8%、4%、1% 4个浓度备用。

1.5人牙髓细胞相对增殖率的测定

Cell Titer 96 @ A Queous One Solution Cell Proliferation Assay(a)是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒实验中的活细胞数量的新的检测试剂, 此试剂含有一个新型的四唑化合物MTS和一种电子偶联剂PES。PES具有增强的化学稳定性,这使它可与MTS混合形成稳定的溶液,是方便的单溶液模式。MTS被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物,可直接溶解于培养基中,这种转换是由代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的还原型烟酰胺腺嘌呤二核甘酸磷酸(NADPH)或烟酰胺腺嘌呤二核甘酸磷酸(NADH)的作用下完成的。检测时,只需将少量的Cell Titer 96 @ AQueous One Solution Reagent试剂直接加入培养板孔的培养基中,孵育1~4 h,然后用酶标仪读取490 nm的吸光度值,操作步骤比MTT更少,更方便快捷。在490 nm处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比。

本实验采用MTS比色法,检测不同浓度的蜂胶水溶剂和氢氧化钙溶液作用于人牙髓细胞后的吸光度(OD值),计算细胞相对增殖率(relative growth rate,RGR):RGR= 实验组OD值/ 阴性对照组OD值×100%,根据RGR换算细胞毒性的级别。

具体方法如下:取生长良好的第5代牙髓细胞, 0.5 g/L胰蛋白酶消化,离心后用含有10%胎牛血清的DMEM培养液吹打成单细胞悬液,用细胞计数板调整细胞浓度至2×104/ml,接种于96孔板,每孔100μl。放置到37℃、5%二氧化碳培养箱中培养48h, 倒置显微镜下观察大多数细胞贴壁并生长。弃去孔内液体及不贴壁的细胞,将各稀释药液加入96孔板中,每种加5孔,每孔100μl;阴性对照组加含有10% 胎牛血清的DMEM培养液,每孔100μl。在预实验中,笔者发现蜂胶的颜色也对吸光度产生一定的影响,因此在每组蜂胶实验组的上方还设一组不含细胞的蜂胶液对比孔,在该对照孔中加对应浓度的蜂胶液100μl。用该蜂胶组的OD值减去该孔的OD值以排除蜂胶色度对实验组吸光度的影响,96孔板置37℃,体积分数5%二氧化碳条件下培养48 h后, 每孔加入20μl配好的MTS试剂,再放回培养箱中放置4 h取出,在酶标仪上振荡30 s,于490 mm波长下测OD值,每种浓度孔的OD值取平均值。计算细胞RGR,根据细胞毒性评级标准(见表1),用RGR值换算细胞毒性级。

1.6统计学方法

采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析,对实验结果组间进行方差分析,对蜂胶与氢氧化钙总体细胞毒性进行两独立样本t检验,P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1细胞的培养和形态学观察

本研究用传统的组织块培养法,12~15 d内可见有的组织块周边有少量梭形细胞长出,2~3 d后细胞迅速扩增,约18~20 d左右细胞长满瓶底。按1∶2传代,2~3 d可传一代。原代及传代培养的细胞胞体呈长梭形,星形胞体细长,胞浆丰富,核位于中央,排列紧密多呈近于平行的束状,细胞界限清楚, 呈“漩涡状”。见图1。

2.2细胞来源鉴定

取第4代对数生长期人牙髓细胞爬片,按试剂盒说明书进行波形丝蛋白,角蛋白免疫组织化学染色, 光镜下观察。牙髓成纤维细胞呈典型的成纤维样细胞,细胞浆内波形丝蛋白染色为阳性,角蛋白染色呈阴性。波形丝蛋白是成纤维细胞的特征性蛋白, 而角蛋白是上皮细胞的特征性蛋白,因此证实培养的是中胚层来源的人牙髓成纤维细胞。见图2、3。

2.3细胞相对增殖率结果及毒性分级

第5代人牙髓成纤维细胞以2×104/ml,接种于96孔板,培养48 h后,各孔细胞密度均匀。细胞贴壁生长,形态正常,胞体呈长梭形。加样48 h后,阴性对照组细胞密度增加,形态正常;加药物的实验组和对照组,低浓度的各孔中细胞形态基本正常,随着浓度的增加,培养孔中出现变性死亡细胞,部分细胞漂浮起来。各孔加入MTS试剂后,放回培养箱中孵育4 h,取出后用酶标仪测定各孔的吸光度。不同浓度蜂胶水溶液与氢氧化钙溶液对人牙髓成纤维细胞作用48 h后的吸光度值、换算的细胞相对增殖率及毒性级别如下,见表2。

对蜂胶组各浓度OD值进行方差分析,F =30.618, P <0.05,差异有统计学意义,认为不同浓度下的蜂胶OD值不同。对氢氧化钙组各浓度OD值进行方差分析,F =44.275,P <0.05,差异有统计学意义,认为不同浓度下的氢氧化钙OD值不同。对蜂胶和氢氧化钙总体细胞毒性进行两独立样本t检验,t =0.882, P <0.386,差异无统计学意义,表明蜂胶和氢氧化钙总体细胞毒性无差异。

3讨论

由于牙髓组织具有形成牙本质和营养硬组织的功能,对外来刺激能产生一系列防御性反应,因此保存活髓具有十分重要的意义。理想的盖髓材料要有良好的封闭性,能有效地隔绝外界刺激,杀灭细菌,消除牙髓炎症,保护牙髓。诱导牙髓细胞分化成成牙本质细胞形成修复性牙本质桥,并能提供牙髓修复,牙本质生物矿化所需要的微量元素及适宜的微环境[1]。

氢氧化钙是目前应用最广泛的盖髓材料,它能有效地促进牙髓细胞分化,形成修复性牙本质封闭露髓孔,并且其强碱性也具有一定的抑菌和杀菌作用。 但临床应用也发现它有明显的缺陷,例如它会引起接触部位牙髓炎症坏死;会发生牙髓退行性改变,出现根管内营养不良性钙化,钙化蔓延到整个根管,出现堵塞或牙内吸收等[2]。为进一步改善性能,有研究试图用氢氧化钙复合其他材料或激光处理的方法提高治疗效果[3,4]。也有学者在探索新的盖髓材料,目前有矿化三氧化物凝聚体(MTA);牙本质粘接剂;磷酸钙类材料(羟基磷灰石、磷酸钙骨水泥,陶瓷化骨粉等);生物活性材料(骨形成蛋白、表皮生长因子、 牙本质胶原蛋白、富血小板血浆等);抑菌类材料(各类抗生素);中药类(黄芩苷等)[5,6,7,8,9,10,11]。但各种材料各有优缺点:如磷酸钙类材料无抗菌性;生物活性材料易被破坏;粘接剂密封性好,但有刺激性等等,单一的材料均不能达到理想的盖髓材料应具备的性能。进一步探索具有生物诱导活性,良好的生物相容性, 消炎杀菌及物理机械性能都良好的复合盖髓材料, 提高活髓保存的成功率是该领域的研究方向。由于盖髓治疗常因微渗漏或牙本质深层藏存的细菌感染而失败,因此盖髓剂能否杀灭露髓孔内残余细菌,消除牙髓炎症有重要的意义。因此有研究者试图复合几种材料的性能,如束红蕾[12]等把甲硝唑,红霉素,克林霉素加入到磷酸钙骨水泥,陶瓷化骨粉中用于实验动物的盖髓,实验研究也取得了较好的效果。

