卵母细胞

卵母细胞（共8篇）

卵母细胞 篇1

摘要：在哺乳动物卵母细胞成熟过程中, 不进行间期DNA复制而连续分裂两次, 所以产生单倍体配子, 即为减数分裂。这两次分裂是不对称的, 以此来保证大部分母源储备物质留在卵母细胞中, 产生大小不同的子细胞。所有这些事件是基于卵母细胞的细胞骨架的动态变化并具有高度的协调性。本文对小鼠卵母细胞的细胞骨架和细胞周期相互作用作一综述。

关键词：减数分裂,染色体,纺锤体,细胞骨架,综述

对大部分动物来说, 有性生殖需要两种单倍体配子:精子和卵母细胞的结合。形成这些高度特异性细胞的减数分裂是一个长期过程。对哺乳动物卵母细胞来说, 包含减数分裂, 被称为减数分裂成熟的这个短时期对形成有功能的配子是至关重要的。在这一时期内, 卵母细胞进行两次细胞分裂, 间期不进行DNA复制。这些包含一系列连续事件的分裂被卵母细胞的染色体和细胞骨架控制并具有高度时序性间调控性 (附图) 。微管在第一次减数分裂构成纺锤体和分离的同源染色体, 在第二次减数分裂构成姊妹染色单体。此外, 纺锤体微管和肌动蛋白微丝控制这两次分裂的不对称性。这两次分裂都产生一个称为极体的小细胞和大的卵母细胞, 卵母细胞保持其体积和卵子发生时积累的全部母源储备。在过去几年里, 对卵母细胞减数分裂原理已有进一步理解, 大部分应归功于小鼠卵母细胞体外研究和受精卵胞质提取物体外分析。按照这些近期研究, 我们在此对哺乳动物卵母细胞减数分裂成熟过程中的调控机制做一综述。

1 减数分裂过程简述

小鼠卵母细胞的减数分裂涉及到染色体、纺锤体、细胞皮质以及细胞骨架的变化。附图是小鼠卵母细胞减数分裂的简要过程[1,2], 首先卵巢中的初级卵母细胞停滞在减数分裂第一次分裂前期的双线期, 其中的染色质尚未凝聚;排卵前, 卵母细胞成熟开始的时候, 减数分裂第一次分裂恢复, 细胞核发生生发泡破裂, 染色质凝聚成染色体;纺锤体开始装配;减数分裂第一次分裂中期, 微管在大部分染色体周围放射状聚合并逐渐组织成双极纺锤体, 处于卵母细胞中央区域;经过染色体列队, 所有的染色体排列到赤道板上;中期纺锤体向卵母细胞的周边迁移, 逐渐接近卵母细胞的皮质区域。之后纺锤体继续接近皮质区域, 卵母细胞进一步极化。当纺锤体到达皮质区域时, 减数分裂从中期向后期转化, 同源染色体分开并分别向纺锤体的两极运动。当染色体到达两极, 减数分裂第一次分裂进入末期。胞质分裂完成后, 初级卵母细胞排出第一极体, 卵母细胞变为次级卵母细胞, 减数分裂第二次分裂纺锤体迅速形成。小鼠次级卵母细胞进入减数分裂停滞, 停止在减数分裂第二次分裂的中期, 等待受精。此时的纺锤体位于卵母细胞皮质下, 纺锤体的长轴大致与卵母细胞皮质平行。次级卵母细胞受精后, 减数分裂第二次分裂从中期向后期转变, 姊妹染色单体分开并向纺锤体的两极运动。在两套染色体的上方皮质区域形成两个皮质突出部分。两个皮质突出部分之一继续变大, 而另一个缩小;纺锤体开始转动。当纺锤体转动90°完毕, 简述分裂经过末期和胞质分裂排出第二极体。

2 卵母细胞纺锤体装配依赖染色体

2.1 染色体控制双极纺锤体装配

在有丝分裂过程中, 纺锤体装配很大程度上是被中心体引导的, 而中心体 (Centrosomes) 是微管聚合的主要位点[3]。有丝分裂开始时, 中心体已经复制并且两个中心体分离、迁移到细胞核相对的两侧。结果当核被膜破裂时, 从每个中心体发散生长出微管与染色体联系并迅速组织成双极纺锤体。卵母细胞没有中心体, 从细胞质中被称为微管组织中心的发散位点聚合。在小鼠卵母细胞中多个微管组织中心散布在细胞质中, 染色体引导纺锤体装配。生发泡破裂结束MI开始时, 微管组织中心首先被激活并在染色体附近募集, 而且此区域的微管首先被稳定。微管的随机方向生长被逐渐组织到染色体附近的双极型阵列中。

2.2 染色质控制中期板形成

一旦双极纺锤体装配完成, 染色体排列在纺锤体赤道上并形成中期板。在有丝分裂过程中, 此调整定位是由动粒控制的, 动粒是与染色体的每个姊妹染色单体都关联的结构。动粒捕获、稳定微管并形成坚固的“动粒纤维”。当动粒纤维将染色体的两个动粒连接到纺锤体相对的两极时, 染色体运输到纺锤体赤道。在小鼠卵母细胞第一次减数分裂M期时, 二价染色体排列到赤道板上有备选方案。与有丝分裂不同, 二价体动粒在第一次减数分裂M期的大部分时间不能锚定微管并使之稳定。然而, 动粒纤维缺失时, 二价染色体仍然向着纺锤体赤道板运输并停留在这个区域几个小时。在长时间的前中期之后, 动粒激活触发动粒纤维形成, 使染色体在中期板上精确排列。

3 卵母细胞分裂的非对称性依赖于染色体

3.1 纺锤体运动能力依赖于肌动蛋白和染色体的相互作用

小鼠卵母细胞的减数分裂是非对称性的。这种分裂产生一个被称为极体的小细胞和保持原大小的卵母细胞。这种非对称性是由纺锤体在巨大的卵母细胞的周边定位来确保的。减数分裂第一次分裂纺锤体一般在卵母细胞中心形成并迁移到卵母细胞边缘。第一极体在迁移轴线上排出。减数分裂第二次分裂纺锤体在卵母细胞边缘形成并在中期阻滞时停留在质膜之下。受精或用实验手段激活触发纺锤体旋转和第二极体排出。我们对非称分裂机制的认识源自对有丝分裂细胞的研究, 在有丝分裂中纺锤体定位依赖于细胞皮质和将纺锤体极连接到细胞皮质的“星状”微管的相互作用。卵母细胞没有中心体并且纺锤体没有星状微管:替代机制在卵母细胞纺锤体定位中起作用。与其它物种的卵母细胞相比, 小鼠卵母细胞纺锤体迁移和锚定需要肌动蛋白微丝而非微管[4]。这些过程依赖微丝和染色体自身的原始相互作用, 但此相互作用的分子基础还远未被了解。

3.2 小鼠卵母细胞染色体控制皮质区重组

在小鼠卵母细胞中, 纺锤体偏心位置与卵母细胞皮质区局部重组有关 (附图) 。皮质区在纺锤体迁移过程中出现并维持到减数分裂二期纺锤体之后。重组以微绒毛局部缺失和排出皮质颗粒为标志[5]。微绒毛是质膜下的肌动蛋白微丝积累而成小鼠卵母细胞分裂的非对称性依赖于染色体在肌动蛋白网络重组中的一种原始作用。染色体和肌动蛋白间的直接相互作用控制纺锤体定位。此外, 染色体通过一种“远方”效应介导皮质区肌动蛋白重组。这与染色体在卵母细胞微管组织中的作用有惊人的相似性。染色质相关机动蛋白介导染色体和纺锤体微管间的物理相互作用。此外, 染色体控制它们周围纺锤体装配所需因子的活性。在这些相似性的基础上, 我们假设在小鼠和更多一般哺乳动物卵母细胞巨大的细胞质中, 染色体像“领域界标”一样来组织微管和肌动蛋白微丝。这种空间控制对两次非对称减数分裂是必需的。

4 结论

有功能的雌配子的产生对哺乳动物繁殖是必须的。它很大程度上依赖于卵母细胞两次减数分裂中细胞骨架的动态组织。成熟卵母细胞的形成也依靠微管和肌动蛋白微丝进程。这些进程异常就不能产生有能力的卵母细胞并导致受精问题。同样, 减数分裂的细胞骨架依赖性非对称性地将卵子发生时的母源储备物质留在卵母细胞。

参考文献

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卵母细胞 篇2

关键词：卵泡直径；绵羊；卵母细胞；孤雌激活

中图分类号： S826.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）03-0141-04

随着哺乳动物体外受精、克隆、转基因等生物技术研究的不断深入，对动物卵母细胞的数量、质量要求越来越高。目前，胚胎体外生产（in vitro production，IVP）的卵母细胞主要来源于屠宰场收集的卵巢，由于屠宰动物的年龄及卵巢表面卵泡的大小等存在差异，培养后获得的胚胎质量也有很大差异[1]，一般收集的卵泡卵母细胞囊胚率都很低[2]。与体内自然成熟的卵母细胞相比，体外培养的卵母细胞成熟率、受精率和早期胚胎发育能力呈现不同程度的下降趋势。在体内，卵母细胞在卵泡内发育成熟，作为卵母细胞的生长环境，卵泡的大小对卵母细胞的成熟和后期发育潜力起着至关重要的作用[3]。Crozet等早期报道，不同直径卵泡中的卵母细胞发育能力不同，所以研究卵泡大小对后期发育潜力的影响十分必要[4]。目前，国内外很多研究者只报道了山羊[5-6]、牛[3]的卵泡大小对卵母细胞发育的影响，且国内还未见对绵羊的报道。本研究分析卵泡直径对卵母细胞的回收效果、比例分布以及对卵母细胞直径、谷胱甘肽（GSH）含量和体外发育能力的影响，以期为胚胎工程中卵子的来源和选择提供基础依据，并提高体外生产胚胎的水平。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品及试剂 本研究所用化学试剂除特殊说明外均购自Sigma公司；培养用胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（NEAA）购自Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）购自Bovogen公司。

