细胞损伤（精选12篇）
细胞损伤 篇1
摘要：中药的保护作用有多方面, 这里主要对缺糖缺氧损伤、对缺氧再给氧损伤和对病毒、化疗药物损伤的保护作用做以简要分析。
关键词：中药,心肌,保护
0 引言
近年来有关中药保护心肌细胞的研究有发较大发展, 下面从三个方面进行分析:
1 对缺糖缺氧损伤的保护作用
大量实验研究表明, 培养的心肌细胞如缺糖缺氧6小时, 则迅速引起细胞内能量耗竭, 导致细胞功能受损, LDH等酶溢出, 并伴有细胞超微结构损害。研究发现, 中药能有效地对上述损害起保护作用。研究发现:在LDH酶水平显著高于正常对照组 (P<0.01) 的缺糖缺氧心肌细胞培养液中, 加入玫瑰茄提取液后, 培养液中的LDH显著低于未加药物的缺糖缺氧组 (P<0.05) , 提示该药物能较好的对缺糖缺氧损伤起保护作用。研究人员将中药提取物酸枣仁总皂甙分别用两种浓度 (33μg/ml和11μg/ml) 加入模型组中, 结果发现高浓度组可减轻缺糖缺氧心肌细胞LDH的释放, 低浓度组则没有这样的作用, 说明该药对心肌细胞的保护作用存有量效关系。值得一提的是:培养的心肌细胞对不同中药的浓度反应也有较大差异, 研究发现, 100μg/ml与250μg/ml的三七总皂甙均能减少缺糖缺氧组心肌细胞的LDH与α-羟丁酸脱氢酶 (α-HBD) 的释放, 但作用以100μg/ml浓度为明显, 250μg/ml的浓度反有减弱的趋势, 提示中药保护心肌细胞与适宜的浓度相关, 过大过小均不能达到最大效应。
有关中药保护心肌细胞缺糖缺氧损伤机理的研究, 近年来也取得了长足的进展。洪行球采用中药复方何氏心悸方 (党参、五味子、麦冬等) 观察其对细胞内琥珀酸脱氢酶 (SDH) 活性的影响, 该酶是三羧酸循环及线粒体氧化磷酸化有关的主要酶。实验发现, 缺糖缺氧组细胞内SDH染色示活性明显降低, 加入该药抽滤液后可明显提高SDH的活性, 且使细胞搏动恢复, 说明何氏心悸方是通过改善心肌细胞内代谢起到保护心肌细胞作用。研究人员采用计算机技术和SDH染色相结合的方法。将该酶活性量化, 并检测LDH.心肌细胞内总磷酯和总胆固醇含量以及Ca2+—Mg2+ATP酶活性进行综合分析发现, 大豆磷脂脂质体可抑制心肌细胞培养液中LDH的活性和心肌细胞内SDH的反应性增加, 减轻心肌细胞Ca2+—Mg2+ATP酶活性的降低, 提高心肌细胞总磷脂和总胆固醇的含量, 说明大豆磷脂脂质体减轻培养心肌细胞缺糖缺氧性损伤, 可能与其作用于细胞膜脂质有关。近年来, 有关中心肌细胞保护作用机理研究已达到分子水平。用同位素标记法研究发现, 三七总皂甙可以减少缺糖缺氧心肌细胞DNA合成的降低。用精制血府胶囊 (柴胡、赤芍、红花、桃仁等) 取药给兔灌胃后, 心脏采血, 分离含药血清, 研究其对缺糖缺氧心肌细胞的保护作用, 发现该药可以提高缺糖缺氧心肌细胞的3H—urid (尿嘧啶核苷) 及3H—Leu (亮氦酸) 的掺入率, 提示中药能够减轻缺糖缺氧心肌细胞的DNA、RNA、蛋白质等大分子物质的合成, 起到保护心肌细胞的作用。进一步研究显示, 该药能够改善心肌细胞-氧化氦合成酶 (NOS) 基因的表达, 可能亦是精制血府胶囊保护心肌细胞的重要机理之一。
心肌细胞超微结构的研究, 进一步对中药保护心肌细胞提供形态学依据。研究发现缺糖缺氧6小时的心肌细胞核畸形, 染色体边缘浓缩, 线粒体肿胀, 嵴消失, 甚至出现空泡变性, 此外, 肌原结构破坏, 有些区域偶见Z膜和A带, I带模糊不清或消失。有些肌原纤维有断裂和破碎, 分别加用黄芪、当归, 当归养血汤等后, 大部分细胞核正常、染色质均一, 肌原纤维内粗细肌丝排列整齐, Z膜、A带和I带清楚。局部未见肌原纤维断裂破碎, 说明上述中药有较好的抗心肌细胞缺糖缺氧损伤作用。熊胆能够明显恢复缺糖缺氧心肌细胞的核畸形、线粒体及肌浆网肿胀, 并与对照组比较, 糖元增加, 分布均匀。另外, 中药对缺氧再给氧对心肌细胞结构性损伤也有很好的保护作用。正常细胞超微结构清晰, 缺氧15分钟心肌细胞结构基本正常, 仅偶见线粒体嵴变平、消失, 而缺氧复氧组心肌线粒体损伤明显, 肿胀、嵴溶解消失, 并可见致密体, A带和I带消失。加入酸枣仁皂甙组及SOD组细胞超微结构明显改善, 仅见部分线粒体肿胀, 肌原纤维排列整齐, A带、I带清晰可见。提示:酸枣仁总皂甙有明显的抗缺氧复氧损伤作用。
2 对缺氧再给氧损伤的保护作用
现代病理生理学研究提示:缺氧再给氧损伤主要表现在自由基损伤及钙超载两个方面。研究发现:缺氧再给氧时, 心肌细胞内超氧化构歧化酶 (SOD) 活性降低, 过氧化产物丙二醛 (MDA) 升高, 细胞膜脂质流动性下降, 酸枣仁总皂甙能够剂量依赖地显著降低缺氧再给氧心肌细胞MDA的含量。提高SOD活性。增加细胞膜流动性。说明其具有抗自由损伤的作用。外源性自由基损伤黄嘌呤一次黄嘌呤氧化酶 (x-xo) 系统, 损伤的心肌细胞, 发现损伤后细胞起搏比例明显降低, 电参数 (动作电位幅度、超射、阈电位及最大除极速度) 等均变小, 呈膜损伤改变, 加入西洋参茎叶皂甙后细胞起搏比例及电参数与正常组对比改变不明显, 说明该药有抗外源性自由基损伤的作用。在众多抗自由基损伤中药中, 人参的研究尤为深入。应用电子自旋共振法 (ESR) 检测人参各组份抗外源性自由基损伤 (x-xo系统) 时, 心肌细胞内自由基的含量, 发现11种人参皂戒单体中, 有8种单体 (Rg1、Rb1、Re、Rb2、RL、Rg2、Rb3、Rk1) 可使心肌细胞内自由基明显少于对照组, 有一种单体Rd对自由基含量无明显影响, 另二组单体Rf、R0使细胞内自由基数量明显高于对照组。提示:人参皂甙净效应有良好的抗自由基损伤作用, 但不同组份可出现效应迥异。作者认为, 这主要取决于与甙元相连的糖基链, 其中达玛烷型四环三萜被认为是抗自由基作用最主要的甙元基团。
