纤维母细胞生长因子

纤维母细胞生长因子（共7篇）

纤维母细胞生长因子 篇1

摘要：目的 探讨成人烟雾病不同阶段中肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)及血管源性生长因子(VEGF)的变化。方法 回顾性分析2013年11月2014年12月江西省人民医院(以下简称“我院”)神经内科住院的行全脑血管造影检查确诊为烟雾病的41例患者临床资料,根据Suzuki分期,8例患者为早期(Suzuki分期1~2期),17例为中期(Suzuki分期3~4期),16例为晚期(Suzuki分期5~6期),同时选择在我院诊治的40例脑动脉粥样硬化患者为阳性对照,另选择我院20例健康体检者为正常对照。采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测上述人群血清中HGF、b-FGF及VEGF浓度。结果 烟雾病早、中、晚期患者的HGF与动脉粥样硬化患者、健康人比较,差异有统计学意义(P<0.05)。烟雾病晚期患者b-FGF与动脉粥样硬化患者、健康人比较,差异有统计学意义(P<0.05)烟雾病早期患者VEGF与动脉粥样硬化患者、健康人比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 烟雾病的发生发展过程HGF、b-FGF及VEGF均有参与,但三者作用并不相同,HGF可能在烟雾病整个发生发展过程中均发挥作用,而b-FGF可能在烟雾病晚期发生发展中发挥了作用,VEGF则可能在烟雾病早期发生发展中发挥了作用。

关键词：烟雾病,肝细胞生长因子,碱性成纤维细胞生长因子,血管源性生长因子

侧支循环是近年来国内外研究的热点问题[1,2],通过侧支循环,可以维持病变血管的远端血液供应,从而避免出现脑梗死,当侧支循环好时,预后较好。故其在缺血性脑血管病的发生、发展、治疗、预后中都起到了十分关键的作用,更为重要方面其还是一条可干预的途径[3]。因此需要加强侧支循环建立的基础和临床方面的研究,从而为缺血性脑血管病的治疗开启新的方向。烟雾病是一种以双侧颈内动脉末端及大脑前、中动脉起始部狭窄或闭塞,并在颅底有异常增生血管网的脑血管病[4],其突出特征之一便是出现颅外向颅内代偿的侧支循环和新生的毛细血管网,其分别代表次级及三级侧支循环。随着病情的发展,新生的毛细血管网会发生不断地变化,呈现出增生、旺盛及衰减的过程,而次级侧支循环也会逐渐建立并起主要代偿供血作用,是目前研究侧支循环变化最好的途径[5]。目前很多国内外研究已提示多种细胞因子在烟雾病患者中表达明显增加[6,7,8,9],其中,肝细胞生长因子(HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)及血管源性生长因子(VEGF)最具有代表性[10],但烟雾病毛细血管网的增生、旺盛和衰减的具体过程及次级侧支循环变化与上述细胞因子的相关性尚不清楚,本研究探讨HGF、b-FGF、VEGF)在成人烟雾病不同阶段的变化,现报道如下:

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2013年11月~2014年12月江西省人民医院(以下简称“我院”)神经内科住院的行全脑血管造影检查确诊为烟雾病的41例患者临床资料,其中男15例,女26例,平均年龄为(51.34±8.71)岁,上述患者行相关检查排除相关疾病,同时行全脑血管造影检查确诊为烟雾病,影像学评判标准选择Suzuki分期,2位神经内科医师分别单独进行判定,8例患者为早期(Suzuki分期1~2期),17例为中期(Suzuki分期3~4期),16例为晚期(Suzuki分期5~6期)。同时选择在我院诊治40例脑动脉粥样硬化患者为阳性对照,另选择我院20例健康体检者为正常对照。所选健康对照人员均为血象、血生化、常规心电图、胸片、腹部B超、经颅多普勒超声检查等上述检查项目正常的健康成人。

烟雾病诊断标准:①颈内动脉(internal carotid artery,ICA)末端和/或大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)、大脑前动脉(anterior cerebral artery,ACA)起始端狭窄或闭塞;②其颅底可见烟雾状异常血管网;③病变为双侧性。

脑动脉粥样硬化诊断标准:①全脑血管检查发现血管管腔有狭窄;②排外肌纤维发育不良等其他原因所致血管管腔变化。

烟雾病Suzuki分期的标准[11]:第1期,双侧颈内动脉末端分叉处狭窄。第2期,颈内动脉末端分叉处狭窄,ACA和MCA起始部狭窄并分支扩张,颅底有烟雾血管形成,但无颅外至颅内侧支循环形成。第3期,ACA和MCA主要分支闭塞,烟雾血管非常明显,形成烟雾血管团,但大脑后动脉(PCA)或后交通不受影响,仍无颅外至颅内侧支循环形成。第4期,颅底烟雾状血管开始减少,ICA闭塞已经发展到与后交通动脉的联合处。从颅外到颅内的侧支循环逐渐形成,或有异常增生的新生血管吻合支。第5期,从ICA发出的全部主要动脉完全闭塞,烟雾血管比第4期更少,从颅外到颅内的侧支供血进一步增多。第6期,烟雾状血管完全消失,ICA主干闭塞,仅见到从颅外进入颅内的侧支循环。

1.2 检测方法

烟雾病和动脉粥样硬化组在入院后第2天,正常对照组在当天即采取空腹静脉血6 m L,常温放置30 min,以3000 r/min离心15 min,取血清并将其置于-70℃冰箱备检。各组血清中HGF、b-FGF及VEGF浓度均采用酶联免疫吸附法(ELISA法)检测。检测试剂盒采用武汉博士德生物工程有限公司,检测步骤严格按操作说明书进行。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析,正态分布计量资料以均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;多组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示,采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 烟雾病患者、脑动脉粥样硬化患者、健康人一般资料比较

烟雾病患者、脑动脉粥样硬化患者、健康人的一般资料,烟雾病患者、脑动脉粥样硬化患者危险因素比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

