成纤维细胞

成纤维细胞（共11篇）

成纤维细胞 篇1

成纤维细胞是结缔组织中最主要的细胞类型, 具有较强的分裂增生能力, 适应性强, 性状稳定, 是容易培养的动物细胞类型之一, 在生物学、医学、药理学及生物工程等研究中应用广泛, 起着重要的作用。成纤维细胞是常用的体细胞核移植技术的供体细胞[1,2], 体细胞克隆技术在动物育种、制备转基因动物、基因治疗和器官移植等方面具有重大的作用和广阔的应用前景。体细胞已经逐渐成为重要的畜禽品种资源, 通过构建濒危畜禽品种细胞库的途径保存其种质资源, 是目前最为理想的方法之一[3]。成纤维细胞的体外培养可作为体外细胞模型, 用于研究细胞因子对其功能的调控作用。近年来, 由体细胞直接重构为诱导性多能干细胞 (i PS细胞) 技术[4]的研究正在兴起。成纤维细胞成为i PS细胞研究的主要体细胞来源, 不仅为i PS细胞技术的研究提供种子细胞, 而且也可作为干细胞培养的饲养层, 从而建立完全无动物源性的干细胞培养系统[5]。

建立稳定、高效、易操作的成纤维细胞培养方法是开展各项研究的基础。猪器官的组织结构和生理生化特性与人类相近, 利用克隆转基因技术生产经遗传修饰的克隆猪, 可作为异种器官移植的供体, 因此猪成纤维细胞的培养具有更深远的意义。关于猪成纤维细胞培养方法的报道较多[6,7,8];但因试验条件、品种、取样部位的不同, 采用的方法不尽相同, 且对不同组织成纤维细胞培养方法比较的报道较少。本研究采用不同的培养方法, 培养了猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞, 对比培养效果, 旨在筛选出最佳的培养方法, 现报道如下。

1 材料

卡那霉素、青霉素、链霉素、DMEM/F12培养基、血清, 购自Gibco公司;胰酶、配制PBS所用的试剂, 购自Sigma公司;台盼蓝、EDTA、DMSO, Amresco公司产品;细胞培养所用的耗材, JET BIOFIL (广州) 公司产品。

2 方法

2.1 样品的采集及处理

猪胎儿采自昆明某屠宰场。把妊娠约30 d的猪胎儿 (约3 cm长) 连带一段子宫浸泡在PBS (含有50μg/m L卡那霉素、100 IU/m L青霉素和100μg/m L链霉素) 中, 立即带回实验室。剪开子宫壁和胎膜, 取出胎儿, 移入超净工作台 (型号为BCM-1300A, AIRTECH公司生产) , 用镊子去除胎儿头、尾、四肢、心脏及其他脏器, 用PBS清洗后用眼科剪将胚胎充分剪碎, 用PBS冲洗几次, 备用。

猪耳皮肤采自版纳微型猪。尽量挑选猪耳组织上血管较细少的部位, 用乙醇擦拭消毒, 剪下一小块猪耳组织, 将组织块放入PBS (含有50μg/m L卡那霉素、100 IU/m L青霉素、100μg/m L链霉素) 中, 立即带回实验室。在超净工作台上, 将猪耳组织块浸入75%乙醇10 s, 然后置于无菌培养皿中, 用眼科剪剪去毛, 再用PBS清洗5~10次, 然后剪成1~2 mm3的小块, 备用。

2.2 培养

2.2.1 胰酶热消化法

向剪碎的组织块中加入约2倍组织块体积的37℃预温的0.25%胰酶-0.04%EDTA, 在37℃培养箱 (Thermo) 中消化1 h (期间有规律地摇晃几次, 以充分消化) ;加入DMEM/F12培养液 (含10%FBS) 终止消化;取上清液, 以800 r/min离心5 min;弃上清液, 然后加入培养液, 轻轻吹打重新悬浮细胞, 以5×104/m L的密度接种于培养瓶中, 利用台盼蓝染色法计算细胞存活率。

2.2.2 胰酶冷热结合消化法

向剪碎的组织块中加入少量0.25%胰酶-0.04%EDTA, 置于4℃冰箱中冷消化3~4 h;在37℃培养箱中消化30~60 min;终止消化, 收集细胞, 离心, 重悬细胞, 培养并计数。

2.2.3 胰酶室温消化法

在组织块中加入室温的0.25%胰酶-0.04%EDTA, 在室温条件下, 置于摇床上消化1~2 h;终止消化, 收集细胞, 离心, 重悬细胞, 培养并计数。

2.2.4 组织块培养法

将组织块剪碎后, 加入37℃预温的DMEM/F12培养液, 转移至50 m L培养瓶内, 并均匀铺开, 吸去多余的培养液, 放入培养箱, 使组织块充分吸附于瓶底, 5 h后再加入37℃预温的DMEM/F12培养液, 24~48 h后观察组织块旁细胞生长情况。

2.3 成纤维细胞的传代、培养与纯化

细胞形成细胞单层 (80%~90%汇合) 时进行传代培养。在传代过程中成纤维细胞被纯化, 用PBS冲洗3次, 去除血清和脱落的组织块及死细胞, 加入1~2 m L 0.25%胰酶-0.04%EDTA, 显微镜下观察, 细胞收缩变圆时倒掉消化液, 加入含10%血清的DMEM/F12终止消化。轻敲瓶底, 用吸管反复吹打培养瓶瓶壁, 使成纤维细胞脱落, 并把细胞团分散为单细胞, 分瓶继续培养。

2.4 成纤维细胞生长曲线的绘制

选择生长状态良好的成纤维细胞, 用常规消化法消化, 制成细胞悬液, 计数;再以1×104/m L密度接种于24孔培养板, 于37℃、5%CO2的培养箱中培养。从接种时间算起, 每天对3个孔中的细胞进行计数, 算出平均值。以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标绘制生长曲线。

2.5 成纤维细胞的冻存、复苏

冻存:常规消化, 计算冻存细胞数量, 收集细胞, 弃去上清液, 用冻存液 (70%DMEM+20%FBS+10%DMSO) 调节细胞密度为1×106/m L, 分装于冻存管中。将冷冻管放入细胞程序冷冻盒 (型号为5100-0001, NALGENE公司生产) , 置于超低温冰箱冷冻2~3 h, 然后转入液氮罐中长期保存。

复苏:从液氮中取出冻存管, 立即放入38℃温水中并不停搅动, 令其快速解冻。将细胞悬液移入离心管中, 加入DMEM/F12培养液5 m L, 800 r/min离心5 min;弃上清液, 加入培养液, 充分吹打, 利用台盼蓝染色法计算复苏率。以5×104/m L的密度接种于培养瓶, 放入37℃、5%CO2的培养箱中培养, 观察。

3 结果与分析

3.1 不同培养方法的培养效果

猪胎儿成纤维细胞原代培养分别采用了胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法, 其中胰酶热消化法解离细胞量多, 但细胞存活率显著地低于胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法 (P<0.05) , 且细胞贴壁效果较差;与胰酶冷热结合消化法相比, 胰酶室温消化法所获得的细胞量略少, 但细胞存活率显著提高 (P<0.05) , 且贴壁效果也较好, 所得到的细胞透明度好, 细胞内颗粒少, 立体感强, 界限明显, 而且胰酶室温消化法操作简单, 操作时间短, 不用反复离开操作台, 减少污染的可能性;组织块培养法培养所需要的时间长, 1~2 d游离出少量细胞, 7 d可生长出大量细胞。综上所述, 胰酶室温消化法操作简单, 细胞培养效果好, 是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法。

注:同列数据肩标小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) 。

在猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中, 胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少, 组织块几乎不能被分离;胰酶冷热结合消化法在冷处理时, 胰酶可充分与组织接触, 对细胞的伤害也小一些, 所得的细胞较胰酶热消化法和胰酶室温消化法多, 可培养成功;组织块培养法所需的组织量少, 6~12 h部分组织块可贴壁, 2~3 d大部分组织块贴壁, 并游离出个别成纤维细胞, 细胞生长很快, 逐渐向周围铺开, 长成单层。10 d左右连生, 并铺满瓶底 (见180页彩图1) 。鉴于新生猪耳皮肤组织可供的试验取材量少, 且耳皮肤组织比猪胎儿难消化, 在4种方法中组织块培养法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。

3.2 成纤维细胞传代、培养与纯化

试验中培养的细胞经原代培养长成单层并铺满瓶底时进行传代。传代几次后生长状态基本相似, 生长繁殖旺盛, 4~5 d即可长满, 继续传代。所培养的细胞呈梭形、多角形等, 为典型的成纤维细胞形态, 胞质近中央处有椭圆形胞核, 核仁清晰可见。但仍然可见到上皮样细胞 (呈星型或三角状) 、神经细胞、游走型细胞。这些杂细胞会在反复传代过程中被逐渐淘汰。随着培养时间的延长, 整个细胞群体呈现火焰状和旋涡状, 成群细胞呈现放射状、漩涡状等走行形式。

3.3 成纤维细胞生长曲线

试验绘制出细胞生长曲线, 为掌握细胞传代周期提供参考。接种后第1天细胞计数略微下降, 2~4 d为缓慢生长期, 5~6 d细胞开始加速生长, 7~8 d细胞成倍增长 (为细胞对数期) , 8 d以后细胞转为缓慢增长, 为细胞增长平台期 (见图2) 。

3.4 成纤维细胞的冻存、复苏

试验采用的冻存方法得到的细胞复苏率在85%以上, 可满足试验要求。细胞复苏后贴壁很快, 24 h后观察已有半数细胞呈现梭形或三角形, 细胞生长状态与冻存前相同, 为典型的成纤维细胞状态。4~5 d已基本汇合成单层并铺满培养瓶底部。