近年来, 应用膜片钳技术成功地观察到心肌细胞膜上不同离子电流进行离子通道的研究。应用该技术确证了人参二醇组、人参三醇组单体有钙通道阻滞作用, 表现为钙离子通道的开放时间及开放频率减少。进一步研究人参皂甙单体Rh1等, 结论基本相同, 表明人参保护心肌细胞的另一可能机理为钙阻滞。
3 对病毒、化疗药物损伤的保护作用
应用45Ca示踪发现, 黄芪能够减轻柯萨其病毒B3 (CB3) 感染心肌细胞的继发性钙超载, 并对细胞内病毒的RNA复制具有抑制作用。研究证实:牛磺酸可保护CB3病毒感染的心肌细胞, 其作用可能与Ca2+阻滞有关。近年来, 中药复方制剂抗病毒感染也出现了可喜的苗头, 研究发现心肌宁可明显抑制CB3吸附细胞表面, 并直接灭活病毒, 为临床中药抗病毒性心肌损伤提供可靠的实验依据。
在临床中观察到, 生脉散可以减轻化疗病人的心肌受损, 但在培养的心肌细胞实验中并未发现生脉散有直接心肌细胞保护作用。提示中药抗化疗损伤心肌作用, 体液因素不可忽视。
细胞损伤 篇2
(2)胆红素(bilirubin)：也是在吞噬细胞内形成的一种血红蛋白衍生物。在生理情况下，衰老的红细胞在单核吞噬细胞中被破坏，其血红蛋白被分解为珠蛋白、铁及胆绿素，后者还原后即成为胆红素，进入血液。血中胆红素过多时则将组织染成黄色，称为黄疸。胆红素一般呈溶解状态，但也可为黄褐色折光性小颗粒或团块。在胆道阻塞及某些肝疾患时，肝细胞、毛细胆管及小胆管内可见许多胆红素。黄疸明显时，胆红素颗粒亦可见于kupffer细胞、肾小管上皮细胞内，并可在肾小管腔内形成胆汁管型。但人体因有血脑屏障的保护，胆红素通常不能进入脑和脊髓，而在新生儿则由于血脑屏障尚不完善，故在高胆红素血症(hyperbilirubinemia)时，大量胆红素可进入脑细胞内，使其氧化磷酸化过程受障，能量产生受抑，细胞乃发生变性，引起神经症状。肉眼观可见多处神经核(豆状核、下丘脑、海马回等)明显黄染，故称之为核黄疸。
(3)脂褐素(lipofuscin)：为一种黄褐色细颗粒状色素，其成分约50%为脂质，其余为蛋白质及其他物质。脂褐素颗粒为细胞内自噬溶酶体(autophagolysosome)中的细胞器碎片发生某种理化改变后，不能被溶酶体酶所消化而形成的一种不溶性残存小体。正常人的附睾上皮细胞、睾丸间质细胞以及某些神经细胞的胞浆中可含有少量脂褐素。老年人及一些慢性消耗性疾病患者的肝细胞、肾上腺皮质网状带细胞的胞浆以及心肌细胞核两侧的胞浆中，均可出现脂褐素，故此色素又有消耗性色素之称。脂褐素颗粒在电镜下呈典型的残存小体(residual bodies)结构。
细胞损伤 篇3
[关键词]间充质干细胞；神经损伤；疗效
[中图分类号] R651.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2012）02-25-02
Clinical analysis of treatment of the esenchyme stem cell in nerve injury
ZHAO Hetai LI Jiangtao ZHANG Xiaobei LI Wei YANG Shuqing QIN Xueyan LI Ding
HE Long
The Stem Cell Center,the 303 Hospital of PLA,Nanning 530021，China
[Abstract] Objective discusses methods mesenchymal stem cells treatment nerve damage clinical curative effect. Methods selection in December 2010 to June 2011 in our hospital for treatment of nerve damage in 31 cases of patients as the research object,31 cases clinical neurological damage of patients targeted mesenchymal stem cell therapy,， the more effect; Results the treatment effect of the observation that effective number for 24 cases, 77.42%,and other patients after 2 to 3 course of symptomatic treatment are different degree of better,patients much performance is feeling or movement function improved obviously,urine to control ability is obviously increased. To study the crowd nerve damage time distribution analysis results for 56.7±11.6 months. Clinical therapy appear harmful response mainly for the fever,headache,small of the back pain,symptomatic treatment basically disappeared,did not appear other adverse reactions. Conclusion the mesenchymal stem cells nerve damage treatment clinical curative effect is good,should strengthen clinical promotion.