注:“-”表示无

2.2 烟雾病患者、动脉粥样硬化患者、健康人血清中HGF、b-FGF、VEGF比较

烟雾病早期、中期、晚期患者的HGF与动脉粥样硬化患者、健康人比较,差异有统计学意义(P<0.05),烟雾病早期、中期、晚期患者之间HGF相比较,差异无统计学意义(P>0.05)。烟雾病晚期患者b-FGF与其他各组比较,表达最为明显,差异有统计学意义(P<0.05),其余各组间b-FGF差异无统计学意义(P>0.05)。烟雾病早期患者VEGF与其它各组比较,表达最为明显,差异有统计学意义(P<0.05),其余各组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

3 讨论

根据国内外相关研究报道[6,7,8,9],HGF、b-FGF、VEGF均在烟雾病患者病变处的颈内动脉颅内段及其分支血管中层和增厚的内膜中广泛表达,另外在患者脑脊液中检测含量明显增高,而正常对照组则未发现,表明这些相关病变组织中含有上述细胞因子,提示与烟雾病的发生发展有关。

烟雾病的病变血管不同于动脉粥样硬化病变,其以内膜增厚为主要表现,从而造成了血管管腔变细、狭窄,直至闭塞,同时周围逐渐出现新生毛细血管网,上述病理过程均与血管内皮细胞增生有相关性[12]。随着病程的进展,新生毛细血管会逐渐衰减,而次级侧支循环则起主要代偿供血作用,根据这些影像学变化可行Suzuki分期,8例早期,17例中期,16例晚期,分别代表了不同的次级和三级侧支循环变化阶段。

HGF是一种很强的促血管再生因子[13,14],它不仅促进血管的生成,而且可调节内皮细胞的生长、运动。本实验揭示血清中HGF浓度在烟雾病各个阶段均有明显的升高,既使烟雾病后期毛细血管网减少时,HGF浓度仍未下降,提示其从始至终一直参与新生毛细血管网及次级侧支循环的形成,可能是一种主要的促侧支循环开放的细胞因子。

b-FGF在体内分布很广,可诱导内皮细胞的迁移和增殖,并促进内皮细胞的黏附和形成血管腔[15],临床试验也进一步证明其具有强大的血管再生作用[16]。本研究发现烟雾病晚期患者血清中b-FGF含量明显增加,此时烟雾病变的血管闭塞达到最高峰,而新生毛细血管网已处于衰减期,但第二级侧支循环逐渐出现并起主要作用,故推测其在烟雾病侧支循环变化的后期病变中发挥了重要作用。

VEGF是一种血管生长因子,主要作用不但可刺激血管内皮细胞增生,调节细胞的生长,而且还可促进血管形成[17,18,19],临床试验显示通过特异性VEGF纳米抗体能抑制血管的生长,反证其具有促进血管再生作用[20]。本研究提示烟雾病早期组血清中VEGF含量明显增加,此时烟雾病患者病变血管尚处于病变早期,新生毛细血管处于增生期,推测其在烟雾病的侧支循环早期的变化发挥了重要作用。

综上所述,根据影像学分期和上述结果,HGF、bFGF、VEGF均与烟雾病的侧支循环变化发展有关,但HGF可能参与了烟雾病新生毛细血管网和次级侧支循环建立的整个病变过程,烟雾病晚期次级侧支循环增加时FGF可能起了作用,而烟雾病早期毛细血管网增殖过程中VEGF可能发挥了作用。由于本研究采用了血清学检测,而非患者直接病变组织,另外所选择样本量少,有可能造成实验的偏倚,今后将在需要进一步扩大样本量进行研究。

纤维母细胞生长因子 篇2

关键词：FGF23,慢性肾病,磷酸盐,研究

成纤维细胞生长因子23(FGF23)是由骨细胞与骨成纤维细胞分泌的具有调磷作用的内分泌荷尔蒙因子,因其与FGFR-KLOTHO复合物结合具有细胞特异性[1,2]。FGF23通过近端肾小管的钠磷共转运蛋白Na Pi-2a与Na Pi-2c的胞吞作用能增加磷酸的外分泌;通过抑制1-α羟化酶与催化24-羟基酶的合成减少血液中1,25-双羟基维生素D(1,25D)浓度[3,4]。在健康人中,无论饮食中磷浓度如何变化,FGF23的分泌量都与其成平行关系,因此血液中磷浓度总是维持在正常范围内[5,6,7,8]。在动物与人体试验中,FGF23与磷浓度总是相关,但这并不是说磷总是直接调控FGF23,事实上,当非饮食的因素干扰血清中磷时,FGF23的浓度并没有改变[9,10]。另一个主要引起FGF23分泌的是1,25D,FGF23的增加抑制1,25D是以一个经典的负反馈甲状腺激素与1,25D调节环。饮食中磷的摄取与1,25D对FGF23的独立影响在甲状旁腺切除术兔中也得到了非常好的证明,给药1,25D后增加了FGF23浓度但没有改变血清中磷浓度,肾功能缺陷鼠饮食中给磷导致FGF23浓度增加5位,此时血液1,25D与PTH浓度并没有改变。

1 FGF23和慢性肾病中的矿物质代谢

尽管没有公开的资料显示FGF23在个体中随着时间的变化而发生相应的变化,但是FGF23的浓度在慢性肾脏疾病(CKD)的早先阶段确实是增加的。通过广泛的肾小球过滤率的横向研究表明,浓度渐进性提高的同时肾小球过滤率(GFR)会下降[11,12,13]。FGF23早先浓度的增加使1,25D的浓度降低,继发性甲状旁腺功能亢进症释放甲状旁腺,这是经典的反馈抑制[14,15,16,17]。

Ix等[18]在其最新报道中通过对792名患有冠脉疾病的门诊病人的横向研究表明,在开始的肾小球过滤率为90m L/(min·1.73 m2)中,FGF23的浓度有一个显著的上升。另外一个在早期的慢性肾病患者(CKD)和健康参与者中的FGF23和PTH的测量研究中提供了一个线索,即FGF23过量优先于PTH过量,因为FGF23的浓度是常态的2倍并且明显高于在健康患者中的浓度,PTH的浓度是正常的,在慢性肾病患者(CKD)和健康的参与者中没有明显的不同[19]。