近年来,人们越来越热衷于绿色天然药物的开发和应用,蜂胶含有多种生理活性物质,具有广泛的生理和药理作用,临床上多用于治疗溃疡、烧伤、 糖尿病及心血管病等[13]。最重要的是蜂胶的强抗菌功能是其他天然物质无可比拟的,由于蜂胶含有大量的黄酮类及芳香酸、脂肪酸及烯类等多种化合物, 它具有广谱抗菌作用,能抑制多种细菌和病毒,有研究证实1%~10%的蜂胶对真菌和霉菌都有抑制作用[14]。在口腔领域关于蜂胶的研究也很广泛,国内已有研究表明,蜂胶的生物安全性很好[15]。蜂胶对龋病、牙周病和感染根管的致病菌有明显的杀灭及抑制作用,已有研究将其引入龋病、牙周病及感染根管消毒治疗领域[16,17]。国外有研究还发现,蜂胶能有效杀灭对氢氧化钙消毒耐受的细菌,能有效杀灭难治性根尖周炎根管内的粪肠球菌[18,19]。蜂胶的消炎镇痛、表面麻醉、促进增生、改善微循环的作用使其对复发性口疮、扁平苔藓等口腔黏膜病也有较好的疗效[20],已有蜂胶的牙膏,漱口水、口腔溃疡贴膜生产用于口腔临床。对于牙髓治疗领域,由于蜂胶含醛, 有凝固蛋白的作用,国内有学者报道用蜂胶复合普鲁卡因等制成的复方蜂胶失和剂可以失和牙髓[21]。国外学者研究报道,较低浓度的蜂胶醇溶剂在保持有效的杀菌效力的同时对人牙髓、牙周及牙龈成纤维细胞的细胞毒性远低于氢氧化钙,生物安全性好,用于盖髓治疗能诱导修复性牙本质形成[22,23,24],但尚无进一步深入的研究报道。国内目前尚无水溶蜂胶对人牙髓细胞的细胞毒性及蜂胶用于盖髓治疗的实验报告。

为进一步明确蜂胶在盖髓治疗中的性能,研究能否利用蜂胶的天然强抗菌性,丰富的物质含量和改善微循环、促进增生等多种生物活性消除暴露牙髓的炎症,从而诱导牙髓—牙本质复合体反应形成修复性牙本质,笔者采用国产水溶蜂胶做人牙髓细胞的细胞毒性实验。由于以前多数研究为蜂胶乙醇提取液,对蜂胶水提取液的研究非常少。在本实验中,为降低对牙髓的刺激,并填补蜂胶水溶剂用于盖髓治疗的研究空白,采用国产水溶蜂胶制备不同浓度的蜂胶水溶剂。采用体外细胞培养技术培养人牙髓细胞,用MTS比色法检测不同浓度的蜂胶水溶剂作用于人牙髓细胞后的OD值。计算细胞RGR,根据RGR换算细胞毒性的级别。观察不同浓度的蜂胶水溶剂对人牙髓细胞增殖的影响,并对其细胞毒性进行评级。

实验结果表明,水溶蜂胶及氢氧化钙对人牙髓细胞的细胞毒性各浓度组间差异有统计学意义(P < 0.05);对蜂胶与氢氧化钙总体细胞毒性进行两独立样本t检验,差异无统计学意义(P >0.05),表明蜂胶和氢氧化钙总体细胞毒性无差异。1 g/L及以下国产水溶蜂胶溶液对人牙髓细胞的毒性在2以下,具有低毒性,可考虑用于临床治疗。

摘要：目的 探讨水溶性蜂胶对人牙髓成纤维细胞的毒性作用,为蜂胶的临床应用提供理论依据。方法 用一种新的四唑类化合物MTS比色法检测人牙髓细胞在不同浓度的蜂胶、氢氧化钙溶液中体外培养48 h后细胞的相对增殖率(RGR),用5级毒性分类法评级。结果 1 g/L及以下浓度的水溶蜂胶组对人牙髓成纤维细胞的毒性级别在2以下。结论 1 g/L及以下浓度的水溶蜂胶液对人牙髓成纤维细胞的毒性作用较小,是治疗牙髓疾病的安全药物。

人心肌成纤维细胞 篇5

芍药苷(paeoniflorin,PEF)是从传统中药芍药干燥根中提取的有效成分,具有多种药理学活性,如降低胆固醇水平,抗血小板聚集以及神经保护效应等[4,5,6]。最近有研究发现,PEF通过抑制肝脏星形细胞的增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原的产生而具有明显的抗肝纤维化效应[7]。但其是否具有抗MF的作用,尚未见文献报道。

心肌成纤维细胞是MF的主要效应细胞,其增殖和胶原合成聚集过多是MF的主要病理基础。有文献报道,过度刺激β肾上腺素能受体可导致心肌胶原的沉积和MF的形成[8]。因此,本实验用β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱导大鼠心肌成纤维细胞的增殖和胶原的产生,观察PEF对ISO诱导的细胞增殖和胶原产生的影响,并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自Gibco公司;Trizol Reagent购自Invitrogen公司;ISO购自Sigma公司;CT-1和β-actin抗体购自Abcam;逆转录试剂盒购自MBI公司;MTT及活性氧检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所;Ⅰ、Ⅲ型胶原ELISA试剂盒购自上海蓝基生物科技有限公司;PEF(纯度≥98%)购自杨凌东科麦迪森制药有限公司;其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

主要仪器有5%二氧化碳培养箱(SANYO,Japan);倒置显微镜(Olympus,Japan);7500型实时荧光定量PCR仪及分析软件SDS(Applied Biosystems,USA)。

1.3 试验方法

1.3.1 原代心肌成纤维细胞的培养

取出生1周以内的SD大鼠10只,断颈处死,用75%酒精浸泡消毒;开胸取心脏,仔细去除血管、心房及周围结缔组织;取心尖部心室肌剪成0.5 mm×0.5 mm×0.5mm～1.0 mm×10 mm×1.0 mm大小的组织块,用PBS清洗2次;将组织块移入离心管,并加入0.25%胰蛋白酶2 m L,37℃水浴中消化5 min;轻轻吹打,吸取上层混悬液移弃;再加入胰蛋白酶2 m L于组织中消化5 min,沉淀,收集上清液加入含20%胎牛血清的DMEM中终止消化,吹打收集上清液。重复上述步骤3次。将收集的上清液于1 000 r/min离心10 min,弃上清,加入含20%胎牛血清的DMEM培养基,吹散后接种于培养瓶中,置培养箱(5%二氧化碳、37℃)中培养1.5 h,弃去上清液,换新鲜培养基,继续培养。用差速贴壁法纯化细胞,至第四代获取纯度大于95%的心肌成纤维细胞用于实验。

1.3.2 实验分组

实验共分为5个组:正常组:细胞中不加任何试剂;ISO损伤组:细胞中加入10-5mol/L的ISO;低剂量PEF+ISO组:先加入10μmol/L的PEF孵育细胞2 h,然后加入10-5mol/L的ISO;高剂量PEF+ISO组:先加入100μmol/L的PEF孵育细胞2 h,然后加入10-5mol/L的ISO;高剂量PEF组:细胞中加入100μmol/L的PEF。以上各组ISO的处理时间均为48 h。

1.3.3 MTT检测细胞增殖活性

以传代方法将细胞接种于96孔板中培养。待细胞融合成单层,换以含1%胎牛血清的DMEM培养基同步化12 h后,即可按前述进行分组处理,药物作用相应时间后,每孔加入MTT(5 mg/m L)20μL,放入培养箱中继续孵育4 h,终止培养,吸弃上清液,加入二甲基亚砜(DM-SO)150μL/孔,振荡10 min,490 nm波长下测吸光度(OD)值。

1.3.4 Real-time PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原和CT-1m RNA的表达

应用Trizol提取各处理组细胞总RNA,取1μg总RNA在20μL反应体系中逆转录合成c DNA;取c DNA进行PCR扩增,用以检测Ⅰ、Ⅲ型胶原和CT-1 m RNA的表达,引物序列见表1。

1.3.5 ELISA法检测上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量

细胞完成相应处理后,收集细胞培养上清液于离心管中。用ELISA法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量,操作严格按照说明书进行。