1.1.2 卵巢采集 卵巢采集于新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市华凌屠宰场。母羊屠宰后立即剖腹取出卵巢，置于37～38 ℃含青霉素、链霉素（双抗）的生理盐水中，2～3 h内送至实验室；用约38.5 ℃、含有双抗的生理盐水洗涤2～3次，以灭菌的吸水纸吸干后，用带9号针头的吸有1～2 mL抽卵液的10 mL注射器分别抽取<2 mm（小卵泡）、2～5 mm（中卵泡）、>5 mm（大卵泡）的卵泡中的卵泡液；分别在体式镜下挑选出卵丘细胞包裹3层以上、结构致密的卵母细胞-卵丘细胞复合体（cumulus oocyte complexes，COCs），移入抽卵液中洗3次。

1.2 方法

1.2.1 卵母细胞的体外成熟培养 将各组卵母细胞分别用抽卵液洗涤3次后，再用体外成熟（in vitro maturation，IVM）液洗涤3次，按20～30枚/滴移入100 μL提前5～6 h平衡好的IVM液滴内，在38.6 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下进行成熟培养。液体配制如下：抽卵液：Hepes-199+2%FBS+ 6 U/mL 肝素钠+100 U/mL双抗；IVM：TCM199+0.05 U/mL FSH+10%FBS+1 μg/mL雌激素+10 ng/mL EGF+0.1 mmol/L半胱胺酸+24.2 mg/mL丙酮酸钠+100 U/mL双抗。

1.2.2 去除卵丘细胞 卵母细胞成熟培养22～24 h后，将卵母细胞在含0.1%透明质酸酶的Hepes-199中用吸管反复吹打去除全部卵丘细胞，在体视镜下挑出排出第一极体的卵母细胞用于后期培养，并统计体外培养成熟率。

1.2.3 卵母细胞孤雌激活 挑选出有极体且细胞质均匀的卵母细胞在含5 μmol/L离子霉素（ionomycin）的激活液中激活4 min，经2 mmol/L 6-DMAP培养液洗2次后，移入含 6-DMAP 的培养液内培养2 h，培养液洗涤3次后移入含有 600～700 μL 体外培养液的四孔培养板中培养，CO2箱培养条件为38.6 ℃、5%CO2、5%O2、90% N2及饱和湿度，培养 48 h 后统计卵裂率，培养6～8 d统计囊胚率。

1.2.4 囊胚Hoechst细胞染色 取7 d的囊胚，将囊胚转移到含10 μg/mL Hoechst33342的抽卵液内避光孵育7～10 min，再将囊胚转移到载玻片上，尽量少带液体，盖上盖玻片，用凡士林封片，在倒置显微镜的紫外光下进行细胞计数。

1.2.5 数据统计 数据采用SPSS 13.0统计软件的 One-way ANOVA方法进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同卵泡直径的比例

随机从一批卵巢中抽取约40个卵巢进行样本统计，分成3种卵泡，卵泡直径<2 mm（小卵泡）、2～5 mm（中卵泡）、>5 mm（大卵泡）3组间差异极显著（P<0.01）（表1）。

2.3 不同直径卵泡中卵母细胞直径的比较

抽取不同直径卵泡的卵母细胞，培养24 h后分别脱卵丘后使用尼康（NIS-Element D3.1）系统软件进行直径测定，结果如图1所示，中卵泡和大卵泡卵母细胞的直径差异不显著（P>0.05），但均极显著高于小卵泡卵母细胞的直径（P<001）。

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2.4 不同直径卵泡中卵母细胞GSH含量的比较

抽取不同直径卵泡的卵母细胞，培养24 h后分别脱卵丘后进行GSH含量测定（采用江苏碧云天公司生产的GSH和GSSG检测试剂盒），结果如图2所示，随着卵泡直径增大，GSH含量增加，中卵泡和大卵泡卵母细胞的GSH含量差异不显著（P>0.05），但均显著高于小卵泡卵母细胞的GSH含量（P<0.05）。

2.5 卵泡直径对卵母细胞体外培养的影响

为了比较卵泡直径对卵母细胞体外培养效果的影响，将回收的3组卵泡卵母细胞分别成熟培养并孤雌激活，结果如表3所示，小卵泡卵母细胞的成熟率极显著低于中卵泡卵母细胞（P<0.01），也显著低于大卵泡卵母细胞（P<0.05）；3组卵泡卵母细胞卵裂率差异不显著（P>0.05）；小卵泡卵母细胞囊胚率极显著低于中卵泡和大卵泡（P<0.01），后两者之间差异不显著（P>0.05）；中卵泡卵母细胞囊胚细胞总数显著高于小卵泡（P<0.05），与大卵泡差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

3.1 卵泡直径对卵泡比例分布的影响

同一卵巢上的卵泡比例分布还未曾有人报道。绵羊是常见的季节性发情动物，其最主要的发情时间集中在9—12月。由于受日照时间和体内激素水平的影响，在非繁殖季节和繁殖季节，卵巢表面的卵泡大小有所不同。非繁殖季节主要为中、小卵泡，中、大卵泡通常在每个卵巢上最多只有2个[7]。本研究结果表明，同一卵巢表面小卵泡（小于2 mm）占的比例较多，随着卵泡直径增大，中卵泡（2～5 mm）和大卵泡（大于5 mm）占的比例越来越少，小卵泡、中卵泡和大卵泡3组间差异极显著，这可能是因为本试验是在非繁殖季节所统计。

3.2 不同卵泡直径对卵母细胞回收效果的影响

田长永等报道，山羊不同直径卵泡卵母细胞的回收率无差异，但在可用率方面，大卵泡卵母细胞极显著高于小卵泡[6]，本研究结果与该结论一致。随着卵泡直径的增大和体内激素的变化，卵泡腔变大，卵泡液增多，颗粒细胞将卵母细胞包裹得更加紧密[8]。本研究中，随着卵泡增大，回收率和可用率都在增加，仅个别的卵母细胞有退化现象，这与Heighington等的研究结果[9]基本一致，大卵泡的回收率和利用率达到最高，同时也发现小卵泡卵母细胞极易抽成裸卵。究其原因，一是小卵泡的卵泡液较少，卵丘卵母复合体（COCs）和周围的卵巢组织联系比较紧密，大部分颗粒细胞和卵泡相连，在抽吸的过程中易于抽裸，而大卵泡卵泡液较多，仅有一小部分颗粒细胞和卵泡相连，卵母细胞接近游离状态，易于回收；二是大卵泡的卵泡液较多，在抽吸的过程可能会起到一定缓冲作用，减少了针头对COCs的机械损伤，而小卵泡卵泡液较少，损伤程度可能较大，所以大卵泡和中卵泡的可用率明显高于小卵泡。这说明卵泡直径显著影响卵母细胞的回收利用效果。

3.3 不同直径卵泡内卵母细胞直径、GSH含量与卵母细胞成熟的关系

有许多研究者认为，卵母细胞的直径大小也是其成熟的指标之一。Anguita等报道，卵母细胞直径比卵泡直径更能反应其成熟和发育能力[10]。Izumi等报道，猫体内卵母细胞与卵泡同步发育[11]。在早期，Crozet等报道，卵母细胞只有达到一定直径（家畜约110 μm）后才获得完成减数分裂发育到MⅡ期的能力[4]，牛直径110 μm、猪直径l15 μm 的卵母细胞可以完成减数分裂发育至核成熟[12]。本研究结果表明，培养24 h后，随着卵泡的增大，卵母细胞直径有所增加，中卵泡卵母细胞的直径（115.5 μm）比大卵泡卵母细胞的直径（115.1 μm）长约0.4 μm，但都极显著大于小卵泡卵母细胞的直径（111.8 μm），与早期报道的牛的卵母细胞直径长度[12]基本一致。在成熟率上，小卵泡卵母细胞极显著低于中卵泡卵母细胞，并显著低于大卵泡卵母细胞，小卵泡卵母细胞直径和成熟率都低于中卵泡和大卵泡，可见卵母细胞直径的大小可以间接反映其成熟情况。此外，也有研究者认为体外成熟后卵母细胞内GSH含量也可作为卵母细胞胞质成熟的标志[13]。Abdoon等研究表明，培养后排第二极体卵母细胞的GSH含量明显高于未成熟的卵母细胞[14]。本研究结果表明，小卵泡卵母细胞内GSH含量显著低于中卵泡和大卵泡，结合上文提到的各组间卵母细胞的成熟率，说明卵泡卵母细胞内GSH含量也是其成熟的重要指标之一。

