卵母细胞成熟（精选8篇）
卵母细胞成熟 篇1
I Y U O H S U M U X N A U H IC S
1 钙振荡
几乎所有的生理活动都受Ca2+的调控。钙离子在生命的开始就触发受精过程, 控制细胞发育和分化成为特定类型的细胞, 然后调节细胞的各种生理活动, 最后参与细胞凋亡过程。
迄今为止研究的所有动物卵母细胞在受精时, 都有一个共同的现象, 即胞质游离Ca2+浓度从静息状态的40~100 nmol/L升高至600~1 000 nmol/L水平, 并以波的形式从精卵结合点向卵子的其他部位扩展。在哺乳动物受精诱导的Ca2+浓度变化表现为有规律的跃升, 即Ca2+波动或振荡, 而非哺乳类受精诱导的卵内游离Ca2+浓度仅表现单一升高。Carroll和Swann在l992年王晓丽, 辛立江, 成俊萍, 潘红平, 石德顺*
(广西大学动物科学技术学院, 广西南宁530005)
首次报道在小鼠卵母细胞体外自发成熟过程中存在自发的Ca2+波动, 周期约1~3 min, 持续1~2 h。同时, 发现另一种对thimerosal敏感的钙离子波, 它们均可导致GVBD前卵母细胞内Ca2+波动的产生。Li等在小鼠卵母细胞成熟分裂过程中观察到另外一种Ca2+的波动, 其周期约10 min, 持续1 h, 这种形式的Ca2+波动与GVBD的发生相关联, 不发生GVBD的卵母细胞不出现这种形式的Ca2+波动。许多研究证实, 哺乳动物精子获能和顶体反应过程中伴随着Ca2+内流, 使细胞内游离Ca2+呈现多次有规律的脉冲升高, Ca2+在精子获能和顶体反应过程中起着主导作用。且有大量报道在卵激活时存在Ca2+的波动。邓满齐等证实乙醇、电刺激等多种激活方法都会引起胞质Ca2+升高。Vitullo等通过人工激活卵母细胞可使胞质Ca2+重新分布, 呈现脉冲升高。
目前认为引起钙振荡的机制有两种:一是认为钙库排空后对IP3和Ryanodine的敏感性立即降低, 使排空的钙库对外来的连续刺激产生一个不应期。与此同时钙库排空后开启质膜上的Ca2+通道使胞外Ca2+内流。胞外Ca2+内流后, 使排空的钙库再次充盈并恢复对IP3和Ryanodine的敏感性, 从而引起第二次Ca2+释放。这种周而复始的过程导致胞质Ca2+浓度有规律地波动。此外, 还有人认为, 当外界的信号与钙蛋白结合的受体或结合酪蛋白激酶的受体作用, 使细胞内磷酯酶C (PLC) 水解4, 5-二磷酸磷酯酰肌醇 (PIP2) 产生IP3, IP3与细胞内Ca2+库的受体结合, 激动贮存的Ca2+的释放或引起外Ca2+的流入。当细胞内游离Ca2+的水平超过一定阈值细胞内钙库又吸收胞质中的Ca2+, 引起细胞内Ca2+的波动。但是胞质Ca2+波动的机制目前仍处于假说阶段, 有许多问题还没有解决。
2 钙离子的检测方法
细胞内的钙以三种方式存在: (1) 牢固地结合在细胞结构成分或大分子上。 (2) 以离子形式自由状态存在于细胞中, 即细胞内游离钙。 (3) 与高容量低亲和的钙结合蛋白松弛的结合而存于质网、线粒体等胞内钙库中, 当信号传来时能将钙释放入胞浆中成为游离钙。最初人们一直难以找到好的方法测定钙浓度, 这主要是由于细胞内游离钙浓度很低;且没有合适的探针既可导入细胞和Ca2+很好地结合又不损伤细胞。第一次测定活细胞钙浓度是60年代用水母发光蛋白测定巨肌肉细胞中的钙浓度。70年代出现了两类方法:双偶氮吸光染料法和钙选择性微电极法。1982年出现了荧光法;随后, 荧光染料不断更新, 各种方法不断增多。这的确为我们提供了方便, 但倘若选择方法不恰当, 将影响实验的准确性;因此在研究时选择合适的测定方法显得尤为重要。目前常见的检测方法有:Ca2+活化的发光蛋白法、偶氮染料法、钙离子选择性微电极测定法、放射示踪法、核磁共振法 (NMR) 、荧光标记法。
3 卵母细胞成熟分裂过程中Ca2+的研究现状
哺乳动物卵母细胞成熟和卵受精过程是Ca2+依赖的, 且在卵的激活方面起着主导作用。自从1992年Carroll和Swarm首次报道在小鼠卵母细胞体外成熟分裂过程中存在自发的Ca2+波动后, 许多研究者对其进行了大量的实验研究。研究表明, 钙与卵母细胞GVBD的关系的解释具有争论性。Tombes发现小鼠卵母细胞GVBD的发生不依赖细胞内钙的变化。王晨光, 邓满齐通过研究也得到相同的结论, 认为GVBD的发生是不依赖于Ca2+变化的事件。而Li等在小鼠卵母细胞成熟分裂过程中观察到的Ca2+波动与GVBD的发生相关联, 不发生GVBD的卵母细胞不出现这种形式的Ca2+波动。Carroll等用heparin拮抗IP3均导致牛和猪卵母细胞的GVBD的抑制, 认为卵母细胞发生GVBD是依赖Ca2+的。另外, 外钙与卵母细胞GVBD发生之间的关系, 许多学者仍持有不同意见。有研究报道小鼠的卵母细胞在无Ca2+的培养基中培养2 h, 就几乎不能存活, 除非卵母细胞先在含Ca2+的培养基中培养中培养2 h, 使成熟分裂恢复, 说明小鼠卵母细胞只有外钙存在时才可发生GVBD。通过使用钙离子通道阻断剂-rerapamil和钙离子载体A23187等手段来研究细胞外钙的作用发现, 有些种类的卵母细胞在缺Ca2+的培养基中, 对减数分裂的恢复没有明显的影响。但实验都是在添加血清的条件下进行的, 也许血清中所含的少量Ca2+足以使减数分裂恢复。对细胞外钙作用的相互矛盾的报道, 可能是实验方法造成的误差, 或是不同种类卵母细胞对Ca2+的敏感性不同所造成的。王晨光, 邓满齐等用BAPH/AM鳌合小鼠细胞内的钙离子会使染色体的向极运动不能发生, 抑制排出第一极体。李明文等在小鼠GVBD后的发育过程中, 通过焦地酸钾原位定位法得到, 此时在纺锤体两极区域有较多的Ca2+分布, 可能与染色体的向极运动有关。
越来越多的研究表明, 无论是受精还是人工刺激, 细胞内游离Ca2+浓度升高是卵激活的初始信号。据报道, 仓鼠GV期卵受精诱导的Ca2+波动振幅仅为成熟卵的1/20, 但对于小鼠GV期卵受精诱导Ca2+波动则报道不一。邓满齐等对小鼠卵母细胞不同发育时期受精诱导Ca2+波的研究发现, MI期及MII期卵受精诱导Ca2+波动的振幅明显高于GV期卵, 且认为Ca2+波的产生源于钙库Ca2+的释放, 可兴奋性的不同可能与钙库Ca2+释放的敏感性有关。另外, 人工激活刺激亦能诱导卵母细胞产生受精样Ca2+变化。邓满齐, 范必勤等证实, 乙醇、钙离子载体A23187、电刺激等多种激活方法都会引起胞质Ca2+升高, 且用乙醇刺激MII期卵母细胞可诱导胞质游离Ca2+浓度多次升高;单次电刺激仅可诱导Ca2+浓度单次升高;多次电刺激则诱导Ca2+浓度多次升高, 并与之形成一一对应关系。这与兔上的实验结果一致。刘红林等通过向小鼠卵内注入Ca2+而引起卵激活, 说明Ca2+浓度升高在卵母细胞激活中有重要作用。
Ca2+与卵母细胞成熟机制的关系在某些动物如牛、猪、小鼠、仓鼠等已进行了研究, 但在许多动物上仍未有报道。国内外学者对小鼠卵母细胞成熟过程中Ca2+变化机制方面做了大量的工作, 并取得了一定研究成果。Homa等向牛的卵母细胞注射IP3可动员细胞内的Ca2+从钙库释放, 而解除c AMP对卵母细胞发育的抑制作用。苏友强、夏国良等分别对猪也有研究报道, 而对水牛卵母细胞成熟过程中Ca2+研究未见有报道。■参考文献 (略)
卵母细胞成熟 篇2
关键词：卵泡直径；绵羊；卵母细胞；孤雌激活
中图分类号： S826.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0141-04
随着哺乳动物体外受精、克隆、转基因等生物技术研究的不断深入，对动物卵母细胞的数量、质量要求越来越高。目前，胚胎体外生产（in vitro production，IVP）的卵母细胞主要来源于屠宰场收集的卵巢，由于屠宰动物的年龄及卵巢表面卵泡的大小等存在差异，培养后获得的胚胎质量也有很大差异[1]，一般收集的卵泡卵母细胞囊胚率都很低[2]。与体内自然成熟的卵母细胞相比，体外培养的卵母细胞成熟率、受精率和早期胚胎发育能力呈现不同程度的下降趋势。在体内，卵母细胞在卵泡内发育成熟，作为卵母细胞的生长环境，卵泡的大小对卵母细胞的成熟和后期发育潜力起着至关重要的作用[3]。Crozet等早期报道，不同直径卵泡中的卵母细胞发育能力不同，所以研究卵泡大小对后期发育潜力的影响十分必要[4]。目前，国内外很多研究者只报道了山羊[5-6]、牛[3]的卵泡大小对卵母细胞发育的影响，且国内还未见对绵羊的报道。本研究分析卵泡直径对卵母细胞的回收效果、比例分布以及对卵母细胞直径、谷胱甘肽（GSH）含量和体外发育能力的影响，以期为胚胎工程中卵子的来源和选择提供基础依据，并提高体外生产胚胎的水平。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品及试剂 本研究所用化学试剂除特殊说明外均购自Sigma公司；培养用胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（NEAA）购自Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）购自Bovogen公司。