1.3.6 Western blot检测CT-1蛋白的表达

药物处理完毕后,用RIPA裂解液提取细胞总蛋白,分装并保存于-70℃冰箱中备用。以BCA法测定蛋白浓度,取40μg待测蛋白行SDS-PAGE电泳,10 V半干式电转膜25 min,将蛋白质转移至PVDF膜上。TBST配制的5%脱脂牛奶室温封闭1 h后加入CT-1单克隆抗体(1∶100)4℃过夜,漂洗后与1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗室温反应1h,洗膜后加发光剂显影,定影,洗片。用凝胶成像分析系统进行灰度扫描,以同一标本β-actin的产物灰度值作为内参,并计算出相对值。

1.3.7 ROS的测定

细胞处理完毕后,吸弃培养板中的培基,用无血清的DMEM洗涤细胞2次;加入适当体积稀释好的DCFH-DA(用无血清DMEM培养液以1∶1 000稀释,使终浓度为10μmol/L),加入的体积以能充分盖住细胞为宜;37℃细胞培养箱内孵育20 min;用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA;在488 nm激发波长,525 nm发射波长下检测荧光强度。

1.4 统计学分析

用SPSS 12.0统计软件进行统计学处理,所有数据均以均数±标准误(x±s)表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用One-way ANOVA和Newman-Keuls-test多重比较t检验,双侧P<0.05认为差异有显著性。

2 结果

2.1 PEF对ISO诱导心肌成纤维细胞增殖活性的影响

MTT结果显示:ISO处理体外培养的心肌成纤维细胞后可明显诱导细胞的增殖,与正常对照组相比差异具有显著性(P<0.01);预先应用不同浓度的PEF孵育细胞后,可明显抑制ISO的上述效应,但单独应用PEF对成纤维细胞的增殖活性并无明显影响(图1)。

2.2 PEF对ISO诱导成心肌纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达和含量的影响

由于MF主要与Ⅰ型和Ⅲ型胶原的沉积有关,因此我们检测了心肌成纤维细胞中Ⅰ型和Ⅲ型胶原m RNA表达的变化。Real-time PCR结果显示:ISO可显著上调Ⅰ、Ⅲ型胶原m RNA的表达,与正常对照组相比差异具有显著性(P<0.01);预先孵育不同剂量的PEF后可显著下调Ⅰ、Ⅲ型胶原m RNA的表达(图2)。细胞培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原的蛋白含量也呈现一致的变化(图3)。

2.3 PEF对ISO诱导心肌成纤维细胞CT-1mRNA和蛋白表达的影响

由于CT-1是MF过程中的关键因子,因此我们检测了CT-1 m RNA和蛋白的表达。结果显示:ISO处理心肌成纤维细胞后可明显上调CT-1 m RNA和蛋白的表达,与正常对照组相比差异具有显著性(P<0.01),预先应用不同浓度的PEF处理后可明显抑制ISO的上述效应,但单独应用PEF对CT-1m RNA和蛋白的表达并无明显影响(图4、5)。

2.4 PEF对ISO诱导成心肌纤维细胞ROS产生的影响

结果显示:ISO处理成纤维细胞后可明显增加细胞内ROS的水平,与正常对照组相比差异有显著性(P<0.01);预先应用不同浓度的PEF孵育细胞后,可明显抑制ISO诱导的ROS的产生,但单独给予PEF对细胞内ROS的产生并无明显影响(图6)。

3 讨论

MF是以心肌成纤维细胞增殖和间质胶原过度沉积为特征的一种病理状态,也是心脏的一种代偿反应。当心肌细胞数量减少时,心肌间质增生,胶原纤维过量聚集以弥补心肌细胞的不足。胶原在间质中异常堆积可增加心脏的僵硬度,导致顺应性降低和舒张充盈下降;细胞间和细胞周围胶原纤维的增加,可限制细胞运动和降低心肌收缩性;胶原纤维过量聚集还可引起心肌组织电传播异常,引发心律失常,这些最终将导致心力衰竭的发生。因此,阐明MF的病理生理机制,以寻求有效的防治措施,将会明显延缓心力衰竭的发生。

CT-1是PENNICA等[9]人在1995年首次从小鼠心脏发育的胚胎干细胞中克隆出的一种新基因,因其编码产物能够诱导心肌细胞肥大,故而命名。CT-1的分子量为21.5 kD,是细胞因子白细胞介素-6超家族中的一员。在心脏、骨骼肌、卵巢、肾脏等多种组织细胞中均存在CT-1的表达,这对维持机体正常的生长发育是必需的。但在某些病理状态下,CT-1的过度表达参与了多种疾病的发生[10,11]。有研究发现,在醛固酮诱导的MF动物模型中,CT-1的表达水平显著上调,敲除CT-1则可明显抑制心肌胶原的沉积和纤维化的形成[12]。同样,外源性给予CT-1也能明显诱导大鼠MF的形成[13]。以上研究结果说明,CT-1在MF过程中有着重要的作用,是一种新的致纤维化因子,可作为抗纤维化治疗的一个靶目标[13]。

PEF是一种单萜类糖苷化合物,是从传统中药处方芍药根中提取的一种主要活性单体成分,在中枢神经系统、免疫系统以及血液系统均有着有益的生物学效应。最近有文献报道,PEF在体内和体外均能明显抑制细胞的增殖和胶原的产生,从而改善肝脏纤维化[14,15]。因此推测,PEF可能具有抑制MF的作用。本实验中笔者观察到,预处理PEF可明显抑制ISO诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原产生。由于CT-1是一种重要的致纤维化因子,因此认为PEF抑制细胞增殖和胶原合成的作用可能与CT-1有关。进一步的研究发现,PEF抑制细胞增殖和胶原合成的同时,CT-1的m RNA和蛋白表达也明显降低。以上研究结果说明,PEF可能通过下调CT-1的表达进而抑制ISO诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原产生。

有研究发现,过氧化氢、氯化钴以及低氧均能明显上调CT-1的m RNA和蛋白表达,提示CT-1的表达受活性氧(reactive oxygen species,ROS)的调节[16]。另有文献报道,在培养的人脐静脉内皮细胞,PEF通过减少细胞内ROS的产生明显抑制过氧化氢诱导的细胞凋亡[17],提示PEF还具有抗氧化特性。此外,ZHANG等[18]发现,ISO诱导的大鼠MF与ROS的过量产生密切相关。基于以上的研究,笔者推测:本实验中PEF抑制CT-1的表达可能与降低细胞内ROS的产生有关。本实验也确实观察到,PEF下调CT-1表达的同时,细胞内ROS的水平也明显降低。以上结果说明,PEF可能通过抑制ROS的产生进而下调CT-1的表达。

综上所述,PEF能明显抑制ISO诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原合成,其机制可能与减少细胞内ROS的产生进而下调CT-1的表达有关。

摘要：目的 观察芍药苷(PEF)对异丙肾上腺素(ISO)诱导心肌成纤维细胞增殖和胶原产生的影响,并探讨其机制。方法 体外培养的心肌成纤维细胞,待细胞生长到融合状态时加入不同浓度的PEF(10或100μmol/L)预处理2 h,然后加入ISO(10-5mol/L)作用48 h。用四唑盐比色实验(MTT)检测细胞增殖活性;实时荧光定量PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原和心肌营养素-1(CT-1)mRNA表达;酶联免疫吸附法(ELISA)检测上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量;Western blot和DCFH-DA荧光法分别检测CT-1蛋白和细胞内活性氧(ROS)的水平。结果 ISO能明显诱导心肌成纤维细胞的增殖,并能显著增加Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达和含量,同时CT-1的mRNA和蛋白表达以及细胞内ROS的水平也显著升高,而预先应用不同浓度的PEF处理后,上述效应明显减弱。结论 PEF能抑制ISO诱导的心肌成纤维细胞增殖和胶原产生,其机制可能与降低细胞内ROS的产生进而下调CT-1的表达有关。