Shimada等[20]最近研究表明,研究者测量了43个成年人和儿科腹膜透析患者的血浆中FGF23的浓度,通过完整的(i FGF23)和C-末端(c FGF23)免疫反应性含量测定,对比了这些结果和FGF23在细胞中的生物活性的含量。他们也使用了Western印迹法来表现循环FGF23的特性并且确定它们的总量。免疫反应的i FGF23和c FGF23是非常相关的,在之前的研究中通过对比CKD中的这2个因素表明[21,22],每一个免疫反应的结果都与FGF23的生物活性紧密相关。但是Western印迹法检测到的只有完整的FGF23而没有检测到C-末端的FGF23,倘若换个角度看第1次的重要数据,实际上所有循环中的FGF23都具有生物学活性。实际上,通过对比FGF23浓度的增加发现,尽管FGF23经常会达到正常水平的1 000倍以上,但是PTH很少会达到100倍的增加。这引起了2个重要的问题,即如此高的FGF23的浓度是否可能直接导致疾病?什么引起CKD中如此高的FGF23的浓度?关于饮食磷摄入量对于CKD中FGF23的浓度影响的研究较少,是否是klotho表达的减少引起CKD中的FGF23的浓度增加,这些已经被提出[23,24,25]。

2 慢性肾脏疾病不利结果的有效预测

带有CKD的病人在心脏血管疾病和过早死亡方面,在所有阶段都表现出明显的高风险,因为CKD对于心脏血管疾病和过早死亡均表现出独立的风险因素。据调查,导致CKD的特殊因子可能对于普遍流行于人类中的脂肪沉滞性动脉硬化症来说是个危险因素。矿物质代谢的紊乱牵连的所有成分在一定程度上支持了以下观点,即风险因素与高钙血症、高磷血症、甚至正常磷酸盐的浓度相关联,缺乏1,25-双羟基维生素D,会引发继发性甲状旁腺功能亢进症和FGF23的过量[21,26,27,28,29,30,31]。这些机制的联系可能与矿物质代谢的紊乱有关,包括加速脂肪沉滞性动脉硬化症、动脉钙化、血管僵硬和左心室肥大[32]。通过刺激身体对矿物质代谢的积极反应,努力提高在CKD中的生存。目前已经广泛采用K/DOQI和KDIGO,虽然没有最后证明,但是强调FGF23对磷酸盐和PTH的控制[33,34]。尽管对CKD中FGF23的领域的研究时间还很短,但是早先的研究结果表明,FGF23在改变临床方法上具有潜力,因为它通过预测不利的临床结果和对比传统的矿物质代谢产物如磷酸盐和PTH方面,表现出优越性。

3 FGF23与磷酸盐的比较

在一项调查中对177名非糖尿病的慢性肾病患者平均观察53个月,发现FGF23而不是血清磷酸盐或PTH是可以有效地独立预测CKD进展[35]。同样,FGF23和左心室肥大[36,37,38]、血管功能性障碍[39]以及脂肪沉滞性动脉硬化[40]症密切相关,然而相同的研究中,血清磷酸盐和PTH没有一致的关联。因此,尽管高磷血症牵涉到CKD进展、心血管病、试验小鼠的死亡[26,41],但是很难看出这些影响是否由磷酸盐本身或与它相关的FGF23的浓度的增加引起的,这还没有被测定。

2项研究表明,死亡风险的增加与FGF23的增加相关。首先,Gutierrez等[12]证明了剂量依赖性与FGF23浓度的增加导致的致死率有关,这是在美国对400个相关事件的门诊病人第1天血液透析所进行的测量。这个结果在血清磷酸盐中的各个浓度均一致,并且不像先前对磷酸盐、PTH和死亡率的研究那样,这是杰出的实践成果,它导致了当前实践中存在的只着手于大的校正分析等问题的出现,FGF23的结果从单变量和多变量分析上是统一的。

此外,FGF23对风险预测的分辨率显著高于磷酸盐。尽管在调查设计中存在较多的差异,Jean等[42]在法国219名同期的普通血液透析病人中观察到了相同的结果。不像美国的研究,病人接受了5~8 h的透析,其中许多人接受FGF23测试之前,过去正在接受磷酸盐和活性维他命D,在调查表中大多数病人是经过透析的普通病人。尽管在方法上存在显著的不同,但是都证明了同样的结果,即FGF23与死亡率之间存在稳定的联系。

4 结论

纤维母细胞生长因子 篇3

关键词：结肠癌,碱性成纤维细胞生长因子,血管内皮生长因子

结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一,20世纪90年代以来,发病率呈明显上升趋势[1,2]。影响结肠癌预后的因素很多,血管生成在肿瘤生长、转移中发挥重要作用。本研究采用免疫组织化学SP法,检测85例结肠癌标本中碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达情况,以探讨bFGF和VEGF表达的相关性及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般材料

收集辽宁中医药大学附属第三医院2007年10月～2011年10月间85例外科手术切除结肠癌标本,所有患者术前均未接受放疗或化疗,所有研究对象均按HE病理切片诊断标准确诊为结肠癌,年龄32～81岁,平均51.6岁,其中,男59例,女26例;伴淋巴结转移52例,不伴淋巴结转移33例;组织学分型:高分化32例,中分化15例,低分化38例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期40例,Ⅲ～Ⅳ期45例。

1.2 方法

标本经4%甲醛固定,常规石蜡包埋,4μm连续切片,分别进行HE染色和免疫组织化学SP法染色,兔抗人的bFGF和VEGF抗体购自福州迈新生物技术开发有限公司,并设立阳性和空白对照。

1.3 结果判定

bFGF和VEGF表达均定位于细胞浆,胞浆染有明显的棕黄色为阳性,胞浆无着色为阴性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析,计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验;采用Spearman检验进行两变量间的相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 bFGF和VEGF在结肠癌的表达情况

bFGF和VEGF在男性结肠癌的表达阳性率分别为64.4%、62.7%,女性结肠癌的阳性表达率分别为69.2%、65.4%,包浆均有明显的棕黄色染色(图1、2),不同性别间差异无统计学意义(P>0.05)。bFGF和VEGF在高、中、低分化结肠癌的阳性表达率依次为59.3%和56.2%、66.7%和60.0%、71.1%和71.0%,各组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。bFGF和VEGF在TNMⅠ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期阳性表达率分别为37.5%、50.0%和91.1%、75.6%,组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 bFGF和VEGF表达的相关性

bFGF和VEGF表达的相关性见表2。用Spearman检验进行两变量间的相关性分析表明,bFGF和VEGF结肠癌的表达呈正相关(r=0.268,P<0.05)。