1.1.2 卵巢采集 卵巢采集于新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市华凌屠宰场。母羊屠宰后立即剖腹取出卵巢，置于37～38 ℃含青霉素、链霉素（双抗）的生理盐水中，2～3 h内送至实验室；用约38.5 ℃、含有双抗的生理盐水洗涤2～3次，以灭菌的吸水纸吸干后，用带9号针头的吸有1～2 mL抽卵液的10 mL注射器分别抽取<2 mm（小卵泡）、2～5 mm（中卵泡）、>5 mm（大卵泡）的卵泡中的卵泡液；分别在体式镜下挑选出卵丘细胞包裹3层以上、结构致密的卵母细胞-卵丘细胞复合体（cumulus oocyte complexes，COCs），移入抽卵液中洗3次。
1.2 方法
1.2.1 卵母细胞的体外成熟培养 将各组卵母细胞分别用抽卵液洗涤3次后，再用体外成熟（in vitro maturation，IVM）液洗涤3次，按20～30枚/滴移入100 μL提前5～6 h平衡好的IVM液滴内，在38.6 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下进行成熟培养。液体配制如下：抽卵液：Hepes-199+2%FBS+ 6 U/mL 肝素钠+100 U/mL双抗；IVM：TCM199+0.05 U/mL FSH+10%FBS+1 μg/mL雌激素+10 ng/mL EGF+0.1 mmol/L半胱胺酸+24.2 mg/mL丙酮酸钠+100 U/mL双抗。
1.2.2 去除卵丘细胞 卵母细胞成熟培养22～24 h后，将卵母细胞在含0.1%透明质酸酶的Hepes-199中用吸管反复吹打去除全部卵丘细胞，在体视镜下挑出排出第一极体的卵母细胞用于后期培养，并统计体外培养成熟率。
1.2.3 卵母细胞孤雌激活 挑选出有极体且细胞质均匀的卵母细胞在含5 μmol/L离子霉素（ionomycin）的激活液中激活4 min，经2 mmol/L 6-DMAP培养液洗2次后，移入含 6-DMAP 的培养液内培养2 h，培养液洗涤3次后移入含有 600～700 μL 体外培养液的四孔培养板中培养，CO2箱培养条件为38.6 ℃、5%CO2、5%O2、90% N2及饱和湿度，培养 48 h 后统计卵裂率，培养6～8 d统计囊胚率。
1.2.4 囊胚Hoechst细胞染色 取7 d的囊胚，将囊胚转移到含10 μg/mL Hoechst33342的抽卵液内避光孵育7～10 min，再将囊胚转移到载玻片上，尽量少带液体，盖上盖玻片，用凡士林封片，在倒置显微镜的紫外光下进行细胞计数。
1.2.5 数据统计 数据采用SPSS 13.0统计软件的 One-way ANOVA方法进行分析。
2 结果与分析
2.1 不同卵泡直径的比例
随机从一批卵巢中抽取约40个卵巢进行样本统计，分成3种卵泡，卵泡直径<2 mm（小卵泡）、2～5 mm（中卵泡）、>5 mm（大卵泡）3组间差异极显著（P<0.01）（表1）。
2.3 不同直径卵泡中卵母细胞直径的比较
抽取不同直径卵泡的卵母细胞，培养24 h后分别脱卵丘后使用尼康（NIS-Element D3.1）系统软件进行直径测定，结果如图1所示，中卵泡和大卵泡卵母细胞的直径差异不显著（P>0.05），但均极显著高于小卵泡卵母细胞的直径（P<001）。
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2.4 不同直径卵泡中卵母细胞GSH含量的比较
抽取不同直径卵泡的卵母细胞，培养24 h后分别脱卵丘后进行GSH含量测定（采用江苏碧云天公司生产的GSH和GSSG检测试剂盒），结果如图2所示，随着卵泡直径增大，GSH含量增加，中卵泡和大卵泡卵母细胞的GSH含量差异不显著（P>0.05），但均显著高于小卵泡卵母细胞的GSH含量（P<0.05）。
2.5 卵泡直径对卵母细胞体外培养的影响
为了比较卵泡直径对卵母细胞体外培养效果的影响，将回收的3组卵泡卵母细胞分别成熟培养并孤雌激活，结果如表3所示，小卵泡卵母细胞的成熟率极显著低于中卵泡卵母细胞（P<0.01），也显著低于大卵泡卵母细胞（P<0.05）；3组卵泡卵母细胞卵裂率差异不显著（P>0.05）；小卵泡卵母细胞囊胚率极显著低于中卵泡和大卵泡（P<0.01），后两者之间差异不显著（P>0.05）；中卵泡卵母细胞囊胚细胞总数显著高于小卵泡（P<0.05），与大卵泡差异不显著（P>0.05）。
3 讨论
3.1 卵泡直径对卵泡比例分布的影响
同一卵巢上的卵泡比例分布还未曾有人报道。绵羊是常见的季节性发情动物，其最主要的发情时间集中在9—12月。由于受日照时间和体内激素水平的影响，在非繁殖季节和繁殖季节，卵巢表面的卵泡大小有所不同。非繁殖季节主要为中、小卵泡，中、大卵泡通常在每个卵巢上最多只有2个[7]。本研究结果表明，同一卵巢表面小卵泡（小于2 mm）占的比例较多，随着卵泡直径增大，中卵泡（2～5 mm）和大卵泡（大于5 mm）占的比例越来越少，小卵泡、中卵泡和大卵泡3组间差异极显著，这可能是因为本试验是在非繁殖季节所统计。
3.2 不同卵泡直径对卵母细胞回收效果的影响
田长永等报道，山羊不同直径卵泡卵母细胞的回收率无差异，但在可用率方面，大卵泡卵母细胞极显著高于小卵泡[6]，本研究结果与该结论一致。随着卵泡直径的增大和体内激素的变化，卵泡腔变大，卵泡液增多，颗粒细胞将卵母细胞包裹得更加紧密[8]。本研究中，随着卵泡增大，回收率和可用率都在增加，仅个别的卵母细胞有退化现象，这与Heighington等的研究结果[9]基本一致，大卵泡的回收率和利用率达到最高，同时也发现小卵泡卵母细胞极易抽成裸卵。究其原因，一是小卵泡的卵泡液较少，卵丘卵母复合体（COCs）和周围的卵巢组织联系比较紧密，大部分颗粒细胞和卵泡相连，在抽吸的过程中易于抽裸，而大卵泡卵泡液较多，仅有一小部分颗粒细胞和卵泡相连，卵母细胞接近游离状态，易于回收；二是大卵泡的卵泡液较多，在抽吸的过程可能会起到一定缓冲作用，减少了针头对COCs的机械损伤，而小卵泡卵泡液较少，损伤程度可能较大，所以大卵泡和中卵泡的可用率明显高于小卵泡。这说明卵泡直径显著影响卵母细胞的回收利用效果。
3.3 不同直径卵泡内卵母细胞直径、GSH含量与卵母细胞成熟的关系
有许多研究者认为，卵母细胞的直径大小也是其成熟的指标之一。Anguita等报道，卵母细胞直径比卵泡直径更能反应其成熟和发育能力[10]。Izumi等报道，猫体内卵母细胞与卵泡同步发育[11]。在早期，Crozet等报道，卵母细胞只有达到一定直径（家畜约110 μm）后才获得完成减数分裂发育到MⅡ期的能力[4]，牛直径110 μm、猪直径l15 μm 的卵母细胞可以完成减数分裂发育至核成熟[12]。本研究结果表明，培养24 h后，随着卵泡的增大，卵母细胞直径有所增加，中卵泡卵母细胞的直径（115.5 μm）比大卵泡卵母细胞的直径（115.1 μm）长约0.4 μm，但都极显著大于小卵泡卵母细胞的直径（111.8 μm），与早期报道的牛的卵母细胞直径长度[12]基本一致。在成熟率上，小卵泡卵母细胞极显著低于中卵泡卵母细胞，并显著低于大卵泡卵母细胞，小卵泡卵母细胞直径和成熟率都低于中卵泡和大卵泡，可见卵母细胞直径的大小可以间接反映其成熟情况。此外，也有研究者认为体外成熟后卵母细胞内GSH含量也可作为卵母细胞胞质成熟的标志[13]。Abdoon等研究表明，培养后排第二极体卵母细胞的GSH含量明显高于未成熟的卵母细胞[14]。本研究结果表明，小卵泡卵母细胞内GSH含量显著低于中卵泡和大卵泡，结合上文提到的各组间卵母细胞的成熟率，说明卵泡卵母细胞内GSH含量也是其成熟的重要指标之一。
3.4 卵泡直径对卵母细胞体外培养效果的影响