人心肌成纤维细胞 篇6

1材料与方法

1.1样本制备材料和设备

4英寸的硅片,腐蚀液( 3HF ∶ 6NH4F ∶ 10H2O) ,光刻胶,清洗液( 4H2SO4+ H2O2,NH4OH + H2O2+ 5H2O, HNO3+ H2O2+ 5H2O) ,氧化4470四管微控制扩散系统,Karlsuss MA6 /BA6光刻键合对准机,双管等离子体去胶机-DQ-500,JS-3X-100B磁控溅射台,Dektak3 Series膜厚测量仪。环境扫描电镜( ES-EM) : XL30 ESEM-TMP,Philips-FEI。

1.2细胞培养、电镜观察细胞黏附形态的材料及设备

DMEM低糖培养液( Gibco,美国) ,胎牛血清FBS( Hy Clon,美国) ,0. 25% 胰蛋白酶( Gibco,美国) ,专用电镜固定液: 3. 7% 戊二醛 - 1. 5% 多聚甲醛( G5882, 16005,Sigma) ,临界点干燥仪( Leica EM CPD300) ,场发射扫描电镜( Nova Nano SEM 230 FEI) 。

1.3实验方法

1. 3. 1样本制备的方法湿法蚀刻步骤,硅片上制备钛表面的沟槽,具体步骤如图1A最后在材料表面溅射200 nm Ti。不同组别沟槽的剖面示意图如图1B表示,沟槽的剖面为倒梯形,沟槽侧壁与顶部交角为54. 74°。根据各组材料沟槽的宽度和深度,分组命名为: T0,T15 /5,T15 /10,T30 /5,T30 /10,T60 /5,T60 / 10。

1. 3. 2各向异性微沟槽形貌的表征环境扫描电镜 ( ESEM) ,放大倍数为1 000倍观察表面微沟槽的正面和侧面形貌,同时测量微沟槽的深度和宽度。

1. 3. 3细胞在材料表面的黏附形态观察细胞接种前材料( 1 cm × 1 cm) 消毒: 丙酮超声3 min,100% 酒精浸泡2 h,灭菌超纯水清洗,无菌镊子夹入24孔板中,紫外照射30 min。每个孔接种HGF 5 × 104个( 原代培养[2],第6代接种) ,细胞培养时间为1 d,将材料片夹出,纯水轻轻冲洗2遍后专用的电镜固定液: 3. 7% 戊二醛 - 1. 5% 多聚甲醛固定15 min,蒸馏水洗2 ~ 3次,2 min / 次,脱水: 30% 、50% 、70% 、90% 、 95% 、100% 酒精逐级脱水,每次3 min; 临界点干燥,喷金扫描,500和5 000倍场发射SEM观察拍照。

1. 3. 4HGF在材料表面的增殖效率检测材料 ( 1 cm × 1 cm) 放入24孔板同前消毒,每孔接种1 × 104个细胞,加入1 ml DMEM培养液,6 h,1、3、5、7d时间点进行测量,相应的时间点用镊子取出材料片,将材料片移入新的24孔板,PBS轻轻冲洗2次,每孔加500 μl培养基,设置一孔不含钛片的培养基,每个孔加入50 μl CCK-8孵育2 h,每个孔吸出200 μl加入新的96孔板中, 孔板周围用培养液充填; 酶标仪测量 ( 450 nm) 吸光度值,每组材料重复测量3次。所得A值采用SPSS 17. 0统计软件,单因素方差分析,组间统计SNK-q test进行两两比较,P < 0. 05差别有统计学意义。

2结果

2. 1各向异性微沟槽形貌的表征

观察不同宽度和深度的微沟槽表面呈现规则的各向异性排列走向,沟槽宽度和间隔尺寸如图2,利用扫描电镜测量各组沟槽的宽度,间隔和深度,各组沟槽表面尺寸均符合原始设计尺寸要求[2]。

2. 2扫描电镜图像下细胞在不同宽度和深度沟槽表面的黏附生长

细胞无规则排列,沟槽表面细胞顺着沟槽排列 ( 图3) ,观察细胞和沟槽的比例关系( 图3) ,T15组细胞跨过沟槽生长且很难进入槽沟,T30组细胞能够进入槽沟生长且与沟槽侧壁尚有间隙,而T60组细胞轻松进入槽沟生长且留有更大空间让更多细胞进入生长,为更多细胞提供更多生长空间。

2. 3HGF在不同宽度和深度微沟槽表面 的增殖 ( CCK-8)

相同时间点各组材料表面增殖结果的比较( 图4) 。黏附6 h: T60沟槽表面吸光度值大于其他组,在黏附第1天: T30,T60组的增殖高于T15,T15组与T0组差异不大,在相同宽度下深度不同对细胞增殖差异影响没有统计学意义( P > 0. 05) ,随着时间推进,进入第3天后,随着宽度的增加细胞增殖加大,T60组的增殖水平明显高于其他( P < 0. 001) ,高度对增殖水平的影响表现为,在窄的沟槽T15组深度越大增殖越弱,而宽的沟槽组( T30,T60) 深度越大增殖越强,这种趋势到了第5天更加明显。进入第7天这种趋势保持,不同的是T15组A值低于T0有统计学意义,其中T15 / 10 A值最低。每组材料随着时间推移增殖的比较: 从6 h到第5天各组材料表面随着时间的推移细胞逐渐增殖,到了第7天,T0,T15 /5,T15 /10增殖下降,均少于第5天的水平,下降的趋势以T15 /10最为显著; T60 /5,T60 /10仍保持较高的增殖水平。

3讨论

3.1沟槽形貌应用于种植体穿龈部位形貌的设计

研究认为[3,4]实现“接触诱导”效应的关键是形貌的尺寸应小于目的细胞本身,本实验选用的宿主细胞为HGF,完全铺展后约100 μm,为了保证“接触诱导”效应的实 现,沟槽宽度 确定为15、30、60 μm。 Clark[4]比较沟槽的深度对“接触诱导”效应中发现,随着沟槽深度增加( 1、5、10 μm) “接触诱导”现象越明显,此外Mrksich[5]研究发现在V形沟槽底细胞无法良好的贴覆而是跨过生长,因此沟槽深度设计上有所控制,沟槽形态为倒梯形( 图1A) ,5 μm和10 μm的深度能够保证有较宽的沟槽底部有利于细胞在此部位贴覆生长。

3.2HGF在不同宽度和深度微沟槽表面的黏附形态

1952年Weiss等[6]首先提出了“接触诱导”现象, 当黏附表面有台阶存在时,细胞很难跨过在有台阶的表面生长,而受到边界的限制延长转而高度极性化生长,不同的细胞对不同的微环境( 表面形貌形态和尺寸) 有不同的反应[7]。细胞黏附于光滑的表面,细胞骨架以细胞核为中心向四周伸展,而细胞所在沟槽环境则存在的“边界效应”影响,细胞膜受到边缘交线的顶起,感受到周围沟槽边缘嵴即落差后转换为环境对自身的力学作用,进而调整其自身顺着平面生长而躲避落差环境。本实验中不同沟槽的宽度和深度对细胞都成功起到了“接触诱导”效应,T60组为细胞提供更多生长空间的同时也保证了诱导细胞顺着沟槽生长。