3 讨论

恶性肿瘤的发生、发展机制涉及肿瘤细胞遗传物质、表面结构、侵袭力、黏附力、血管新生、淋巴管新生等诸多因素[3]。目前许多研究资料发现,新生血管的形成在肿瘤的生长、转移中发挥重要作用,恶性肿瘤细胞凭借丰富的新生血管网获取无限生长所需要的营养和氧气,因此,肿瘤的血管生成以及以血管为靶向的药物研究成为肿瘤研究领域的热点之一[4]。已经发现越来越多的因子与肿瘤血管生成有关[5]。

bFGF是广泛存在于体内多种组织的一类多肽生长因子,在机体的胚胎发育、血管形成、创伤修复过程中起重要调节作用。近年来研究发现,bFGF在肝癌、肺癌、胶质瘤、黑色素瘤中都有较高表达[6]。本实验研究表明,bFGF在大肠癌中有异常表达,与性别、组织分化程度无关,与临床分期、淋巴结转移情况密切相关。

VEGF属于血小板源生长因子超家族,为分子量46 000的高度糖基化碱性蛋白,可通过蛋白激酶C(PKC)或ras信号传导通路激活丝裂原活化蛋白激酶(MAKP)系统,刺激内皮细胞增殖,并产生纤维蛋白溶解酶原激活剂和胶原酶等[7],增加微血管通透性[8],促进血浆纤维蛋白渗出,为血管中多种细胞的迁徙提供纤维网络,从而促进血管形成和肿瘤细胞脱落进入血管或向邻近纤维结缔组织扩散。VEGF在正常情况下表达水平较低,在一些病理情况下出现过表达。本研究表明,VEGF在大肠癌中的异常表达与性别、组织分化程度无关,与临床分期、淋巴结转移情况密切相关。

本研究结果显示,bFGF和VEGF在结肠癌的表达呈正相关关系(r=0.268,P<0.05),二者共同参与了结肠癌浸润和转移的过程,相互的协同作用可以使结肠癌更具侵袭性。因此,联合检测bFGF和VEGF在大肠癌中的表达,可以作为评估结肠癌预后的客观指标,对指导临床诊断和治疗具有一定的意义,可能作为肿瘤靶向治疗的新靶点,通过某种技术抑制bFGF和VEGF高表达,可实现缓解病情甚至治疗结肠癌的目的,减少复发和转移。

参考文献

[1]李颖超,张观宇,许立莉.CD105和VEGF在大肠癌中的表达及意义[J].中国误诊学杂志,2010,10(36):8878.

[2]张娟,魏君,王士杰,等.Twist和E-cadherin在大肠癌组织中的表达及临床意义[J].中国肿瘤临床,2011,38(3):143-147.

[3]谢明,杨翅,梁红,等.大肠癌中pAkt、VEGF和MVD的检测及其临床意义[J].诊断病理学杂志,2009,16(5):337-339.

[4]蒋金玲,刘卫仁,于颖彦,等.肿瘤学管形成的模型建立与显微图像定量分析研究[J].中华病理学杂志,2011,40(7):475-479.

[5]于建宪,崔琳,张七一,等.组织芯片检测大肠癌中NOS、HIF-1α的及与血管生成的关系[J].诊断病理学杂志,2007,14(1):44-49.

[6]Okada-Ban M,Thiery JP,Jouanneau J.Fibroblast growth factor-2[J].Int J Biochem,2000,32(3):263-267.

[7]胡艳萍,吕彧,崔莉,等.血管内皮生长因子及其受体在胃肠间质瘤中的表达[J].诊断病理学杂志,2007,14(5):381-382.

纤维母细胞生长因子 篇4

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取健康成年SD (Sprague-Dawley) 大鼠45只, 雄性, 体重200～250g, 由哈尔滨医科大学动物实验中心提供。

1.2 实验方法

将实验动物随机分为对照组、CNTF治疗组、b FGF治疗组, 每组15只。各组又分为7、14、21、28天四个时间段, 每组15只大鼠, 每只动物进行单眼实验, 另一眼作为正常对照组。三个实验组视神经夹挫伤后, 伤眼球后立即注射0.9%生理盐水注射液0.1ml、CNTF0.1ml、b FGF 0.1ml (2000u) , 双眼分别于伤后7、14、21、28天随机处死动物取材, 每次5只。

1.3 观察方法

1.3.1 病理学观察

0.6%戊巴比妥钠过量给药处死大鼠, 尽量多保留球后视神经摘除眼球。置于10%中性福尔马林溶液固定, 隔日, 沿角膜缘环形剪开, 去除晶状体, 固定24h。固定后眼球的石蜡包埋, 以视神经和外直肌缝线处为标志, 于视盘边缘向颞侧切片, 连续切片三张, HE染色。留取部分视神经组织, HE染色, 纵向切片。

1.3.2 RGC计数及轴突形态学观察

由视盘边缘向颞侧取材连续切片三张, 长宽固定HE染色, 光镜40倍下选取RGC最密集的区域行RGC计数, 每片连数两个视野;取球后视神经3mm, HE染色, 光镜下观察轴突形态学变化。

2 结果

2.1 视网膜神经节细胞形态

正常组大鼠视网膜组织结构与人视网膜组织结构相似, 内界膜清楚, 神经纤维层较稀疏, 水平排列, 较规整;节细胞呈单层排列, 胞核较大, 呈圆形或椭圆形, 染色较淡, 排列整齐;内网状层较厚、疏松, 呈较明显的网状结构;内核层由3～5层细胞构成, 胞核较大, 染色稍深;外网状层明显薄于内网状层;外核层较厚, 由8～10层细胞组成, 胞核较小, 染色深, 排列较紧密;外界膜边界清楚、整齐。视神经夹挫伤后, 初期节细胞皱缩变小, 对照组随时间延长, 节细胞分布愈发稀疏, 细胞间出现空泡。节细胞核亦明显稀疏, 大而染色浅的细胞核基本消失。28天时最明显。