在体内，随着卵泡直径增大，RNA逐渐在卵母细胞内蓄积，只有在较大的卵泡（≥2 mm）中卵母细胞才能储存足够量的RNA，以维持随后的体外受精和发育。小于2 mm卵泡内的COCs因周围环境中缺乏某些因子而限制了后期的发育[15]。早期Crozet等对山羊的研究结果显示，直径小于 3 mm 卵泡卵母细胞能完成体外成熟和体外受精，但受精卵一般只能发育到8细胞期或16细胞期，而大卵泡卵母细胞受精卵基本都能发育到桑葚胚或囊胚[4]。本研究结果表明，在成熟率上，小卵泡卵母细胞极显著低于中卵泡卵母细胞，并显著低于大卵泡卵母细胞，与Feng等的研究结果[15]类似。同时，本研究发现小卵泡卵母细胞在体外成熟培养时，死亡现象明显多于中、大卵泡卵母细胞，可能是因为小卵泡卵母细胞体内的RNA或其他物质合成储存不足，不适宜培养，而直径较大卵泡卵母细胞在体内已趋于易于成熟的阶段；但是并没有出现像Pavlok等提出的过度成熟而导致的老化现象[16]。在卵裂率上，随着卵泡直径增大，卵裂率增加，但各组间无显著差异，这与Crozet等的结果[4]不符，可能是因为本试验做的是孤雌激活，没有做体外受精，还有可能是由山羊与绵羊之间的物种差异造成的。在囊胚率上，随着卵泡直径增大，囊胚率升高，中、大卵泡卵母细胞之间差异不显著，但都极显著高于小卵泡卵母细胞，即小卵泡卵母细胞基本获得了核成熟能力（排第二极体），能够完成受精和卵裂；但只有中、大卵泡卵母细胞才能进一步支持受精卵发育到囊胚，这与Han等[17]、Crozet等[4]的研究结果类似。此外，很多研究者在做卵泡直径对卵母细胞体外培养的影响研究时，基本都只是培养到囊胚阶段，而在本研究中又继续对囊胚Hoechst细胞染色。早期Brison等研究表明，囊胚细胞数是评价胚胎发育质量的一个重要指标，内细胞数越多越易于附植和妊娠[18]。本研究结果显示，中卵泡卵母细胞的囊胚细胞总数显著高于小卵泡组，但与大卵泡组差异不显著。本研究结果比牛[19]、小鼠[20]未分卵泡直径但利用BCB筛选、体外受精的对照组囊胚总细胞数高，主要原因可能是孤雌激活的囊胚细胞总数本身就比体外受精的高（本实验室得到孤雌激活的囊胚细胞总数比体外受精的高），也有可能是不同物种的差异造成，具体原因还需继续研究。可见卵泡直径对卵母细胞体外培养效果有显著影响，中、大卵泡的卵母细胞有更大的体外发育潜力。
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4 结论
综上所述，本研究认为，同一卵巢的表面可回收利用的卵母细胞数量有限，卵巢表面卵泡直径≥2 mm的卵母细胞可以作为卵子的主要来源，并且能够生产大量的体外胚胎，为胚胎工程提供重要依据；但<2 mm卵泡卵母细胞的利用价值不高的原因还需进一步从分子的角度继续深入研究。
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卵母细胞成熟 篇3
关键词：兔,卵母细胞,体外成熟,保存温度,运输时间,季节
随着体外受精技术和胚胎移植技术在生产应用中的快速发展以及体细胞核移植和转基因等胚胎工程技术的深入开展,如何稳定地获得高质量的成熟卵母细胞已经成为该领域中一个极其重要的问题。目前,主要依靠超数排卵后用手术的方法从输卵管获得成熟的卵母细胞。但是单纯依靠超数排卵技术获得卵母细胞需要使用激素,不但费用昂贵,试验过程中还需要大量的人力和物力,而且获得的卵母细胞数量有限。而采集屠宰场废弃的兔卵巢,回收其卵母细胞用于体外成熟培养,获得可以用于体外受精、单精子注射和转基因克隆的成熟卵子,这种方法成本低、取材方便,能满足大批量生产体外胚胎的需求,但卵巢的收集和运输往往需要较长的时间,同时屠宰大多数都在夜间进行,给后续的工作带来诸多不便。如果能够建立良好的卵巢保存体系,使其在一定时间内的储存不对卵母细胞的体外成熟和成熟后的发育能力造成不利影响,就能为相应的研究工作和生产应用带来极大的便利。针对以上存在的问题,本研究就兔卵巢运输时的保存温度、运输时间等因素对卵母细胞体外成熟及发育的影响及体细胞核移植技术的实际应用进行了初步研究,旨在获得更多高质量的卵母细胞,为体外受精、转基因、体细胞核移植等胚胎工程技术的研究奠定基础。
1 材料
试验所用试剂除TCM-199购自Gibco公司外,其余均购自Sigma公司。
洗卵液和胚胎培养液(CM):TCM-199+5 mmol/L HEPES+26.2 mmol/L NaHCO3+3%发情牛血清(OCS)。
卵母细胞(COC)体外成熟培养液(M):TCM-199+5%(OCS)+0.2 μg/mL促卵泡素(FSH)+20 ng/mL上皮细胞生长因子(EGF)+5 μg/mL促黄体素(LH)+3.5 μg/mL催乳素(PRL)。
所有培养液均添加60 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素,用1 mol/L NaOH溶液将pH值调至7.4,并用孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤消毒。
2 方法
2.1 兔卵巢的收集
试验所用兔卵巢均来自南宁市淡村市场当日清晨屠宰的母兔。在不同季节,母兔宰杀后,将兔卵巢取出分别置于含有K+、Ca2+、Mg2+的20～30 ℃、31～35 ℃、36～40 ℃的生理盐水的保温瓶内,分别在>3 h、≥3～≤4 h、>4 h送到实验室。
2.2 卵母细胞的收集
剪去卵巢周围多余的系膜、脂肪、输卵管等,先用加有双抗的生理盐水反复清洗卵巢,放入75%乙醇中浸泡30 s;再用PBS洗3次,置于装有经过平衡的CCM液的玻璃皿中,用1 mL注射器的针头将卵巢表面的可见卵泡刺破,使卵母细胞流出,迅速在实体显微镜下捡卵。
2.3 卵母细胞的分级选择及体外成熟
卵母细胞的类型通常是以形态学进行分类的:A类为由致密的卵丘细胞层完全包裹的卵子;B类为卵丘细胞层不完全包裹的卵子;C类为完全裸露的卵子,亦称为裸卵。在实体显微镜下,用玻璃吸管选择色泽均匀、大小均一并有完整或部分致密卵丘细胞的卵母细胞,即A、B级卵母细胞,弃去空泡化、色泽不均的卵母细胞及裸卵,然后用洗卵液将选出的卵母细胞清洗2次后,根据试验设计分组放入装有成熟培养液的玻璃平皿中,在38.5 ℃、5%CO2和最大饱和湿度的培养箱中培养22～24 h。
2.4 卵母细胞的体外成熟鉴定
主要通过卵母细胞形态观察来判断成熟情况,正常成熟的卵母细胞胞质均匀,没有空泡,其周围的卵丘细胞发生扩散,呈放射状排列。先将卵母细胞放入0.1%的透明质酸酶中,用玻璃吸管轻轻反复吹打,使周围颗粒细胞脱落,之后将卵母细胞放入洗卵液洗3次,最后在实体显微镜下观察统计。判断标准:胞质完整、均匀,且能观察到第一极体排出的为成熟卵母细胞。
2.5 数据的统计分析
每个试验至少重复3次,所得试验数据均用卡方(χ2)分析,P< 0.05判定差异显著。
3 结果
3.1 不同保存温度对兔卵母细胞体外成熟培养效果的影响(见表1)
注:同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。
从表1可以看出,温度对卵母细胞体外成熟的影响很大,25～30 ℃保存的兔卵巢中的卵母细胞成熟率可达61.09%,显著高于温度为31～35 ℃和36～40 ℃两组(26.30%和15.79%,P<0.05)。
3.2 不同运输时间对兔卵母细胞体外成熟培养的影响(见表2)
注:同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05),字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
由表2可知,兔卵母细胞成熟率随运输时间的增加而降低,但<3 h和≥3～≤4运回实验室时,卵母细胞体外成熟率差异不显著(P>0.05),分别为64.24%和59.64%;但当运输时间>4 h时,成熟率降低到50.23%,与另两组差异显著(P<0.05)。
3.3 不同季节对兔卵母细胞体外成熟的影响(见表3)
从表3可以看出,春、秋、冬3个季节进行兔卵母细胞体外成熟的效果较好,成熟率分别为64.26%、58.37%、64.86%,显著高于夏季32.65%(P<0.05),但3组间差异不显著(P>0.05),春、冬2个季节稍好于秋季。
注:同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05),相同表示差异不显著(P>0.05)。
4 讨论
4.1 卵巢运输时不同保存温度对兔卵母细胞体外成熟的影响