3.3HGF在不同宽度和深度微沟槽表面的增殖

影响细胞黏附增殖的主要因素[8,9]包括了表面的化学成分、表面形貌、粗糙度以及亲水性。HGF更适于在光滑还是粗糙形貌表面附着还存在争议,Att[10]研究认为酸蚀粗糙的表面相比机械切割表面有利于HGF的贴覆生长,Kim[11]也认为粗糙的表面有利于形成更稳固的结缔组织附着,并建议用在种植体穿龈部份,而Abrahamsson[12]比较光滑表面与酸蚀处理表面证明种植体周软组织对表面的附着能力不受材料表面粗糙度的影响。本实验结果表明所有沟槽表面HGF黏附从6 h ~ 5 d都显示出比光滑表面较好的增殖趋势,可见沟槽形貌在一定时间内有利于细胞黏附增殖, 可能由于微沟槽的“接触诱导”导致的细胞有序排列, 增加了细胞的生长空间。沟槽形貌表面HGF的增殖决定于沟槽的尺寸与HGF的大小比例所决定的细胞生长空间的提供,T15沟槽的表面减少了细胞增殖的时间,增殖幅度也不如宽度大的沟槽明显,主要是因为随着细胞伪足的伸展,对于100 μm左右的HGF,15 μm宽度的沟槽过于狭窄,细胞无法进入槽沟生长生长空间相对减少。因此出现到细胞增殖的第7天, T15 /5,T15 /10组表面细胞数量下降,可能是由于生长空间有限导致细胞生长达到饱和进而产生接触抑制的结果,同时T15 /10可能由于窄而深的沟槽不利于细胞黏附,导致黏附第7天增殖大幅下降。

细胞增殖的结果一方面与三维空间关系密切,另一方面与表面的亲水性有关,本研究结果与大多数研究结果相似[13,14]: 材料表面的亲水性能增加材料表面细胞的黏附增殖。各组材料亲水性测试结果显示[2]随着沟槽的宽度变窄和深度增加材料表面的疏水性显著增大,T60组的接触角小于其他宽度的微沟槽表面, 且T60 /5的接触角最小亲水性最好,T15 /10接触角测量值最大为疏水性最强,甚至大于光滑组T0。黏附6 h,T60沟槽表面A值大于其他各组材料表面,与T60材料表面亲水性较大有直接关系,然而虽然T60 /5亲水性最好,但黏附后期的增殖水平小于T60 /10,可能由于表面形貌的影响程度超过了亲水性,较深的沟槽提供了更多的生长空间相对于亲水性促进黏附的影响更大,因此T60 /10组增殖结果最强。T15组最为疏水,其中T15 /10上方细胞的增殖效率最差,除了沟槽过窄导致的生长空间相对有限外,还与T15 /10组最为疏水有一定的关系。

综合以上: 本实验设计的沟槽尺寸均成功的诱导细胞顺着沟槽生长,T15组因沟槽间隔较窄,细胞跨过沟槽表面无法进入沟槽之间生长,随着沟槽宽度的增加,T60组细胞自由进入沟槽生长且保持“接触诱导” 效应,即沟槽宽度和深度的增大均有利于细胞的增殖。 就“接触诱导”及细胞增殖而言,T60 /10建议作为种植体穿龈部分的沟槽尺寸,当然最终穿龈部位沟槽尺寸的确定还要其他更为详实的实验支持。

摘要：目的:观察微沟槽形貌对人牙龈成纤维细胞(HGFs)黏附形态和增殖的影响。方法:在钛表面设计不同沟槽尺寸,利用光刻技术制作微沟槽形貌,沟槽宽度与间隔分别为15、30、60μm,沟槽的深度为5μm和10μm,分组为T15/5,T15/10,T30/5,T30/10,T60/5,T60/10,光滑钛(T0)表面为对照组,环境扫描电镜(ESEM)观察各组材料表面微沟槽形貌,接种HGFs后,通过扫描电镜和CCK-8实验观察分析不同沟槽尺寸上方细胞黏附和增殖差异。结果:T0组表面细胞排列不规则,其余组沟槽表面细胞均顺着沟槽排列,T60/10组沟槽表面细胞的增殖幅度最大,增殖时间最长。结论:本实验所设计的沟槽尺寸均能成功诱导细胞顺着沟槽排列,随着沟槽的宽度增加深度增大越有利于促进细胞增殖。

人心肌成纤维细胞 篇7

1 资料与方法

1.1 对象与分组

201 2年6月至2014年5月本院收治的浅Ⅱ度烧伤患者46例, 男37例, 女9例;年龄1~47岁;烧伤面积1%~40%, 烧伤创面分布头面颈、躯干、四肢。按随机数字表法将46例分为艾夫吉夫组21例与对照组25例。艾夫吉夫组平均年龄 (25±14) 岁;热液伤16例, 火焰伤4例, 电弧伤1例;创面位于头面颈11例, 躯干5例, 四肢5例;烧伤面积为全身体表总面积 (TBSA) 的 (11.3±9.1) %。对照组平均年龄 (29±12) 岁;热液伤22例, 火焰伤1例, 电弧伤2例;创面位于头面颈12例, 躯干9例, 四肢4例;烧伤面积为 (14.5±9.4) %。两组年龄、性别、致伤原因、烧伤部位及面积等接近。

1.2 治疗方法

患者入院后均予1∶1000氯己定溶液清创, 然后用生理盐水冲洗创面。艾夫吉夫组:患者清创后外用艾夫吉夫 (上海万兴生物制药有限公司生产, 25 000U/瓶) , 将包装中10ml溶媒倒入装有艾夫吉夫冻干粉的瓶内, 使药液浓度为2500U/ml。将此药液浸透于单层无菌干纱布, 用量为100U/cm2, 覆盖创面, 每日换药1次, 直至创面愈合。对照组:清创后外用磺胺嘧啶银糊剂外涂, 每日换药1次, 直至创面愈合。所有患者愈合后随访3个月观察色素沉着情况。艾夫吉夫组用药前后分别检测血尿常规及肝肾功能, 查看药物不良反应情况。

1.3 疗效评定标准

有效:愈合创面轻中度色素沉着, 与周围正常皮肤接近或差别较小。无效:愈合创面有重度色素沉着, 与周围正常皮肤颜色差别较大, 色素沉着明显。

1.4统计学方法

采用SPSS 16.0软件处理数据。计量资料以 (±s) 表示, 采用t检验;计数资料用χ2检验;P<0.0 5为差异有统计学意义。

2 结果

两组均未发生明显感染, 用药期间亦未见明显不良反应, 治疗后血尿常规、肝肾功能检查均在正常范围。平均愈合时间:艾夫吉夫组 (7.3±1.4) 天, 对照组 (9.4±1.9) 天, 差异有统计学意义 (t=4.20, P<0.01) 。3个月后, 艾夫吉夫组有效16例 (76.2%) , 无效5例 (23.8%) ;对照组有效11例 (44.0%) , 无效14例 (56.0%) 。艾夫吉夫组创面色素沉着较浅, 疗效好于对照组, 差异有统计学意义 (χ2=4.88, P<0.05) 。

3 讨论

浅Ⅱ度烧伤创面是皮肤表皮及部分真皮浅层受损, 通过残留的基底细胞及皮肤附件上皮再生, 使创面愈合。创面的修复要经历增殖、再生、修复和重建等一系列的病理生理过程, 期间有多种因子参与, 其愈合质量可以直接影响患者的生活质量。

细胞生长因子临床应用于烧伤已10多年。从早期的表皮生长因子来看, 其临床使用都显示了它在烧伤领域良好的治疗效果。酸性成纤维细胞生长因子对创伤、糖尿病溃疡及术后皮瓣坏死等多种皮肤损伤有促进愈合作用[1]。这些生长因子有三种作用, 即趋化作用、合成分泌作用和增殖分化作用。艾夫吉夫是人工合成的一种多肽, 由141个氨基酸组成, 分子量为15.5KD的活性多肽, 其化学结构、理化性质和生物活性与人体内的酸性成纤维细胞生长因子完全一致。

与其他生长因子比较, 重组人酸性成纤维细胞生长因子的优点在于: (1) 受体最多, 结合能力更强。 (2) 创面环境呈酸性[2], 重组人酸性成纤维细胞生长因子更亲和酸性创面环境。 (3) 从正负电荷看, 重组人酸性成纤维细胞生长因子在创面酸性环境下带负电荷, 更容易与带正电荷的细胞膜上的受体结合, 发挥其温和持久的生物学活性[3]。它还能够激活和诱导巨噬细胞迁移, 降低创面感染机会。以往观察发现, 重组人酸性成纤维细胞生长因子对深Ⅱ度烧伤有良好的促愈合作用[4], 还对骨、神经、血管有广泛的修复作用。烧伤创面微环境呈酸性有利于重组人酸性成纤维细胞生长因子在局部发挥生物学活性, 促进烧伤创面上皮生长, 诱导毛细血管胚芽形成, 修复创面。