[Key words] Mesenchymal stem cells; Nerve damage; Curative effect
神經损伤是一种临床多发病，尤其多见于神经内科。若临床治疗方法不当常会引起神经功能受损，引发不可逆的损害。对于神经损伤的临床治疗方法众多，本研究选择间充质干细胞治疗进行研究，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本研究选择2010年12月～2011年6月在笔者所在医院进行治疗的神经损伤的患者31例进行研究，其中男19例，女12例，男略多于女，平均年龄（34.7±8.9）岁，最大50岁，最小19岁，神经损伤原因分布情况分布显示，车祸患者11例，高空坠落7例，精神压力过大5例，砸伤和跳水患者各2例，摔伤2例，脊髓炎和脊髓栓综合征1例。采用对症治疗的方法进行治疗，所有患者均签署知情同意书，愿意参加本研究。
1.2 临床治疗
对研究患者在治疗前均进行凝血功能、心肺、肝肾功能障碍情况分析，要求体格检查、血常规、尿常规和便常规检查均正常，无严重病变。参考文献提供的方法[1]，进行间充质干细胞制备，简单的描述方法为收集脐带并去除外膜和动静脉血，将脐带剪成0.5 cm2的组织细胞进行提取，加入等体积的胶原酶中，在37 ℃进行消化过夜。次日加入两倍体积的胰蛋白酶37 ℃消化1 h[1]，离心收集活细胞并进行计数。在培养瓶中进行传代培养，采用流式细胞术进行细胞表型测定，常规感染源进行鉴定并收集细胞放于-80 ℃的冰箱中备用。在患者住院4 d开始腰穿，进行脊髓鞘中注射间充质干细胞，1次/周，1个疗程为4周，治疗过程中应辅助地塞米松进行蛛网膜下腔注射治疗。治疗中应注重康复功能锻炼。治疗后进行随访，观察患者的治疗效果及不良反应的发生情况，主要的不良反应为发热、头疼、腰痛等。
1.3 统计学处理
采用SPSS13.0统计软件进行统计描述与分析，采用t检验，检验水准为0.05。
2 结果
2.1 临床疗效分析
对31例临床神经损伤的患者进行有针对性的间充质干细胞治疗后，有效例数为24例，占77.42%，其他患者经2 ~ 3疗程的对症治疗均有不同程度的好转，患者多表现为感觉或者运动功能明显改善，对大小便的控制能力明显增强。对研究人群进行手术前后ASIA评分显示，治疗后1个月与治疗前比较在痛觉、触觉、日常生活能力和运动均有明显的改善（P＜0.05），其中轻微性神经损伤患者中有23例患者有效，占85.19%，严重性神经损伤中治疗显示有1例患者治疗有效，占25.00%。
2.2 治疗有效时间与不良反应
对研究人群神经损伤时间分布情况分析显示为（56.7±11.6）个月，最长时间197个月，最短时间17个月。研究人群中采用对症治疗过程中出现不良反应主要为发热、头痛、后腰疼痛，采用对症治疗后3 d内临床症状基本消失，未出现其他不良反应。
3 讨论
间充质干细胞是细胞生物学中干细胞家族中的重要组成成员，其来源于发育早期的胚胎的中胚层和外胚层[2]。其最初在人群的骨髓中发现，主要临床特征为具有自我更新、多向分化、造血支持、免疫调控等特点，其临床使用越来越引起人群的重视。在体内或体外一定的诱导环境下可分化为脂肪、肌肉、心肌、肌腱、韧带、肝、骨、软骨、内皮等多种人体组织细胞，采用连续传代培养以及冷冻保存的方法可依然具有多向分化的潜能，临床常作为理想组织器官损伤修复，尤其是神经损伤[3]。临床研究证实，采用间充质干细胞还可以治疗多种血液系统疾病、心血管疾病。神经损伤包括脑外伤、脑血管硬化、脑溢血、脑血栓、后遗症、脑炎与脑膜炎后遗症、脱髓鞘疾病等脑血管病后遗症。采用间充质干细胞治疗神经损伤取得了良好的临床效果，应加强临床推广。
本研究中31例患者中有效的例数为24例，占77.42%，其他患者经2 ~ 3个疗程的对症治疗均有不同程度的好转，患者多表现为感觉或者运动功能明显改善，对大小便的控制能力明显增强。对研究人群神经损伤时间分布情况分析结果为（56.7±11.6）个月。临床治疗出现不良反应主要为发热、头痛、后腰疼痛，采用对症治疗后基本消失，未出现其它其他不良反应。提示本治疗是安全的，可以改善大部分不完全性SCI患者的神经功能，提高这些患者的生活质量。
[参考文献]
[1] Avanzini MA， Bernardo ME， Cometa AM， et al. Generation of mesenchymal stromal cells in the presence of platelet lysate： a phenotypic and functional comparison of umbilical cord blood- and bone marrow-derived progenitors [J]. Haematologica， 2009， 94（12）：1649-1660.
[2] 黄红云.中枢神经修复学[M].北京：科学出版社，2009：221-225，234-235.
[3] Okano H，Ogawa Y，Nakamura M， et al.Transplantation of neural stem cells into the spinal cord after injury[J].Semin Cells Dev Bio，2003，14（3）：191-198.
吸二手烟半小时即损伤细胞 篇4
美国研究人员在一项新的研究中发现, 即便只是短时间吸入二手烟, 也会对健康造成损害。
根据这项研究, 在普通的酒吧环境中, 吸入30分钟的二手烟, 就足以对年轻健康的非吸烟者的血管造成损害。不仅如此, 身体的自然修复机能手烟的环境下受到抑制。
研究还表明, 二手烟环境对身体造成的有害影响至少持续24小时, 比人们过去认为的要长得多。吸入二手烟导致内皮祖细胞无法正常发挥作用, 而血液中的内皮祖细胞在身体自动修复受损伤血管的过程中发挥着重要作用。
细胞损伤 篇5
第一节 概述
生活机体的细胞和组织经常不断地接受内外环境各种刺激因子的影响，并通过自身的反应和调节机制对刺激作出应答反应。这种反应能力可保证细胞和组织的正常功能，维护细胞、器官乃至整个机体的生存。但细胞和组织并非能适应所有刺激的影响，当刺激的性质、强度和持续时间超越了一定的界限时，细胞乃受损甚至死亡。
然而，在正常和发生了适应性改变的、损伤的死亡的细胞之间，在结构和功能上往往并无截然的界限。可复性的和不可复性的改变之间，也常难以截然区分。总之，这些过程都是逐渐过渡的。至于一个刺激究竟会引行细胞的适应性改变、损伤还是死亡，也只有待其作用一定的时间(潜伏期)，细胞和组织出现明确的结构变化以后，才能从形态上加以判断。这段潜伏期的长短不仅决定于刺激因子的性质和强度，还取决于受累细胞和组织的种类。例如中枢神经系统特别是神经节细胞对于缺氧的耐受能力就远不如结缔组织细胞，也不如肝、肾、肺等器官的实质细胞。常温下大脑缺氧后尚能复苏的时间极限为8～10分钟(大脑壳核又比其他部位如脑干核团更为敏感)，肝通常为30～35分钟，肾为60～180分钟，肺约为60分钟(支气管上皮约为90分钟)。
细胞损伤 篇6