兔宰杀后,在最短的时间内采集卵巢,回收卵母细胞效果最好。但实际上,屠宰场与实验室之间有一定的距离,需要长距离运送,这就存在着卵巢质量受运输温度和时间影响的问题。目前,一般都是保存在含抗生素的生理盐水中,但保存的温度各异。从本试验结果看,兔卵巢运输时保存温度为25～30 ℃时卵母细胞的成熟率显著高于保存在31～35 ℃和 36～40 ℃,保存温度为31～35 ℃的卵母细胞成熟率显著高于36～40 ℃。当温度大于36 ℃时,大部分卵母细胞变形,死卵增多,胞质多数不均匀。Naoi H等[1]研究发现,猫卵巢的储存温度过高会损害卵母细胞减数分裂的能力。从理论上讲,保存温度越接近动物体温越好,即在36～37 ℃的生理盐水中保存卵巢时卵母细胞的成熟应该是最好的,但是从试验数据上看,结果并不是这样的,这可能是因为温度接近动物体温,卵巢代谢活动旺盛,卵母细胞中的物质发生降解造成有害物质积累,另外卵巢在离体的环境中缺乏充足的营养物质供应,使卵母细胞的质量下降较快,当采用和体温相同或更高温度的生理盐水保存卵巢时,卵子受到热应激而影响其成熟后的质量。不同动物卵子对温度的耐受性不同,兔卵母细胞对温度较为敏感,温度过高很容易造成细胞的老化甚至死亡。库尔班·土拉克[2]在研究卵巢运输保存温度对野生梅花鹿卵母细胞体外成熟的影响时发现:梅花鹿卵巢在20～25 ℃保存时,卵母细胞成熟率为77%,且无变形卵子出现;而在10～15 ℃保存时,卵母细胞成熟率为45%,变形率为18%。有学者发现,牛卵巢在37 ℃保存的卵裂率与20 ℃保存相比显著下降;在10 ℃保存30 min就会出现变形卵子。罗光彬等[3]也证实黄牛卵巢保存温度达到36 ℃以上时,卵母细胞的成熟率开始下降。刘青春[4]认为,高温会导致卵巢的新陈代谢加快,卵母细胞可能会过早成熟,而同时产生的大量废物无法及时运出,从而产生毒害作用,致使体外培养时卵母细胞的发育受到不良影响,成熟率下降,降低保存温度可能会避免这些影响,但温度过低也会产生不良影响。因此,在实际运用中,不能因追求在卵巢运回实验室时温度接近体温而一味地提高保存卵巢的初始生理盐水温度,温度下降幅度过大也不利于卵母细胞的成熟。因此,在本研究条件下,卵巢保存温度以25～30 ℃为宜。
4.2 卵巢运输时不同运输时间对兔卵母细胞体外成熟的影响
研究表明,采集到的兔卵巢一般应在4 h内运回实验室,时间太长对卵巢有很大损伤,从而影响卵母细胞的成熟率。本试验也得出了一致的结论,兔卵巢运输时间为4 h以内时,卵母细胞成熟率没有显著差异,而当运输时间大于4 h时,卵母细胞的成熟率显著降低。Wongsrikeao P等[5]研究发现,猪卵巢保存6～12 h,卵巢保存液会产生比卵母细胞多的酸性物质,从而使卵母细胞的pH值下降,导致卵母细胞DNA片段化,不利于卵母细胞的发育。母猪卵巢离体时间的长短直接影响卵母细胞体外成熟及胚胎卵裂率,成熟率和卵裂率均随卵巢离体时间的增加而呈降低趋势。Naoi H等[1]的研究结果表明,为保持卵母细胞的后续发育潜能,猫卵巢在室温下保存不宜超过6 h。Blondin P等[6]的试验结果表明,牛卵巢长时间(7～8 h)保存,会减少卵母细胞体外受精后胚胎的卵裂率和囊胚的形成。进一步的研究表明,卵巢中部分蛋白的变性和DNA的降解对马[7]和猫[8]卵母细胞的发育潜能造成影响。李东伟[9]在研究黄牛的卵母细胞运输时间时认为,卵巢在离体的情况下,卵巢内由于代谢所产生的有毒物以及氧气的供给不足会影响卵母细胞的体外成熟率,运输时间越短越有利于卵母细胞体外成熟培养的成功。何良军等[10]在研究绵羊的卵母细胞成熟时指出,运输时间过长会导致很多卵母细胞老化,生理活动功能降低,虽然对成熟率的影响不大,但会大大降低其体外受精的效果。本试验的结果与以上报道的结果相一致。
4.3 不同季节对兔卵母细胞体外成熟的影响
试验结果表明,季节对于兔卵母细胞体外成熟率有一定影响。春、秋、冬3个季节的卵母细胞成熟率显著高于夏季。分析其原因可能是由于不同季节的水质有差异。另外,虽然兔为四季发情动物,但对于本地区来说,夏天的气温较高,高温会影响母兔的生理机能和繁殖机能,使母兔的发情率大大降低,而在春、秋、冬3个季节兔更易发情。发情季节有大量的卵泡生长,体内的FSH、LH等较高,采集到的卵母细胞经体内激素作用,卵母细胞内产生了更多的激素受体,在体外培养更易成熟。孙桂金[11]在研究中也发现,虽然在发情季节与乏情季节,绵羊卵母细胞在采集数量上差异不显著,但发情季节的卵母细胞成熟率显著高于乏情季节(74.2%、57.3%,P<0.05)。
师如意等[12]在研究中发现,卵母细胞的成熟潜力与季节密切相关,并认为动物在繁殖季节或气候适宜的季节获取的卵母细胞成熟能力较强。因此,在进行兔体细胞克隆等胚胎操作试验时,条件允许的话,可以避开夏天采卵,以防由于卵母细胞成熟质量的降低而影响其发育。
5 结论
总的来说,兔卵巢的保存温度、运输时间和采卵季节对兔卵母细胞的体外成熟培养有很大的影响。兔卵巢保存于25～30 ℃生理盐水中,在4 h内运回实验室为宜;春、秋、冬3个季节经废弃卵巢采集的卵母细胞体外成熟培养质量较好。
参考文献
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卵母细胞成熟 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
实验动物为6～8周SPF级昆白小鼠, 购自重庆市中药研究所。
1.1.2 药品与试剂
PMSG (宁波第二激素制品厂) ;FSH、LH (中国科学院动物研究所) ;其他药品均购自Sigma公司。基础培养液TYH和体外受精获能液T6为实验室自配制。
1.2 方法
1.2.1 GV期卵母细胞的获取
注射10U PMSG 46h后脱臼处死小鼠, 剪取卵巢于另一盛有M2液中的培养皿中清洗三遍后将其尽量剪碎, 分别收集卵丘-卵母细胞复合体 (COCs) 和自然裸卵 (NO) 。
1.2.2 卵母细胞的体外成熟培养
LH和FSH添加浓度分别为为20μg/m L和10μg/m L。体外成熟培养分为两组:不添加生殖激素的TYH和M199。根据实验效果选择更好的培养液添加生殖激素进行研究。卵母细胞放入5%CO2、37℃的二氧化碳培养箱培养16～17h。
1.2.3 精子的采集和体外受精系统
在对体外培养成熟的卵母细胞进行体外受精时, 分别在含有5μg/m L、10μg/m L、15μg/m L、20μg/m L肝素钠和不含肝素钠的获能液中进行, 以研究肝素钠对小鼠卵母细胞体外受精的影响。
1.2.3.1 精子的采集及处理
将公鼠用脱臼法处死, 分离附睾尾剪并剪成若干段后放入培养箱中, 20min后取出培养皿, 在显微镜下用血球计数板统计精子数目。将受精液中的精子密度调整为0.5-1×106/m L后加入受精滴中, 培养17～24h后观察2-细胞胚胎的百分率, 以此作为受精成功与否的标准。
1.3 统计学方法
所有试验数据用SPSS统计软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 不同培养液和生殖激素对GV期卵母细胞体外成熟的影响
2.1.1 M199和TYH对COCs和NO体外成熟的影响
注:上标相同字母表示差异不显著 (P>0.05) , 字母不同表示差异显著 (P<0.05)
由表1可以看出, TYH比M199更加适合做为COCs和NO的成熟培养液, 两者之间差异显著 (P<0.05) 。
2.1.2 单独添加LH、FSH和同时添加LH和FSH对COCs和NO体外成熟的影响
注:上标相同字母表示差异不显著 (P>0.05) , 字母不同表示差异显著 (P<0.05)
由表2可以看出, TYH基础培养液和添加FSH组合两者之间差异不显著 (P>0.05) , 说明单独添加FSH并不能提高卵母细胞的成熟效果。而添加LH和同时添加LH和FSH两组同前两组之间差异显著 (P<0.05) , 同时添加两种生殖激素对卵母细胞的成熟效果最好, 与单独添加LH组相比差异显著 (P<0.05) 。
2.2 体外受精获能液中肝素对卵母细胞受精率的影响
注:上标相同字母表示差异不显著 (P>0.05) , 字母不同表示差异显著 (P<0.05)
由表3可知, 体外受精获能液中肝素对卵母细胞受精率有较大的影响, 在小鼠体外受精获能液中添加10g/mL肝素效果最好。随着肝素浓度的增加, 即当肝素浓度达到15g/mL时, COCs和NO的受精率开始大幅度的下降。结果表明, 在小鼠体外受精获能液中添加10μg/m L的肝素为宜。