4 讨论

提高细胞在体外培养的成功率和效率是细胞培养试验工作的首要问题。动物细胞的培养方法主要有2种, 即组织块培养法和酶消化法。组织块培养法简单方便, 虽获得传代细胞需较长的时间, 收获的细胞量不大, 但长出的细胞比较整齐且便于选择, 培养动物皮肤成纤维细胞常用此法。体外培养中最常用的消化酶是胰酶。胰酶是一种能够破坏基质和黏附蛋白的蛋白水解酶, 容易破坏以单层方式生长的细胞所分泌的细胞外基质和黏附蛋白;因此必须严格控制酶浓度、作用时间长短以及酶处理温度, 并且要根据不同的组织选择合适的细胞分离方法。本试验分别采用胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法培养猪胎儿成纤维细胞和猪耳皮肤成纤维细胞, 以筛选合适的原代细胞分离方法。试验中发现, 采用常规的胰酶消化法对猪胎儿组织进行分离与培养时, 分离效果良好, 传代细胞与原代细胞在形态上无明显差异。但是采用胰酶热处理法处理猪耳皮肤成纤维细胞时, 发现细胞分离效果差, 得到的细胞量少, 难以继续培养, 其原因是耳皮肤表皮上有角质, 结缔组织多, 比胎儿组织难消化。

不同消化方法对细胞贴壁和生长增殖有明显影响。试验对常规的胰酶热消化法进行改进, 对比了胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法获得细胞的存活率和细胞贴壁情况。在猪胎儿成纤维细胞培养中, 胰酶热消化法解离细胞多, 但细胞存活率显著低于胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法 (P<0.05) , 且细胞贴壁效果也差一些。于珠玲等[8]的研究也表明, 胰酶冷热结合消化法的细胞存活率明显高于胰酶热处理法, 胰酶冷热结合消化法对细胞的损伤较少。孙兴参等[9]的研究也认为, 室温消化法与常规的热消化法相比, 是一种能够获得高成活率、高收获量、细胞形态和生长状况良好的胎儿成纤维细胞培养方法, 与本研究结果一致。本试验中室温消化法所获得的细胞量略少于胰酶冷热结合消化法, 但细胞存活率显著提高 (P<0.05) , 且贴壁效果也较好, 得到的细胞透明度好, 细胞内颗粒少, 立体感强, 界限明显。由此可见, 在4种培养方法中, 胰酶室温消化法最适合于猪胎儿成纤维细胞的原代培养。

猪耳皮肤成纤维细胞最好采用组织块培养法。胰酶消化法得到的细胞数量少, 组织块几乎不能被分离;胰酶冷热结合消化法所得到的细胞比其他两种消化法多, 冷处理时胰酶可充分与组织接触, 对细胞的伤害也小一些, 可培养成功。组织块培养法需要的组织量少, 操作简便, 易于掌握, 10天左右爬片细胞就可以铺满瓶底。鉴于新生猪耳皮肤组织可供的试验取材量少, 且耳皮肤组织比猪胎儿难消化, 在4种方法中组织块培养法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。丁生财等[7]的研究也表明, 组织块培养法培养猪皮肤成纤维细胞的效果优于胰酶消化法。一些研究均采用了组织培养块法培养不同物种的耳皮肤成纤维细胞[10,11]。

胰酶和胶原酶是消化、分离动物组织的常用酶。胰酶常用于消化细胞间质较少的软组织, 是源于胰腺的蛋白水解酶, 不仅消化力强, 残留酶活性很容易用血清中和, 且对组织的消化较彻底, 但对细胞的损伤较大。胶原酶是从细菌中提取的酶, 在pH值为6.5~7.8的范围内都有活性, 且其活性不依赖于Ca2+、Mg2+, 也不受血清影响, 虽然对组织的消化不完全, 但对细胞损伤小。本试验未采用胶原酶处理组织, 有待于进一步研究。

无论是用消化分散的单细胞培养还是组织块培养, 混合生长的原代细胞都有多种细胞类型, 大多是上皮细胞与成纤维样细胞的混合物。组织培养初期, 由于细胞仍基于原组织生长, 还保持着较强的增生能力, 因此组织块周围首先移出的是上皮样细胞。成纤维细胞在体外生存能力强, 生长速度快, 3~4 d后呈优势生长。上皮细胞与成纤维细胞分区生长, 这一特征与牛、人、山羊皮肤组织细胞的体外生长特征相似[12]。成纤维细胞较上皮细胞贴壁快, 对胰酶的敏感性高, 容易消化脱落, 依据这一特征收集不同消化时间的细胞, 经多次选择传代, 可纯化成纤维细胞。本研究也采用该方法得到了纯化的猪胎儿成纤维细胞和猪耳皮肤成纤维细胞。

由生长曲线可以看出, 成纤维细胞在离体培养条件下的生长曲线呈“S”型, 与杨素芳等[6]得到的广西巴马香猪、丁生财等[7]得到的贵州小香猪的皮肤成纤维细胞生长曲线相似。

本研究以含10%DMSO、20%FBS的DMEM/F12为冻存液保存成纤维细胞效果较好。丁生财等[7]的研究也采用了相同的方法。任芳丽等[13]证明10%DMSO保护液对牛皮肤成纤维细胞的冷冻效果较其他浓度的DMSO及乙醇 (EG) 、甘油 (GL) 作为冷冻液的效果更好, 表现出较稳定的保护效果, 平均贴壁率达87.9%。还有报道称, 用含一定浓度的BSA、EG和蔗糖的PBS液为冻存液冻存小鼠胎儿和牛睾丸成纤维细胞的效果优于10%DMSO和血清的DMEM冻存液, 用此冷冻液保存猪成纤维细胞的效果是否更好, 有待于进一步研究。

摘要：为了研究猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞的分离培养体系, 根据取样组织的不同, 筛选出最佳的培养方法, 试验以猪胎儿和耳皮肤为试验材料, 用4种不同的培养分离方法, 即胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法, 分离培养猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞, 对比培养效果, 筛选出最佳的培养方法。结果表明:胰酶室温消化法分离的猪胎儿成纤维细胞存活率显著高于胰酶热消化法和胰酶冷热结合消化法 (P<0.05) , 细胞贴壁效果好, 且操作简单;猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中, 胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少, 组织块培养法所需的组织量少, 且较胰酶冷热结合消化法操作简单。试验中培养的细胞呈典型的成纤维细胞形态, 生长曲线呈“S”型, 经冻存复苏后生长状态良好, 说明胰酶室温消化法是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法, 胰酶热消化法和胰酶室温消化法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。

关键词：猪,胎儿成纤维细胞,耳皮肤成纤维细胞,培养方法

成纤维细胞 篇2

强脉冲光对成纤维细胞增殖与周期的影响

目的`:研究强脉冲光对正常离体人皮肤成纤维细胞(fibroblast,FB)的生长活力、细胞增殖能力以及细胞周期变化的影响并探讨其可能的发生机制,为强脉冲光除皱提供可能的理论依据.方法:培养人皮肤成纤维细胞,应用MTT比色法、免疫组织化学的方法和流式细胞仪(FCN)分析技术,观察皮肤成纤维细胞经不同能量的强脉冲光照射后细胞的生长活力、细胞增殖能力以及细胞周期变化.结果:强脉冲光能促进体外培养人皮肤成纤维细胞增殖,FCN结果显示强脉冲光照射后,成纤维细胞G1期百分比降低,而S期百分比升高,增殖指数PrI值(S+G2M)百分比增高.结论:强脉冲光可促进正常成纤维细胞增殖和DNA合成,从而为强脉冲光面部美容除皱供理论依据,

作 者：李晓格 李世荣 曹川 邓向东 LI Xiao-ge LI Shi-rong CAO Chuan DENG Xiang-dong 作者单位：第三军医大学西南医院整形科,重庆,400038刊 名：中国美容医学 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF AESTHETIC MEDICINE年，卷(期)：16(10)分类号：Q813.1关键词：强脉冲光 成纤维细胞 细胞增殖 细胞周期 面部除皱

成纤维细胞 篇3

褥疮是神经内科常见的并发症,尤其是脑卒中致残、长期卧床的患者,出院后,由于得不到较好的、科学的护理,往往在出院后半年内由于褥疮感染、发热而再次入院,针对患者情况,我们使用碘伏联合基因重组牛碱性成纤维因子进行褥疮护理,再结合翻身、频谱治疗,取得良好的效果。

1 临床资料

1.1 一般资料:2003年至2008年,我科共收往26例Ⅳ期褥疮合并感染的患者,最大年龄93岁,最小年龄31岁,其中男17例,女9例,脑血管意外23例,帕金森氏病2例,运动神经元疾病1例,褥疮最多者于全身褥疮好发部位均有,达十余处,单处最大面积10×11cm,溃烂程度最深的已达骨膜。

1.2 方法

1.2.1 清创:创面用无菌生理盐水清洗,并剪去坏死组织,周围皮肤用盐水清洗干净后用0.5%的碘伏消毒。

1.2.2 重组牛碱性成纤维细胞生长因子的使用:创面用盐水清洗清创后,不用碘伏消毒,直接喷重组牛碱性成纤维细胞生长因子于创面,喷药后创面暴露,待药液吸收干燥后才覆盖,每天一次。

1.2.3 碘伏的使用:每天除去清晨使用基因重组牛碱性成纤维因子外,在每次为患者翻身时,将身体支撑妥当、各关节置于功能位,用拇指指腹按压创面周围组织,以促进血液循环,用无菌棉签将创面上的脓性分泌物擦净,擦时稍用力方能擦净,以免脓性分泌物及坏死组织形成干痂,影响愈合,最后,在创面上涂擦0.5%的碘伏,擦后暂时暴露,待干燥后才覆盖。

1.2.4 每天用频谱治疗仪照射创面两次,以改善循环,促进组织修复。给予气垫床缓解局部受压的压强。定时协助患者翻身,保持床单、衣服干燥。

2 .结果

通过积极的护理,除1例因病情较重死亡外,其余25例患者的褥疮均彻底愈合,最轻者7天愈合,最重者20天愈合。

3 体会

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3.1 褥疮(即压疮):是由于身体局部组织长期受压,血液循环障碍,组织营养缺乏,致使皮肤失去正常功能,而引起的组织破损和坏死[1]。

3.2 重组牛碱性成纤维细胞生长因子:是由含有高效表达牛碱性成纤维细胞生长因子基因的大肠杆菌,经发酵、分离和高度纯化后制成。对来源于中胚层和外胚层的细胞(如上皮细胞、真皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等)具有促进修复的再生和[2]。