本文结果表明, 应用艾夫吉夫外敷浅Ⅱ度烧伤创面, 愈合时间快于应用磺胺嘧啶银, 色素沉着较轻, 且未见明显不良反应, 提示艾夫吉夫治疗浅Ⅱ度烧伤有一定的优势。

摘要：目的 观察外用冻干重组人酸性成纤维细胞生长因子 (艾夫吉夫) 治疗浅Ⅱ度烧伤的效果。方法 将46例浅Ⅱ度烧伤患者随机分为艾夫吉夫组21例和对照组25例。艾夫吉夫组用艾夫吉夫外涂, 对照组用磺胺嘧啶银糊外涂。观察两组创面愈合时间、愈合后创面色素沉着效果及不良反应。结果 艾夫吉夫组创面愈合时间 (7.3±1.4) 天, 有效16例 (76.2%) ;对照组创面愈合时间 (9.4±1.9) 天, 有效11例 (44.0%) 。两组创面愈合时间及疗效差异均有统计学意义, 均未见明显不良反应。结论 与磺胺嘧啶银相比, 艾夫吉夫能明显促进浅Ⅱ度烧伤创面的愈合, 减轻色素沉着。

关键词：外用冻干重组人酸性成纤维细胞生长因子,浅Ⅱ度烧伤,创面,愈合时间,色素沉着

参考文献

[1]马宇光, 武力, 王红磊, 等.重组人酸性成纤维细胞生长因子治疗乳腺癌根治术后皮瓣坏死的临床观察[J].中国临床药理学与治疗学, 2009, 14 (4) :436.

[2]马珂, 李强, 刘炘, 等.重组人酸性成纤维细胞生长因子促进家兔体表溃疡愈合作用研究[J].医药导报, 2008, 27 (2) :126.

[3]曲狄, 王雪莹, 刘铭然, 等.外用冻干重组人酸性成纤维细胞生长因子 (艾夫吉夫) 对15例溃疡创面的临床应用[J].中国伤残医学, 2009, 17 (6) :69.

人心肌成纤维细胞 篇8

1 资料与方法

1.1 一般资料

乳鼠 (SD大鼠) ;胰酶1:250 (Amresco公司生产) ;胶原酶B型 (Roche公司生产) ;DMEM高糖培养基 (Gibico公司生产) ;噻唑蓝MTT (Sigma公司生产) ;二甲基亚砜DMSO (Amresco公司生产) ;倒置显微镜 (Olympus公司生产, 型号IX74TH4-200) ;酶标仪 (BIO-TEK公司生产, 型号ELX800) 。实验分组:选择胎牛血清组为对照组;选择正常人15例为实验组, 年龄 (57.0±1.3) 岁。

1.2 方法

1.2.1 实验材料处理方法

1.2.1. 1 实验血清处理方法及原代培养液制备

将无菌促凝管中抽取的成人动脉血, 置于4℃温度下1 h, 待血液凝固后, 离心 (3000转/min) 10 min, 取上清置于离心管中, 实验用的胎牛血清从试剂公司购回, 在无菌超净台中将其分装至无菌小瓶中看, 置于-20℃冰箱中冻存备用。每次使用时将其置于室温下完全溶解即可使用。将处理好的人或胎牛血清加入达尔伯克 (氏) 改良伊格尔 (氏) 培养基, 血清浓度为10%, 有研究显示血清浓度为10%~15%时, 成纤维细胞生长良好[3], 放置于无菌超净台中用滤膜微孔为0.22微米的一次性滤器滤过除菌, 制备成原代培养液, 按照100 U/m L的浓度加入双抗 (分别将青霉素和链霉素用无菌蒸馏水完全溶解后制成的溶液) 以抑制培养过程中细菌的生长, 防止细胞被污染, 置于-20℃冰箱中冻存备用。

1.2.1. 2 乳鼠心脏成纤维细胞的分离培养步骤

在超净台中, 取乳鼠 (出生3 d以内) 心脏, 剪碎后用双酶消化 (2.5 g/L胰酶+1 g/L胶原酶) , 第一次消化10 min后弃上清, 从第二次开始每次消化5 min, 将上清转移到含有原代培养液的无菌离心管中, 直至将组织消化完毕, 离心 (1000转/min) 10 min, 弃上清, 加入培养基混匀, 分装在50 m L培养瓶中, 置于温度为37℃, CO2浓度为50 m L/L的培养箱中, 两小时后弃去上清, 将分离出的成纤维细胞分为二等分, 分别用含有胎牛血清和人血清的原代培养液进行培养, 隔日换液。每个样本换液均用其原代培养液。体外成纤维细胞在培养容器的典型存活和生长方式是贴壁和增殖, 贴壁成纤维细胞在光学显微镜下观察为梭形、三角形或不规则形, 有较长的伪足样突起。

1.2.2 实验结果获得方法

1.2.2. 1 显微镜下观察步骤:将培养容器放置在倒置显微镜 (Olympus公司生产, 型号IX74TH4-200) 下选择细胞轮廓清晰的视野进行照相记录。

1.2.2. 2 检测成纤维细胞增殖的MTT (噻唑蓝) 比色法步骤:取生长状态良好的细胞用2.5 g/L的胰酶消化, 在显微镜下见细胞变圆, 弃去胰酶, 加入原代培养液吹打, 吹打完毕后转移至无菌96孔板中继续培养, 每孔约4000个细胞, 200μL培养液。连续6 d检测结果, 检测当天, 每孔加入5μL MTT, 放入温度为37℃, CO2浓度为50 m L/L的培养箱继续培养4 h, 弃去上清, 每孔加入150μL的二甲基亚砜, 10 min摇匀后, 以570 nm为测量波长, 在酶联免疫检测仪上测每孔的光吸收值 (OD) , 以不加细胞的空白孔OD值作调零值, 并以时间为横轴, 光吸收值为纵轴绘制曲线。

1.3 统计学处理

各组计量资料用 (±s) 表示, 数据分析用配对t检验, 统计处理使用软件SPSS 13.0完成, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置显微镜 (×200) 下, 成纤维细胞形态结果

传代后, 在倒置显微镜 (×200) 下观察成纤维细胞形态及密度, A、C为FCS所培养, B、D为HFS所培养。第1天两种含不同血清培养基培养的成纤维细胞形态相似, 呈梭形或三角形, 有较长伪足样突起, 且密度大致相同, 如图1中A、B所示。第4天两种含不同血清培养基培养的成纤维细胞相似, 呈梭形、三角形或不规则形, 但密度不同:含FCS培养基培养出的成纤维细胞密度大于含HFS培养基的, 见图1中C、D。与第1天相比, 每种培养基培养细胞的密度均比同种在第1天观察到的密度大。

2.2 吸光度与时间关系

根据每日检测结果绘制细胞增殖的吸光度与时间关系曲线。 (图表中数据为细胞增殖的吸光度值, 为各组各样本每天吸光度值的均数。从图中可以看出, 两组细胞吸光度均随培养天数的增加呈上升趋势, 其中牛血清组的上升趋势快于人血清组, 见图2。