关键词 重度颅脑损伤 失血性休克 细胞因子
资料与方法
临床资料:选择2004年6月-2006年10月收治入院的27例重度颅脑损伤合并其他部位多发伤的患者，ISS评分均≥16分；根据是否伴有失血性休克将27例患者分为两组:重创无休克组和重创伴休克组另外，随机选取14例健康体检者作为对照组。
研究对象构成及排除标准: A组为14例健康体检者，男性8例，女性6例；B组为重度颅脑损伤无失血性休克患者16例，男性12例，女性4例，其中合并四肢闭和性骨折7例，单纯肋骨骨折5例，脊柱骨折3例；C组为重度颅脑损伤伴失血性休克患者11例，男性8例，女性3例，其中合并四肢开放性骨折6例，胸部损伤3例。
排除标准：研究对象如原有心、肝、肾的基础疾病或创伤直接导致心、肾、肝损伤者予以排除。
标本采集和测定指标:实验组B组和c组对象标本采集与指标测定:在患者入院后的第1天(T1),第3天(T2)、第5天(T3)、第14天(T4)晨间空腹抽取静脉血6~8ml，分别置于普通干管中，血样标本在离心后取上清液，-80℃保存于深低温冰箱，之后在有效期内测定血清标本中的白介素-2 (IL-2)、白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)的浓度。对照组A组对象标本采集与指标测定:随机抽取20名空腹健康体检者静脉血6~8ml，血样标本的处置和指标测定方法均同实验组。
统计学处理:全部资料输入SPSS10. 0软件包进行分析处理，计量资料数据均用X ±S表示。取P<0. 05为统计学有显著性差异。
结 果
重度颅脑损伤伴有或不伴有失学性休克时IL-6的动态变化：B组和C组IL-6的血清浓度除B组T1、T4时点外，其他与A组基础值比较差异有显著性（P<0.05或P<0.01）,而C组的IL-6的血清浓度与B组同时点值差异均有显著性(P<0.05)。B组内IL-6的血清浓度在T2、T3时点与T1相比较差异有显著性(P<0.05)，在T4时点值与Ti相比差异无显著性（P>0.05）；C组内IL-6的血清浓度在T2、T3、T4时点与T1相比较差异有显著性（P<0.05或P<0.01）。数值见表1。重度颅脑损伤伴有或不伴有失学性休克时IL-2的动态变化C组IL-2的血清浓度在T3、T4时点与A组基础值比较有显著性差异（P<0.05），而B组和C组IL-2的血清浓度在同时点值之间比较均无显著性差异（P>0.05）。B组内IL-2的血清浓度在T2、T3时点与T1相比有显著性差异（P<0.05），在T4时点值与T1相比无显著性差异（P>0.05）；C组内IL-2的血清浓度在T2、T3、T4时点与T1相比均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。
重度颅脑损伤伴有或不伴有失血性休克时IL-10的动态变化B组和C组IL-10的血清浓度除B组T1、T4和C组T1时点外,其他与A组基础值比较差异有显著性（P<0.05或P<0.01）,而C组IL-10的血清浓度在T2、T3、T4与B组同时点值比较均有显著性差异（P<0.05）。B组内IL-10的血清浓度在T2、T3时点与T1相比有显著性差异（P<0.05），在T4时点值与T1相比无显著性差异（P>0.05）；C组内IL-10的血清浓度在T2、T3时点与T1相比差异均有显著性（P<0.05或P<0.01）。
讨 论
目前己知的细胞因子包括肿瘤坏死因子、白细胞介素、干扰素、生长因子、集落刺激因子等。机体在严重创伤、细菌毒素等刺激因素作用下，都会首先不同程度地释放促炎性细胞因子如TNF- α、IL-2, IL-6等炎性介质，严重时会引起全身炎性反应综合征:随之机体又可释放抗炎性细胞因子如IL-4, IL-10, TGF- D等内源性抗炎介质。一般情况下，体内促炎反应和抗炎反应保持平衡，维持机体内环境的稳定，不会引起机体脏器功能的损害。一旦失去平衡，即可导致炎症反应失控，易引起多器官功能障碍综合征,增加患者并发症的发病率和病死率。各种炎性细胞因子是机体对严重创伤诱发的全身炎性反应的关键性介质，其血清浓度的高低对患者疾病的转归产生着重要影响。
细胞损伤 篇7
绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)Makino)又名天堂草、福音草,是葫芦科绞股蓝属多年生草本攀岩植物,中医认为绞股蓝性凉、味苦,入药具有消炎解毒、止咳祛痰的功效。现代药理学研究发现,绞股蓝皂苷为绞股蓝的主要活性成分,具有降血脂、抗肿瘤、保护肝脏等多种药理作用[5]。近年来某些学者发现绞股蓝皂苷对中枢神经系统也具有一定的保护作用,可明显改善D-半乳糖、SAMP8、β淀粉样蛋白(Aβ1~40)以及脑血管损伤等痴呆动物模型的学习记忆能力,保护并修复已受损的中枢神经系统,这种保护作用可能与绞股蓝皂苷的抗氧化及抗炎机制有关[6,7]。
本研究从体外实验的角度将研究对象由动物模型转变成常见的PC12神经细胞株,采用低糖低血清、谷氨酸及β淀粉样蛋白(Aβ25~35)3种物质诱导该细胞,模拟不同发病机制的老年痴呆症模型,通过研究绞股蓝皂苷对PC12细胞的保护作用,为老年痴呆症的治疗提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株
PC12细胞由中国医学科学院基础医学研究所细胞中心提供。
1.2 药品与试剂
绞股蓝皂苷(安康正大制药有限公司,国药准字Z10900013);DMEM高糖培养基(含10% 小牛血清,10%马血清,100U·mL-1青霉素,100μg·mL-1链霉素)、DMEM无糖培养基(含1%小牛血清,1%马血清,100U·mL-1青霉素,100μg·mL-1链霉素)(美国Gibco公司);甲基噻唑蓝四氮唑盐、谷氨酸、β淀粉样蛋白(Aβ25~35)(美国Sigma公司);二甲基亚砜、胰蛋白酶(美国Biotium公司);乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)
1.3 仪器
HERAcell 150i型CO2 培养箱(美国Thermo公司);Olympus IX51型倒置显微镜(日本Olympus公司);Allegra 25R型高速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特有限公司);酶标仪(美国Thermo公司)。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养与分组
将PC12 细胞接种到含有10% 小牛血清的DEME高糖培养基中,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养,取对数生长期的细胞进行实验。实验随机分为5 组:空白对照组、模型组、绞股蓝低剂量(50μg·mL-1)组、绞股蓝中剂量(200μg·mL-1)组和绞股蓝高剂量(500μg·mL-1)组。
1.4.2 绞股蓝皂苷对PC12细胞增殖的影响