3.3 碘伏:是碘以表面活性剂为载体的络合物,具有广谱杀菌作用,能杀灭细菌、芽胞,还有清洁作用。

3.4 神经科患者,由于中枢或外周神经病变,至使受累部位的神经营养缺乏,较易发生褥疮,且愈合比较困难,因此,褥疮重在预防。褥疮发生后,由于患者基础病变而引起的偏瘫、截瘫、吞咽困难导致的全身营养不良等因素影响,以往我们给予常规护理,收效差,疮面愈合慢,患者住院时间长,负担增加。自从我们改用碘伏联合基因重组牛碱性成纤维因子进行疮面护理后,效果明显,缩短了患者的住院时间,有利于患者的康复。

参考文献

[1] 殷磊.护理学基础[M]. 2版.北京:人民卫生出版社,1998:128

[2] 中华人民共和国药典.临床用药须知.化学药和生物制品卷[M].2005年版.北京:人民卫生出版社,842

[3] 张文福.医学消毒学[M]. 1版.北京:军事医学出版社,2002:122

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作者单位:654400 云南省红河州第一人民医院

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肾纤维化和肾成纤维细胞的起源 篇4

多数学者原来普遍认为间质成纤维细胞是细胞外基质的唯一来源。1867年, Cohnheim发表了关于炎症机制的经典文章, 其中说明了成纤维细胞 (当时被称为收缩细胞成分) 是白细胞的迁移后代。这一理论在一个多世纪内都被广泛地认同, 直到Ross等在联体大鼠实验中发现成纤维细胞来源于局部。最近的研究发现, 至少有一部分成纤维细胞来源于骨髓, 故成纤维干细胞的概念已被普及到骨髓来源。此外, 也可能来源于外膜周细胞和肾小管上皮细胞。

1 肌成纤维细胞和非肌成纤维细胞

多数学者认为成纤维细胞在纤维化过程中转换成所谓的肌纤维细胞 (由于表达仅限于血管平滑肌细胞中的平滑肌肌动蛋白) 。神经生长因子、血小板衍生生长因子-α和血小板衍生生长因子-β受体、CD90、exto-50-核苷酸和成纤维细胞特异性蛋白-1 (FSP-1) 被认为是肾皮质成纤维细胞的标志[1]。虽然确定这些细胞仍然具有挑战性, 但是典型的间充质细胞形态可以加以鉴定。在成纤维细胞转变成肌成纤维细胞的过程中, 平滑肌肌动蛋白的表达不是唯一的改变。此外, 表型的转变往往被低估, 从而使寻找这些细胞变得十分困难。正常和肾脏纤维化成纤维细胞之间的差异在于它们的增殖活性和基质合成的能力[2]。

如上所述, 细胞外基质的产生不是只有间质成纤维细胞参与。许多研究证实, 间质内有骨髓细胞存在[3]和骨髓细胞可以EMT为肾小管上皮细胞[4]。利用转基因标记成纤维细胞和肾小管上皮细胞发现, 来自骨髓的成纤维细胞约占正常小鼠肾间质细胞的12%[5]。在这项研究中, 有一个进展性肾脏病的实验模型, 成纤维细胞在肾间质细胞中所占的比例也没有改变。相反, 多达36%的分泌细胞外基质的细胞是来自于肾小管上皮细胞的EMT。EMT是脊椎动物胚胎分散细胞[6]和损伤组织形成成纤维细胞的公认机制[7]。EMT是一个动态的过程, 包括上皮细胞标志物减少与间质标志增加, 并且在迅速进展的慢性衰竭模型中表现较多。肾小管基底膜完整性的破坏是发生EMT的前提, 细胞外基质的组成影响肾小管上皮细胞的分化状态[8]。最近, Yamashita等[9]证实肾祖肾小管上皮细胞可能发生EMT, 并认为这些细胞是间质肌纤维细胞的来源。

2 肾成纤维细胞是否是肾脏疾病进展的起源

最近, Faulkner等[10]研究哈布毒液损伤后血管紧张素Ⅱ引起的肾纤维化模型中α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞的起源。联合血管紧张素Ⅱ和哈布毒液注射后14 d加速了肾纤维化和肾小球硬化模型。利用该模型, Faulkner等基本确定肾小管间质α-平滑肌肌动蛋白表达细胞是局部的来源。通过得克萨斯红葡聚糖标记发现肾小管基底膜的完整性没有被破坏, 近端肾小管上皮细胞也没有进入间质[10]。有趣的是, α-平滑肌肌动蛋白阳性的肌纤维细胞在血管周围早期即扩大。Wiggins等在抗肾小球基底膜抗体引起的肾炎和肾小球周区域也有相同的发现。这是否意味着在血管紧张素Ⅱ/哈布毒液模型中激活间质成纤维细胞是肌纤维细胞的唯一来源呢?事实并不是这样。首先, 正如有学者所认为EMT的可能仍然存在, 因为他们的重点是排除肾小管上皮细胞是EMT的来源, 但是EMT也可以发生在远端肾小管上皮细胞。第二, 骨髓来源的造血干细胞或间质干细胞的浸润没有被排除, 仍然存在可能性。第三, 如前所述, 仅利用α-平滑肌肌动蛋白的表达作为基质分泌细胞的标志是不能代表所有这些细胞的。Okada等[11]在多囊肾病小鼠模型中也发现相同的问题存在。最后, 笔者推测基质分泌细胞来源可能根据不同的模型是会变化的。

3 治疗的影响

对于以上结果, 现在还不能被临床医生所用, 但它们在临床抗纤维化治疗中的重要性很快会被证明。基质分泌细胞的来源根据潜在疾病和 (或) 肾纤维化的进程可能不同。基质分泌细胞的主要来源可能有治疗意义。例如, 间质成纤维细胞是转基因的首要目标[5]。另一方面, 成纤维细胞的增殖和刺激在某些慢性肾脏疾病如UUO模型中不是十分重要。UUO模型以及肾毒性血清肾炎模型都是通过EMT激活成纤维细胞。用骨形成蛋白 (BMP) -7或抑制肝细胞生长因子阻断EMT能抑制进展, 以及在应用BMP-7的情况下, 甚至可以还原这些模型中的基质沉积[12]。相反, 骨形态发生蛋白-7在没有或很少EMT如超载蛋白尿模型中其抗纤维化就会减弱或没有[13];但是关于人类的细胞来源, 激活成纤维细胞形成是一个刚刚开始研究的领域。因此, 如何将实验模型收集到的信息应用于临床研究将是非常有趣的。

4 结论

成纤维细胞 篇5

材料与方法 细胞 DF-1细胞、CEF细胞、Hela细胞。裸鼠 2月龄（或体重18～22g）、或乳鼠（3~5日龄）、或小鼠（8~10g）。细胞营养液 细胞生长液为无血清培养基。细胞染色体制备和核型分析

4.1 染色体标本制备 按常规方法分别将DF1细胞进行秋水仙素处理、细胞消化与低渗处理、细胞固定与在固定、滴片与染色。

4.2 染色体特征及数目、细胞核型分析 取有丝分裂中期的细胞进行姬母萨染色检查，（总共需要150个视野的图片）。细胞致瘤性试验

5.1 细胞样品的制备 按常规方法制备好DF-1细胞。

5.2 阳性对照细胞 将Hela细胞经胰酶消化分散，离心收集细胞。制成含活细胞数约106cells/0.2ml的细胞悬液。

5.3 阴性对照细胞 按常规方法制备的鸡胚成纤维细胞（CEF），制成含活细胞数约107cells/0.2ml的细胞悬液。

5.4 致瘤性试验

5.4.1和5.4.2任选其一。

5.4.1 将细胞样品分别皮下注射裸鼠30只，每只107 cells /0.2ml细胞。

5.4.2 取3~5日龄乳鼠或8~10g小鼠，用抗胸腺血清处理后，将细胞样品分别皮下接种18只，每只107 cells /0.2ml细胞。

5.4.3 阳性对照 每只裸鼠皮下或肌肉注射106 cells /0.2ml，共注射5只裸鼠，为阳性对照。（如以乳鼠或小鼠试验，注射剂量不变，数量为3只）。

5.4.4 阴性对照：每只裸鼠皮下注射107 cells /0.2ml，共注5只裸鼠，为阴性对照。（如以乳鼠或小鼠试验，注射剂量不变，数量为3只）。

5.5 实验动物检查及处理

5.5.1 逐日观察至14日，检查有无结节或肿瘤形成。如有结节或可疑病灶，应在观察至少7～14日后剖检，进行病理组织学检查。

5.5.2 未发现结节的动物，对其中的一半动物观察21日后剖检，另外一半动物观察12周后剖检，观察各个淋巴结核器官中是否形成结节，如有怀疑，应进行病理组织学检查。不应有移植瘤形成。

5.5.3 阳性对照组观察21日后，应出现明显的肿瘤。

5.5.4 阴性对照组观察21日，应为阴性。

成纤维细胞 篇6

【关键词】预成纤维桩 口腔修复 应用分析

传统的口腔修复治疗中，通常采取拔牙的方式，口腔修复的水平随着医疗技术的发展不断的提高，同时也出现了修复口腔的新型材料，使得临床口腔修复的治疗有了较大的进步。在目前的口腔修复中，大多数采用预成纤维桩，因为这种修复材料的机械性能比较良好、拆除起来比较容易、有较好的生物相容性等[1]，同时也对修复口腔的范围进行有效的扩展，在目前临床口腔的修复中得到普遍的使用。本文主要对预成纤维桩在口腔修复中的应用体会进行探讨，具体分析如下：

1资料与方法

1.1资料

对从2011年5月到2013年5月收治的46位采取口腔修复患者的临床资料进行回顾与分析，共有患牙72颗。病例的入选标准：患者患牙的牙体缺损情况比较严重；与修复口腔的要求相符合；牙周的状况比较好；患者的牙根足够长，患者的根管治疗比较完善[2]。患者中有30位男性患者，16位女性患者，患者的年龄在20岁到80岁之间，患者的平均年龄为（41.12±2.53）岁。72颗患牙中，42颗前牙，5颗磨牙。