3.4 卵泡直径对卵母细胞体外培养效果的影响

在体内，随着卵泡直径增大，RNA逐渐在卵母细胞内蓄积，只有在较大的卵泡（≥2 mm）中卵母细胞才能储存足够量的RNA，以维持随后的体外受精和发育。小于2 mm卵泡内的COCs因周围环境中缺乏某些因子而限制了后期的发育[15]。早期Crozet等对山羊的研究结果显示，直径小于 3 mm 卵泡卵母细胞能完成体外成熟和体外受精，但受精卵一般只能发育到8细胞期或16细胞期，而大卵泡卵母细胞受精卵基本都能发育到桑葚胚或囊胚[4]。本研究结果表明，在成熟率上，小卵泡卵母细胞极显著低于中卵泡卵母细胞，并显著低于大卵泡卵母细胞，与Feng等的研究结果[15]类似。同时，本研究发现小卵泡卵母细胞在体外成熟培养时，死亡现象明显多于中、大卵泡卵母细胞，可能是因为小卵泡卵母细胞体内的RNA或其他物质合成储存不足，不适宜培养，而直径较大卵泡卵母细胞在体内已趋于易于成熟的阶段；但是并没有出现像Pavlok等提出的过度成熟而导致的老化现象[16]。在卵裂率上，随着卵泡直径增大，卵裂率增加，但各组间无显著差异，这与Crozet等的结果[4]不符，可能是因为本试验做的是孤雌激活，没有做体外受精，还有可能是由山羊与绵羊之间的物种差异造成的。在囊胚率上，随着卵泡直径增大，囊胚率升高，中、大卵泡卵母细胞之间差异不显著，但都极显著高于小卵泡卵母细胞，即小卵泡卵母细胞基本获得了核成熟能力（排第二极体），能够完成受精和卵裂；但只有中、大卵泡卵母细胞才能进一步支持受精卵发育到囊胚，这与Han等[17]、Crozet等[4]的研究结果类似。此外，很多研究者在做卵泡直径对卵母细胞体外培养的影响研究时，基本都只是培养到囊胚阶段，而在本研究中又继续对囊胚Hoechst细胞染色。早期Brison等研究表明，囊胚细胞数是评价胚胎发育质量的一个重要指标，内细胞数越多越易于附植和妊娠[18]。本研究结果显示，中卵泡卵母细胞的囊胚细胞总数显著高于小卵泡组，但与大卵泡组差异不显著。本研究结果比牛[19]、小鼠[20]未分卵泡直径但利用BCB筛选、体外受精的对照组囊胚总细胞数高，主要原因可能是孤雌激活的囊胚细胞总数本身就比体外受精的高（本实验室得到孤雌激活的囊胚细胞总数比体外受精的高），也有可能是不同物种的差异造成，具体原因还需继续研究。可见卵泡直径对卵母细胞体外培养效果有显著影响，中、大卵泡的卵母细胞有更大的体外发育潜力。

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4 结论

综上所述，本研究认为，同一卵巢的表面可回收利用的卵母细胞数量有限，卵巢表面卵泡直径≥2 mm的卵母细胞可以作为卵子的主要来源，并且能够生产大量的体外胚胎，为胚胎工程提供重要依据；但<2 mm卵泡卵母细胞的利用价值不高的原因还需进一步从分子的角度继续深入研究。

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玻璃化冷冻山羊卵母细胞效果研究 篇3

关键词：玻璃化冷冻,山羊,卵母细胞

卵母细胞冷冻保存不但可以使卵母细胞的供给不受时间和空间的限制,而且对品种资源保护、体外胚胎生产技术的商业化等也具有重要意义。自1985年W.F.Rall等[1]发明玻璃化冷冻方法并冷冻保存小鼠胚胎成功后,又有许多研究表明,玻璃化冷冻法在冷冻保存卵母细胞方面的效果优于传统冷冻方法,但目前玻璃化冷冻保存卵母细胞的存活率和发育能力仍然不能达到实际应用的水平。分析其原因,这与玻璃化冷冻方法含有较高浓度的抗冻保护剂有关。玻璃化冷冻液中的抗冻保护剂浓度高达6～8 mol/L,而传统冷冻方法的抗冻保护剂浓度则低于2 mol/L,说明玻璃化冷冻可以更有效地保护细胞在冷冻过程中冰晶形成所造成的物理性损伤。因此玻璃化冷冻法在冷冻保存卵母细胞方面的效果优于传统冷冻方法。由于玻璃化冷冻液中含有较高浓度的抗冻保护剂,其对细胞也具有较强的化学毒性,因此在一定程度上损伤了经玻璃化冷冻保存卵母细胞的存活率及发育能力。可见,研究开发低毒、高效的玻璃化冷冻液,将是提高玻璃化冷冻保存卵母细胞效果的有效途径之一。

目前,二甲其亚砜(DMSO)和乙二醇(EG)是配制玻璃化冷冻液最常用的2种渗透性抗冻保护剂。EG的优点是毒性低、渗透性高,但形成玻璃化态的能力较DMSO弱;虽然DMSO与EG相比形成玻璃态能力强[2],但其化学毒性较EG大,且渗透性相对较差[3]。如果将2种抗冻保护剂联合应用于配制玻璃化冷冻液,可显著降低各种抗冻保护剂的浓度,因此能够降低玻璃化冷冻液中抗冻保护剂的化学毒性,同时仍可以保证玻璃化冷冻液具有较好的形成玻璃化态的能力。

在采用含有高浓度抗冻保护剂的玻璃化冷冻液保存卵母细胞过程中,其毒性作用之一是增加了卵母细胞质内Ca2+游离浓度,孤雌激活卵母细胞[4,5]。有研究证实:玻璃化冷冻液中的Ca2+和DMSO、EG均可以使卵母细胞质内Ca2+浓度瞬时升高,并孤雌激活卵母细胞;但在不含Ca2+的玻璃化冷冻液中的EG并不引起显著性的Ca2+浓度增加;而无论玻璃化冷冻液中是否含Ca2+,DMSO都会引起细胞内Ca2+浓度增加[4,5]。据此推断,采用不含Ca2+的玻璃化冷冻液,并将DMSO在玻璃化冷冻液中的浓度控制在较低水平,将有助于提高玻璃化冷冻保存卵母细胞的效果。

因此,研究以山羊卵母细胞为材料,研究在不含Ca2+的玻璃化冷冻液中,不同浓度配比的DMSO和EG这二种抗冻保护剂对冷冻保存山羊体外成熟卵母细胞效果的影响,旨在探索适宜的玻璃化冷冻液配方,以提高卵母细胞冷冻保存后的存活率及发育能力。

1 材料

1.1 OPS管的制备

参照朱士恩等[6]的方法制备OPS管,用自制的小酒精灯明火加热0.25 mL的塑料管,变软后拉成OPS管。OPS管的内径为0.02～0.03 mm,管壁为0.02 mm,待冷却后用刀片将其切断,得到2支OPS管,细端长度为2～3 cm。

1.2 溶液的配制

FS液的配制:30%聚庶糖(Fico1170)+0.5 mol/L蔗糖+3.0 g/L牛血清白蛋白(BSA),溶液为无Ca2+的DPBS。预平衡液:以无Ca2+的DPBS为基础液,3种预平衡液的组成见表1。玻璃化冷冻液以FS液为基础液,3种玻璃化冷冻液组成见表1。0.5 mol/L解冻液:将0.5 mol/L的蔗糖溶于1 L无Ca2+的DPBS。0.25 mol/L解冻液:将0.25 mol/L的蔗糖溶于1 L无Ca2+的DPBS。

1.3 卵母细胞的采集及体外成熟培养

从河北省唐县定点屠宰场收集山羊卵巢,保存于30 ℃左右盛有生理盐水的保温瓶中,1～4 h内运回实验室。用生理盐水洗涤3次后,用刀片划破(切剖法)卵巢上直径为2～6 mm的卵泡,在放有采卵液的培养皿中洗刷几次,将卵丘卵母细胞复合体(COCs)冲洗下来,在实体显微镜下用口吸管挑选形态正常、胞质均匀、颗粒细胞不少于3层的COCs移入100 μL成熟培养液[M199液+100 μL/L 半脘氨酸+10 μg/mL卵泡刺激素(FSH)+10 μg/mL黄体生成素(LH)+1 μg/mL雌二醇(E2)+10%FCS]微滴中,微滴上覆盖矿物油,每个微滴放入20枚COCs,在38.5 ℃、5% CO2饱和湿度的CO2培养箱中成熟培养22 h。用口吸管吹打除去部分颗粒细胞,以卵母细胞周围保留2～3层颗粒细胞为宜。洗净后供冷冻试验用。

2 方法

将体外成熟培养22 h的山羊卵母细胞按3种方法进行处理:1)卵母细胞在玻璃化冷冻液中进行暴露处理,但不投入液氮中进行冷冻保存(毒性处理);2)卵母细胞利用玻璃化冷冻液进行冷冻保存(冷冻保存);3)卵母细胞既不进行毒性处理,又不进行冷冻保存(对照)。将经过处理的卵母细胞,分别进行体外受精及体外胚胎发育培养,统计相关指标。

2.1 卵母细胞的玻璃化冷冻-解冻

调节室温至25 ℃,卵母细胞的玻璃化冷冻-解冻均在37 ℃的恒温板上完成。成熟培养22 h的卵母细胞用口吸管吹打除去部分颗粒细胞,在预平衡液中平衡30 s,移入玻璃化冷冻液中平衡25 s,将5～6枚卵母细胞吸入OPS管中,直接投入液氮中冷冻保存。解冻时,从液氮中取出OPS管后,将含有卵母细胞的部分直接浸入盛有0.5 mol/L解冻溶液的表面皿中,解冻后将卵母细胞用口吸管轻轻吹出,将回收的卵母细胞立即移入新鲜的解冻溶液中平衡3 min,移入0.25 mol/L解冻溶液中平衡2 min,脱出反抗冻保护剂后用成熟培养液洗3次,移入成熟液,于38.5 ℃、5% CO2饱和湿度的CO2培养箱中恢复培养2 h。在显微镜下观察统计各组卵母细胞的正常形态数。