将对数生长期的PC12细胞用0.25%的胰蛋白酶进行消化,吹打成单细胞悬液,按1×108个/L的密度接种到96孔培养板中,每孔100μL,置于CO2培养箱中培养24h后,吸去DEME高糖培养液,加入新鲜配制的浓度为50、200、500μg·mL-1的绞股蓝皂苷培养液,对照组加入等量的高糖DEME培养液,实验中每组设6个平行,继续培养24h后采用MTT法检测细胞存活率。
1.4.3 绞股蓝皂苷对低糖低血清损伤PC12细胞的影响
将单细胞悬液按每毫升1×108个的密度接种到培养板中培养24h后,分别加入低、中、高剂量组的绞股蓝皂苷培养液,对照组加入等量的空白DEME高糖培养液,待细胞适应1h后,再向模型组和绞股蓝低、中、高剂量组加入DMEM无糖培养液,对照组仍用等量的DEME高糖培养液进行补充,实验中每组设6个平行,待细胞培养到24h后采用MTT法检测细胞存活率。
1.4.4 绞股蓝皂苷对谷氨酸损伤PC12细胞的影响
方法同1.4.3,将模型组和给药组中的低糖低血清换成等量的20mmol·L-1的谷氨酸,MTT法测定细胞存活率。
1.4.5 绞股蓝皂苷对Aβ25~35损伤PC12细胞的影响
方法同1.4.3,将低糖低血清换成等量的10μmol·L-1的Aβ25~35,MTT法测定细胞存活率。
1.4.6 细胞存活率和及乳酸脱氢酶(LDH)活力的测定
细胞培养前4h,向培养板中加入5mg·mL-1的MTT 20μL,于37℃、5%CO2的培养箱中继续培养,待培养液中有蓝紫色的结晶出现后,吸去培养液,加入150μL的DMSO,震荡15 min,待紫色结晶完全溶解,用酶标仪测定570nm处的光密度值,并计算细胞存活率,具体公式如下:
收集培养板中的培养液,取50μL参照乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒说明书测定LDH活力。
1.4.7 统计学处理
采用SPSS统计学软件对实验数据进行统计分析,计量资料用(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,p<0.05表明差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 绞股蓝皂苷对PC12细胞增殖的影响
由图1可以看出,采用不同剂量的绞股蓝皂苷处理PC12细胞24h后,细胞存活率均显著高于对照组(p<0.01);随着绞股蓝皂苷剂量的不断增加,细胞存活率也逐渐升高,这可能是由于绞股蓝皂苷具有抗氧化作用的特性,减少自由基对PC12细胞的损害,促进细胞继续增殖。
注:与对照组比较##p﹤0.01Note:compared with normal group##p﹤0.01
2.2 绞股蓝皂苷对低糖低血清损伤PC12细胞的影响
正常P12细胞经低糖低血清处理后,其细胞存活率明显下降(p<0.01),这说明低糖低血清能引起PC12细胞出现损伤,当加入不同剂量的绞股蓝皂苷后,细胞存活率显著提高,在中、高剂量组中细胞存活率甚至超过了对照组,可见绞股蓝皂苷不仅能缓解低糖低血清造成的细胞损伤,而且还能进一步促进细胞的增殖。具体结果如图2所示。
注:与对照组比较##p﹤0.01;与模型组比较**p﹤0.01Note:compared with control group##p﹤0.01;compared with modle group**p﹤0.01
2.3 绞股蓝皂苷对谷氨酸损伤PC12细胞的影响
由图3可见,采用谷氨酸对PC12细胞进行处理后,谷氨酸模型组与正常对照组相比,细胞存活率显著下降(p<0.01),添加不同剂量的绞股蓝皂苷对PC12细胞进行预处理后,细胞存活率相比模型组明显上升(p<0.01,p<0.05),这说明绞股蓝皂苷可对抗谷氨酸,保护PC12细胞免受损伤。
注:与对照组比较##p﹤0.01;与模型组比较*p﹤0.05,**p﹤0.01Note:compared with control group##p﹤0.01;compared with modle group*p﹤0.05,**p﹤0.01
2.4 绞股蓝皂苷对损伤Aβ25~35PC12细胞的影响
由图4 可以看出,添加10μmol· L-1的Aβ25~35后,模型组与对照组相比细胞存活率明显下降(p<0.01),可见Aβ25~35对正常PC12细胞具有明显损伤;添加不同剂量的绞股蓝皂苷对细胞进行预处理后,给药组的细胞存活率明显高于模型组(p<0.01),这说明绞股蓝皂苷对Aβ25~35引起的细胞损伤具有明显的保护作用。
注:与对照组比较##p﹤0.01;与模型组比较**p﹤0.01Note:compared with control group##p﹤0.01;compared with modle group**p﹤0.01
2.5 绞股蓝皂苷对乳酸脱氢酶(LDH)活力的影响
由表1 可以看出,低糖低血清、谷氨酸和Aβ25~35对PC12细胞处理后,LDH含量显著增加(p<0.01)。乳酸脱氢酶(LDH)的水平高低是反映细胞是否受到损害的一个敏感性指标。当细胞出现损伤时,细胞膜通透性将增加,细胞内LDH将逐步释放到培养液中,导致培养液中LDH含量增多,因此测定培养液中LDH水平的高低可以判断细胞损伤的程度[8]。LDH水平越高说明细胞受损程度越严重,因此以上3种物质对PC12细胞的损伤程度依次为谷氨酸>Aβ25~35>低糖低血清;实验中加入不同剂量的绞股蓝皂苷后,与模型组相比,培养液中LDH释放水平显著降低(p<0.05),且降低程度与绞股蓝皂苷呈剂量依耐性,这进一步证实了绞股蓝皂苷可减少LDH的释放,对低糖低血清、谷氨酸和Aβ25~35引起的细胞损伤有明显的保护作用。
注:与对照组比较##p ﹤0.01;与模型组比较*p ﹤0.05,**p ﹤0.01Note:compared with control group##p ﹤0.01;compared with modle group*p ﹤0.05,**p ﹤0.01
3 讨论
阿尔茨海默病(AD)是一种发病机制非常复杂的神经系统退行性疾病,人们根据发病机制的不同,在体外构建了各种神经细胞病理模型,包括淀粉样蛋白损伤模型、过氧化氢损伤模型、谷氨酸损伤模型、缺血缺氧损伤模型等,这些模型构建方法简单,周期较短,重复性好,现已成为AD药物筛选和神经系统病理机制研究中的常见模型[9~12]。PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株,具有神经内分泌细胞的一般特征,培养过程中因其具有可传代的特点而广泛应用于神经生理与神经药理研究中。
神经细胞代谢异常活跃,为维持神经系统正常运行,神经细胞需要不断地从外界摄取能量。研究发现,当神经细胞处于缺血、缺氧的环境中时,其能量代谢将出现障碍,引起神经元变性、凋亡,因此低糖低血清损伤模型常作为体外血管性痴呆模型。
谷氨酸是中枢神经系统中一种十分重要的兴奋性递质,参与各种神经功能活动。近年来研究发现,谷氨酸不仅可作为营养因子促进神经元及轴突的生长发育,同时也是一种神经毒素,它能激活谷氨酸受体,导致神经元代谢紊乱并出现肿胀而死亡,同时还可竞争神经细胞膜上的谷氨酸/胱氨酸逆转因子,破坏细胞对胱氨酸的摄取,导致胞内谷胱甘肽含量下降,活性氧大量积累,最终迫使神经细胞出现死亡[13]。