3 讨论
3.1 不同培养液对GV期卵母细胞体外成熟的影响
在对GV期卵母细胞进行体外成熟培养时, 使用了TYH和M199为基础培养液, 结果发现以TYH为基础培养液的培养方式更适合于卵丘-卵母细胞复合体 (COCs) 和自然裸卵 (NO) 的体外成熟培养。原因可能是在体外成熟过程中M199的作用主要是通过卵丘细胞来实现的, 而TYH则是直接作用于卵母细胞。因此在进行卵母细胞体外成熟培养时, 选用TYH可以获得更高的卵母细胞体外成熟率。
3.2 LH、FSH以及LH和FSH的联合作用对GV期卵母细胞体外成熟的影响
Masui等人 (1979) 发现LH可以促使两栖动物卵母细胞上的颗粒细胞产生一种类似孕酮的物质 (MIH) , 从而诱导卵母细胞减数分裂的恢复;Goldschmit等人 (1989) 报道, 经过LH处理的卵丘细胞和颗粒细胞中含有P450scc从而诱导颗粒细胞分泌孕酮等类固醇激素。Tsafriri等人 (2005) 认为LH诱导产生的孕酮具有可以促进恢复恒河猴卵母细胞减数分裂的作用, LH参与卵母细胞减数分裂的恢复。
3.3 体外受精获能液中肝素对卵母细胞受精率的影响
Parrish等研究表明, 牛精子至少要在含肝素的获能液中孵育4h才能提高穿卵效果。周佳勃等人研究发现, 山羊精子获能的最佳肝素浓度是50μg/m L。文国艺研究表明, 肝素和咖啡因组合对牛精子获能作用具有协同作用。
4 结论
卵母细胞成熟 篇5
在国内外有关猪卵母细胞体外成熟研究的基础上, 本研究选择若干培养系统、培养时间以及不同发育阶段卵泡卵母细胞为主要研究内容, 进一步探讨其对体外成熟 (极体排出和细胞活力等) 与体外受精影响, 为开展猪胚胎发育生物学和种质资源保存等研究提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 卵巢卵母细胞与卵丘细胞复合
体 (COCs) 的采集和猪卵泡液 (pFF) 制备
自本地屠宰场采集卵巢, 置于25~37℃生理盐水 (含抗生素) 的保温桶中, 3 h内返回实验室。卵巢用生理盐水冲洗3遍, 用干净的纱布拭干。采用10 mL注射器抽吸pFF, 汇集于37℃保温的试管中, 取试管下部滤液, 实体显微镜下分捡, 收集直径2~8mm, 包裹2~4层卵丘细胞的COCs。另取卵巢皮质组织, 于生理盐水中适度剪碎, 滤网过滤, 取滤液置实体显微镜下捡卵, 收集ф<2 mm的COCs。COCs暂时置DPBS中, 待IVM处理;捡卵后留下的pFF (分别为ф2~5mm、ф5~8 mm和ф2~8 mm卵泡类群) 经1 500 rpm/min离心15min, 取上清, 0.22μm滤膜过滤, -20℃冷冻保存, 备用。
1.2 不同COCs IVM系统
1.2.1 不同培养液种类:
成熟培养系统分别为两种, 即添加10%pFF (ф2~8mm) 、10%NCS、69μg/mLL-Cys、10U mLPMSG、10IU/mLHCG、1μg/mL17β-E2以及双抗 (青、链霉素) 各100 IU的改良TCM199培养液和改良NCSU23培养液 (其中以4mg/mLBSA代替10%NCS) 。IVM在35 mm培养皿内进行, 每皿布点5个50μL微滴, 覆盖矿物油, CO2培养箱中预平衡2 h以上待用。选取胞质均匀、包被三层或四层以上致密卵丘细胞的ф2~8 mmCOCs, 分别用TCM199和NCSU23基础培养液洗3遍, 转入相应的预平衡的成熟培养微滴系统中 (3~5枚/滴) , 在5%CO2, 饱和湿度, 39℃条件下培养44 h, 统计分析卵母细胞成熟培养效果。
1.2.2 添加不同pFF:
在改良TCM199培养液中分别添加10%ф2~4 mm、ф5~8mm和ф2~8 mm pFF, 以不添加pFF为对照, 按1.2.1条件条件进行ф2~8 mm卵泡COCs培养, 比较不同发育程度的卵泡pFF对IVM的影响。
1.2.3 添加不同外源激素:
分别选择添加17β-E2 (1μg/mL) 、PMSG (10IU/mL) +HCG (10 IU/mL) 和17β-E2+PMSG+HCG的改良TCM 199培养系统为处理组, 以不添加任何激素为对照组, 其它培养条件与1.2.1相同, 分析比较ф2~8mm卵泡卵母细胞IVM效果。
1.3 不同发育阶段COCs
COCs培养在四孔板上进行, 每孔TCM199成熟液500μL (含3.6 mg/mL丙酮酸钠、0.1%乳酸钠和10%NCS) , 上覆矿物油, 培养箱中预平衡2 h, 备用。分别收集的ф2 mm和ф2~8mm卵泡COCs移入预平衡的培养液内, 每孔<50枚, 培养板置CO2培养箱 (5%CO2的空气, 饱和湿度, 39℃) 内培养44 h, 期间间断取样, 检测卵泡COCs成熟发育状况。
1.4 不同IVM培养时间
选择约ф2~8mm卵泡卵母细胞为试验对象, 设置6个培养时间组, 每组3~4个重复, 培养条件与1.2.1相同, 培养32 h始间隔2 h采样, 观察卵丘细胞扩散状态, 尔后, 用0.1%透明质酸酶的DPBS处理约5 min, 除去卵母细胞周围的颗粒细胞, 实体显微镜下观察PbΙ排出情况。
1.5 体外受精
室温下将10 mL稀释精液 (当日采集的长白猪冷藏稀释精液, 购自句容动物改良站) 置台式离心机内, 1 500rpm/min, 离心5 min, 弃上清液, 精子沉淀加3 mLDPBS混匀沉淀, 重复离心2次。添加mTBM 2 mL, 混匀, 离心弃上清, 再添加2 mL获能液 (含100μg/mL肝素的mTBM) 混匀沉淀, 离心, 弃上清, 轻轻加入2 mL获能液, 离心管45°倾斜置37℃水浴中呈孵育40~60min, 使精子获能。将IVM后含有Pb1的成熟卵母细胞移入培养箱中预平衡过的mTBM液中洗3次, 然后移入CO2培养箱预平衡4 h (5%CO2, 饱和湿度, 39℃) 的mTBM微滴 (50μL) 中 (10枚/滴) , 最后, 取获能精液上清夜 (约1.0×106个精子/mL) 50μL, 加入CO2培养箱中含有卵母细胞的受精微滴中, 体外受精6~8 h。
1.6 胚胎体外短期培养 (IVC)
卵母细胞体外受精处理后, 先将受精卵移出受精液, 转入NCSU23 (含4mg/m LBSA) 基础培养液中洗涤3次, 然后移入培养箱内预平衡2 h以上的NCSU23培养液中培养 (5%CO2的空气, 饱和湿度, 39℃) 48 h。分别置倒置显微镜下观察和评价受精卵卵裂发育状态。
1.7 数据分析
试验数据采用SPSS11.0进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同培养液对卵母细胞IVM的影响
由表1可见, 采用改良TCM 199和NCSU23培养液对卵泡卵母细胞培养44h后卵丘细胞扩散率和第一极体 (Pb1) 排出率未显示统计学差异 (P>0.05) , 故认为该两种培养液系统皆为较理想的培养系统, 可有效地应用于猪有腔卵母细胞IVM。
2.2 pFF对卵母细胞IVM影响
实验结果表明 (见表2) , 与对照组相比较, 添加ф2~5 mm卵泡pFF对COCs卵丘细胞扩散率没有显著差异, 但Pb1排出显著降低;添加ф5~8 mm pFF显著提高了卵丘细胞扩散率和Pb1排出率;而添加2~8 mm (即ф2~5mm和ф5~8 mm混合pFF亦显示出明显地促进COCs成熟作用, 且与5~8 mm组差异不显著 (P>0.05) 。
2.3 外源激素对卵母细胞IVM的影响
表3中所列的数据显示, 与不添加任何外源激素相比较, 单独添加E2对卵丘细胞扩散率和Pb1排出率未表现明显影响;而添加PMSG+HCG或PMSG+HCG+E2的培养液则显著地提高了卵丘细胞扩散率和Pb1排出率 (P<0.05) 。
2.4 不同COCs卵母细胞IVM效果
重复实验表明, COCs经体外培养成熟44 h后, ≤ф2 mm和ф2~8 mm两种卵泡COCs平均卵丘扩散率分别达64.7%和81.4% (P<0.05) , 而Pb1排出率分别为11.8%和50% (P<0.01) , 两者在卵丘细胞扩散率和排出率两个衡量指标上均存在显著差异。这说明本实验中采用的IVM系统仅适合于发育后期 (ф2~8 mm) COCs的成熟培养, 而对发育早期小卵泡 (即≤ф2 mm) COCs的IVM效果较差。
2.5 不同培养时间对卵母细胞IVM的影响