2.2 体外受精

将成熟培养24 h的COCs用口吸管吹打除去部分颗粒细胞,在受精液(SOF 液+20%热灭活发性羊血清+5 U/mL肝素钠)中洗涤3次,移入30 μL的受精液微滴中,每个微滴放入约10枚卵母细胞。通过上游法制备体外受精(IVF)精子,方法是将解冻的500 μL冻精放入盛有2 mL预平衡受精液的底层,1 h后移出含有活精子的上层液约800 μL,并测定精子密度。每个受精滴中加入精子的密度为1×106/mL。精子和卵母细胞在CO2培养箱中培养24 h。

2 3 胚胎发育

体外受精24 h后,将假定受精卵从受精液移入发育液,用口吸管吹打除去颗粒细胞,在发育液中洗涤3次,移入30 μL发育液微滴中(预先在培养箱中平衡4 h),每个微滴放入15～20枚受精卵,置于含有混合气(5% CO2、5% O2、90% N2)、38.5 ℃饱和湿度的CO2培养箱中进行体外发育培养,每48 h半量换液1次。受精当天计为第0天,第48小时观察卵裂数,第120小时观察桑葚胚数,第192小时观察囊胚数。

2.4 地衣红(Orcein)染色液法测定卵母细胞核相

将卵母细胞/受精卵从培养液中取出,用PBS液洗3次,放在载玻片上,排成一条直线,盖上盖玻片,不要将卵母细胞/受精卵压碎,在4 ℃固定液中固定48 h,再用Orcein染色液染色9 min,用脱色液脱去染色液,用指甲油封片。在相差显微镜下观察卵母细胞核相,判定卵母细胞是否被孤雌激活。

2.5 统计分析

采用SPSS 11.5中的配对样本t检验对试验数据进行统计分析,P<0.05表示差异显著。

3 结果与分析

3.1 卵母细胞暴露在不同玻璃化冷冻液中对其正常形态数和孤雌激活数的影响(结果见表2)

注:同列数据肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),括号内数据均为百分率(%)。

由表2可知:在玻璃化冷冻液1,2,3中暴露后,卵母细胞的形态正常率分别为97.1%、97.3%、97.3%,与对照组的形态正常率(100%)相比差异不显著(P>0.05),说明卵母细胞仅在玻璃化冷冻液1,2,3中暴露处理不会对其形态造成损伤。在玻璃化冷冻液1,2,3中暴露后,卵母细胞的孤雌激活率分别为1.0%、2.7%、3.5%,与对照组孤雌激活率(0)相比差异不显著(P>0.05),说明玻璃化冷冻液1,2,3的化学成分对卵母细胞没有造成明显的毒害作用。可见,玻璃化冷冻液1,2,3对卵母细胞不具有明显的化学毒性。

3.2 卵母细胞暴露在不同玻璃化冷冻液中对其体外受精及胚胎发育能力的影响(结果见表3)

注:同列数据肩标字母相同表示差异不显著(P>0.05),字母不同表示差异显著(P<0.05),括号内数据均为百分率(%)。

由表3可知:采用玻璃化冷冻液1,2,3保存卵母细胞,卵裂率及囊胚率均显著低于对照组(P<0.05),说明玻璃化冷冻保存卵母细胞均会在一定程度上损伤其受精及胚胎发育能力。对玻璃化冷冻液1,2,3冷冻保存山羊卵母细胞的效果进行比较,玻璃化冷冻液2冷冻保存卵母细胞的囊胚率(13.8%)显著高于玻璃化冷冻液1(5.7%)和玻璃化冷冻液3(5.1%)(P<0.05),说明玻璃化冷冻液2冷冻保存山羊卵母细胞的效果优于玻璃化冷冻液1,3。

4 讨论与小结

山羊卵母细胞在玻璃化冷冻液1,2,3中进行暴露处理,卵母细胞并未表现出异常孤雌激活现象,原因之一是玻璃化冷冻液中不含Ca2+。Ca2+作为卵母细胞激活的中间调节物,其在细胞内瞬时升高是引起第2次减数分裂中期(MⅡ期)卵母细胞被孤雌激活的重要原因[7],卵母细胞在含Ca2+玻璃化冷冻液暴露过程中,容易导致胞质内Ca2+浓度瞬时升高,从而引起卵母细胞孤雌激活。这与田树军等[8]发现,含Ca2+的玻璃化冷冻液对体外成熟绵羊卵母细胞的孤雌激活具有增强作用的结果一致。S.Succu等[9]采用以Ca2+为基础液配制的玻璃化冷冻液冷冻保存绵羊卵母细胞,孤雌激活率高达54.5%。 引起卵母细胞孤雌激活的另一原因可能是玻璃化冷冻液中含有较高浓度的DMSO。以往的研究发现:DMSO可以引起多种细胞内Ca2+浓度的瞬时升高[10]。M.G.Larman等[4]发现,小鼠MⅡ期卵母细胞暴露于以DMSO和EG作为抗冻保护剂的玻璃液中可能引起细胞内Ca2+浓度升高,并且无论冷冻液中是否含Ca2+,DMSO都会引起细胞内Ca2+浓度升高,而不含Ca2+的玻璃化冷冻液中EG并不引起显著性的Ca2+浓度增加。田树军等[11]研究发现:玻璃化冷冻液中的DMSO对体外成熟绵羊卵母细胞具有孤雌激活作用的研究结论支持了这一观点,并进一步证实卵母细胞被孤雌激活后引起卵母细胞皮质层部分皮质颗粒提前释放到卵周隙,导致透明带变硬,从而降低精子穿透卵子的能力。通常玻璃化冷冻液中DMSO所占体积浓度在15%以上,试验中玻璃化冷冻液中DMSO体积浓度分别降低,为5%、2.5%、0,然而试验组卵母细胞的受精率仍然低于对照组,说明含有低浓度DMSO抗冻保护剂的玻璃化冷冻液依然对山羊卵母细胞的体外受精能力具有一定程度的损伤。但这种损伤是由玻璃化冷冻液中抗冻保护剂的化学毒性所致,还是冷冻过程所造成的物理性损伤,还有待于进一步研究。

尽管采用玻璃化冷冻液1,2,3保存山羊卵母细胞,囊胚率与对照组相比显著降低,但玻璃化冷冻液2冷冻保存山羊卵母细胞的囊胚率达到13.8%,显著高于玻璃化冷冻液1(5.7%)和玻璃化冷冻液3(5.1%),说明玻璃化冷冻液2更适合于山羊卵母细胞的冷冻保存。研究的效果好于S.Succu等[9]采用玻璃化冷冻液保存绵羊卵母细胞囊胚率为0的结果,以及田树军等[8]采用玻璃化冷冻液保存绵羊卵细胞囊胚率为7.1%的结果。

综上所述,玻璃化冷冻液2(27.5%EG+5%DMSO) 不产生引起山羊卵母细胞被孤雌激活的化学毒性作用,用玻璃化冷冻液2冷冻保存山羊卵母细胞可获得较为理想的胚胎发育效果。

参考文献

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[4]LARMAN M G,SHEEHAN C B,GARDNER D K.Calcium-freevitrification reduces cryoprotecatant-induced zona pellucida hard-ening and increases fertilization rates in mouse oocytes[J].Repro-duction,2006,131:53-61.

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[9]SUCCU S,LEONI G,BERLINGUER F,et al.Vitrification devicesaffect developmental competence and biochemical properties of IVMovine oocytes(abstract)[J].Reprod Fertil Dev,2005,18:163.

[10]MORLEY P,WHITFIELD J F.The differentiation inducer,dimethylsulfoxide,transiently increases the intracellular calcium ion concen-tration in various cell types[J].J Cellular Physiology,1993,156:219-225.

卵母细胞 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用猪卵巢

试验所用猪卵巢全部采自贵阳市花溪屠宰场, 母猪屠宰后30min内将两侧卵巢剪下, 除去特大卵泡与多余脂肪组织, 灭菌纱布擦干, 置于试验设计温度的灭菌生理盐水 (含双抗) 广口保温瓶内, 迅速送回实验室。随后用等温的生理盐水冲洗2～3次至无血水, 剪去卵巢上附带的输卵管系膜, 在超净工作台上灭菌纱布吸干卵巢表面水珠备用。

1.1.2 主要仪器设备

二氧化碳培养箱 (Forma 3111, 美国热电) 、实体显微镜 (Olympus) 、恒温水浴锅 (天津泰斯特仪器有限公司) 等。

1.1.3 试剂耗材

TCM-199, 氯霉素、青霉素、透明质酸酶、四孔培养皿均购自Sigma公司 (美国) , 其它试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1

抽吸法和剖切法采集猪卵巢卵母细胞在采卵室内, 分别采用抽吸法和剖切法采集猪卵巢卵丘-卵母细胞复合体 (COCs) , 抽吸法用带有16G针头的5mL注射器抽吸卵巢表面2～8mm大小卵泡, 吸卵液为m PBS;剖切法是将清洗干净的卵巢置于内有5mL m PBS吸卵液的无菌培养皿中, 然后用灭菌手术刀片对卵巢表面所有卵泡 (2～6mm) 进行纵横方向切剖。参考文献介绍的方法进行收集、分级、记录, 分为A、B、C三级。