β淀粉样蛋白(Aβ)是AD老年斑的主要成分,由β-淀粉样蛋白前体(APP)通过蛋白酶水解生成。正常情况下,APP会在α蛋白酶和γ蛋白酶的帮助下进行水解,该过程中不会产生β淀粉样蛋白;但当有β蛋白酶存在时,APP会改变氨基酸水解位点,生成Aβ1~42/43和Aβ1~40,其中Aβ1~40可引起神经元功能丧失进而导致死亡[14]。研究发现,在体外水溶液中,Aβ1~40中25到35位氨基酸残基可形成稳定的聚集,产生神经毒性,因此Aβ25~35常作为体外神经细胞毒性实验的AD模型[15]。
细胞损伤 篇8
1 材料和方法
1.1 材料
选用普通级SD雄性成年大鼠 (重庆市中药研究院实验动物中心提供, 生产许可证号:SCXK (渝) 2007-0006) 50只, 体重250～280 g。
1.2 仪器
BSM-7105K 床边监护仪 (上海光电医用电子仪器有限公司) ;动物人工呼吸机 (浙江大学医学仪器厂DH150) ;UV751GD紫外/ 可见分光光度计 (上海分析仪器厂) ;J E M-1200EX型透射电子显微镜 (日本电子公司) ;LKB 超薄切片机 (LEICA EMC6型LEICA公司) ;流式细胞仪 (美国贝克曼库尔特有限公司) 。
1.3 试剂
葡萄糖酸锌: 天津市光复精细化工研究所 (批号: 2010-05-10) ;肌酸激酶试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒: 南京建成生物工程有限公司。Annexin-V- FITC∕ PI细胞凋亡检测试剂盒 :北京宝塞生物技术有限公司。
1.4 方法
1.4.1 心肌缺血再灌注损伤模型制备
大鼠心肌缺血再灌注损伤实验模型[1]:取雄性SD大鼠, 以乌拉坦 (1 g/kg) 腹腔注射。描记肢体Ⅱ导联心电图。气管插管, 自左侧第1～3肋开胸, 采用人工呼吸机正压呼吸。暴露大鼠心脏后, 拉紧结扎线, 使硅胶管压迫冠状动脉左前降支而致闭塞, 切断结扎线再通。①假手术组, 只穿线不结扎;②葡萄糖酸锌167 (1/15LD50) , 250 (1/10LD50) , 357 (1/7LD50) mg/kg剂量组, 分别以相应剂量葡萄糖酸锌 (溶于蒸馏水中, 2 ml) 灌胃, 2 ml/次, 上下午各1次, 依据葡萄糖酸锌的半衰期:t1/2= (2.46±0.30) h[2], 故两次灌胃给药间隔时间为2.5 h。于末次灌胃1 h后行冠状动脉左前降支结扎30 min, 再灌注60 min;③缺血再灌注模型组, 给予葡萄糖酸锌各剂量组等容量的0.9%氯化钠注射液灌胃, 其他处理同上。
1.4.2 CK和LDH活性测定
于实验结束后立即于左颈总动脉取血5.0 ml, 待测血清肌酸激酶和乳酸脱氢酶活性。
1.4.3 流式细胞仪检测细胞凋亡
于实验结束后立即取心尖及左室心肌组织5 mm3, 4℃冰0.9%氯化钠注射液洗去血污, 用Annexin-V-FITC/PI流式细胞仪检测细胞凋亡。将心肌组织制成细胞悬液, 细胞浓度为1×109/L。取1 ml细胞, 1000 r/min, 4℃离心10 min, 弃上清。加入1 ml冷的磷酸盐缓冲液, 轻轻震荡使细胞悬浮。重复上述步骤2次。将细胞重悬浮于200 μl BindingBuffer。加入10 μl AV和5μl PI, 轻轻混匀, 室温避光反应15 min。加入300 μl Binding Buffer, 在1 h内上机检测。
1.4.4 电镜观察心肌细胞超微结构
于实验结束后立即取心尖及左室心肌组织1 mm3, 4℃冰0.9%氯化钠注射液洗去血污, 常规电镜样品包埋, 半薄切片, 光镜选区定位, 超薄切片, 铀、铅双染, 透射电镜下观察心肌细胞超微结构变化。
1.5 统计学分析
采用SPSS 12.0软件进行统计学处理。所有数据以
2 结果
2.1
各组大鼠心肌缺血再灌注心律失常发生率及ST段指标的变化, 见表1。
2.2
各组大鼠血清中CK、LDH活性及心肌细胞凋亡指数的变化, 见表2。
注:与假手术组相比aP< 0. 01; 与缺血再灌注模型组相比bP< 0. 01
注:与假手术组相比aP< 0. 01; 与缺血再灌注模型组相比bP<0. 01
2.3
各组大鼠心肌细胞超微结构的变化, 见图1。
2.3.1 假手术组
心肌细胞肌丝排列整齐, 粗细肌丝清晰可见, 肌节明暗带清楚, 线粒体结构正常, 嵴排列规则, 核膜清晰完整。
2.3.2 缺血再灌注模型组
心肌细胞肌丝排列疏松、紊乱, 局部肌丝断裂、溶解, 肌丝明暗带模糊不清, 线粒体嵴部分断裂, 有空泡, 核膜不清晰。
2.3.3 葡萄糖酸锌低剂量组
较模型组心肌纤维超微结构损伤程度有所减轻, 心肌细胞肌丝排列较规则, 肌丝明暗带欠清楚, 局部肌丝断裂、溶解, 线粒体肿胀减轻, 嵴部分断裂, 有空泡, 核膜不清晰。
2.3.4 葡萄糖酸锌中剂量组
心肌细胞肌丝排列较规则, 肌丝明暗带较清楚, 线粒体肿胀, 嵴部分断裂, 有空泡, 核膜较清晰。
2.3.5 葡萄糖酸锌高剂量组
心肌细胞肌丝排列规则, 肌丝明暗带清楚, 线粒体肿胀, 嵴部分断裂, 有空泡, 核膜较清晰。
3 讨论
细胞凋亡是缺血再灌注 (I/R) 损伤早期细胞死亡的主要方式。其发生机制包括氧自由基学说、钙超载学说、凋亡学说等。研究者在心、脑、肝、肺、肾、肠等多种器官缺血再灌注损伤模型上均观察到细胞凋亡[3,4]。Rentsch[5]等研究证实随着冷灌注保存及再灌注时间的延长大鼠移植肝细胞凋亡数显著增加, 而且bax表达增强。张浩[6]等研究表明大鼠冷灌注保存及再灌注后肝脏均有肝细胞凋亡发生, 且呈阶段性。在冷灌注保存肝组织中可检测到Bax及Fas, 未检测到Bcl-2, 肝移植再灌注后肝组织中可检测到Bax、Fas及Bcl-2。许多研究表明, 锌可调控细胞凋亡。多数学者认为锌可抑制细胞凋亡, 其机制可能与其阻断Ca2+凋亡信号的传导系统、影响蛋白激酶C信号系统以及抑制核酸内切酶等有关[7]。有研究表明补充携硒、锌、维生素E的大豆磷脂脂质体可通过保护生物膜尤其是线粒体膜而减少心肌细胞的凋亡和坏死, 发挥保护缺血心肌的效应[8]。
本实验研究结果表明, 与模型组相比, 补锌组心律失常发生率、CK和LDH活性、细胞凋亡指数均降低, 电镜观察显示补锌组心肌细胞超微结构损伤明显减轻, 心肌细胞肌丝排列规则, 肌丝明暗带清楚, 线粒体肿胀, 嵴部分断裂, 有空泡, 核膜较清晰。本研究证实葡萄糖酸锌具有保护缺血再灌注损伤心肌的作用, 其机制可能通过抑制心肌细胞凋亡和减轻心肌细胞超微结构损伤实现的。传统的补锌剂硫酸锌不易吸收, 对消化系统有副作用, 而葡萄糖酸锌则具有显效快, 生物利用度高, 副作用小, 使用方便等优点。本实验结果可为临床应用锌制剂治疗心血管疾病提供一定的理论基础。
参考文献
[1]齐志敏, 王倩, 张莹.大鼠心肌缺血再灌注损伤实验模型开胸方法的研究.中国临床康复, 2004, 8 (30) :6620-6621.