1.2方法

在进行口腔修复以前，都采取X片的常规检查，对患牙填充的完整与否进行详细的了解，并且观察牙根的方向以及长度等，牙根管的扩大要由细到粗的进行，注意牙钻的选择要合适，这样能满足口腔修复的有关要求。通常的情况下，备桩宽度为牙根直径三分之一左右，长度为二分之一到三分之一的牙根，根尖需要保持3mm到5mm。纤维桩的选择要按照桩道预备的大小，比较理想的效果就是在插入桩以后不活动。试桩完成以后，根内牙本质的酸蚀可以采取酸蚀剂，冲洗要在20秒以后，牙本质中所包含的液体可以应用纸尖进行吸干。黏接剂要涂抹两层到三层，多出的黏接剂要采取纸尖进行吸干。纤维桩上的粘结剂最好涂抹两层，并且进行10s的光照。将催化剂和双重固化黏结剂基底进行调和[3]，注入要使用的注射枪头，最后插入纤维桩。

1.3疗效判定标准

患者的自觉症状明显消失；功能基本上恢复到正常水平；修复体没有渗漏的情况出现；患者牙龈颜色基本恢复正常；叩诊没有不适的情况；患者的患牙在经过X线的检查以后，没有出现阴影的区域，这时可以判定为修复成功。以上的几项内容中，有一项不符合标准，判定为修复失败。

2结果

本次研究的46位口腔修复患者，共有患牙72颗，主要使用预成纤维桩对口腔进行修复，口腔修复以后，对患者进行6个月到1年的随访，有7颗牙修复失败，修复成功为65颗，成功修复的概率为90.27%。修复失败的7颗牙均为前牙，其中有1患者无法做口腔修复，有6位患者可以进行口腔修复。有1位患者为牙龈炎，修复失败的原因为在边缘的处理方面效果不理想；有2为患者为根折，修复失败的原因为根管壁比较薄；有1位患者为脱落，修复失败的原因为根管较细；有1位患者为桩断裂，修复失败的原因为根管较细；有2位患者为松动，修复失败的原因为所残留的牙体组织比较少。

3讨论

随着口腔修复技术水平的不断提高，预成纤维桩在口腔修复中得到了普遍的使用，在口腔修复中应用预成纤维桩有利于牙根强度的加强、牙根和桩冠的保存，是目前进行修复口腔的主要材料。预成纤维桩的优点为较高的强度、颜色比较好、材料轻便、有较好的弹性模量，主要应用于口腔修复。预成纤维桩具有较广的使用范围，并且在临床中操作起来比较简单，能在一定程度上减少患者完成口腔修复以后复诊的次数。在进行口腔修复的过程中，预成纤维桩主要在错牙位、扭转牙、畸形牙等方面使用[4]，但是要注意在实际情况中不一样的粘连系统和纤维状系统有着不同的操作过程，操作要根据不同材料的说明做到规范操作。总而言之，预成纤维桩属于新型口腔修复材料，在临床口腔修复的过程中得到广泛使用，能在一定程度上拓宽口腔修复的范围，具有临床应用价值。

参考文献：

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[2]黄燕飞，潘小波，李荣婷，钟爱喜，彭利辉，刘光雪.排龈硅橡胶在高强度纤维桩核修复应用中的护理探讨[J].中国临床新医学，2011，32（02）：180-182.

[3]陈剑声，欧阳瑾.石英纤维桩在不同缺损程度前牙修复中抗折裂性能的临床分析[J].临床和实验医学杂志，2011，34（22）：167-169.

成纤维细胞与后发性白内障的关系 篇7

1 成纤维细胞及其生物学行为

成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分, 亦广泛存在于各种致密结缔组织及网状组织等部位, 成纤维细胞主要以2种形式存在:成纤维细胞与纤维细胞, 二者在一定条件下可以相互转化。

成纤维细胞是机体受到损伤或遇到某种刺激的情况下, 具有强大潜在的再生能力的一种细胞形式, 其在创伤修复、结缔组织再生时发挥巨大作用。光学显微镜下可见其细胞扁平, 多突起, 呈星状, 胞质较丰富呈弱碱性, 胞核较大, 扁卵圆形, 染色质疏松着色浅, 核仁明显。在电镜下可见:胞质内富有粗面内质网, 游离核糖体和发达的高尔基复合体。该形式存在的成纤维细胞具有旺盛的合成蛋白质的能力, 能够合成和分泌胶原蛋白, 弹性蛋白, 并能生成胶原纤维, 网状纤维和弹性纤维, 也能合成分泌糖胺多糖和糖蛋白等基质成分。成纤维细胞通过基质糖蛋白的介导附着于胶原纤维上。在遇到创伤或炎症刺激等情况下, 成纤维细胞能缓慢的在趋化因子如淋巴因子、补体等的吸引下向一定方向移动并分离增殖, 从而参与和细胞外基质重构有关的多种病理过程[2]。

纤维细胞为成纤维细胞功能处于静止状态时的细胞形态。细胞瘦小, 呈长梭形, 胞核小, 着色深。电镜下可见其胞质内粗面内质网少, 高尔基复合体不发达[2], 是机体处于稳定状态下, 不繁殖的一种稳定性细胞[3]。在一定条件下, 如创伤修复, 结缔组织再生时, 纤维细胞又能转变为成纤维细胞, 表现出旺盛的合成分泌蛋白及增生分泌能力。

2 成纤维细胞来源及生物学功能

成纤维细胞可由多种细胞分化而来。成纤维细胞除由纤维细胞转变而来以外, 尚可由具有分化潜能的未分化的间充质细胞在炎症与创伤时分化而来。成纤维细胞亦可以由某些上皮细胞在炎症刺激下发育而来。兔眼人工晶体植入后第1～14天观察虹膜及睫状体可以发现巨噬细胞向成纤维细胞转变[5]。兔眼人工晶体植入术后第4、7、15、3天瞳孔区人工晶体前膜中可见到巨噬细胞、成纤维细胞样细胞[6]。有研究证实, 取人眼虹膜色素上皮细胞进行体外培养, 其原代细胞呈棕黑色多角形或不规则形。分裂增殖生长的细胞色素颗粒逐渐减少, 4～6代后细胞内色素随着不断分裂逐渐减少至消失, 部分形态变成成纤维细胞样[7]。晶状体细胞体外培养, 经TGF-β转染后可过表达基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinases-2, MMP-2) , 而这些过表达MMP-2的晶体上皮细胞出现了诸如肌成纤维细胞样形态学变化, 细部层次呈多样化, 细胞形态延长, 并有α-平滑肌肌动蛋白的表达[8]。多项研究证明, 不同来源的成纤维细胞可表现出不同的生物学活性和功能, 体外培养的甲状腺相关眼病眶后成纤维细胞和皮肤成纤维细胞, 发现前者较后者生长缓慢, 且二者光镜下细胞多形性和胞浆富含颗粒性不同[4]。

Rous肉瘤病毒转化的鸡胚成纤维细胞与未转化者比较可以表达MMP-2及TIMP-2量的升高, 并能够改变MMP-2和TIMP-2之间的转录及翻译的水平的平衡[9]。另外, 成纤维细胞还有可能分泌MT-1-MMP及MMP蛋白酶类, 从而易化了肿瘤细胞的迁移[10]。

3 成纤维细胞与后发障

后发障的组织病理学表明: (1) 晶状体周边部皮质残留, 前后囊膜粘连包裹皮质而变浑浊, 形成周边混浊, 中央透明的环即Soemmering环; (2) 上皮细胞增殖, 聚集成簇, 形成透明的珍珠样小体-Elschnig珠; (3) 后囊膜纤维化; (4) 混合型。病理证实, 后发障的形成中成纤维细胞起到了很关键的作用。目前, 主要推测该成纤维细胞来源于术后增殖能力较强的残留的晶体上皮细胞, 且体外培养晶状体上皮细胞也确实能证实晶状体上皮细胞有向成纤维细胞转化的能力[8], 但体外培养的虹膜色素上皮细胞亦有向成纤维细胞转化的趋势, 且术中机械性损伤极易使虹膜色素上皮脱落从而大大易化了其移行及迁移, 虹膜基质层亦有成纤维细胞及未分化的间充质细胞, 这些细胞在受到外界刺激时都有向成纤维细胞分化, 向后囊膜移行并增殖的可能。术中机械性损伤也很易导致虹膜损伤, 出血及并发症。另外, 白内障术后, 巨噬细胞也被发现可分化为成纤维细胞样细胞[5～6]。

综上所述, 后发障中后囊膜上成纤维细胞来源是否单一, 即是否除了晶体上皮细胞移行、化生、增殖之外, 是否还有虹膜细胞及某些炎性细胞在细胞水平上参与了后囊膜混浊的发生, 该不同来源的成纤维细胞生物学行为有无差异等等一系列问题将有可能对后发障在细胞水平上的发病机制的探索有一定的作用, 也有可能为将来早期干预后发障的发生提供某种新的途径。

参考文献

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成纤维细胞 篇8

1 材料与方法

1.1 取胚

用75%酒精擦拭消毒7～10日龄禽蛋外壳, 带入无菌操作间, 从禽蛋气室敲开, 用消过毒的镊子穿过尿囊绒毛膜将禽胚挑出[2], 去四肢、头部和内脏。经PBS清洗2～3遍, 在平皿中用消过毒的手术剪刀剪成1 mm3小块, 用枪头将组织块移至1.5 mL 离心管中, 1 000 r/min离心5 min。吸出组织块, 用枪头分散到培养皿上, 贴壁培养6 h, 加入全DMEM/F-12培养液培养。

1.2 传代

当细胞密度达到70%～80%时开始传代, 弃除旧培养液, 用预热的PBS洗细胞2次, 消除旧培养液中血清和脱落的组织块及死细胞[3]。加入0.25%胰蛋白酶溶液, 在倒置显微镜下观察, 细胞回缩、变圆时加入血清终止消化, 按所需比例分瓶培养。