2.3 两组吸光度的比较结果

两组吸光度在第1天比较, 差异无统计学意义;第4天两组吸光度比较差异有统计学意义, 且牛血清组吸光度高于人血清组, 见表1。

*与FCS组相比较, P<0.05;△与HFS组相比较, P<0.05

3 讨论

成纤维细胞是结缔组织中常见的细胞, 由胚胎时期的间充质细胞分化而来。电镜下可看到胞质中有丰富的粗面内质网、游离的多核糖体和发达的高尔基复合体, 表明该细胞合成蛋白质的活动旺盛, 在正常情况下, 这种细胞多处于静止状态, 功能活动不活跃, 成为纤维细胞, 而在创伤等条件下可被炎症介质趋化, 进入增殖活化状态, 成纤维细胞可以合成和分泌弹性纤维、网状纤维等细胞外基质成分[4], 同时还可合成和分泌金属蛋白酶及其抑制剂, 间接参与旧胶原的降解和新胶原的重排、沉积, 参与受损组织的纤维性修复即纤维化过程, 然而, 过度的纤维化使器官及组织丧失原有的形态或功能[5,6]。因此, 纤维化的发生发展成为研究的热点, 成纤维细胞成为该类研究不可或缺的研究部分, 心脏纤维化是目前心脏疾病研究的热点, 心脏的纤维化不仅能造成心脏结构、功能的异常, 导致心脏扩大进而出现心力衰竭[7], 也由于心脏成纤维细胞的电生理学特性造成心律失常[8], 由于在人类活体上获取心脏组织细胞有一定难度, 而且可能会对受试者造成不可知的伤害, 因此本研究选取出生3 d以内的乳鼠心脏作为成纤维细胞的来源器官, 利用在同一培养皿中心肌细胞与成纤维细胞贴壁时间的不同分离出心脏成纤维细胞[9]。目前的科学研究中, 多用动物血清来培养细胞, 其培养的细胞存活率较高、分裂增殖活动比较活跃[10], 而关于成年动物血清尤其是人类血清培养的成纤维细胞是否出现类似现象的研究甚少, 而选择人类血清直接培养细胞要比动物血清培养细胞之后再进行相关的干预更具说服力。

在倒置显微镜下, 成活的乳鼠心脏成纤维细胞呈梭形、三角形或不规则形, 细胞质透明、向外伸出突起呈伪足样, 细胞核大, 呈椭圆形, 无自发性搏动, 显微镜下可直接看到成活乳鼠成纤维细胞的形态及密度。MTT比色法是一种常用的检测细胞存活和生长的方法, 其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中, 而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲瓒, 用酶联免疫检测仪在490 nm或570 nm波长处测定其光吸收值, 可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内, MTT结晶形成的量与活细胞数成正比。

本研究将人血清和胎牛血清培养乳鼠心脏成纤维细胞的结果进行对比, 第1天镜下观察到的含两种不同血清培养基培养的成纤维细胞密度无明显差异 (见图1的A、B) 且MTT结果中吸光度无显著差异 (见表1) , 说明第1天时成纤维细胞处在一个适应过程, 到第4天时每种培养基培养细胞的密度均比同种在第1天观察到的密度大 (见图1的C、D) , 且在培养的头4天, MTT结果显示吸光度都随时间呈增长趋势 (见图2) , 这说明两种培养基培养的成纤维细胞均已存活, 且有数量上的增加, 即有分裂增殖行为。在第二代细胞培养第4天以后, 两种不同培养基培养的成纤维细胞经MTT法检测的吸光度都有下降的趋势, 提示成纤维细胞的数量有所下降, 这可能跟培养的空间有限, 限制了细胞的增殖。综合以上镜下观察以及MTT吸光度的结果可以发现, 乳鼠心脏成纤维细胞在胎牛血清培养基中可存活并分裂增殖, 在人血清培养基中显示了同样的趋势。对比两组结果, 成纤维细胞在胎牛血清中生长更为活跃, 可能与胎牛血清中含有更多的刺激细胞生长的细胞因子有关。实验证明, 乳鼠心脏成纤维细胞不仅可在人血清中存活, 且有增殖行为, 乳鼠成纤维细胞直接由人血清培养是可行的。虽然该实验选取心脏成纤维细胞作为研究对象, 但因成纤维细胞在动物各个器官广泛存在, 且生物学特性类似, 故人血清直接培养其他器官来源的成纤维细胞亦是可行的, 该研究为人类血清培养动物细胞的可行性提供了依据。

参考文献

[1]马金, 丁春华.心脏成纤维细胞与心肌纤维化[J].中华心血管病杂志, 2014, 42 (3) :269-272

[2]刘爱旗, 夏璐.CCK-8法与MTT法检测兔成纤维细胞活性的比较研究[J].中国医学创新, 2013, 10 (2) :12-13.

[3]刘鹏, 金岩, 刘源, 等.不同种属真皮成纤维细胞在不同血清浓度培养基中生长的比较观察[J].实用口腔医学杂志, 2004, 20 (1) :16-19.

[4]Wynn T A.Cellular and molecular mechanisms of fibrosis[J].J Pathol, 2008, 214 (2) :199-210.

[5]Brown J J, Bayat A.Genetic susceptibility to susceptibility to raised dermal scarring[J].Br J Dermatol, 2009, 161 (1) :8-18.

[6]Juckett G, Hartman-Adams H.Management of keloids and hypertrophic scars[J].Am Fam Physician, 2009, 80 (3) :253-260.

[7]Li Y Q, Li X B, Guo S J, et al.Apocynin attenuates oxidative stress and cardiac fibrosis in angiotensinⅡ-induced cardiac diastolic dysfunction in mice[J].Acta Pharmacol Sin, 2013, 34 (3) :352-359.

[8]邢晓倩, 徐健, 苏浩, 等.犬心房颤动模型缝隙连接蛋白40、45与心肌纤维化的相关性[J].中华心血管病杂志, 2011, 39 (2) :176-180.

[9]Golden H B, Gollapudi D, Gerilechaogetu F, et al.Isolation of cardiac myocytes and fibroblasts from neonatal rat pups[J].Methods Mol Biol, 2012, 843 (1) :205-214.

人心肌成纤维细胞 篇9

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

镍铬合金、钴铬合金、纯钛、金合金(深圳美冠达); MMP-2 ELISA试剂盒、MMP-13 ELISA试剂盒(北京中杉金桥有限公司); 胎牛血清(杭州四季青生物制品有限公司); 鼠抗人波形丝蛋白单克隆抗体、鼠抗人角蛋白单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司);全自动CO2培养孵箱(日本三洋公司);PM-10A倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);TS型酶联免疫检测仪(瑞士Sunrise公司);离心机(上海生化仪器厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 人牙龈成纤维细胞培养

取临床正畸拔牙患者牙颈部健康的牙龈缘组织,剪成约1mm×1mm×1mm大小的组织块,在EP管中加入1mL的胰蛋白酶消化30min,DMEM终止消化,再用牙科探针将组织块均匀分布在25mL培养瓶底,倒置培养瓶,置37℃,5%CO2孵箱中孵育12h后,加入3mL的10%胎牛血清的DMEM液,继续培养。待细胞从组织块爬出且铺满瓶底的80%-90%后,弃去原培养液,用PBS液冲洗一次,加入0.25%胰蛋白酶,使之与细胞均匀接触2～5min,细胞呈圆形并于瓶底滑动,弃去胰蛋白酶液,加入培养基终止消化,用吸管吹打使细胞从培养瓶底脱落,将细胞接种到新的培养瓶中,传代比例为1:1。此后为细胞铺满瓶底80%～90%,传代比例为1:2。

1.2.2 人牙龈成纤维细胞的来源鉴定方法

①倒置显微镜下细胞形态学观察;②免疫荧光染色法:将第三代HGF细胞接种于6孔板中的盖玻片上,待细胞铺满盖玻片底约60%时弃去培养液,PBS冲洗,10%福尔马林固定,吹干后按照常规免疫荧光法进行波形丝蛋白和细胞角蛋白染色,光镜下观察;③生长曲线绘制:取第3代对数生长的细胞,以0.25%胰蛋白酶消化细胞,制成细胞密度为3×104/mL的单细胞悬液,接种于24孔板1mL/孔,每3孔为一组,共8组。放入CO2培养箱内继续培养8d,每天取一组,胰蛋白酶消化后进行细胞计数,取三孔平均值,绘制生长曲线。