[2]林秀云, 郭琦.兔体内甘草酸锌和葡萄糖酸锌药动学比较.微量元素与健康研究, 1994, 11 (3) :4-5.
[3]Jones BA, Gores GJ.Physiology and pathophysiology of apoptosis in epithelial cells of the liver, pancreas, and intestine.AmJ Physiol, 1997, 273 (6) :1174-1188.
[4]Noda T, Iwakiri R, Fujimoto K, et al.Programmed cell death in-duced byischemia-reperfusion in ratintestinal mucosa.AmJ Physi-ol, 1998, 274 (2) :270-276.
[5]Rentsch M, Beham A, Iesalnieks I, et al.Impact of prolonged cold ischemia and reperfusion on apoptosis, activation of caspase3, and expression of bax after liver transplantation in the rat.Transplant Proc, 2001, 33 (12) :850-1.
[6]张浩, 钱建民, 王学浩.大鼠肝脏移植再灌注细胞凋亡与凋亡调控的研究.中华实验外科杂志, 2002, 19 (4) :352-353.
[7]Muschel RJ, Bernhard EJ, Garza L, etal.Induction ofapoptosis at different oxygen tensions:evidence that oxygen radicals do not me-diate apoptotic signaling.Cancer Res, 1995, 55 (5) :995-998.
细胞损伤 篇9
1 资料与方法
1.1 一般资料
60例均为我院收治的脊髓损伤的住院患者, 全部病例均经CT或MRI诊断确诊, 其中男性50例, 女性10例, 年龄18～45岁, 平均 (32.5±4.2) 岁, 病程1～10个月。受伤原因均为外伤, 原因如下:车祸32例, 重物砸伤16例, 坠落伤12例, 大部分患者在骨科已进行椎板减压及内固定术。损伤部位:颈髓损伤12例, 胸髓20例, 腰髓28例, 按美国脊髓损伤学会 (ASIA) 残损分级:A级26例, B级20例, C级12例, D级2例。将该组患者随机分为观察组和对照组, 每组30例, 两组在年龄、性别、病程、损伤部位、残损分级方面均具有可比性, P>0.05。
1.2 治疗方法
(1) 对照组:采用综合康复治疗方法, 根据患者损伤程度, 脊柱稳定情况及功能状况进行康复治疗, 具体方法为进行正确的体位摆放, 被动关节活动、持续牵张运动和主动肌力训练, 轮椅技巧训练、按摩、坐位及站位移乘, 平衡训练, 针灸或功能电刺激, 佩带矫形器及支具等。 (2) 治疗组:在对照组的基础上采用间充质干细胞治疗, 治疗前常规检查排除干细胞移植禁忌证, 治疗前由患者签署干细胞治疗知情同意书及伦理同意书。
间充质干细胞的制备:采集经理化检验合格后新生儿脐带, 将脐带剪碎至约1mm×1mm×1mm, 首先经0.1%胶原酶37℃消化30min后, 在经0.125%的胰酶37℃消化30min, 用100目及200目分别进行滤网过滤, 去除未消化的组织, 离心收集细胞。细胞经培养、数次接代后可获得 (1.0～5.6) ×107的间充质干细胞, 再次检验合格后, 可用于移植治疗。使用时将细胞数为1×107的间充质干细胞悬液30mL静脉输注, 同时沿脊柱两侧竖脊肌及骶髂关节区域点状注射按照1:4稀释后的间充质干细胞。定期检查患者血常规、尿常规、肝肾功能、心电图、肌电图、X线胸片、血清免疫球蛋白、C3、C4、血压等指标, 记录患者的不良反应及其好转情况。
1.3 评价指标
比较两组患者治疗前及治疗后90d的感觉评分、运动评分、日常生活能力评分。采用评定表 (第6版) 进行治疗前后感觉与运动评分, 感觉评定为皮节的痛觉和触觉, 共分为0、1、2三级, 痛觉和触觉的总分都为112分。运动功能评定上下肢10块肌肉, 分别为深肘肌、屈肘肌、伸腕肌、屈指肌、小指展肌、伸膝肌、屈髋肌、踝背肌、拇长伸肌、踝蹠屈肌。日常生活活动能力评定采用改良的Barthel指数量表。
1.4 统计学处理
用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料以 (珚x±s) 表示, 组间比较采用t检验;计数资料以百分比描述, 采用χ2检验;以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组治疗效果比较
治疗前两组感觉评分、运动评分、日常生活能力评分无显著性差异, P>0.05。治疗组在治疗90d后的感觉评分、运动评分、日常生活能力评分的改善程度显著优于对照组, P<0.05。见表1。
(±s)
注:治疗前后相比, △P<0.05;治疗组与对照组相比, *P<0.05。
2.2 并发症
治疗组治疗期间出现发热1例, 头痛2例, 予降温及抗炎等对症处理后, 均在移植后2天内消失, 未出现严重并发症中断治疗。
3 讨论
脊髓损伤是较为严重的中枢神经系统的创伤, 患者主要表现为感觉、运动功能部分或完全丧失和大小便失禁。成熟神经元不具备增殖分化能力, 脊髓损伤后不能自我恢复, 因此, 常规治疗方法虽然在一定程度上缓解了脊髓损伤的病理性改变, 但仍不可改变患者的截瘫。间充质干细胞能分泌多种细胞因子, 发挥营养神经的作用, 可在体外细胞因子和体内微环境诱导下分化为神经细胞[3]。间质干细胞移植后向病变部位组织渗透融合, 其在新的环境下表达神经细胞表型, 替代损伤细胞, 作为连接损伤脊髓两断端的桥状结构, 支持并引导宿主轴突再生穿越损伤区, 重建神经环路, 其还能上调神经细胞的可塑性蛋白质, 刺激内源性神经系统的修复机制, 达到恢复神经功能的目的[4]。
本研究结果显示, 在综合康复治疗的基础上采用间质干细胞治疗脊髓损伤, 患者在感觉评分、运动评分、日常生活能力评分的改善方面显著优于综合康复治疗组, P<0.05。间充质干细胞不容易引起宿主的免疫排斥, 本研究中未发现严重排斥反应而终止治疗的病例。这说明采用间充质干细胞治疗脊髓损伤, 能够在近期内显著改善患者的运动和感觉能力, 但远期疗效还有待于进一步观察。
参考文献
[1]谢遵伟, 崔贵祥, 李义, 等.自体骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤疗效观察[J].中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11 (7) :1277-1279.