1.3 细胞计数

用微吸管吸取细胞悬液滴加于血细胞计数板盖玻片上, 细胞悬液进入计数室, 统计四角大方格中的细胞数, 细胞压中线时, 只计左侧与上方者。

计算公式:细胞浓度 (个/mL) =四角大方格中的总细胞数4×104[4]。

1.4 冻存

将长势良好的细胞消化吹起, 离心, 弃除上清液。调整细胞密度5×106 个/mL, 放入冻存剂 (含10%DMSO和10%胎牛血清的DMEM/F-12培养液) 封存到冻存管中, 于4 ℃静置40 min后在-20 ℃的冰箱中放置2 h, 再放入-80 ℃冰箱过夜, 最后用液氮长期储存[5]。

2 结果

2.1 细胞3次冻存前后细胞活率的比较 (见表1)

2.2 细胞自原代接种后第8天的密度 (见图1)

接种当天标记为0天, 0～2 d为缓慢生长期;3～7 d为指数生长期;第8天以后细胞又转为缓慢增长, 为增长平台期。

2.3 细胞不同阶段形态 (见图2、图3)

通过光显微镜观察细胞形态, 并对原代及冻存复苏后细胞的生长旺盛期拍照留图。

3 讨论

在初代培养及早期传代培养时, 可见成纤维细胞与上皮细胞呈现区域性生长, 在培养瓶表面形成一些小的细胞块, 需对细胞进行纯化。根据上皮细胞与成纤维细胞对酶消化作用的敏感性不同及二者贴壁速度的差异可将二者分离。将混杂生长的培养物用常规消化法作用5～8 min, 用手轻轻拍打瓶壁, 此时成纤维细胞绝大部分可悬浮, 加入培养基后移入另一培养瓶内继续培养。经过2～3次选择传代, 可完全纯化二者, 形成纯的成纤维细胞。

鸡成纤维细胞的生长曲线呈“S”型, 细胞经历了潜伏期、指数生长期和平台期3个阶段。细胞在接种时, 细胞密度不宜过大, 防止进入指数生长期后, 细胞快速连接成片, 相互抑制生长。细胞在体外的生长速度因动物个体的品种、年龄、健康状况不同而有所不同。试验结果表明:鸡成纤维细胞在1～2 d, 细胞处于潜伏期, 生长迟缓;而3～7 d, 细胞进入指数生长期, 细胞数量成倍增长;7 d以后处于平台期, 说明细胞数已达到最大。进入平台期后, 应该及时传代, 否则会造成细胞死亡。

由于低温保护剂DMSO对细胞有毒性, 因而应尽量缩短DMSO与成纤维细胞在4 ℃以上的接触时间。降温和复温速度是影响细胞存活的关键因素。为保持细胞最大存活率, 采用慢冻快融的方法, 冻存液中加入保护剂DMSO后, 可使冰点降低, 在缓慢冻结条件下, 使细胞内水分在冻结前透出细胞外, 从而减少细胞内冰晶的形成。细胞复苏时采用40 ℃水浴快速复温法, 使之迅速通过细胞最易受损伤的-5～0 ℃。

细胞生长速度与细胞浓度有关, 由于细胞的短距离相互作用是依靠相邻细胞间的连接而实现的, 细胞过稀导致细胞生长缓慢;细胞浓度偏高, 培养液中代谢废物浓度增长较快, pH值快速下降, 也会抑制细胞的正常生长, 并且在短时间内连接成片, 出现接触抑制现象, 因此传代后的细胞应维持在一定的密度范围内, 有资料表明当细胞浓度为3×104～5×105个/mL时, 细胞分裂旺盛。

参考文献

[1]李青旺.动物细胞工程与实践[M].北京:化学工业出版中心, 2005:10-15.

[2]宋思扬, 楼士林.生物技术概论[M].北京:北京科学出版社, 2003:76-78.

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[4]陈瑞铭, 动物组织培养技术及其应用[M].北京:科学技术出版社, 1998:77-85.

成纤维细胞 篇9

不同细胞类型转基因供核体细胞的克隆动物相继产生,充分表明不同分化类型的体细胞在卵母细胞胞质的作用下均有完全重建而重新发育成新个体的潜能。但如何简便、快速、高效地制备丰富的转基因核供体细胞是成功获得转基因动物的关键技术之一[3]。目前,由于胎儿成纤维细胞具有取材方便、生长快、分化程度相对较低、体外传代次数相对较高、转基因效率高等特点成为用于生产转基因克隆动物的首选体细胞系。由胎儿成纤维细胞提供核供体相继产生了转基因克隆绵羊[4]、山羊[5]、牛[6]以及基因定点修饰的绵羊[7]和猪[8]。

研究通过组织块贴壁培养的方法分离培养草原红牛胎儿成纤维细胞,并设计性别特异性引物对其进行体外培养,以获得用于转基因克隆牛制作的核供体转基因细胞,为高效率、低成本制作转基因克隆牛奠定基础。

1 材料与方法

1.1 胎儿组织的获取与处理

草原红牛胎儿来自吉林省农业科学院畜牧科学分院草原红牛保种场。具体胎儿获取方法:将妊娠40 d母牛电击屠宰,迅速剖腹摘取怀孕子宫,为防止污染,将胎儿与子宫一同置于装有37 ℃生理盐水的保温瓶中带回实验室。用手术剪在PBS液中剥除胎膜,将分离的牛胎儿用含500 IU/mL 青霉素、500 mg/mL 链霉素的PBS 液冲洗3 遍后,移入无菌操作台处理。

1.2 组织块的贴壁培养

胎儿成纤维细胞的分离培养参照李扬的组织块贴壁法进行,并稍作改动。简要方法:首先用手术剪去除胎儿头、四肢、内脏,保留躯干,将胎儿躯干部用手术刀切成1～3 mm3的小块,用含10%胎牛血清的DMEM完全培养液冲洗2遍,分别接种于含完全培养液的直径为35 mm细胞培养皿中,然后将培养液吸干,放入培养箱中培养5 h,使组织块充分贴壁,待贴壁完全后,小心加入完全培养液,置于38.5 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.3 成纤维细胞的纯化及传代培养

待细胞铺满培养瓶底后,采用胶原酶消化法将上皮细胞和成纤维细胞分开,具体做法:吸出瓶内的培养液,用无菌PBS液清洗2遍后加入0.5 mg/mL的胶原酶,使消化液浸没细胞,将培养瓶放在倒置显微镜下观察,发现成纤维细胞变圆、部分脱落时,立即加入2 mL含血清的培养基终止消化;用弯头吸管轻轻吹打成纤维细胞生长区域,再用少量培养基漂洗1次;然后将消化液吸出,转移至新的培养瓶中加入适量培养基继续培养,于38.5 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.4 细胞生长曲线的测定

将传至第3代的牛胎儿成纤维细胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化,调整细胞浓度为5×104个/mL,接种于24孔细胞培养板中,每孔接种0.5 mL,置38.5 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养,每隔24 h消化收集细胞,用血细胞计数板计数3个孔的细胞数,每孔计数2次,取平均值,最后绘制生长曲线。在细胞接种及计数过程中用台盼蓝染色法去除死细胞干扰。

1.5 血液和细胞基因组的提取

选取雌雄各5头成年草原红牛,颈静脉采集血液样品,加ACD抗凝。草原红牛胚胎成纤维细胞及血液基因组的提取采用酚氯仿法提取(方法详见《分子克隆》第3版),用0.8%琼脂糖电泳检测基因完整性及纯度,-20 ℃冷冻保存。

1.6 牛性别特异性引物的设计与合成

选取牛性别特异性基因SRY(登录号为EU581861)及内参基因GAPDH(登录号为NC_007303),采用引物设计软件Oligo 6.0设计基因特异性引物。SRY基因引物序列为SRY U 5′-AAGTTTGCCTTATGGATT-3′,SRY D 5′-GAAGTAATATGCGGTGTA-3′;GAPDH基因引物序列为GAPDH U 5′-ATTCTGGCAAAGTGGACATCG-3′,GAPDH D 5′-ACATACTCAGCACCAGCATCAC-3′。 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.7 性别鉴定引物的特异性检验

以已知性别成年草原红牛外周血基因组为模板,采用基因组PCR方法对试验中设计的性别鉴定引物进行特异性检验。PCR 反应体系(25 μL):10×PCR Buffer 1.5 μL,上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL,Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)1 μL,DNA 模板(50～100 ng/L)1 μL,dNTP(10 mmol/L)1 μL,加ddH2O 至25 μL。反应条件:95 ℃预变性4 min;95 ℃变性40 s,62 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,共35个循环;72 ℃延伸10 min ;4 ℃保存。取产物用1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测性别鉴定引物的特异性。试验中设置水空白对照以排除体系污染。

1.8 草原红牛胎儿成纤维细胞的性别鉴定

在完成性别鉴定引物特异性的前提下,对本研究中分离培养的草原红牛胚胎成纤维细胞进行基因组PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测以确定其性别。具体基因组PCR反应程序参见1.7。

2 结果

2.1 草原红牛胎儿成纤维细胞的分离培养及生长特征

胎儿组织块经贴壁培养48 h后可见单细胞游离出来,呈辐射状向外贴壁生长。培养1周后贴壁细胞逐渐增多,多数围绕组织块周围生长。随着培养时间的推移,组织块周围可见大量成纤维细胞包绕,其间有上皮样细胞共生(见图1A)。9～10 d后成纤维细胞生长旺盛,成纤维细胞呈梭形或不规则三角形、放射状或漩涡状走行(见图1B)。培养2周左右,组织块移出的单层细胞汇合,细胞铺满瓶底,可进行消化传代。

2.2 草原红牛胎儿成纤维细胞的生长规律

胎儿成纤维细胞传至第3代时,以5.0×104个/mL的浓度接种24孔细胞培养板,细胞于7～8 d长满。于不同时间点测定细胞数并绘制生长曲线,见图2。

从图2可以看出,胎儿成纤维细胞生长曲线基本呈现S型,分别代表潜伏期、指数增生期和停滞期,0～4 d为潜伏期,5～9 d为指数增生期,培养至第10天进入生长停滞期。