实验中发现 (见表4) , 随着培养时间的适当延长, COCs周围的卵丘细胞呈现出逐渐扩散现象, 培养40 h时扩散率最高, 呈典型辐射状扩散状态, Pb1排出率亦达到最高水平;随着培养时间进一步延长, 卵丘细胞呈现逐步脱落现象, 扩散率亦不断降低, 虽然Pb1排出率降低速率较小, 但已排出的Pb1中退化和崩解的比例明显增加。由此认为, 对于ф2~8 mm COCs的IVM来讲, 在选择使用的改良TCM199培养系统中的最佳IVM时间为40 h左右。
%
注:同一列中标有不同字母的数据表示差异达到显著水平 (P<0.05) , 下同
%
注:大部分卵丘细胞呈不完全扩散, 未发现典型的辐射状扩散状态
注:同一列中标有不同字母的数据表示差异达到显著水平 (P>0.05)
2.6 体外受精卵裂率
多次重复实验表明, 卵母细胞体外成熟培养40 h后, 已排出PbΙ的成熟卵母细胞体外受精后2-细胞卵裂率为20.0%~36.0%, 平均达29.2%以上;4-细胞平均卵裂率达15.3%。本试验中652个卵巢采用抽吸法共采集可用卵母细胞4679枚, 平均每个卵巢可用卵母细胞为7.2枚;根据最初采集的可用卵母细胞数量推算, 每采集3枚卵母细胞可获得1枚2-4-细胞胚胎。
3 讨论
目前, 猪卵母细胞的体外成熟培养主要选择NCSU23和M199两种系统。NCSU23配方简单, 用作猪胚胎发育培养效果较好, 可使猪胚越过体外培养4-细胞阻滞;TCM 199培养液添加外源激素成分后可有效地促进卵母细胞成熟。从经济的角度考虑, 建议大量COCs培养时采用M199粉剂配制的成熟培养液。在人卵母细胞体外成熟培养中, 添加成分E2有利于胞质成熟[3]。但在牛卵母细胞体外成熟培养中, 最初培养时间阶段 (8 h前) 添加E2会引起卵子发育阻滞;而8 h后添加则增加核异常比例;但不影响胞质成熟[4]。本实验在猪卵母细胞卵母细胞体外成熟培养证明, 在含有PMSG和HCG的培养系统中添加E2对卵母细胞成熟发育未发现不良影响, 且添加E2后有利于卵丘细胞的充分扩散。据报道, pFF包含有多种因子, 能够促进卵丘细胞的扩散以及卵母细胞核成熟和受精能力[5], 其中含有的高浓度超氧歧化酶成分对培养中的卵母细胞有显著保护作用[6]。本实验亦取得相似的结果, 但不同发育阶段pFF添加效果有一定的差异。
一般情况下, 猪卵母细胞体外成熟培养需要30~48 h。本研究中, 32 h以后卵母细胞出现Pb1, 40 h成熟率最高, IVM 52 h时部分卵母细胞出现退化现象, 卵周隙明显增大, 超大或超小Pb1增多。目前, 进行动物卵泡COCs体外培养时许多学者往往以卵丘细胞扩散状态作为判断卵母细胞是否成熟的指标, 该指标在大多情况下是比较简单易行的, 可在程度上反映卵母细胞成熟状态。但是, 我们在实验过程中发现猪卵丘扩散度与Pb1的排出率在某些情况下并不一定吻合。因此, 认为应将卵丘细胞扩散和Pb1排出两者结合在一起作为衡量多数动物卵母细胞IVM成熟的指标, 特别是Pb1排出率指标更为重要。
本研究为了获得较多的COCs, 选择卵泡直径2~8 mm内的卵母细胞为主要培养对象。由于不同发育程度卵泡卵母细胞在IVM过程中很难达到同步, 这就需要将不同发育程度的卵母细胞分别培养以更好的达到同步成熟。
国内外有关研究成果表明, 猪体内成熟卵母细胞的体外受精卵裂率可达80%[7], 而IVM卵母细胞的IVF卵裂率一般只有30%~40%, 两者差异很大。要使获得更高的卵裂率, 还需要进一步的从选择培养材料以及培养液成分的改进等多方面因素综合考虑, 以完善整个系统。
本研究对影响猪卵母细胞IVM的主要因素进行了比较与分析, 初步建立了利用屠宰场废弃的猪卵巢为材料进行猪早期胚胎体外批量生产的基本方法。今后的研究重点将进一步改进和完善该项技术路线, 提高各技术环节效率, 并深入探讨体外受精卵裂胚的体外发育能力。该技术与胚胎保存和胚胎移植等相关技术结合起来, 可形成一整套猪胚胎体外生产与繁殖技术, 应用于养猪业科研与生产领域。
摘要：介绍了以屠宰场废弃的猪卵巢为材料, 通过系统技术途径得到猪早期胚胎的基本方法。新鲜的猪卵巢采集后, 25～35℃条件下保存, 在3h内进行卵泡卵母细胞与卵丘细胞复合体 (COCs) 采集与分级, 对COCs中卵母细胞体外成熟 (IVM) 、体外受精 (IVF) 及其受精卵体外发育 (IVD) 等关键技术环节进行了系统地探索, 重点探讨了不同发育阶段 (直径大小) 卵泡卵母细胞、不同培养系统与添加成分以及不同培养时间等关键因素对猪卵母细胞IVM的影响, 并对其IVF卵裂能力进行了比较与评价。实验结果表明, 采用mTCM199作为基础成熟培养系统液, 并添加ф5～8mm卵泡液 (pFF) 和雌二醇 (E2) , ф2～8mm卵巢卵泡COCs经IVM40h可得到较高的成熟率 (66.7%) 和IVF卵裂率 (29.2%) 。本研究初步建立了猪2-4-细胞早期胚胎的体外批量生产技术, 可望进一步改进和完善, 应用于养猪业科研与生产实践。
关键词：猪,卵母细胞,体外成熟,体外受精,卵裂率
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卵母细胞成熟 篇6
1 材料与方法
1.1 试验试剂
h CG与LH均为宁波激素制品有限公司生产。
1.2 卵巢的采集和保存
试验材料为当日屠宰的山羊卵巢。山羊屠宰剖腹后,立即无菌采集卵巢,并保存于37℃灭菌生理盐水中,在2 h内运回实验室。
1.3 卵母细胞的获取
卵巢运回实验室后,去除其表面多余组织,用无菌生理盐水清洗3次。用剪刀剪取卵泡并将卵泡放于盛有PBS的平皿中,用针头刺破卵巢上的卵泡,挑选包有3层以上卵丘细胞的卵母细胞进行体外成熟培养。体外成熟培养采用直径为35 mm的塑料带盖培养皿培养。培养前将500μL培养液倒入培养皿中并放入CO2培养箱中预平衡。培养条件为:37℃,5%CO2,100%湿度,培养24~26 h。基础培养液成分为:TCM 199,HEPES(5.96 mg/m L),Na HCO3(2.2 mg/m L),FSH(0.01 mg/m L),E2(1μg/m L)。
1.4 卵母细胞体外成熟的观察
培养结束后,将卵丘卵母细胞复合物放于0.1%透明质酸酶液中处理2~3 min,去除卵丘细胞,在显微镜下观察第一极体是否存在,以第一极体排出作为卵母细胞成熟的标准。
1.5 试验方法
1.5.1 LH对卵母细胞体外成熟的影响:基础培养液中,LH的终浓度分别为0、5、10、15、20、30μg/m L,将收集的未成熟卵母细胞随机置于其中培养成熟,观察和记录第一极体排出情况。
1.5.2 h CG对卵母细胞体外成熟的影响:基础培养液中,h CG的终浓度分别为0、10、15 IU/m L,,将收集的未成熟卵母细胞随机置于其中培养成熟,观察和记录第一极体排出情况。
1.5.3 LH与h CG的协同作用:一定浓度的LH与5、10、15 IU/m L的h CG共同处理卵母细胞。
2 结果与分析
2.1 不同浓度的LH对山羊卵母细胞体外成熟的影响
注:同一列中,不同小写字母上标为差异显著(P<0.05);相同小写字母上标为差异不显著(P>0.05)
由表1可知,5、10、15μg/m L 3个LH处理组中的卵母细胞培养成熟后,其第一极体排出率均高于对照组,15μg/m L组的集体排出率显著高于对照组;20、30μg/m L两个试验组的第一极体排出率均低于对照组。但差异不显著。各实验组之间5、10、15μg/m L三组的极体排出率无显著差异,20、30μg/m L两组显著低于15μg/m L LH组。结果表明:15μg/m L LH对山羊卵母细胞体外成熟第一极体的排出有促进作用。
2.2 不同浓度h CG对山羊卵母细胞体外成熟的影响
注:同一列中,不同小写字母上标为差异显著(P<0.05);相同小写字母上标为差异不显著(P>0.05)
由表2可知,卵母细胞经体外成熟后,5、10、15 IU/m L h CG处理组的极体率虽略低于对照组,但差异不显著;不同浓度h CG组别之间无显著差异,说明在体外成熟培养液中添加h CG不影响山羊卵母细胞体外成熟是第一极体的排出。
2.3 LH与h CG协同对山羊卵母细胞体外成熟的影响
μg/m L、个、%
注:同一列中,不同小写字母上标为差异显著(P<0.05);相同小写字母上标为差异不显著(P>0.05)