CNTF治疗组和bFGF组在各阶段内形态学上较接近, 随治疗时间延长细胞间逐渐出现少量空泡, 细胞核缓慢丢失。

2.2 视网膜神经节细胞计数

治疗7、14、21、28天时, 三个给药组分别与正常对照组比较P<0.01, 差异有显著性;bFGF治疗组和CNTF治疗组分别与对照组比较, P<0.01, 差异有显著性;bFGF组和CNTF治疗组两组间比较P>0.05, 差异无显著性。见表1。

3 讨论

b FGF是近年来研究中较为广泛而又深入的神经营养因子, 国内外大量的动物实验证实b FGF对促进中枢神经的再生有确切意义, 并且小部分应用于临床, 比如治疗视神经疾病。b FGF在正常中枢神经系统的发育阶段是一个重要的诱导剂, 与其它生长因子共同在神经系统的塑型过程中发挥作用, 国内李景恒用其治疗急性多发性视神经炎20例疗效显著, 认为其主要作用是阻止神经元继发死亡和促进神经组织的再生[1]。并有研究显示, 在治疗中发现治疗效果除了与年龄有关外, 还与病程长短及视力损害程度有关[2]。本实验可见, 伤后7天对照组的节细胞即有明显死亡, 随时间推移每组各时间点节细胞数逐渐减少, 但CNTF组和b FGF组之间比较差异始终无显著性。说明CNTF组和b FGF组在神经损伤后轴突再生的调节中有许多独特的功能。

摘要：目的 观察球后注射神经营养因子 (Ciliary neurotrophicfactor, CNTF) 和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 对大鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞存活的作用。方法 将45只健康成年大鼠、体重200～225g、Wistar大鼠随机分成三组, 对照组、CNTF治疗组、bFGF治疗组每组15只, 每只动物进行了单眼实验, 另一只眼为正常对照组。比较各组的视网膜神经细胞形态及细胞计数。结果 视神经急性损伤后bFGF组和CNTF组各时间点检测指标比较P>0.05;随给药时间延长, 各组节细胞数均有丢失, bFGF组和CNTF组分别与生理盐水组比较P<0.01, 两组之间比较P>0.05;伤后7天生理盐水组胶质细胞明显增多, 视神经纤维排列紊乱, 而bFGF组和CNTF组伤后28天视神经纤维的排列略有稀疏, 细胞器的结构仍保持得较完整。结论 CNTF治疗组与bFGF治疗组均对视神经有保护作用, 二者差异无显著性。

关键词：bFGF,CNTF,视网膜神经节细胞,视神经损伤,视神经保护

参考文献

[1]李景恒.20例急性多发性神经根炎细胞生长肽疗效观察[J].临床脑电学杂志, 1997, 6 (4) :255.

纤维母细胞生长因子 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

兔下颌骨牵张器:四川大学口腔生物医学工程重点实验室;聚乳酸-聚羟基乙酸(PLGA/85∶15):中山大学高分子所;碱性成纤维细胞生长因子(rbFGF):暨南大学生物工程研究所。

1.2 建立动物模型

新西兰大白兔18 只,随机分为实验组A(9 只)、对照组B(9 只)。建立兔下颌牵张成骨模型。手术中将消毒好的rbFGF/PLGA缓释植入片(制作方法另行发表)一分为二,植入A组下颌体部截骨线双侧,B组中植入不含 rbFGF 的PLGA植入片。一周后开始牵张,牵张速率为0.5 mm/12 h,连续牵张6 d,共牵张6 mm 后固定6 周。

1.3 观察指标

固定期第1、3、6 周进行X线、组织学检查,血清碱性磷酸酶活性及骨钙素检测。固定期第3、6 周时采用双能X线骨密度仪检测下颌骨密度。同期取3 只同龄兔检测下颌骨密度做为正常对照,固定期第6 周进行下颌骨生物力学检测,并取3 只同龄兔检测下颌骨生物力学。

2 结 果

2.1 X线检查

牵张区组织呈进行性钙化,随固定时间延长,牵张间隙阻射性影像逐渐增强。早期2 组区别不明显,固定期第6 周,A组牵张区阻射性影像均匀,骨皮质边缘光滑。B组阻射性影像低于邻近正常骨,新生骨痂仍在改建(图 1、2)。

2.2 组织学观察

固定期第1 周时,A组牵张间隙内出现较多新生骨小梁,成骨细胞活跃,血管丰富。第3 周时,牵张区出现大量新生骨小梁,其排列与牵张力方向一致(图 3)。第6 周时,牵张区骨小梁大片连接成编织骨,皮质骨中出现哈弗系统,骨髓腔明显。B组固定期第1 周时牵张间隙出现少量不成熟骨小梁,可见大量胶原纤维。第3 周时,骨小梁数量增多,但排列较乱(图 4)。第6 周时,骨小梁连接成片,开始形成编织骨,哈弗系统数量较少,在骨小梁周边仍见较多成骨细胞排列。