2.3 性别鉴定引物的特异性检验结果

提取已知性别草原红牛血液基因组(雌雄各5头),利用所设计的牛性别鉴定SRY基因引物,以GAPDH基因特异性引物为对照,采用基因组PCR方法对性别鉴定SRY引物进行特异性检验,结果(见图3)发现:在完全没有进行PCR条件摸索的情况下,性别特异性SRY引物能够特异性地扩增出雄性草原红牛SRY基因片段(见图3 第1～5泳道),而以雌性草原红牛为模板则完全不能扩增出任何片段(见图3 第6～10泳道);内参基因GAPDH引物无论在雌性还是雄性草原红牛中均能很好地扩增出特异性片段。说明基因组质量良好,不影响引物的扩增。同时以水作为空白对照不存在任何扩增产物,说明扩增体系不存在污染现象。

1～5.雄性草原红牛血液基因组扩增产物; 6～10.雌性 草原红牛血液基因组扩增产物;11.水空白对照组。

2.4 草原红牛胎儿成纤维细胞的性别鉴定结果

本研究在验证SRY性别鉴定引物特异性的基础上,对已分离的草原红牛胚胎成纤维细胞利用SRY引物采用基因组PCR方法进行性别鉴定,结果见图4。表明已分离培养的胚胎成纤维细胞为雄性。

3 讨论

1.100 bp DNA Ladder;2.草原红牛胚胎 成纤维细胞SRY基因PCR结果;3.雌性草原红牛SRY 基因PCR对照; 4.雄性草原红牛SRY基因PCR对照。

动物成纤维细胞分离培养主要采用两种方法,一种是组织块贴壁培养法;另一种是胰酶消化分离单细胞接种培养法。通常情况下,组织块贴壁培养法长出细胞比分离单细胞培养法需要较长的时间,但操作相对简单方便,目前多用此法培养动物成纤维细胞[9,10]。本研究同样采用此方法成功分离出草原红牛胚胎成纤维细胞。

在转基因克隆动物的研究过程中,成纤维细胞活力及纯度严重影响转基因细胞的制备及体细胞核移植操作,与转基因克隆动物的获得息息相关。尽管胚胎早期细胞的分化程度不高,但早期分离培养的胚胎成纤维细胞依然多为上皮细胞和成纤维细胞的混合物。上皮细胞由表皮生发层细胞分裂、增殖而来,是源于外胚层的细胞;成纤维样细胞是由真皮层细胞分裂、增殖而来,源于中胚层。两者具有完全不同的细胞特征及生长特性。在体外培养过程中,可以利用这些生长特性进行成纤维细胞的分离、纯化,常规方法是利用上皮细胞与成纤维细胞的贴壁能力及对胰酶消化反应时间差不同进行初步分离纯化[11],也可以针对上皮细胞及成纤维细胞的不同生长区域进行人为刮除。本研究采用细胞时间差酶消化法分离纯化胚胎成纤维细胞,经过反复几轮的分离纯化达到比较理想的效果。

成纤维细胞 篇10

关键词：滑膜成纤维细胞,关节炎,类风湿,细胞培养

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜为主要靶组织的慢性系统性炎症性自身免疫性疾病。关节滑膜衬里层增生,滑膜下层炎症浸润为其典型病理改变。其中类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)是介导RA关节破坏的主要细胞[1,2]。RA-FLS在慢性炎症过程中被激活后,出现细胞表型的显著改变[3],具有不完全转化细胞的特性,即使脱离炎症环境,仍持续活化,增殖能力升高,逃脱接触抑制,具有侵袭的能力。RA-FLS体外培养数代后仍能持续自发产生大量细胞因子,这种自分泌、旁分泌的行为可能参与RA-FLS发生肿瘤样改变的机制。

FLS的体外培养为深入研究信号转导、细胞因子的释放、细胞增殖、细胞凋亡等在RA发病机制中的作用提供了重要研究方法[4]。

1 材料与方法

1.1 标本来源

标本来自2007年12月~2009年3月中山大学附属第三医院行关节腔镜术或关节置换术的患者。其中类风湿关节炎6例,均为女性,年龄40~68岁,平均51.5岁,病程0.5~8年,平均39个月;骨关节炎6例,均为女性,年龄63~72岁,平均65.7岁,病程4~15年,平均100个月;关节创伤病例6例,其中男5例,女1例,年龄27~36岁,平均31.2岁,病程0.5~12个月,平均4个月。

1.2 标本处理

所有标本均取自膝关节滑膜,自手术室取出标本后,立即于无菌条件下分离出滑膜组织,仔细剔除脂肪组织,用PBS洗3遍。取组织的一部分,浸泡于10%甲醛中,送中山大学附属第三医院病理科行蜡块制作、切片、HE染色证实所取标本均为滑膜组织。取另一部分立即用于细胞培养。

1.3 成纤维样滑膜细胞的原代培养--酶消化法

无菌条件下标本经处理后,向滑膜组织滴加1~2滴I型胶原酶消化液,将其锐性剪碎至约1 mm×1mm×1 mm大小。移至15ml离心管中,加入2~3倍体积比I型胶原酶消化液,避光于37℃摇动中消化2或4 h。经200目细胞滤网过滤组织块后,于1000 rpm离心5 min。去上清,加入适量PBS(含双抗),吹打混匀后细胞计数,于1 000 rpm离心5 min。去上清,加入适量20%FBS培养液(含双抗),吹打混匀后,于5%CO237℃培养箱中静置培养48h。根据细胞的生长情况及培养液的变化,每1~3 d更换培养液1次。

1.4 成纤维样滑膜细胞的原代培养-组织块法

无菌条件下标本经处理后,向滑膜组织滴加1~2滴20%FBS培养液(含双抗),将其锐性剪碎至约1mm×1mm×1mm大小,将组织块移至培养瓶中,均匀摆放到瓶底,将培养瓶翻转,使组织块面位于上方,加入适量20%FBS培养液(含双抗),置于5%CO237℃培养箱中约3 h。将培养瓶轻轻翻转,使组织块浸没于培养液中,避免将组织块冲起。置于培养箱继续培养。根据细胞的生长情况及培养液的变化,每1~3 d更换培养液1次。若杂质较多,换液前用PBS(含双抗)轻轻洗1~2次。

1.5 细胞传代

当细胞生长至覆盖底面>80%时,吸弃培养液,用PBS(含双抗)轻轻洗3次,加入胰蛋白酶/EDTA溶液覆盖底面。显微镜下观察至大部分细胞变圆后将培养瓶竖起,加入适量10%FBS培养液(含双抗)终止消化,吸管吹打后移至15 m L离心管中,1 000 rpm离心5 min,弃上清,加入适量10%FBS培养液(含双抗)吹打混匀后,按1:3传代,分装接种到培养瓶中,置于5%CO237℃培养箱中培养。根据细胞的生长情况及培养液的变化,每1~d天更换培养液1次。若杂质较多,换液前用PBS(含双抗)轻轻洗1~2次。

1.6 细胞冻存

当生长至约覆盖80%底面时,更换培养液过夜。吸弃培养液,用PBS(含双抗)轻轻洗3次,加入胰蛋白酶/EDTA溶液覆盖底面。显微镜下观察至大部分细胞变圆后将培养瓶竖起,加入适量20%FBS培养液(含双抗)终止消化,吸管吹打后移至15 m L离心管中。经细胞计数后,1000 rpm离心5 min,弃上清,加入适量的冻存液,吹打混匀后按每支1 m L分装到冻存管中。将冻存管放入细胞冻存盒中,置于-80℃低温冰箱过夜后,转移到液氮中保存。

1.7 细胞复苏

将细胞从液氮中取出,迅速浸没于37℃水中,摇动数分钟至完全溶解。经细胞计数后将细胞移至培养瓶中,加入适量的20%FBS培养液(含双抗),混匀后置于5%CO237℃培养箱中培养,24小时后更换培养液。之后根据细胞的生长情况及培养液的变化,每1~3 d更换培养液1次。若杂质较多,换液前用PBS(含双抗)轻轻洗1~2次。

1.8 细胞计数

将细胞悬液吹打混匀后,用吸管吸5滴细胞悬液到离心管中,加入5滴台盼蓝染液,吹打均匀。然后吸取少量悬液沿细胞计数板上盖片边缘缓缓滴入,至盖片下刚好充满悬液。在低倍镜下观察,以未染色细胞为活细胞,计数四个大格子活细胞数。按照下面公式分别计算活细胞、总细胞密度:细胞悬液的细胞数/m L=(四个大格子细胞数/4)×2×104。并计算活细胞百分比。用于细胞接种。

1.9 流式细胞仪检测FLS表面标记物

当细胞培养至第3代细胞,经消化重悬制成1×105/m L的单细胞悬液,送中山大学附属第一医院行流式细胞仪检测CD55的表达。

2 结果

2.1 成纤维样滑膜细胞的培养情况

本课题过程中总共有6例类风湿关节炎、4例骨关节炎、4例关节创伤患者关节滑膜成功培养出成纤维样滑膜细胞,其中9例应用酶消化法,5例应用组织块法。

应用酶消化法,所获得的细胞量因所取滑膜组织的大小而异,一般类风湿关节炎滑膜组织获得的细胞量较多,但所消化下来的杂细胞及其它细胞间质成分也明显较多,在换液过程中需要一定的冲洗,因而目的细胞在冲洗过程中也必然有所损失。所得细胞以梭形、菱形细胞为主,可见长有伪足的巨噬样细胞、树突状细胞、圆形细胞等,原代一般在1~2周长满,随着细胞的传代,慢慢纯化为较单一的成纤维样细胞,至第三代时成纤维样细胞所占比例>99%。

应用组织块法,一般在2~5 d可见细胞爬出,呈涡旋状生长,混杂细胞较酶消化法明显减少,但所用时间较长,生长欠均匀,原代细胞一般在16~19 d长满。细胞传代后成纤维样细胞所占比例即可>99%。

所培养细胞可于体外传多代,并成功进行细胞冻存、复苏。在第5代之前细胞增殖较快,第6代之后细胞增殖逐渐减慢。本课题中在RA组、OA组、Trauma组三组各随机选取3个标本的FLS进行其它细胞实验,实验所用细胞均为第3代。