由表3可知,经体外成熟后,在15μg/m L LH基础上添加5、10、15 IU/m L h CG中极体率与不添加h CG(15μg/m L LH)组差异不显著;15μg/m L LH+15 IU/m L h CG的极体率则显著低于所有组。由此表明h CG山羊卵母细胞的第一极体的排出没有明显的促进作用,而且还对其有一定的拮抗作用。15μg/m L LH+15 IU/m L h CG拮抗作用最明显。
3 讨论
在排卵过程中,卵母细胞第一次减数分裂的重新启动到成熟排出第一极体,是由LH峰发出的。LH受体存在于卵泡膜细胞和卵丘细胞上,卵母细胞从卵泡转移到培养液中自发成熟,说明卵泡液中存在卵母细胞成熟抑制因子,LH峰的出现可知了起抑制作用。所以LH对于卵母细胞成熟有促进作用。
到目前为止,h CG对哺乳动物卵母细胞体外成熟的作用尚不完全清楚。有报道认为h CG用于体外成熟的前期处理会增加未成熟卵母细胞的成熟潜力。但从以上试验中,没有看到明显的促进作用,而且还有一定的拮抗作用。有可能是由于h CG竞争性地占用了LH的一部分受体,因此致使一部分LH生理作用未能发挥。
综上所述,在山羊卵母细胞的体外成熟发育过程中,LH可以促进卵母细胞的成熟过程,但与h CG混合使用并不能促进卵母细胞的成熟。由于上述结论是在上述特定培养条件下获得的,所以由此得到的相关结果仍需要进行更深入的研究探讨。
参考文献
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[3]傅国栋,张似青,夏国良.ForskoLin和促性腺激素对猪卵母细胞体外成熟的影响.上海农业学报,2002(1):84～87
卵母细胞成熟 篇7
在关于蛋白酶的研究中,抑制剂是其重要的一部分,蛋白酶抑制剂E-64[Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido(4-guanidino)butane]能够抑制半胱氨酸蛋白酶的活性,同时也能够抑制木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶等。E-64能抑制其他2种哺乳动物半胱氨酸蛋白酶,即组织蛋白酶L和人乳腺癌瘤组织蛋白酶[6,7]。这些研究说明E-64可能是一种有效的蛋白酶抑制剂。国内外研究者通过在成熟培养液中添加不同的物质来促进卵母细胞的体外成熟,提高卵母细胞的质量。梁素丽等[8]在成熟液中添加蛋白酶抑制剂MG-132能够促进重构胚的重编程。鲍建昌等[9]在成熟液中添加丁内酯-Ⅰ对猪卵母细胞孤雌胚胎发育能力和核移植胚胎的发育能力有一定的提高。有研究者通过在成熟液中添加瘦素从而显著提高了卵母细胞体外发育的囊胚发育率[10]。目前,蛋白酶抑制剂E-64用于绵羊、牛等动物卵母细胞体外成熟培养研究报道较多,然而在猪上相关研究较少,且关于在成熟培养液中添加E-64的最佳浓度对猪卵母细胞孤雌胚胎的影响尚未见报道。试验旨在研究不同质量浓度的E-64对猪卵母细胞的体外成熟、孤雌胚胎早期发育的影响,以期完善猪卵母细胞的体外培养体系,为提高猪卵母细胞和胚胎质量以及下一步做转基因猪试验奠定基础。
1 材料
1.1 试验动物
猪卵母细胞,从当地屠宰场收集母猪卵巢,立即置于盛有35~38℃添加100 IU/m L青霉素和链霉素的生理盐水的保温瓶中,2 h内运回实验室。
1.2 溶液的配制
卵母细胞体外成熟液为改良TCM-199:3.05 mol/L D-Glucose,0.91 mol/L Sodium Pyruvate,0.57 mol/L Cysteine,10 ng/m L表皮生长因子(EGF),75μg/m L青霉素,60μg/m L链霉素,10%胎牛血清(FBS),10%猪卵泡液,10 IU/m L人绒毛膜促性腺激素(h CG),10 IU/m L孕马血清促性腺激素(PMSG)。猪体外培养液为PZM-3+3 mg/m L牛血清白蛋白(BSA),洗卵液为TL-Hepes液,电激活/融合液为0.3 mmol/L甘露醇+0.1 mmol/L Ca Cl2·2H2O+0.1 mmol/L Mg SO4·7H2O+0.01%聚乙烯醇(PVA)。自配溶液均使用纯化水并经0.22μm直径滤器(millipore)过滤;培养皿、离心管和注射器等均为无菌包装并仅作一次性使用。
1.3 主要试剂与仪器
TCM-199、FBS,购自Gibco公司;无特殊说明,试剂均购自Sigma公司;拣卵针,由广西大学动物遗传育种与繁殖实验室自制。
2 方法
2.1 不同质量浓度E-64对猪卵母细胞体外成熟的影响
将运回的卵巢用双抗生理盐水冲洗3次。用带针头的注射器抽取卵巢表面3~6 mm卵泡的卵母细胞,在体视显微镜下用自制玻璃吸管吸取带2层以上卵丘细胞且胞质均匀的卵母细胞,在洗卵液中洗3次,再在经平衡4 h以上的成熟液中洗3次。将检出的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)分别移入对照组和含有0,5,10,15,20μmol/L的E-64成熟培养微滴中,置于38.5℃、5%CO2饱和湿度的条件下培养44 h。每个试验均重复3次。卵母细胞的成熟以卵丘细胞扩展良好并排出第一极体作为判定标准。
2.2 卵丘颗粒细胞的去除
用200μL移液枪将经体外成熟后的卵母细胞在含0.1%透明质酸酶的洗卵液中吹打去除卵丘颗粒细胞,再用洗卵液洗3次,备用。
2.3 不同浓度E-64成熟液中卵母细胞成熟情况
将除去卵丘细胞的卵母细胞放在体视镜显微镜下挑选已排出第一极体的卵母细胞。
2.4 成熟液中添加0,10μmol/L E-64对猪卵母细胞核成熟情况
用0.1%透明质酸酶除去卵丘细胞的卵母细胞,置于4%多聚甲醛中,在室温下固定30 min。用含有3.0 mg/m L BSA和0.1 mol/L甘氨酸的PBS(阻断液)洗涤3次固定,每次5 min。随后将卵母细胞放入含有3.0 mg/m L BSA和0.01%Triton X-100的PBS中清洗3次,再将卵母细胞放入含有10μg/m L Hochest33342的DPBS中染色10 min。然后用PBS清洗卵母细胞3次,将卵母细胞置于载玻片和盖玻片间固定并封片,在200倍显微镜下观察卵母细胞核成熟情况。根据染色后极体排出及细胞核情况评估卵母细胞,染色体发育到第二次减数分裂中期即为核成熟。
2.5 猪卵母细胞孤雌激活
将成熟液中添加0,10μmol/L E-64,培养44 h后用0.1%透明质酸酶除去卵丘细胞的卵母细胞,放在体视镜显微镜下挑选已排出第一极体、细胞质均匀的个体,采用电激活处理,即用100 V/mm、80μs、3次脉冲对卵母细胞进行电激活后放入PZM-3中培养,分别于第2天、第7天统计分裂率和囊胚发育率。
2.6 数据的统计分析
利用统计学软件SPSS 17.0对试验数据进行方差分析与t检验分析,数据均以“平均数±标准误”表示。
3 结果与分析
结果见表1~3、293页彩图1。
注:同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05),小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
由表1可知:在成熟液中添加浓度分别为0,5,10,15,20μmol/L的E-64,成熟率分别为63.95%、66.21%、70.31%、62.04%、64.52%。其中0,5,15,20μmol/L组间差异不显著(P>0.05),但成熟液中添加10μmol/L的E-64成熟率显著高于其他试验组,说明成熟液中添加10μmol/L的E-64能显著提高猪卵母细胞的成熟率。
注:同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05),小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
由表2可知:成熟液中添加0,10μmol/L的E-64,孤雌卵母细胞的分裂率差异不显著(P>0.05);但与未添加E-64组相比,成熟液中添加10μmol/L的E-64能显著提高卵母细胞的囊胚发育率(P<0.05)。说明在成熟液中添加10μmol/L的E-64能促进卵母细胞的后期发育能力。
由表3可知,与未添加E-64组相比,在成熟液中添加10μmol/L E-64极显著提高了卵母细胞的核成熟率(P<0.01)。说明成熟液中添加10μmol/L的E-64能显著提高卵母细胞的核成熟率,对促进卵母细胞的核成熟具有显著作用。
注:同列数据肩标小写字母不同表示差异极显著(P<0.01)。
4 讨论