2.3 骨钙素检测

2 组动物术后不同时间血清骨钙素检测结果见表 1。

2.4 碱性磷酸酶(ALP)活性检测

2 组动物术后不同时间血清ALP活性检测结果见表 2。

2.5 骨密度(BMD)检测

2 组动物下颌牵张区新生骨BMD检测结果见表 3。

2.6 生物力学检测

2 组动物下颌新生骨三点弯曲刚度检测结果见表 4。

①与对照组比较P<0.05,②与正常组比较P<0.01,③与正常组比较P<0.05,④与正常组比较P>0.05

①与对照组比较P<0.05,②与正常组比较P>0.05,③与正常组比较 P<0.05

3 讨 论

3.1 bFGF促进成骨的作用

bFGF不仅是一种具有广谱作用的分裂素,而且是体内已知的作用最强的促血管生长因子,在牵张成骨中起重要作用。它有效促进骨、软骨、肌腱、韧带、血管、皮肤、周围和中枢神经等多种组织损伤愈合。Tatsuyama等[1]研究表明在骨折愈合过程中有许多生长因子参与了骨折修复过程,其中bFGF起重要作用,它能促进成骨细胞分裂增殖,使其骨钙上升。Moursi等[2]研究亦表明bFGF可明显促进胎鼠颅骨成骨细胞的增殖和保持正常细胞形态,并能促进颅缝的融合。Tanaka[3]在去骨髓鼠的股骨内注入外源性rbFGF 能明显增加成骨细胞的基因表达,而不同浓度的rbFGF对碱性磷酸酶和骨钙蛋白mRNA的表达没有影响。Nakamura等[4]将rbFGF注入兔股骨末端,研究rbFGF对骨形成的影响,发现rbFGF能明显增加注射点周围矿物质的浓度,进而促进股骨细胞的增殖。Okazaki 等[5]将rbFGF注入到兔胫骨牵张间隙中,经组织学和影像学检查发现该因子有促进新骨形成并能使骨矿化含量(BMC)增多。胡静等[6]通过建立兔双侧下颌牵张成骨实验动物模型,并在牵张间隙直接注射外源性rbFGF,也发现这种生长因子具有促进下颌骨牵张后新骨的生长速度和数量的作用。

3.2 bFGF对ALP活性的影响

ALP被普遍认为是成骨细胞分化和功能的标志,也是成熟的成骨细胞的标志之一,其活性的高低可反映成骨细胞的成熟状况。成骨作用旺盛时,血清ALP升高,成为临床估计成骨作用程度的灵敏指标。本实验研究发现牵张成骨后2 组动物血清ALP活性明显升高,也证明了受牵张应力后,体内成骨细胞增长活跃,但实验组早期ALP活性明显低于对照组,证明了外源性bFGF的应用可以促进骨髓基质细胞的分裂增殖并定向分化为成骨细胞,但同时抑制了ALP活性,这和McCarthy[7]在研究中发现bFGF明显抑制ALP 活性是一致的。固定后3～6 周外源性bFGF的作用基本消失,2 组动物ALP活性已无显著性差异(P>0.05)。

3.3 定量缓释bFGF的优点

尽管bFGF作为一种重要的骨生长因子,具有刺激细胞增殖,调节细胞分化,诱导软骨和骨基质合成的生物学效应;还是一种促血管形成因子,与VEGF协同作用,可以加速血管再生,从而促进新骨形成。国内外许多学者也将rbFGF局部注射在牵张成骨间隙中来促进新骨生成,但是由于bFGF在体内的半衰期仅有3～10 min 左右,且易被酶水解,其局部或全身直接应用的生物利用度很低,效果均不能满意。本实验应用与人体生物相容性很高的PLGA可降解材料和rbFGF制成可定量缓释的rbFGF植入片,植入到兔下颌骨牵张成骨模型中,可使rbFGF定量缓慢释放到牵张间隙中,维持其有效浓度和活性,持续发挥rbFGF促进新骨形成的作用,结果表明通过外源性rbFGF在牵张成骨处局部定量缓释,能够促进下颌骨牵张后新骨的生长速度和质量,可以提高兔下颌牵张成骨效果。

参考文献

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[3]Tanaka H,Wakisaka A,Ogasa H,et al.Effects of basic fi-broblast growth factor on osteoblast-related gene expression in the process of medullary bone formation induced in rat fe-mur[J].J Bone Miner Metab,2003,21(2):74-79.

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[5]Okazaki H,Kurokawa T,Nakamura K,et al.Stimulation ofbone formation by recombinant fibroblast growth factor-2in callotasis bone lengthening of rabbits[J].Calcif Tissue Int,1999,64(6):542-546.

[6]胡静,王志国,高占巍,等.成纤维细胞生长因子对兔下颌牵张成骨的影响[J].临床口腔医学杂志,2002,18(1):6-7.

纤维母细胞生长因子 篇6

关键词：植物反应器,碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) ,亚麻芥

随着对植物生物反应器快速发展和深入研究, 植物转基因技术在生物学中的地位越来越重要, 利用转基因植物生产高效的外源重组蛋白也已成为研究热点。一方面利用植物系统可以大规模的生产外源蛋白, 成本低廉;另一方面植物生产的外源蛋白不含致病微生物和动物病毒, 相对比较安全;为植物生产药用蛋白提供了广阔的应用前景。碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF) 是人体内一种特殊的活性物质, 能够促进神经纤维细胞、表皮细胞和软骨细胞的生长, 在临床上具有重要意义和广泛的应用价值。亚麻芥 (Camelina sativa L.Crantz) 是一种新型、较强开发潜力的油料作物, 是动物重要的蛋白和油脂资源, 也是生物能源的重要原料。为了降低生产成本及满足市场对b FGF的大量需求, 本文对利用转基因亚麻芥生产重组蛋白b FGF进行了探索。

1 植物生物反应器

植物反应器是利用植物悬浮细胞, 整株植物生产一些人类需要的蛋白。如生产医用蛋白、疫苗、抗体。这些蛋白在临床和商业上有很大的潜力, 可制成食品添加剂投入在食品生产上。其具有生产成本低, 无毒副作用, 易于获得再生植株, 可得到稳定的遗传后代等优点。通过转基因植物的药物蛋白, 将外源基因在植物中稳定整合和高效表达, 提高植物转化效率和外源基因在植物中表达效率, 目前已成为基因工程领域的研究方向及热点。

1992年, 美国人首先提出了用植物生产疫苗的理论, 随后, 国内外的很多实验室在马铃薯、烟草、萬宦中表达了多种的抗原, 为此后利用转基因植物来生产疫苗提供了理论和现实依据。孟山都公司则培育出了一种能生产人源化抗体转基因大豆, 这种人源化的抗体主要是针对单纯疱疫病毒。星球公司利用转烟草生产了生物新药Caro Rx TM。