2.2 成纤维样滑膜细胞活体镜下观察

在倒置显微镜下,所培养细胞呈纺锤状或星形,部分可呈大多角形。细胞核边界清楚,为卵圆形,位于细胞的中间,可见明显的核仁。所培养细胞形态符合成纤维细胞的形态特征,传代至第三代时,成纤维细胞样细胞所占比例均>99%。(图1)

2.3 流式细胞仪检测成纤维样滑膜细胞表面标记物

所培养第3代细胞行流式细胞仪检测结果CD55表达均>99%(见图2)。

3 讨论

在滑膜组织中,成纤维样滑膜细胞(FLS)与巨噬细胞样滑膜细胞在普通显微镜下无法区分。在电子显微镜下,可见成纤维样滑膜细胞含有大量粗面内质网和高度发育的的高尔基体,而空泡则很少,细胞核表现为开放性的染色质类型。这些典型的特征表现显示其具有大量合成和分泌功能。成纤维样滑膜细胞的特征性标记物有:尿二苷磷酸葡萄糖脱氢酶(uridine diphosphoglucose dehydrogenase,UD-PGD)、血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)/CD106、促衰变因子(decay accelerating factor,DAF)/CD55/m Ab67、Cadherin-11[5]、波形蛋白(Vimentin)、Thy-1(CD90)。在这些标志物中,与其它解剖部位的成纤维细胞相同的标记物有Vimentin和CD90。标记物中区别于其它成纤维细胞(包括滑膜下层的成纤维细胞)有UDPGD、CD55和CD106。这些标记物均可区别于巨噬细胞样滑膜细胞。

原代细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内环境,在无菌、适当温度及酸碱度和一定的营养条件下,使其生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术。原代细胞培养主要有酶消化培养法、组织块培养法和机械分散法。体外培养的细胞分为贴附型和悬浮型型。贴附型分为四型,分别为成纤维细胞型、上皮型、游走细胞型和多型细胞型。成纤维细胞型胞体呈梭型或不规则三角形,中央有卵圆形核,胞质突起,生长时呈放射状。由中胚层间充质起源的组织常呈成纤维细胞型状态,包括成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞等。

体外用酶消化RA滑膜后,可将黏附的细胞分为两类,巨噬细胞样(A型)滑膜细胞和成纤维样(B型)滑膜细胞。早期培养的细胞中还存在很少量的其它黏附细胞,包括树突状细胞和内皮细胞。经培养若干代后,成纤维样(B型)滑膜细胞最终存活并增殖,形成相对同源的细胞系。而巨噬细胞样(A型)滑膜细胞只有较短的生存时间,就算在有外源性生长因子或克隆刺激因子存在的情况下也只能生存几周。从分散的细胞中分化发育的成纤维样细胞能在培养皿中传代数月。它们倍增的速度开始很快,这或许是因为培养物中存在污染的巨噬细胞所产生的细胞因子,也可能是因为滑膜基质的携带效应。一段时间后,增长的速度逐渐变慢,在繁殖了12~15代之后,细胞逐渐衰老,最终停止增长。

目前体外原代培养成纤维样滑膜细胞的方法主要有3种,滑膜组织的酶消化法、滑膜组织的组织块法和滑液的分离培养法。其中酶消化法和组织块法是通过滑膜组织进行培养的。酶消化法目前应用最为广泛。滑膜组织的一般取自关节置换术、关节腔镜手术和关节腔细针活检术,可来源于膝关节、髋关节及其它滑膜关节甚至是掌指关节,不同来源的组织可能影响具体组织分离的细节以及所获得的细胞量。本课题所有标本均来自膝关节滑膜,取自关节置换术或关节腔镜手术,在一定程度上保持了均一性。使用组织块法所获得的FLS性质基本与传统的酶消化法一致,产生透明质烷、I型和III型胶原,持续表达细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM)-1和CD58等[6]。

本课题应用酶消化法和组织块法均成功培养出成纤维样滑膜细胞。所取组织的HE染色结果表明,本课题进行原代细胞分离培养的材料为关节滑膜组织,未存在关节滑膜以外的组织。因此在本课题中,不管是酶消化法还是组织块法,可能出现的细胞局限为成纤维样滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜细胞、滑膜下层的成纤维细胞、血管内皮细胞、脂肪细胞、淋巴细胞、肥大细胞、单核巨噬细胞、粒细胞,甚至可能有淋巴管上皮细胞等。其中悬浮型细胞包括淋巴细胞、肥大细胞、粒细胞,在换液和传代过程中消失。巨噬细胞及其它很少量的黏附细胞包括树突状细胞和内皮细胞,由于体外生存时间短,在传代过程中逐渐消失。在FLS培养至第三代时,经镜下观察,具有典型形态特征的树突状细胞和内皮细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞基本消失,未见悬浮细胞。由于流式细胞仪检测第三代CD55的表达均>99%,基本可认为巨噬细胞、滑膜下层成纤维细胞所占比例<1%。结合培养用组织来源、细胞的形态特征以及CD55检测结果,基本可鉴定本课题所培养的细胞为成纤维样滑膜细胞,纯度>99%。

参考文献

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[2]Steenvoorden MM,Bank RA,Ronday HK,et al.Fibroblast-like synoviocyte-chondrocyte interaction in cartilage degradation.Clin Exp Rheumatol.2007,25(2):239-245.

[3]Kasperkovitz PV,Timmer TC,Smeets TJ,et al.Fibroblast-like synoviocytes derived from patients with rheumatoid arthritis show the imprint of synovial tissue heterogeneity:evidence of a link be-tween an increased myofibroblast-like phenotype and high-in-flammation synovitis.Arthritis Rheum.2005;52(2):430-41.

[4]Pretzel D,Pohlers D,Weinert S,et al.In vitro model for the a-nalysis of synovial fibroblast-mediated degradation of intact carti-lage.Arthritis Res Ther.2009;11(1):R25.

[5]Kiener HP,Brenner MB.Building the synovium:cadherin-11mediates fibroblast-like synoviocyte cell-to-cell adhesion.Ar-thritis Res Ther.2005;7(2):49-54.

成纤维细胞 篇11

1材料与方法

1.1主要实验材料

水溶性固体蜂胶:上海辰蜂生物技术公司提供, 氢氧化钙粉:上海二医张江生物材料有限公司生产。

1.2主要试剂与仪器

DMEM细胞培养基(Hyclone)、澳洲胎牛血清(普飞)、0.5 g/L胰蛋白酶(Hyclone)和96孔细胞培养板均由诺贝生物科技有限公司提供。MTS(普洛麦格生物技术有限公司),二氧化碳培养箱(美国Therm- Fisher Forma 3111),超净工作台(SW-CJ-1D型,苏州净化设备有限公司),高速低温离心机(日本HI- TACHI集团CR22G),小鼠抗人波形丝蛋白单克隆抗体(福州迈新公司),小鼠抗人角蛋白单克隆抗体(福州迈新公司),酶标仪(ST360,上海科化实验系统有限公司)。

1.3人牙髓成纤维细胞的培养及传代

牙髓标本取自昆明医学院附属口腔医院颌面外科门诊,取临床青少年因正畸减数需要拔除的健康恒前磨牙4~5颗,立即置入含有3%双抗的DMEM培养液中带回。在科室用碘酊、乙醇依次消毒牙冠, 无菌高速涡轮机头除去表面牙周组织,裂钻环形切割牙颈部至近髓后立即置入培养液中带到实验室。 在超净工作台内,骨凿劈开牙冠,用无菌的K锉谨慎从根管中抽出牙髓迅速剪去根尖1/3,置入浸有培养液的培养皿中,用无菌眼科剪剪成0.5 mm3组织块,然后用DMEM培养液冲洗3次,探针将组织块挑入培养瓶底部,以0.5 mm的间距均匀铺置,对侧壁滴入培养液,瓶底向上置入二氧化碳培养箱中,静置4 h贴壁后翻转,再加入适量培养液静置于培养箱中培养,组织块未游出细胞前每周换液一次,细胞游出后每3天换液一次,在倒置显微镜下观察细胞游出及生长情况,待细胞达到汇合点时,用0.5 g/L的胰酶消化,按1∶2传代,原代培养的人牙髓细胞传至第4代后,免疫组织化学染色鉴定细胞的组织来源。 细胞继续传代至第5代,取生长良好的第5代牙髓细胞进行细胞接种备用。

1.4蜂胶水溶剂的配制

取国产水溶蜂胶用三蒸水将其配成1 g/10 ml的蜂胶溶液,0.2μm的无菌过滤器滤后再用含有10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成4、2、1、0.6和0.2 g/L 5个浓度备用。对照的氢氧化钙溶液配制: 将200 mg氢氧化钙干粉剂溶于50 ml的三蒸水中, 3 000 r/min条件下离心10 min,取上清液,0.2μm的无菌过滤器滤后用含有10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成10%、8%、4%、1% 4个浓度备用。

1.5人牙髓细胞相对增殖率的测定

Cell Titer 96 @ A Queous One Solution Cell Proliferation Assay(a)是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒实验中的活细胞数量的新的检测试剂, 此试剂含有一个新型的四唑化合物MTS和一种电子偶联剂PES。PES具有增强的化学稳定性,这使它可与MTS混合形成稳定的溶液,是方便的单溶液模式。MTS被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物,可直接溶解于培养基中,这种转换是由代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的还原型烟酰胺腺嘌呤二核甘酸磷酸(NADPH)或烟酰胺腺嘌呤二核甘酸磷酸(NADH)的作用下完成的。检测时,只需将少量的Cell Titer 96 @ AQueous One Solution Reagent试剂直接加入培养板孔的培养基中,孵育1~4 h,然后用酶标仪读取490 nm的吸光度值,操作步骤比MTT更少,更方便快捷。在490 nm处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比。

本实验采用MTS比色法,检测不同浓度的蜂胶水溶剂和氢氧化钙溶液作用于人牙髓细胞后的吸光度(OD值),计算细胞相对增殖率(relative growth rate,RGR):RGR= 实验组OD值/ 阴性对照组OD值×100%,根据RGR换算细胞毒性的级别。