1.2.3 金属浸提液的制备

将4种合金铸造成直径5.5mm ,高2.4mm的圆柱体,常规喷砂、打磨、抛光,蒸馏水中超声清洗10 min,之后在3个大气压、121℃条件下消毒20min。再将四组合金试样分别放于盛有DMEM 培养液的Eppendof 管中,按0.55 cm2/ mL(国际标准化组织相关实验的试件表面积与析出实验所在介质之比规定为0.5-6cm2/mL)的比率加入DMEM培养液,静置于培养箱,在37℃、5%CO2 、湿度95%下保存,7d后收集合金析出液。

1.2.4 实验分组

试验组:A组:镍铬合金浸提液,B组:钴铬合金浸提液,C组:纯钛合金浸提液,D组:低含金量金合金浸提液;E阴性对照组:10%FBS的DMEM培养液。

1.2.5 ELISA法检测人牙龈成纤维细胞MMP-13的表达

运用MMP-13 ELISA试剂盒对培养细胞的上清液进行检测,在酶联免疫检测仪上测450 nm波长处的吸光度值(OD)。通过MMP-13标准品的OD和已知浓度绘制出标准曲线,在标准曲线上找出各值所对应的浓度。

1.3 数据处理方法

采用SPSS17.0统计学软件对试验数据进行统计分析,数据以均数±标准差表示,多组间比较采用重复测量的方差分析方法,两两比较采用SNK-T的检验方法,以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞来源的鉴定

原代培养的细胞一般以组织块为中心呈放射状排列,倒置显微镜下细胞呈长梭型胞浆丰满;细胞核为1个,呈椭圆或圆形。细胞密度较低时细胞交织呈网状,密度较高时细胞排列成束状或漩涡状。

2.2 四种金属浸提液对人牙龈成纤维细胞MMP-13表达水平的影响

由ELISA法实验数据可得出:1h镍铬合金组、钴铬合金组、纯钛合金组、金合金组MMP-13水平与阴性对照组比较均无明显的差异,(P>0.05);6h镍铬合金组、钴铬合金组MMP-13表达水平高于纯钛、金合金组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。而纯钛和金合金与对照组比较差异不具有统计学意义(P>0.05)。12h、24h各组的比较结果与6h各组的结果一致。镍铬合金、钴铬合金MMP-13的表达水平在四个时间段(1、6、12、24h)呈递增的趋势。纯钛和金合金没有明显的变化。(见附表)

3 讨论

牙科合金浸泡在唾液中发生腐蚀,释放各种金属离子,在戴用含合金修复体患者的唾液、牙龈、舌刮片中检测到相关金属离子浓度升高[3]。牙科合金在体内体外均释放金属离子,体外试验表明,口腔科合金释放出的金属离子具有降低细胞代谢、抑制细胞增殖等毒性作用[4]。镍铬烤瓷合金是临床烤瓷牙基底冠最常用的材料,在口腔唾液中主要析出镍离子、少量的铬、钼离子,且随时间延长而增加[5]。FACCIONI等[6]发现,在戴用固定矫治器的患者颊黏膜中,镍铬的浓度分别是正常人的3.4和2.8倍,金属浓度和口腔黏膜细胞活力有明显的负相关。钴铬烤瓷合金具有能与高膨胀性低熔瓷粉结合弹性模量高等优点[7],由于不含有致癌作用的镍元素和铍元素,能较好的解决龈缘灰线问题,但是钴铬合金在口腔唾液中会析出金属离子,且随着时间延长析出的离子量也增加。这些释放出的金属离子被组织摄取而引起细胞的功能变化。钛合金烤瓷修复体具有抗电化学腐蚀、良好的生物相容性、质量轻、密度低、低弹性模量和高强度等优异的性能[8],还具有丰富的自然资源和良好的机械性能。金合金烤瓷修复体化学性质稳定、耐腐蚀性,生物安全性较好[9]。由于颜色为黄色,接近牙本质颜色,在此基础上制作的烤瓷冠表现出很好的美学效果,强度接近自然牙,对牙体磨损小,其弹性模量比其它合金更接近骨,另外其延展性,物理性能好,较非贵金属制作的更为密合,几乎不会出现颈缘黑线。

MMP-13是金属蛋白酶家族重要的成员, 1994 年从乳腺癌细胞中克隆出来[10]。MMP-13 在牙周炎患者的龈沟上皮和牙龈成纤维细胞中均有发现,但其在牙周疾病组织破坏中的作用机制尚不清楚。因此研究MMP-13或许可对牙周支持组织丧失的机制作出一定的解释。MMP-13的作用底物主要是Ⅰ～Ⅲ型胶原,MMP-13 对Ⅱ型胶原的降解能力至少是MMP-1 的10 倍,MMP-13 对凝胶的有效降解作用是MMP-1 的44 倍,MMP-8的3～8倍。MMP-13 在激活其他MMPs的过程中也处于中心地位,促进活性MMP-9、MMP-8的产生,同时还具有自身催化作用,可见MMP-13 水平的微小改变或活性的增强,都可能放大整个下游蛋白分解作用进而发挥MMP-13在激活MMPS之间的“瀑布效应”。从本实验结果我们可以看到1小时MMP-13的表达水平,各个实验组与对照的比较是没有明显的差异,可见正常生理情况下人牙龈成纤维细胞就分泌MMP-13,发挥着对胶原纤维的降解功能,而且可以维持细胞外基质的动态平衡。但是随着作用时间的增加,人牙龈成纤维细胞受镍铬合金、钴铬合金浸提液刺激后,MMP-13的水平与阴性对照比较明显增高,而且MMP-13的表达水平随着时间递增。而本实验中纯钛、金合金浸提液组MMP-13的表达量四个时间点比较(P>0.05)差异没有统计学意义,分别与各个时间点多的对照组比较(P>0.05)也不具有统计学意义。从统计学的分析上来看纯钛和金合金是没有差异的,可见纯钛作为口腔修复材料有很广泛的使用前景。但是从美学上来讲金合金具有更加完美的修复效果。

综上所述,镍铬合金和钴铬合金可以上调人牙龈成纤维细胞MMP-13表达水平,而纯钛和金合金对此影响不明显。这从细胞分泌的角度为我们临床上选择修复材料提供了参考。

参考文献

[1]马轩祥.我国瓷修复的问题与展望[J].中华口腔医学杂志,1999,34(5):261-263.

[2]石连水,王立凯.金属瓷聚体冠修复后发生颈缘灰线的临床观察[J].临床口腔医学杂志,2007,23(11):692-693.

[3]Zinelis S.Surface and elemental alterations of dental alloys inducedby electro discharge machining[J].Dent Mater,2007,23(5):601-607.

[4]ScottA,EgnerW,GawkrodgerDJ,et al.The national survey of ad-verse reactions to dental materials in the UK:A preliminary studyby the UK Adverse Reactions Reporting project[J].BrDentJ,2004,196(8):471-477.

[5]邓旭亮,胡晓阳,欧阳翔英,等.五种金属铸造后的腐蚀性研究[J].现代口腔医学杂志,2002,16(1):32-33.

[6]FaccioniF,France SchettiP,Cerpelloni M,et al.In vivo study onmetal release from fixed orthodontic appliances and DNA damagein oral mucosa cell[J].Am J orthod Dento-facial orthop,2003,124(6):687-693.

[7]AL-HiyasatAS,Bashahshabsheh OM,DarmaniH.An investigationof the cytotoxic effects of dental casting alloys[J].Int J prosth-odont,2003,16(1):8-12.

[8]Kuphasuk C,D Shida Y,Andres C J,et al.Electro chemiacal Cor-rosion of titan ium and titaniumbased alloys[J].J Prosthet Dent,2001,85(2):195-202.

[9]Viennot S,Daland F,Lissac M,et al.Corrosion resistance of co-balt-chromium and palladium-silver alloys used in fixed pros-thetic restorations[J].EurJ Oral Sci,2005,113(1):90-95.