目前, 我国的植物反应器的研究也取得了一定的研究进展。国家加大了对植物生物反应器的扶植力度, 尤其是“863”计划中的“高效转化系统的研究”、“组织和器官特异性基因表达启动子研究及高效表达载体构建”等被列为重大课题。虽然我国的生物医药发展晚于其他国家, 但我国现在拥有较多的生物公司。我国现有乙肝疫苗、人胰岛素、人生长素等15种生物药品也投入了市场。目前, 虽然与通过利用动物或微生物生物反应器来生产外源蛋白相比, 利用植物生物反应器生产外源蛋白来提高植物药用价值, 其具有较高的安全性, 有着不可替代的优越性, 植物作为反应器研究前景和商业价值是不可估量的。

2 碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)

碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor, b FGF) 是人体中一种含量非常少的蛋白多肽, 是FGFs家族成员之一, 在医疗方面也有巨大的作用。早在1940年, 就有研究发现在垂体和脑中含有的物质能够刺激成纤维细胞的生长。1974年, Gospodarowiez等首次从牛垂体中分离并纯化出成纤维细胞生长因子, 其分子量为1.6x1041u。目前, b FGF的基因克隆和人工合成在实验室己经成功完成。碱性成纤维细胞生长因子b FGF广泛分布于脑、脑垂体、丘脑下部、骨、软骨、阜丸、卵巢、前列腺、黄体和胎盘等处, 在肝、胃、心、眼、肾上腺皮质和巨唾细胞内也有b GFG存在。b FGF广泛分布于中胚层和神经外胚层来源的多种人体组织和器官, 同时也存在于肿瘤组织中, 其具有促进细胞增殖、分化、迁移等多种生物学效应, 并参与胚胎发育、血管生成、肿瘤代谢、神经发育等生理和病理过程。

3 亚麻芥

油料作物是人类及其他动物重要的蛋白和油脂资源。目前地球上石化能源日益枯竭, 因此同时还是发展生物能源的重要原料。亚麻芥是一种新型、具较强开发潜力的油料作物, 亚麻芥的含油量35-40%, 蛋白质含量则高达30%, 亚麻芥在食用油脂、保健食品、生物能源和动物饲料等领域上均已展示了其应用潜力。它具有抗逆性, 耐病性, 生长周期短等特点, 并可以加工成各种食品, 菜籽油还可以应用于非食品领域。亚麻芥油中的非饱和十八碳脂肪酸含量特别丰富, 它能成为油化工业中有价值的可再生原材料。另一方面, 亚麻芥油中高含量的α亚麻酸和ω3脂肪酸, 又开始引起很多营养学家的重视。但在20世纪, 由于对该作物研究较少, 导致它的育种工作进展缓慢。但近几年, 亚麻芥分子标记辅助育种工作也得到了广泛的关注。张永泰等以亚麻芥无菌苗幼叶为材料, 建立原生质体培养及植株再生的实用技术体系。Lu等用农杆菌介导的真空渗透的方法农杆菌转化亚麻芥, 收获了约1%的转基因种子, 并获得单拷贝转基因植株。

4 b GFG转化亚麻芥

纤维母细胞生长因子 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

含FGF8a c DNA序列的质粒p Bluescript-FGF8a为本实验室保存;大肠杆菌Top 10′被用于分子克隆;大肠杆菌BL21 (DE3) p Lys S用于蛋白表达;T4DNA连接酶和限制性内切酶均购于Ta Ka Ra公司;Ni Sepharose 6 Fast Flow和Sephacryl S-200 HR购于美国通用公司;抗6×His一抗和碱性磷酸酶标记的二抗购于中杉金桥 (北京) 生物技术;其它试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 p ET14b-FGF8a重组表达质粒的构建

以克隆有FGF8a c DNA序列的质粒p Bluescript-FGF8a为模板, 设计引物 (上游引物:5′-GCCATATGGGCAGCCCCCGCTC-3′;下游引物:5′-CCGCTCGAGTTATCGGGGCTCGG-3′) , 扩增FGF8a阅读框序列。扩增的序列连接到载体p ET14b的Nhe I/Xho I位点上, 与6×His标签在同一阅读框。连接后的重组质粒转化TOP10′感受态细胞, 涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上筛选。鉴定后的阳性转化子进行测序确定表达序列和阅读框的正确性。

1.2.2 重组人FGF8a在大肠杆菌中诱导表达

转化了p ET14b-FGF8a重组表达质粒的大肠杆菌BL21 (DE3) p Lys S在LB培养基中培养过夜, 过夜培养的细菌以1‰的接菌量接到新鲜的LB培养基中, 培养至OD=0.3~0.6时, 加入终浓度约1mmol/L的IPTG进行诱导表达4h。10000rpm 4℃离心10min, 收集菌体, -20℃储存备用。

1.2.3 重组人FGF8a色谱纯化和复性

经IPTG诱导后的菌体进行超声破碎, 7000rpm离心10min, 收集包涵体。包涵体用20mmol/LTris-HCl, 2mol/L尿素, 2%Triton X-100洗涤30min, 15000rpm离心10min, 收集沉淀。洗涤后包涵体在室温下用20mmol/LTris-HCl, 8mol/L尿素, 0.1mol/L Na Cl, p H8.0缓冲液进行溶解2h, 15000rpm离心30min, 取上清。Ni Sepharose 6 Fast Flow柱用上样缓冲液 (20mmol/L Tris-HCl, 8mol/L尿素, 0.1mol/L Na Cl, p H8.0) 平衡。变性溶解后的上清以1ml/min的流速过Ni亲和柱, 随后Ni柱用淋洗缓冲液 (20mmol/LTris-HCl, 8mol/L尿素, 0.1mol/LNa Cl, 0.05mol/L咪唑, p H8.0) 清洗非特异性吸附的杂蛋白。

采用在位复性的方式对变性后的重组人FGF8a进行复性。具体做法如下:吸附有重组人FGF8a的Ni亲和柱采用线性梯度的方式将尿素从8mol/L浓度逐渐下降到0mol/L, 流速为0.1ml/min, 梯度时间24h。随着尿素浓度的逐渐下降, 吸附在Ni上的重组人FGF8a开始复性。最终柱上的重组人FGF8a用洗脱缓冲液 (20mmol/LTris-HCl, 0.1mol/L Na Cl, 0.5mol/L咪唑, p H8.0) 进行洗脱。经Ni纯化的重组人FGF8a用Sephacryl S-200凝胶层析柱做进一步纯化和缓冲液更换。S-200 Sephocryl凝胶层析所用缓冲液为PBS, 流速为1min/ml。收集重组人FGF8a洗脱峰, 并用Bradford法对其进行蛋白定量。