具体方法如下:取生长良好的第5代牙髓细胞, 0.5 g/L胰蛋白酶消化,离心后用含有10%胎牛血清的DMEM培养液吹打成单细胞悬液,用细胞计数板调整细胞浓度至2×104/ml,接种于96孔板,每孔100μl。放置到37℃、5%二氧化碳培养箱中培养48h, 倒置显微镜下观察大多数细胞贴壁并生长。弃去孔内液体及不贴壁的细胞,将各稀释药液加入96孔板中,每种加5孔,每孔100μl;阴性对照组加含有10% 胎牛血清的DMEM培养液,每孔100μl。在预实验中,笔者发现蜂胶的颜色也对吸光度产生一定的影响,因此在每组蜂胶实验组的上方还设一组不含细胞的蜂胶液对比孔,在该对照孔中加对应浓度的蜂胶液100μl。用该蜂胶组的OD值减去该孔的OD值以排除蜂胶色度对实验组吸光度的影响,96孔板置37℃,体积分数5%二氧化碳条件下培养48 h后, 每孔加入20μl配好的MTS试剂,再放回培养箱中放置4 h取出,在酶标仪上振荡30 s,于490 mm波长下测OD值,每种浓度孔的OD值取平均值。计算细胞RGR,根据细胞毒性评级标准(见表1),用RGR值换算细胞毒性级。

1.6统计学方法

采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析,对实验结果组间进行方差分析,对蜂胶与氢氧化钙总体细胞毒性进行两独立样本t检验,P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1细胞的培养和形态学观察

本研究用传统的组织块培养法,12~15 d内可见有的组织块周边有少量梭形细胞长出,2~3 d后细胞迅速扩增,约18~20 d左右细胞长满瓶底。按1∶2传代,2~3 d可传一代。原代及传代培养的细胞胞体呈长梭形,星形胞体细长,胞浆丰富,核位于中央,排列紧密多呈近于平行的束状,细胞界限清楚, 呈“漩涡状”。见图1。

2.2细胞来源鉴定

取第4代对数生长期人牙髓细胞爬片,按试剂盒说明书进行波形丝蛋白,角蛋白免疫组织化学染色, 光镜下观察。牙髓成纤维细胞呈典型的成纤维样细胞,细胞浆内波形丝蛋白染色为阳性,角蛋白染色呈阴性。波形丝蛋白是成纤维细胞的特征性蛋白, 而角蛋白是上皮细胞的特征性蛋白,因此证实培养的是中胚层来源的人牙髓成纤维细胞。见图2、3。

2.3细胞相对增殖率结果及毒性分级

第5代人牙髓成纤维细胞以2×104/ml,接种于96孔板,培养48 h后,各孔细胞密度均匀。细胞贴壁生长,形态正常,胞体呈长梭形。加样48 h后,阴性对照组细胞密度增加,形态正常;加药物的实验组和对照组,低浓度的各孔中细胞形态基本正常,随着浓度的增加,培养孔中出现变性死亡细胞,部分细胞漂浮起来。各孔加入MTS试剂后,放回培养箱中孵育4 h,取出后用酶标仪测定各孔的吸光度。不同浓度蜂胶水溶液与氢氧化钙溶液对人牙髓成纤维细胞作用48 h后的吸光度值、换算的细胞相对增殖率及毒性级别如下,见表2。

对蜂胶组各浓度OD值进行方差分析,F =30.618, P <0.05,差异有统计学意义,认为不同浓度下的蜂胶OD值不同。对氢氧化钙组各浓度OD值进行方差分析,F =44.275,P <0.05,差异有统计学意义,认为不同浓度下的氢氧化钙OD值不同。对蜂胶和氢氧化钙总体细胞毒性进行两独立样本t检验,t =0.882, P <0.386,差异无统计学意义,表明蜂胶和氢氧化钙总体细胞毒性无差异。

3讨论

由于牙髓组织具有形成牙本质和营养硬组织的功能,对外来刺激能产生一系列防御性反应,因此保存活髓具有十分重要的意义。理想的盖髓材料要有良好的封闭性,能有效地隔绝外界刺激,杀灭细菌,消除牙髓炎症,保护牙髓。诱导牙髓细胞分化成成牙本质细胞形成修复性牙本质桥,并能提供牙髓修复,牙本质生物矿化所需要的微量元素及适宜的微环境[1]。

氢氧化钙是目前应用最广泛的盖髓材料,它能有效地促进牙髓细胞分化,形成修复性牙本质封闭露髓孔,并且其强碱性也具有一定的抑菌和杀菌作用。 但临床应用也发现它有明显的缺陷,例如它会引起接触部位牙髓炎症坏死;会发生牙髓退行性改变,出现根管内营养不良性钙化,钙化蔓延到整个根管,出现堵塞或牙内吸收等[2]。为进一步改善性能,有研究试图用氢氧化钙复合其他材料或激光处理的方法提高治疗效果[3,4]。也有学者在探索新的盖髓材料,目前有矿化三氧化物凝聚体(MTA);牙本质粘接剂;磷酸钙类材料(羟基磷灰石、磷酸钙骨水泥,陶瓷化骨粉等);生物活性材料(骨形成蛋白、表皮生长因子、 牙本质胶原蛋白、富血小板血浆等);抑菌类材料(各类抗生素);中药类(黄芩苷等)[5,6,7,8,9,10,11]。但各种材料各有优缺点:如磷酸钙类材料无抗菌性;生物活性材料易被破坏;粘接剂密封性好,但有刺激性等等,单一的材料均不能达到理想的盖髓材料应具备的性能。进一步探索具有生物诱导活性,良好的生物相容性, 消炎杀菌及物理机械性能都良好的复合盖髓材料, 提高活髓保存的成功率是该领域的研究方向。由于盖髓治疗常因微渗漏或牙本质深层藏存的细菌感染而失败,因此盖髓剂能否杀灭露髓孔内残余细菌,消除牙髓炎症有重要的意义。因此有研究者试图复合几种材料的性能,如束红蕾[12]等把甲硝唑,红霉素,克林霉素加入到磷酸钙骨水泥,陶瓷化骨粉中用于实验动物的盖髓,实验研究也取得了较好的效果。

近年来,人们越来越热衷于绿色天然药物的开发和应用,蜂胶含有多种生理活性物质,具有广泛的生理和药理作用,临床上多用于治疗溃疡、烧伤、 糖尿病及心血管病等[13]。最重要的是蜂胶的强抗菌功能是其他天然物质无可比拟的,由于蜂胶含有大量的黄酮类及芳香酸、脂肪酸及烯类等多种化合物, 它具有广谱抗菌作用,能抑制多种细菌和病毒,有研究证实1%~10%的蜂胶对真菌和霉菌都有抑制作用[14]。在口腔领域关于蜂胶的研究也很广泛,国内已有研究表明,蜂胶的生物安全性很好[15]。蜂胶对龋病、牙周病和感染根管的致病菌有明显的杀灭及抑制作用,已有研究将其引入龋病、牙周病及感染根管消毒治疗领域[16,17]。国外有研究还发现,蜂胶能有效杀灭对氢氧化钙消毒耐受的细菌,能有效杀灭难治性根尖周炎根管内的粪肠球菌[18,19]。蜂胶的消炎镇痛、表面麻醉、促进增生、改善微循环的作用使其对复发性口疮、扁平苔藓等口腔黏膜病也有较好的疗效[20],已有蜂胶的牙膏,漱口水、口腔溃疡贴膜生产用于口腔临床。对于牙髓治疗领域,由于蜂胶含醛, 有凝固蛋白的作用,国内有学者报道用蜂胶复合普鲁卡因等制成的复方蜂胶失和剂可以失和牙髓[21]。国外学者研究报道,较低浓度的蜂胶醇溶剂在保持有效的杀菌效力的同时对人牙髓、牙周及牙龈成纤维细胞的细胞毒性远低于氢氧化钙,生物安全性好,用于盖髓治疗能诱导修复性牙本质形成[22,23,24],但尚无进一步深入的研究报道。国内目前尚无水溶蜂胶对人牙髓细胞的细胞毒性及蜂胶用于盖髓治疗的实验报告。

为进一步明确蜂胶在盖髓治疗中的性能,研究能否利用蜂胶的天然强抗菌性,丰富的物质含量和改善微循环、促进增生等多种生物活性消除暴露牙髓的炎症,从而诱导牙髓—牙本质复合体反应形成修复性牙本质,笔者采用国产水溶蜂胶做人牙髓细胞的细胞毒性实验。由于以前多数研究为蜂胶乙醇提取液,对蜂胶水提取液的研究非常少。在本实验中,为降低对牙髓的刺激,并填补蜂胶水溶剂用于盖髓治疗的研究空白,采用国产水溶蜂胶制备不同浓度的蜂胶水溶剂。采用体外细胞培养技术培养人牙髓细胞,用MTS比色法检测不同浓度的蜂胶水溶剂作用于人牙髓细胞后的OD值。计算细胞RGR,根据RGR换算细胞毒性的级别。观察不同浓度的蜂胶水溶剂对人牙髓细胞增殖的影响,并对其细胞毒性进行评级。

实验结果表明,水溶蜂胶及氢氧化钙对人牙髓细胞的细胞毒性各浓度组间差异有统计学意义(P < 0.05);对蜂胶与氢氧化钙总体细胞毒性进行两独立样本t检验,差异无统计学意义(P >0.05),表明蜂胶和氢氧化钙总体细胞毒性无差异。1 g/L及以下国产水溶蜂胶溶液对人牙髓细胞的毒性在2以下,具有低毒性,可考虑用于临床治疗。

摘要：目的 探讨水溶性蜂胶对人牙髓成纤维细胞的毒性作用,为蜂胶的临床应用提供理论依据。方法 用一种新的四唑类化合物MTS比色法检测人牙髓细胞在不同浓度的蜂胶、氢氧化钙溶液中体外培养48 h后细胞的相对增殖率(RGR),用5级毒性分类法评级。结果 1 g/L及以下浓度的水溶蜂胶组对人牙髓成纤维细胞的毒性级别在2以下。结论 1 g/L及以下浓度的水溶蜂胶液对人牙髓成纤维细胞的毒性作用较小,是治疗牙髓疾病的安全药物。