1.2.2 体外培养

将收集的A、B级COCs用于体外成熟培养, 培养液为TCM-199, 采用四孔微滴培养法, 每滴移入30～40枚卵母细胞, 在5%CO2、95%空气、饱和湿度、39℃下培养。

1.2.3 猪卵母细胞成熟鉴定

将培养38～42h的COCs放入含有0.1%透明质酸酶的成熟培养液中, 在CO2培养箱中孵育10min后用吸胚管轻轻吹打以脱去卵丘细胞。将裸卵在显微镜下观察卵母细胞是否已排出第一极体, 含有第一极体的判为成熟, 排出第一极体则为卵母细胞核成熟的标志。

1.2.4 不同保存时间对卵母细胞体外成熟的影响

采用抽吸法采集不同保存时间的猪卵巢COCs并用于体外成熟培养。保存时间设置为4个梯度 (1～1.5h、2～2.5h、4～4.5h、6～6.5h) , 将所获得的COCs用成熟培养液进行体外成熟培养, 培养方法见1.2.2。

1.2.5 卵巢保存温度对卵母细胞体外成熟的影响

将离体卵巢保存在不同温度的生理盐水中, 比较不同的保存温度对猪卵巢COCs体外成熟的影响, 温度设置为3个梯度 (36～38℃、26～28℃、16～18℃) , 采用抽吸法采集所获得的COCs进行体外成熟培养, 培养方法见1.2.2。

1.3 数据处理

所得数据以百分数t检验及平均数t检验进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 不同采集方法采集可用卵母细胞数

从屠宰场共采集猪卵巢158个, 共获得A、B、C级卵母细胞1078个, 其中可用来培养A、B级卵丘卵母细胞667个, 占总采卵数的61.87%, 平均采得可用卵母细胞数4.22枚/卵巢。用抽吸法采得卵母细胞数435个, 其中A、B级卵母细胞255, 平均2.66个/卵巢, 占该法获得卵母细胞的58.6%, C级卵母细胞180个, 占14.4%;而用剖切法得到卵母细胞643个, 其中A、B级卵母细胞数为412个, 平均6.64个/卵巢, 占该法获得的卵母细胞数的64.07%, C级卵母细胞数为231, 占35.93%, 可见这两种方法所得到的无论是卵母细胞数还是可用卵母细胞数差异极显著 (p<0.01) , 剖切法所得可用卵母细胞的比例高于抽吸法 (见表1) 。

2.2 不同采集方法对卵丘细胞完整程度的影响

在2种采集方法中, 剖切法获得的卵母细胞卵丘完整率高于抽吸法 (P<0.05) (见表2) , A、B二级卵母细胞的比例均显著高于抽吸法 (P<0.05) , 抽吸法所得的C级卵母细胞数要显著多于 (P<0.05) 剖切法。

注:同列肩标不同字母表示差异显著 (P<0.05)

2.3 卵巢保存时间对卵母细胞体外成熟的影响

一般而言卵巢保存时间越短越好, 最好是2h内将离体卵巢运回实验室, 但由于某些条件限制, 有时会超过2h。本试验采用抽吸法采集不同保存时间的卵巢卵母细胞并用于体外成熟培养。结果显示 (见表3) , 保存时间在1～1.5h时, 成熟率最高, 成熟率为57.6%;2～2.5h时, 成熟率为52.8%;4～4.5h时, 成熟率为48.2%;6～6.5h时, 成熟率最低, 为26.5%。

注:a、b之间差异显著 (P<0.05)

2.4 卵巢保存温度对卵母细胞体外成熟的影响

与其它哺乳动物相比, 猪卵子对温度特别敏感, 卵巢的回收温度较高或较低, 卵母细胞体外成熟培养的效果较差甚至退化, 较合适的温度是到达实验室维持在32～38℃, 当卵巢保存温度低于25℃, 猪卵母细胞将会受到冷休克的打击, 从而影响卵母细胞体外成熟的成熟率。本试验研究结果显示 (见表4) , 当保存温度在36～38℃时, 26～28℃时, 16～18℃时, 平均成熟率分别为:54.2%、47.6%、27.9%。保存温度36～38℃时与16～18℃时相比较差异极显著 (p<0.01) 。

注:a、b之间差异显著 (P<0.05)

3 讨论

3.1 两种采集方法对获得卵母细胞的数量的影响

卵母细胞的采集方法对获得卵母细胞的数量影响很大, 目前针对大多母畜卵巢COCs的采集多是采用抽吸法, 关于用不同方法获取COCs、对可用卵丘卵母细胞数量的比较研究, 在牛和羊尚有报道, 而猪报道不多。王启胜等 (2002) 用抽吸法从每头水牛卵巢中获得的卵母细胞数为4.57个/卵巢。卫恒习等 (2004) 研究发现用剖切法采集绵羊卵母细胞获得的卵均数、可用卵数均显著高于抽吸法。我们在的研究结果与他们的相似。

3.2 卵巢保存温度和时间对卵母细胞体外成熟的影响

关于卵巢在体外保存的温度和时间, 不同的学者有过不同的研究报道。卵巢保存时间的不同, 成熟率将随着卵巢离体时间的增加呈降低的趋势。文国艺等 (2000) 报道母猪卵巢离体时间的长短直接影响体外成熟率, 成熟率将随着卵巢离体时间的增加而降低的趋势。本试验表明, 卵巢离体时间在6h以内对卵巢卵母细胞的成熟率影响不大, 我们的结果与其相符。当卵巢的温度低于30℃时会对卵母细胞的成熟及之后的发育产生不利的影响。低于25℃时, 卵母细胞将会受到冷休克的打击, 影响体外成熟的成熟率。彭辉等 (2009) 研究发现, 牛卵巢从采集到送达实验室保存在30～39℃的灭菌生理盐水中可以获得较高的成熟率和囊胚发育率。本试验研究结果显示, 当保存温度在36～38℃时, 卵母细胞成熟率最高。

摘要：本试验利用抽吸法和剖切法两种采集方法采集猪卵巢卵母细胞, 对获得可用卵丘卵母细胞数和卵丘完整程度的影响进行比较研究, 并分析在卵巢收集时不同的保存温度、运输时间对卵母细胞体外成熟的影响。结果表明:剖切法采集细胞数目显著高于抽吸法 (P<0.01) ;A、B级卵母细胞的比例在剖切法中显著高于抽吸法 (P<0.05) ;抽吸法所采集的C级卵母细胞显著高于剖切法 (P<0.05) ;剖切法中卵母细胞卵丘完整率高于抽吸法 (P<0.05) ;离体卵巢保存的最佳温度为36℃～38℃;其保存时间为1～1.5h时成熟率57.6%与2～2.5h时成熟率52.8%相比无显著差异 (P>0.05) ;保存时间超过6h时卵母细胞的成熟率显著下降。

关键词：猪,卵巢卵母细胞,采集方法

参考文献

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[4]卫恒习, 等。提高绵羊卵母细胞发育能力的研究[J].黑龙江畜牧兽医, 2005, 5, 34-36.

卵母细胞 篇5

1 玻璃化冷冻的基本原理及影响因素

1.1 冷冻原理

研究发现液体在冷冻过程中可形成晶体和玻璃体两种状态。物质在晶体中分子由原有无序状的结构改变为有序的排列;而在玻璃体中分子原有的结构顺序没有改变,仍处于液态中的无序状。液体的性质和降温的速率决定了液体在冷冻过程中以何种状态固化。从理论上讲,只要获得足够的降温速率,任何液体都可以进入玻璃态,但在工作中,形成玻璃态所需的降温速率往往需要通过在溶液中添加冷冻保护剂来实现。玻璃化冷冻中,细胞在高浓度的冷冻保护剂中超高速降温,形成无结构的玻璃态,而不形成冰晶,可避免冷冻过程中冰晶对细胞的损伤,使细胞在降温过程中保持完整的结构。故自玻璃化冷冻技术问世以来,由于其潜在的优势,已在人类辅助生殖中受到青睐。

1.2 影响因素

玻璃化冷冻效果可受多种因素影响,如:冷冻速率、冷冻载体、冷冻保护剂、冷冻及复苏步骤等。玻璃化冷冻是一种快速冷冻技术,细胞从37℃快速降温至-196℃所需要的时间称为冷冻速率,是玻璃化冷冻技术在保存人类卵细胞和胚胎中的应用非常重要的参数。通过提高温度传导速率可缩短降温需要的时间,即越快越好,但在实际操作中,提高冷冻速率往往会受到限制。为避免在快速降温过程中对细胞的伤害,需要使用冷冻保护剂。玻璃化冷冻液对细胞都有毒性,若浓度过高,对保存的细胞会造成严重的损伤。目前,多数学者认为乙二醇(EG)加上大分子糖类是比较理想的玻璃化溶液的良好候选材料[8]。

2 卵细胞玻璃化冷冻

不同时期的卵细胞对外界环境的敏感性不尽一致。低温会造成卵细胞透明带发生变性,降低卵子的受精能力,因此卵子的冷冻保存成功率较低。研究表明,卵子的玻璃化冷冻较常规的程序化冷冻有较高的存活率和受精率[9],近年来已取得了不少可喜的进步。

2.1 未成熟卵细胞的玻璃化冷冻

未成熟卵细胞(GV)超微结构特点是停留在第1次减数分裂期,染色体分散,存在于核膜内,没有纺锤体。在这个阶段进行冷冻,可以避免冷冻过程对纺锤体微管的损伤,理论上可降低在此后分裂过程中发生细胞遗传学错误的可能性,与成熟卵细胞冷冻相比,存在一定优势。但GV期卵细胞玻璃化冷冻经验非常有限,目前只报道1例GV期卵细胞冷冻保存复苏后经体外成熟并获得活婴分娩[10]。Wu等[11]采用玻璃化技术冷冻人GV期卵细胞,复苏后存活率、成熟率、受精率及妊娠率分别为59%、64%、70%、7%。研究显示,添加二甲亚砜(DMSO)可提高复苏后成熟率[12]。