1.2.4 重组人FGF8a Western blot鉴定

待测样品经12%SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上, 条件100V, 2h。5%脱脂奶粉封闭1h, 在鼠抗6×His抗体中4℃孵育过夜。一抗孵育后的NC膜经TTBS清洗三次, 每次10min。随后在碱性磷酸酶标记的二抗中孵育1h, 膜清洗后用NBT/BCIP系统进行显色。

1.2.5 重组人FGF8a活性检测

按文献方法进行[6], 将NIH3T3细胞以500个细胞/孔接种于96孔培养板, 在含10%胎牛血清DMEM培养基中过夜培养后, 去除未贴壁细胞, 并向每孔中加入100μl的新鲜培养液。实验组中培养液中加入800μg/ml纯化后的FGF8蛋白, 空白对照加入等体积的PBS溶液, 每组实验重复5个复孔, 培养24h后MTT法检测细胞增殖情况。

2 结果

2.1 人FGF8a表达载体的构建

利用特异性引物从克隆质粒p Bluescript-FGF8a中扩增出FGF8a全长阅读框序列 (图1) 。扩增片段5′端含Nhe I位点, 3′端含Xho I位点。PCR扩增片段经Nhe I和Xho I内切酶消化后与Nhe I和Xho I双酶切的原核表达载体p ET14b进行连接, 构建人FGF8a表达载体p ET14bFGF8a。表达载体中FGF8a序列在6×His序列下游, 并与之同一阅读框。因此, 表达的重组人FGF8a蛋白N端将带有6×His。表达序列与载体利用酶切技术对重组载体进行鉴定。连接载体经酶切鉴定正确后 (图2) , 进行测序以确定表达序列和阅读框是否正确。

M:DNA分子量标准;泳道1:PCR扩增产物。

M:DNA分子量标准;泳道1:p ET14b质粒经Nhe I和Xho I双酶切;泳道2:人FGF8a片段;泳道3:FGF8a重组表达质粒经Nhe I和Xho I双酶切。

2.2 人FGF8a在大肠杆菌中有表达与纯化

转化了p ET14b-FGF8a质粒的宿主菌BL21 (DE3) p Lys S用1mmol/L IPTG进行诱导表达, 4小时诱导后在预期分子量大小的位置产生明显的蛋白条带 (图3A) 。Western blot鉴定该蛋白条带为重组FGF8a (图3B) 。包涵体经8M脲变性溶解后过Ni亲和柱, 并在柱上在位复性。Ni亲和柱洗脱峰再经Sephacryl S-200分子筛柱纯化。经Ni亲和柱和Sephacryl S-200分子筛柱纯化到的蛋白能被特异性抗原识别 (图4B) , 且纯度达到电泳纯 (图4A) 。

A FGF8a SDS-PAGE分析。M:蛋白分子标准;泳道1:细菌裂解液;泳道2:包涵体。B细菌裂解液Western blot分析。

A人FGF8a纯化样品SDS-PAGE分析。M:蛋白分子标准;泳道1:细菌裂解液;泳道2:Sephacryl S-200分子筛柱纯化洗脱峰;泳道3:Ni Sepharose 6 Fast Flow柱纯化洗脱峰。B纯化样品Western blot分析。

2.3 重组人FGF8a活性检测

FGF在体外具有刺激细胞增殖的能力, 据此特性, 可对FGF的活性进行检测。传代培养24h后的NIH3T3成纤维细胞分别加入纯化后的重组FGF8a (800μg/ml) 和PBS溶液, 利用MTT法检测细胞的增殖情况, 结果显示, 与加PBS对照组相比, 加入重组FGF8a后, NIH3T3细胞分裂增殖显著增加 (图5) 。

3 讨论

众多研究表明, 不同的FGF8亚型在人类胚胎发育过程中, 在多种不同组织中表达, 对器官的发育与形成起着重要作用。为得到大量人FGF8a蛋白用于功能研究, 我们尝试利用大肠杆菌系统表达人FGF8a。结果表明人FGF8a能在大肠杆菌中大量表达, 但重组表达的FGF8a以包涵体形式存在。包涵体中的多肽不具高级构象, 故无生理活性。为使大肠杆菌中表达的FGF8a有生理功能, 可采用两种方式:第一对包涵体中的多肽进行体外复性;第二改变大肠杆菌的表达条件, 增加胞质中可溶性FGF8a的含量[7]。第二种方法虽可避免包涵体复性过程的烦琐, 但也产生了另外的问题, 如表达量不高、增加纯化难度等。在本研究中, 我们采用了柱上在位复性的方式, 发现柱上复性后的FGF8a经洗脱后并不会出现沉淀现象, 且整个复性过程操作简单。因此, 柱上在位复性方式对于某些蛋白复性可能是一种不错的选择。

为方便纯化, 我们在表达的人FGF8a蛋白N端增加了6×His标签, 经Ni亲和柱和凝胶过滤两步色谱纯化后, 重组蛋白纯度能达到电泳纯 (图4) 。纯化的重组人FGF8a处理NIH3T3细胞后, 细胞增殖能力与对照相比明显增加, 表明N端融合6×His标签的人FGF8a具有生理功能。

摘要：目的 :研究人成纤维细胞生长因子8 (FGF8) 在大肠杆菌中的表达。方法 :利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人FGF8a亚型蛋白, 利用亲和色谱和凝胶过滤技术对包涵体中的重组人FGF8a进行纯化, 通过柱在位复性方式对重组人FGF8a进行复性。结果:柱在位复性的方法能很好的对人FGF8a进行复性, 纯度达到电泳纯。纯化后的FGF8a蛋白能刺激NIH3T3细胞增殖, 表明具有生理功能。

关键词：人成纤维细胞生长因子8a,表达,纯化,复性

参考文献

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