卵母细胞的发育成熟与卵丘细胞密切相关,在卵母细胞的成熟发育过程中卵丘细胞对卵母细胞具有供给营养和保护的重要作用[11],卵丘细胞和卵母细胞之间存在微绒毛结构,氨基酸等小分子营养物质可以直接运输到卵母细胞胞质内从而促进胚胎的发育[12],同时还能诱导有害因子的排出,从而促进卵母细胞的成熟。因此,卵丘细胞的扩散情况常作为卵母细胞体外成熟发育好坏的重要标志之一。猪卵母细胞的退化、死亡主要是通过凋亡来实现的[13]。C.R.Long等[14]对胚胎细胞凋亡进行分析发现,体外胚胎细胞发生凋亡数量和时期显著高于体内发育的胚胎。这可能与某些凋亡基因在体内外的表达产物有差异有关,其作用机制还有待于进一步研究。有研究表明,组织蛋白酶参与了细胞凋亡及增殖等的调节作用[15]。A.Z.Balboula等[16]、A.Bettegowda等[17]研究表明,成熟液中添加E-64能显著降低卵丘细胞、卵母细胞及胚胎的凋亡率。这些研究说明,蛋白酶E-64对卵母细胞的作用方式可能是通过降低卵丘细胞的凋亡或者直接作用卵母细胞从而达到提高卵母细胞的体外发育能力。P.Lonergan等[18]研究表明,判定卵母细胞质量的重要指标是胚胎的发育能力。试验通过在成熟培养液中添加不同质量浓度的E-64发现,E-64能显著提高猪卵母细胞的体外成熟率、胚胎的体外发育能力及孤雌囊胚发育率。
研究表明,随着蛋白酶抑制剂浓度的升高,卵母细胞的成熟率并未一直升高,而是在10μmol/L时达到最优,高浓度的蛋白酶E-64对猪卵母细胞的成熟无显著促进作用,可能是由于蛋白酶抑制剂E-64有低毒作用有关。高浓度的E-64却没有显著降低猪卵母细胞的体外成熟率,可能是由于卵丘细胞对于E-64的低毒性具有一定的屏障作用,保证了卵母细胞体外成熟的顺利进行,其具体作用机制还有待于进一步研究。试验中,E-64能显著提高猪卵母细胞的囊胚发育率却对猪卵母细胞的分裂率影响不显著,说明E-64对猪卵母细胞的后续发育能力有较好的促进作用。
5 结论
卵母细胞减数分裂的调控 篇8
关键词：减数分裂,染色体,纺锤体,细胞骨架,综述
对大部分动物来说, 有性生殖需要两种单倍体配子:精子和卵母细胞的结合。形成这些高度特异性细胞的减数分裂是一个长期过程。对哺乳动物卵母细胞来说, 包含减数分裂, 被称为减数分裂成熟的这个短时期对形成有功能的配子是至关重要的。在这一时期内, 卵母细胞进行两次细胞分裂, 间期不进行DNA复制。这些包含一系列连续事件的分裂被卵母细胞的染色体和细胞骨架控制并具有高度时序性间调控性 (附图) 。微管在第一次减数分裂构成纺锤体和分离的同源染色体, 在第二次减数分裂构成姊妹染色单体。此外, 纺锤体微管和肌动蛋白微丝控制这两次分裂的不对称性。这两次分裂都产生一个称为极体的小细胞和大的卵母细胞, 卵母细胞保持其体积和卵子发生时积累的全部母源储备。在过去几年里, 对卵母细胞减数分裂原理已有进一步理解, 大部分应归功于小鼠卵母细胞体外研究和受精卵胞质提取物体外分析。按照这些近期研究, 我们在此对哺乳动物卵母细胞减数分裂成熟过程中的调控机制做一综述。
1 减数分裂过程简述
小鼠卵母细胞的减数分裂涉及到染色体、纺锤体、细胞皮质以及细胞骨架的变化。附图是小鼠卵母细胞减数分裂的简要过程[1,2], 首先卵巢中的初级卵母细胞停滞在减数分裂第一次分裂前期的双线期, 其中的染色质尚未凝聚;排卵前, 卵母细胞成熟开始的时候, 减数分裂第一次分裂恢复, 细胞核发生生发泡破裂, 染色质凝聚成染色体;纺锤体开始装配;减数分裂第一次分裂中期, 微管在大部分染色体周围放射状聚合并逐渐组织成双极纺锤体, 处于卵母细胞中央区域;经过染色体列队, 所有的染色体排列到赤道板上;中期纺锤体向卵母细胞的周边迁移, 逐渐接近卵母细胞的皮质区域。之后纺锤体继续接近皮质区域, 卵母细胞进一步极化。当纺锤体到达皮质区域时, 减数分裂从中期向后期转化, 同源染色体分开并分别向纺锤体的两极运动。当染色体到达两极, 减数分裂第一次分裂进入末期。胞质分裂完成后, 初级卵母细胞排出第一极体, 卵母细胞变为次级卵母细胞, 减数分裂第二次分裂纺锤体迅速形成。小鼠次级卵母细胞进入减数分裂停滞, 停止在减数分裂第二次分裂的中期, 等待受精。此时的纺锤体位于卵母细胞皮质下, 纺锤体的长轴大致与卵母细胞皮质平行。次级卵母细胞受精后, 减数分裂第二次分裂从中期向后期转变, 姊妹染色单体分开并向纺锤体的两极运动。在两套染色体的上方皮质区域形成两个皮质突出部分。两个皮质突出部分之一继续变大, 而另一个缩小;纺锤体开始转动。当纺锤体转动90°完毕, 简述分裂经过末期和胞质分裂排出第二极体。
2 卵母细胞纺锤体装配依赖染色体
2.1 染色体控制双极纺锤体装配
在有丝分裂过程中, 纺锤体装配很大程度上是被中心体引导的, 而中心体 (Centrosomes) 是微管聚合的主要位点[3]。有丝分裂开始时, 中心体已经复制并且两个中心体分离、迁移到细胞核相对的两侧。结果当核被膜破裂时, 从每个中心体发散生长出微管与染色体联系并迅速组织成双极纺锤体。卵母细胞没有中心体, 从细胞质中被称为微管组织中心的发散位点聚合。在小鼠卵母细胞中多个微管组织中心散布在细胞质中, 染色体引导纺锤体装配。生发泡破裂结束MI开始时, 微管组织中心首先被激活并在染色体附近募集, 而且此区域的微管首先被稳定。微管的随机方向生长被逐渐组织到染色体附近的双极型阵列中。
2.2 染色质控制中期板形成
一旦双极纺锤体装配完成, 染色体排列在纺锤体赤道上并形成中期板。在有丝分裂过程中, 此调整定位是由动粒控制的, 动粒是与染色体的每个姊妹染色单体都关联的结构。动粒捕获、稳定微管并形成坚固的“动粒纤维”。当动粒纤维将染色体的两个动粒连接到纺锤体相对的两极时, 染色体运输到纺锤体赤道。在小鼠卵母细胞第一次减数分裂M期时, 二价染色体排列到赤道板上有备选方案。与有丝分裂不同, 二价体动粒在第一次减数分裂M期的大部分时间不能锚定微管并使之稳定。然而, 动粒纤维缺失时, 二价染色体仍然向着纺锤体赤道板运输并停留在这个区域几个小时。在长时间的前中期之后, 动粒激活触发动粒纤维形成, 使染色体在中期板上精确排列。
3 卵母细胞分裂的非对称性依赖于染色体
3.1 纺锤体运动能力依赖于肌动蛋白和染色体的相互作用
小鼠卵母细胞的减数分裂是非对称性的。这种分裂产生一个被称为极体的小细胞和保持原大小的卵母细胞。这种非对称性是由纺锤体在巨大的卵母细胞的周边定位来确保的。减数分裂第一次分裂纺锤体一般在卵母细胞中心形成并迁移到卵母细胞边缘。第一极体在迁移轴线上排出。减数分裂第二次分裂纺锤体在卵母细胞边缘形成并在中期阻滞时停留在质膜之下。受精或用实验手段激活触发纺锤体旋转和第二极体排出。我们对非称分裂机制的认识源自对有丝分裂细胞的研究, 在有丝分裂中纺锤体定位依赖于细胞皮质和将纺锤体极连接到细胞皮质的“星状”微管的相互作用。卵母细胞没有中心体并且纺锤体没有星状微管:替代机制在卵母细胞纺锤体定位中起作用。与其它物种的卵母细胞相比, 小鼠卵母细胞纺锤体迁移和锚定需要肌动蛋白微丝而非微管[4]。这些过程依赖微丝和染色体自身的原始相互作用, 但此相互作用的分子基础还远未被了解。
3.2 小鼠卵母细胞染色体控制皮质区重组
在小鼠卵母细胞中, 纺锤体偏心位置与卵母细胞皮质区局部重组有关 (附图) 。皮质区在纺锤体迁移过程中出现并维持到减数分裂二期纺锤体之后。重组以微绒毛局部缺失和排出皮质颗粒为标志[5]。微绒毛是质膜下的肌动蛋白微丝积累而成小鼠卵母细胞分裂的非对称性依赖于染色体在肌动蛋白网络重组中的一种原始作用。染色体和肌动蛋白间的直接相互作用控制纺锤体定位。此外, 染色体通过一种“远方”效应介导皮质区肌动蛋白重组。这与染色体在卵母细胞微管组织中的作用有惊人的相似性。染色质相关机动蛋白介导染色体和纺锤体微管间的物理相互作用。此外, 染色体控制它们周围纺锤体装配所需因子的活性。在这些相似性的基础上, 我们假设在小鼠和更多一般哺乳动物卵母细胞巨大的细胞质中, 染色体像“领域界标”一样来组织微管和肌动蛋白微丝。这种空间控制对两次非对称减数分裂是必需的。
4 结论
有功能的雌配子的产生对哺乳动物繁殖是必须的。它很大程度上依赖于卵母细胞两次减数分裂中细胞骨架的动态组织。成熟卵母细胞的形成也依靠微管和肌动蛋白微丝进程。这些进程异常就不能产生有能力的卵母细胞并导致受精问题。同样, 减数分裂的细胞骨架依赖性非对称性地将卵子发生时的母源储备物质留在卵母细胞。
参考文献
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