2.2 成熟卵细胞的玻璃化冷冻

成熟卵细胞(MⅡ)微结构特点为停留在第2次减数分裂中期,核膜溶解,染色体位于纺锤体上。由于其表面积与体积的比值小,对水渗透性低,易于发生冷冻损伤。研究发现,适当浓度的EG+DMSO+蔗糖配比组成的玻璃化液毒性小,冷冻和复苏过程中细胞体积变化小,细胞可以耐受,复苏后存活率及妊娠率均有所提高[13]。Chen等[14]研究发现采用平衡液的复苏后存活率可达93%,明显高于不使用平衡液预处理的65%。同时采用单精子胞浆显微注射(ICSI)可弥补透明带硬化带来的受精困难[15]。可见,玻璃化冷冻技术的临床应用及不断发展,使MⅡ卵细胞冷冻后妊娠率及活产出生率得到明显提高。

3 问题与展望

卵母细胞 篇6

关键词：兔,卵母细胞,体外成熟,保存温度,运输时间,季节

随着体外受精技术和胚胎移植技术在生产应用中的快速发展以及体细胞核移植和转基因等胚胎工程技术的深入开展,如何稳定地获得高质量的成熟卵母细胞已经成为该领域中一个极其重要的问题。目前,主要依靠超数排卵后用手术的方法从输卵管获得成熟的卵母细胞。但是单纯依靠超数排卵技术获得卵母细胞需要使用激素,不但费用昂贵,试验过程中还需要大量的人力和物力,而且获得的卵母细胞数量有限。而采集屠宰场废弃的兔卵巢,回收其卵母细胞用于体外成熟培养,获得可以用于体外受精、单精子注射和转基因克隆的成熟卵子,这种方法成本低、取材方便,能满足大批量生产体外胚胎的需求,但卵巢的收集和运输往往需要较长的时间,同时屠宰大多数都在夜间进行,给后续的工作带来诸多不便。如果能够建立良好的卵巢保存体系,使其在一定时间内的储存不对卵母细胞的体外成熟和成熟后的发育能力造成不利影响,就能为相应的研究工作和生产应用带来极大的便利。针对以上存在的问题,本研究就兔卵巢运输时的保存温度、运输时间等因素对卵母细胞体外成熟及发育的影响及体细胞核移植技术的实际应用进行了初步研究,旨在获得更多高质量的卵母细胞,为体外受精、转基因、体细胞核移植等胚胎工程技术的研究奠定基础。

1 材料

试验所用试剂除TCM-199购自Gibco公司外,其余均购自Sigma公司。

洗卵液和胚胎培养液(CM):TCM-199+5 mmol/L HEPES+26.2 mmol/L NaHCO3+3%发情牛血清(OCS)。

卵母细胞(COC)体外成熟培养液(M):TCM-199+5%(OCS)+0.2 μg/mL促卵泡素(FSH)+20 ng/mL上皮细胞生长因子(EGF)+5 μg/mL促黄体素(LH)+3.5 μg/mL催乳素(PRL)。

所有培养液均添加60 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素,用1 mol/L NaOH溶液将pH值调至7.4,并用孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤消毒。

2 方法

2.1 兔卵巢的收集

试验所用兔卵巢均来自南宁市淡村市场当日清晨屠宰的母兔。在不同季节,母兔宰杀后,将兔卵巢取出分别置于含有K+、Ca2+、Mg2+的20～30 ℃、31～35 ℃、36～40 ℃的生理盐水的保温瓶内,分别在>3 h、≥3～≤4 h、>4 h送到实验室。

2.2 卵母细胞的收集

剪去卵巢周围多余的系膜、脂肪、输卵管等,先用加有双抗的生理盐水反复清洗卵巢,放入75%乙醇中浸泡30 s;再用PBS洗3次,置于装有经过平衡的CCM液的玻璃皿中,用1 mL注射器的针头将卵巢表面的可见卵泡刺破,使卵母细胞流出,迅速在实体显微镜下捡卵。

2.3 卵母细胞的分级选择及体外成熟

卵母细胞的类型通常是以形态学进行分类的:A类为由致密的卵丘细胞层完全包裹的卵子;B类为卵丘细胞层不完全包裹的卵子;C类为完全裸露的卵子,亦称为裸卵。在实体显微镜下,用玻璃吸管选择色泽均匀、大小均一并有完整或部分致密卵丘细胞的卵母细胞,即A、B级卵母细胞,弃去空泡化、色泽不均的卵母细胞及裸卵,然后用洗卵液将选出的卵母细胞清洗2次后,根据试验设计分组放入装有成熟培养液的玻璃平皿中,在38.5 ℃、5%CO2和最大饱和湿度的培养箱中培养22～24 h。

2.4 卵母细胞的体外成熟鉴定

主要通过卵母细胞形态观察来判断成熟情况,正常成熟的卵母细胞胞质均匀,没有空泡,其周围的卵丘细胞发生扩散,呈放射状排列。先将卵母细胞放入0.1%的透明质酸酶中,用玻璃吸管轻轻反复吹打,使周围颗粒细胞脱落,之后将卵母细胞放入洗卵液洗3次,最后在实体显微镜下观察统计。判断标准:胞质完整、均匀,且能观察到第一极体排出的为成熟卵母细胞。

2.5 数据的统计分析

每个试验至少重复3次,所得试验数据均用卡方(χ2)分析,P< 0.05判定差异显著。

3 结果

3.1 不同保存温度对兔卵母细胞体外成熟培养效果的影响(见表1)

注:同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)。

从表1可以看出,温度对卵母细胞体外成熟的影响很大,25～30 ℃保存的兔卵巢中的卵母细胞成熟率可达61.09%,显著高于温度为31～35 ℃和36～40 ℃两组(26.30%和15.79%,P<0.05)。

3.2 不同运输时间对兔卵母细胞体外成熟培养的影响(见表2)

注:同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05),字母相同表示差异不显著(P>0.05)。

由表2可知,兔卵母细胞成熟率随运输时间的增加而降低,但<3 h和≥3～≤4运回实验室时,卵母细胞体外成熟率差异不显著(P>0.05),分别为64.24%和59.64%;但当运输时间>4 h时,成熟率降低到50.23%,与另两组差异显著(P<0.05)。

3.3 不同季节对兔卵母细胞体外成熟的影响(见表3)

从表3可以看出,春、秋、冬3个季节进行兔卵母细胞体外成熟的效果较好,成熟率分别为64.26%、58.37%、64.86%,显著高于夏季32.65%(P<0.05),但3组间差异不显著(P>0.05),春、冬2个季节稍好于秋季。

注:同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05),相同表示差异不显著(P>0.05)。

4 讨论

4.1 卵巢运输时不同保存温度对兔卵母细胞体外成熟的影响

兔宰杀后,在最短的时间内采集卵巢,回收卵母细胞效果最好。但实际上,屠宰场与实验室之间有一定的距离,需要长距离运送,这就存在着卵巢质量受运输温度和时间影响的问题。目前,一般都是保存在含抗生素的生理盐水中,但保存的温度各异。从本试验结果看,兔卵巢运输时保存温度为25～30 ℃时卵母细胞的成熟率显著高于保存在31～35 ℃和 36～40 ℃,保存温度为31～35 ℃的卵母细胞成熟率显著高于36～40 ℃。当温度大于36 ℃时,大部分卵母细胞变形,死卵增多,胞质多数不均匀。Naoi H等[1]研究发现,猫卵巢的储存温度过高会损害卵母细胞减数分裂的能力。从理论上讲,保存温度越接近动物体温越好,即在36～37 ℃的生理盐水中保存卵巢时卵母细胞的成熟应该是最好的,但是从试验数据上看,结果并不是这样的,这可能是因为温度接近动物体温,卵巢代谢活动旺盛,卵母细胞中的物质发生降解造成有害物质积累,另外卵巢在离体的环境中缺乏充足的营养物质供应,使卵母细胞的质量下降较快,当采用和体温相同或更高温度的生理盐水保存卵巢时,卵子受到热应激而影响其成熟后的质量。不同动物卵子对温度的耐受性不同,兔卵母细胞对温度较为敏感,温度过高很容易造成细胞的老化甚至死亡。库尔班·土拉克[2]在研究卵巢运输保存温度对野生梅花鹿卵母细胞体外成熟的影响时发现:梅花鹿卵巢在20～25 ℃保存时,卵母细胞成熟率为77%,且无变形卵子出现;而在10～15 ℃保存时,卵母细胞成熟率为45%,变形率为18%。有学者发现,牛卵巢在37 ℃保存的卵裂率与20 ℃保存相比显著下降;在10 ℃保存30 min就会出现变形卵子。罗光彬等[3]也证实黄牛卵巢保存温度达到36 ℃以上时,卵母细胞的成熟率开始下降。刘青春[4]认为,高温会导致卵巢的新陈代谢加快,卵母细胞可能会过早成熟,而同时产生的大量废物无法及时运出,从而产生毒害作用,致使体外培养时卵母细胞的发育受到不良影响,成熟率下降,降低保存温度可能会避免这些影响,但温度过低也会产生不良影响。因此,在实际运用中,不能因追求在卵巢运回实验室时温度接近体温而一味地提高保存卵巢的初始生理盐水温度,温度下降幅度过大也不利于卵母细胞的成熟。因此,在本研究条件下,卵巢保存温度以25～30 ℃为宜。

4.2 卵巢运输时不同运输时间对兔卵母细胞体外成熟的影响

研究表明,采集到的兔卵巢一般应在4 h内运回实验室,时间太长对卵巢有很大损伤,从而影响卵母细胞的成熟率。本试验也得出了一致的结论,兔卵巢运输时间为4 h以内时,卵母细胞成熟率没有显著差异,而当运输时间大于4 h时,卵母细胞的成熟率显著降低。Wongsrikeao P等[5]研究发现,猪卵巢保存6～12 h,卵巢保存液会产生比卵母细胞多的酸性物质,从而使卵母细胞的pH值下降,导致卵母细胞DNA片段化,不利于卵母细胞的发育。母猪卵巢离体时间的长短直接影响卵母细胞体外成熟及胚胎卵裂率,成熟率和卵裂率均随卵巢离体时间的增加而呈降低趋势。Naoi H等[1]的研究结果表明,为保持卵母细胞的后续发育潜能,猫卵巢在室温下保存不宜超过6 h。Blondin P等[6]的试验结果表明,牛卵巢长时间(7～8 h)保存,会减少卵母细胞体外受精后胚胎的卵裂率和囊胚的形成。进一步的研究表明,卵巢中部分蛋白的变性和DNA的降解对马[7]和猫[8]卵母细胞的发育潜能造成影响。李东伟[9]在研究黄牛的卵母细胞运输时间时认为,卵巢在离体的情况下,卵巢内由于代谢所产生的有毒物以及氧气的供给不足会影响卵母细胞的体外成熟率,运输时间越短越有利于卵母细胞体外成熟培养的成功。何良军等[10]在研究绵羊的卵母细胞成熟时指出,运输时间过长会导致很多卵母细胞老化,生理活动功能降低,虽然对成熟率的影响不大,但会大大降低其体外受精的效果。本试验的结果与以上报道的结果相一致。

4.3 不同季节对兔卵母细胞体外成熟的影响

试验结果表明,季节对于兔卵母细胞体外成熟率有一定影响。春、秋、冬3个季节的卵母细胞成熟率显著高于夏季。分析其原因可能是由于不同季节的水质有差异。另外,虽然兔为四季发情动物,但对于本地区来说,夏天的气温较高,高温会影响母兔的生理机能和繁殖机能,使母兔的发情率大大降低,而在春、秋、冬3个季节兔更易发情。发情季节有大量的卵泡生长,体内的FSH、LH等较高,采集到的卵母细胞经体内激素作用,卵母细胞内产生了更多的激素受体,在体外培养更易成熟。孙桂金[11]在研究中也发现,虽然在发情季节与乏情季节,绵羊卵母细胞在采集数量上差异不显著,但发情季节的卵母细胞成熟率显著高于乏情季节(74.2%、57.3%,P<0.05)。

师如意等[12]在研究中发现,卵母细胞的成熟潜力与季节密切相关,并认为动物在繁殖季节或气候适宜的季节获取的卵母细胞成熟能力较强。因此,在进行兔体细胞克隆等胚胎操作试验时,条件允许的话,可以避开夏天采卵,以防由于卵母细胞成熟质量的降低而影响其发育。

5 结论

总的来说,兔卵巢的保存温度、运输时间和采卵季节对兔卵母细胞的体外成熟培养有很大的影响。兔卵巢保存于25～30 ℃生理盐水中,在4 h内运回实验室为宜;春、秋、冬3个季节经废弃卵巢采集的卵母细胞体外成熟培养质量较好。

参考文献

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[2]库尔班.土拉克.卵巢运输保存温度和时间对野生梅花鹿卵母细胞体外成熟的影响[J].新疆农业大学学报,2008,31(6):63-66.

[3]罗光彬,蔡春花.卵巢保存温度、激素及体外培养时间对延边黄牛卵母细胞体外成熟的影响[J].中国畜牧兽医,2004,6(31):25-26.

[4]刘青春.不同卵巢运输温度和培养方法对卵母细胞体外成熟的影响[J].畜牧兽医杂志,2008,4(27):16-17.

[5]WONGSRIKEAO P,OTOI T,KARJA N,et al.Effect of ovary storagetime and temperature on DNA fragmentation and development of pro-cine oocytes[J].J Reprod Dev,2005,51(1):87-97.

[6]BLONDIN P,COENEN K,GUILBAULT L A,et al.In vitro produc-tion of bovine embryos:developmental competence is acquired beforematuration[J].Theriogenology1,997,47(5):1061-1075.

[7]PEDERSEN H G,WATSON E D,TELFER E.Effect of ovary hold-ing temperature and time on equine granulosa cell apoptosis,oocytechromatin configuration and cumulus morphology[J].Theriogenolo-gy,20046,2(314):468-480.

[8]WOLFE B A,WILDT D E.Development to blastocysts of domesticcat oocytes in vitro matured and fertilized after prolonged cold storage[J].J Reprod Fertil,19961,06(1):135-141.

[9]李东伟.黄牛卵母细胞体外成熟影响因素的研究[D].合肥:安徽农业大学,2002.

[10]何良军,彭莉.绵羊卵母细胞最优运输温度和体外成熟时间的研究[J].塔里木大学学报,2005,17(4):5-7.

[11]孙桂金.绵羊卵母细胞体外成熟、体外受精和胚胎体外培养的研究[D].泰安:山东农业大学,2002.

卵母细胞 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

牛卵巢与绵羊附睾均采自呼和浩特市郊区屠宰厂, 屠宰后快速取材, 卵巢放于20～30 ℃灭菌生理盐水保温瓶中, 附睾置冰袋中, 2～3 h内运回实验室。

1.2 方法

1.2.1 卵母细胞的成熟

用灭菌的生理盐水将卵巢清洗2～3次, 用注射器抽吸距卵巢表面2～6 mm卵泡内的卵丘卵母细胞复合体 (COCs) , 收集形态正常、胞质均匀、至少有3层以上卵丘细胞包覆的COCs;用预热的成熟液洗2次, 转入已平衡2 h以上的成熟液滴中, 在38.5 ℃、5%CO2和饱和湿度培养箱中成熟培养;22～24 h后除去COCs中的卵丘细胞, 在体视显微镜下, 挑选具有第一极体并且胞质均匀的卵母细胞备用。成熟液配方:含10%胎牛血清 (FBS) , 100 μg/mL 卵泡刺激素 (FSH) , 20 μg/mL 促黄体生成素 (LH) , 1.5 μg/mL雌二醇 (E2) 的M199。

1.2.2 精子提取物的制备

将附睾带回实验室, 消毒后用手术刀切割附睾表层;取出精液后采用上浮法处理精液, 即将精液慢慢加到预先平衡的2 mL BO液底部, 在38.5 ℃、5%CO2和饱和湿度培养箱中静置;20 min后吸取上层含精子的液体, 900 g/min离心10 min去除杂质, 重悬沉淀后再次离心, 重复2次;然后将所得沉淀放入裂解液中, 并进行精子计数;将精子密度调至 (5～10) ×108个/mL, 分装在冻存管中;将冻存管直接投入液氮中冷冻, 然后在室温解冻, 如此重复冻融4次;所得产物于4 ℃, 20 000 g/h离心1 h;从离心管中小心地将上清液移出, 用Centricon-30超滤浓缩, 于-80 ℃储存, 使用时解冻。裂解液配方:120 mmol/L KCl, 20 mmol/L Hepes, 100 μmol/L EGTA, 10 mmol/L 甘油磷酸钠, 200 μmol/L苯甲基磺酰氟 (PMSF) , 1 mmol/L二硫苏糖醇 (DTT) , 调pH值至7.5。

1.2.3 精子提取物对卵母细胞的激活

将成熟的卵母细胞分为以下2组:A组 (对照组) 注射不含精子提取物的裂解液, B组注射含精子提取物的裂解液。将牛卵母细胞置于覆有石蜡油的含7.5 μg/mL CB和10%FBS的H199微滴中处理5 min, 将2组液体分别与20%PVP混合, 在显微操作仪上用注射针 (内径为5～6 μm, 外径为9～10 μm) 吸取卵母细胞, 分别吸取3～6 pL 2组液体, 各自注射到卵母细胞的胞质中, 再移到预先平衡的SOFaa微滴中, 于38.5 ℃、5% CO2和饱和湿度培养箱中培养, 48 h后观察、记录注射卵母细胞的卵裂情况, 第8天观察、记录囊胚发育情况。

1.2.4 确定精子提取物注射的最佳剂量

将成熟的卵母细胞分为以下3组:A组注射精子提取物2～5 pL, B组注射精子提取物6～9 pL, C组注射精子提取物10～13 pL。

1.2.5 比较离子霉素联合6-DMAP与精子提取物注射方法激活效率

将成熟牛卵母细胞分为2组:A组将成熟卵放入含5 mmol/L离子霉素的H199中作用5 min, 再在含2 mmol/L 6-DMAP的SOFaa中培养4 h, 然后转入100 μL的SOFaa微滴中培养。B组注射精子提取物6～9 pL。培养方法及检验方法同上。

2 结果

2.1 精子提取物是否有激活卵母细胞作用的结果 (见表1)

注:同列数据肩标字母相同差异不显著 (P>0.05) , 字母不同表示差异显著 (P<0.05) 。

由表1可知, 注射不含精子蛋白提取物的裂解液A组卵母细胞极少有被激活的, 并且囊胚率为0;而注射含精子蛋白提取物的裂解液B组卵裂率和囊胚率都显著高于A组, 且从形态上来看, 孤雌激活后的卵母细胞卵裂 (见图1、图2) 与后期发育至囊胚 (见图3) 均正常。

2.2 精子注射激活卵母细胞的最佳剂量 (见表2)

注:同列数据肩标字母相同差异不显著 (P>0.05) 。

由表2可知, 注射6～9 pL的B组获得的卵裂率与囊胚率均高于其他2个剂量的效率, 但3组间差异不显著 (P>0.05) 。表明使用这3种剂量注射的效果相当。

2.3 离子霉素联合

6-DMAP与精子提取物注射方法孤雌激活的效率比较 (见表3)

由表3可知, 精子提取物注射处理的卵母细胞的卵裂率与囊胚率均高于离子霉素联合6-DMAP的效率, 但二者差异并不显著。

3 讨论

注:同列数据肩标字母相同差异不显著 (P>0.05) 。

哺乳动物排卵后的卵母细胞只有在精子或其他人为因素的刺激下, 才能恢复减数分裂, 排出第二极体, 进入下一步发育。最早在研究海胆的受精过程中发现, 人为升高卵内Ca2+浓度可以激活卵;在随后的哺乳动物的研究中, 也发现了同样的规律。这就证明, 受精过程中卵子内游离的Ca2+浓度变化并非是一种伴随现象, 而是在激活卵过程中起到关键作用。

在受精过程中精子是如何引发卵子中Ca2+振荡的呢?一种比较权威的解释认为, 精子中含有一种可溶性胞质因子 (现证明是蛋白性物质) , 可在精卵膜融合后引发卵子内Ca2+释放[1]。这是由精子提取物注射卵母细胞后引起受精卵Ca2+振荡, 这种因子被称为“精子生成卵细胞激活因子 (sperm- born ooeyte activating factor, SOAF) ”。

目前, 使用的化学激活法被认为并未触发卵源性的Ca2+振荡器, 因为将精子成分注射到已经人工激活的卵母细胞内仍然可以产生Ca2+振荡, 而注射到已经受精的卵母细胞内, 却不会产生Ca2+振荡。可能是由于此原因影响了克隆胚胎的发育效率。

试验使用绵羊精子提取物, 将6～9 pL精子密度为 (5～10) ×108 /mL的精子提取蛋白注射到成熟的牛卵母细胞中, 取得了77.14%的卵裂率和 34.29%的囊胚率, 这证明精子提取物确实具有激活卵子的效果, 且试验使用绵羊精子提取物注射非同种的牛卵母细胞, 进一步论证了精子中这种可激活卵子的因子在哺乳动物间是没有种间差异的。

这些证据都说明精子提取物可能就是促发Ca2+释放、使卵子受精的激活信息的可溶性因子。总之, 精子提取物对卵的激活作用是肯定的, 这对今后克隆或ICSI的效果都会有很大影响, 如何影响有待进一步研究。

参考文献

[1]STRICKER S A.Comparative biology of calcium signaling duringfertilization and egg activation in animals[J].Dev Biol, 1999, 211:157-176.

卵母细胞 篇8

无论是哺乳动物还是禽类,在出生时其卵巢拥有数以万计的原始卵泡,而最终发育成熟并排卵的卵泡所占比例不足1%。绝大多数卵母细胞在发育过程的各个阶段,如:卵子发生、减数分裂、原始卵泡形成以及卵泡选择等均可发生凋亡,以确保最终卵巢池中有适量优质卵泡维护卵巢功能。一般认为,卵母细胞的凋亡主要在发育早期的卵泡闭锁中起主导作用,而颗粒细胞凋亡主要在发育晚期卵泡的闭锁中起主导作用。

在哺乳动物胚胎发育阶段,当原始生殖细胞迁移到还未开始分化的胚胎生殖脊组织后,生殖细胞发生的发育程序就被启动了,此时的雌性生殖细胞称作卵原细胞(oogonia),卵原细胞持续进行活跃的有丝分裂,不断增殖形成许许多多的卵原细胞,扩大生殖系(germline)的规模,直到卵原细胞完成最后一次有丝分裂后,即进入第一次成熟分裂前期(prophasel)细线期[1]。进入第一次成熟分裂的卵母细胞,称为初级卵母细胞。这标志着雌性生殖细胞增殖终结,进入卵母细胞阶段,而在卵子发生过程中有超过三分子二的卵母细胞会发生凋亡,这一自然凋亡的生物学过程叫做胚胎卵母细胞磨损(Fetal oocyte attrition,FOA)[2]。Safia Malki等发现在FOA过程中,卵母细胞细胞核内转座子LINE-1编码的蛋白L1ORF1p表达水平与卵母细胞的存活有关,当其上调表达后,可导致卵母细胞出现更多的减数分裂缺陷,减数分裂细胞非整倍型增加,进一步引起卵母细胞的凋亡和胚胎致死[3]。卵母细胞减数分裂过程易出错,一旦出错机体便会自动启动凋亡程序,清除受损细胞。Touati,S.A等发现Bub R1在第一次减数分裂过程染色质的分离作用中扮演重要角色,包括维持纺锤体组装监测点活性、定时第一次减数分裂启动时间和增强着丝粒和微管的相互作用等,并进一步表明Bub R1会随年龄增加而下调表达,这解释了年老雌性动物卵巢出现非整倍体的卵母细胞概率增加[4,5]。

2 卵泡形成发育阶段的卵母细胞质量控制

初级卵母细胞被单层扁平上皮细胞所包围,聚集在卵巢皮质部位,形成原始卵泡;不断增多的原始卵泡构成了原始卵泡池,原始卵泡形成前卵母细胞的凋亡以及静止期原始卵泡的凋亡是决定原始卵泡池大小和原始卵泡储备量的关键因素,其大小间接影响了动物的繁殖潜力,而在形成原始卵泡库前,卵巢会出现一卵母细胞凋亡高峰。Zhao,L等研究发现原始卵泡池的建立与一些特殊的基因表达有关,其中Rac1基因在原始卵泡形成过程中不可或缺,如果缺失Rac1弱化原始卵泡形成,并出现卵泡结构异常,而卵母细胞特异性表达的一些基因Jagged1,GDF9和BMP15能够消除Rac1的弱化作用,并能通过Notch2信号通路促进原始卵泡的形成[6];Choi,Y等发现Notch2缺失的雌性小鼠卵巢虽能形成原始卵泡,但原始卵泡周围的单层扁平颗粒细胞不会转化柱状多层颗粒细胞,并且出生后14d卵巢中检测不到卵母细胞的存在[7];Castro,F.C等发现GDF9和BMP15参与原始卵泡向初级卵泡转变的过程,能够通过诱导体细胞和颗粒细胞表达与卵泡生长和成熟有关的基因[8]。

大部分原始卵泡会一直处于静息状态直至器官的性成熟前,以维持雌性动物随后漫长的繁殖期。Adhikari,D等发现肿瘤抑制结节性硬化复合体蛋白1(the tumor suppressor tuberous sclerosis complex 1,Tsc1)能够负调节与蛋白合成、细胞生长增殖相关的雷帕霉素复合体蛋白1(rapamycin complex 1,m TORC1)这一条通路来维持原始卵泡的长期静息状态,缺失了Tsc1基因的小鼠卵巢原始卵泡会过早过快激活,表现出早衰的症状[9];他们也发现Tsc/m TORC1信号通路能够与PTEN/PI3K信号通路相互协作来调控原始卵泡的激活与休眠,以维持雌性动物正确的繁殖期[10];Castrillon DH等发现小鼠缺失了转录因子Foxo3后卵巢内的原始卵泡会大量的不受控制的激活,使得小鼠在15周龄时出现不育[11];Pelosi,E等也证实Foxo3能维持卵巢内卵泡储备,延缓绝经期,提高小鼠繁殖力[12]。原始卵泡中的少部分会渐渐的经过不可逆的激活并开始发育,经初级生长、次级生长卵泡和成熟卵泡并排卵。然而大部分卵泡只能发育到有腔卵泡阶段后发生闭锁。卵泡的优势选择机制监控了卵母细胞的质量。早期的研究发现激素参与了优势卵泡选择,如FSH和雌二醇(estradiol,E2)等。Mihm,M等研究发现,优势卵泡中含有浓度的雌二醇和低浓度的胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding proteins,IGFBP)[13,14];随后的研究也发现颗粒细胞表达的一些细胞因子,如3β-HSD、IGFs、BMPs和Inhibins等均可影响优势排卵卵泡选择[15]。

卵母细胞发育过程中的选择对于确保生殖质量和维持遗传资源的稳定性有着重要意义。而发生于整个卵母细胞发育进程中的质量监控与选择是一个复杂的调控网络,涉及到细胞凋亡、激素、生长因子和基因调控元件等多种调控途径。随着研究的发展与深入,相信会有更全面的机制来阐述雌性生殖的质量控制原理。

摘要：物种种群的遗传稳定与其生殖细胞质量的精准选择密切相关。细胞凋亡是机体清除体内多余或受损细胞的重要途径,卵母细胞适当的凋亡对于确保物种的生殖质量,维持遗传资源的稳定性有着重要作用,而卵母细胞在不同时期的质量控制是一个复杂过程,受多种调控因子与调控元件的控制。对卵母细胞发育过程中的几个重要时期,精准调控卵母细胞质量的分子机理作了一些梳理和总结。