[2]崔丙周, 李恩, 杨波, 等.人脐血间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究[J].广东医学, 2011, 32 (3) :304-305.
[3]寿纪新, 马林, 付旭东.脐带血干细胞移植治疗脊髓损伤30例临床观察[J].山东医药, 2010, 50 (40) :607-608.
细胞损伤 篇10
1.1 一般材料
2008年6月至2010年2月我科收治的10例运动性脊髓损伤患者, 其中男8例、女2例, 年龄24~48岁, 平均年龄34岁。术前AIS评分A级7例, C级2例, D级1例 (表1) 。选取患者材料时要求脊髓损伤的诊断明确且脊髓损伤部位无压迫性病变并且其他指标良好可以接受手术治疗的患者。
1.2 神经功能的评价及其统计学分析
术前及术后的半年时间内, 按照目前国际通用的SCI评价标准对患者各方面的变化情况进行评价, 利用目前较常用的美国医学方面制定的评分标准 (ASIA) 对手术前后运动、感觉等功能的变化情况进行评估。将所获得的数据用统计学软件进行处理, 在存在统计学意义的P<0.05的范围内采用t检验。
2 结果
根据AIS分级变化可以看出部分患者的肢体感觉情况有所改善。其中3例患者由A级到B级, 2例患者由C级到D级。根据ASIA评分的变化可以看出所有患者术后半年时间内运动功能的评分与术前相比较有显著差异, 均有所提高。
3 讨论
结合以上结果我们可以看出神经干细胞的移植有利于脊髓损伤的修复并且可以明显改善脊髓损伤患者的神经功能。当患者的神经系统遭到损伤后, 受损的神经元很难再生需要被替换。移植的神经干细胞可以存活、融入患者组织的损伤部位中, 与患者的神经细胞之间形成神经元之间的突触样结构, 使中枢神经系统的功能得到一定改善。神经干细胞移植治疗运动性脊髓损伤在临床上的应用仍处于起步阶段, 有很多问题需要我们进一步发现并解决。
参考文献
[1]王磊, 王连仲.神经干细胞与脊髓损伤的治疗[J].中国组织工程研究与临床康复, 2008, 12 (12) :2335～2338.
[2]柴勇, 杨成.神经干细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展[J].滨州医学院学报, 2008, 31 (1) :43～45.
细胞损伤 篇11
【摘 要】 目的：观察血府逐瘀汤对急性肺损伤患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞免疫的影响。方法：随机将40例ALI患者分为治疗组与对照组各20例。对照组采用常规治疗手段；给予无创呼吸机治疗，治疗原发病；治疗组在常规治疗基础上，给予中药血府逐瘀汤辨证治疗，每日1剂，共7d。比较两组患者治疗前后CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的变化。结果：两组患者入院时检测CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值偏低于正常范围，CD8+高于正常，治疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值均有明显上升，差异具有统计学意义（P<005），治疗组治疗后又较对照组治疗后差异有统计学意义（P<001）。结论：血府逐瘀汤对急性肺损伤患者T细胞免疫有明显增强作用，有利于感染的控制，控制ALI病情的恶化。
【关键词】 T淋巴细胞免疫；血府逐瘀汤；急性肺损伤
【中图分类号】R563 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）20-0123-03
急性肺损伤（Acute Lung Injury，ALI）是由局部或全身的多种疾病引起的一种常见危重症，严重者称之为急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS），临床表现为进行性呼吸窘迫和顽固性的低氧血症。其病理表现为急性的肺间质水肿，广泛的肺微血管内皮损害，微血栓形成及肺泡内纤维蛋白沉着。可认为是多脏器功能障碍综合征在肺部的表现[1]。保护性通气功能虽降低了死亡率，但仍是临床常见的危重症及致死率的重要因素，因此，寻求一种新的治疗手段，具有重要的临床意义。急性肺损伤患者常有明显的紫绀，符合中医学的“血瘀病”范畴，血府逐瘀汤是目前临床较为常见的活血化瘀方药，本研究通过观察血府逐瘀汤对ALI患者外周血T淋巴细胞免疫的影响，探讨血府逐瘀汤对ALI患者的保护作用的可能机制。
1 资料与方法
11 一般资料 选择2013年10月至2015年10月在我院住院的ALI患者40例，随机分成治疗组及对照组，每组20例。纳入标准：①有ALI的高危因素，急性起病，呼吸窘迫；②血气分析：PO2>60mmHg（吸氧情况），200<氧合指数<300；③胸部X线检查显示双肺浸润影；④患者神清，可配合无创呼吸机治疗；⑤中医特征：面色灰暗，唇甲紫绀，舌质暗，舌下瘀筋增粗，脉涩；⑥排除心源性肺水肿及需要有创机械通气。其中男性28例，女性12例，年龄32～53岁，其中全身感染引起的脓毒症38例，溺水2例。两组患者在性别、年龄、营养状况（BMI指数、血清白蛋白）感染程度（白细胞）等一般资料比较差异无统计学意义。
12 方法 对照组按ALI指南均给予持续正压无创呼吸机治疗，维持血氧饱和度>92%，治疗原发病，治疗7d。治疗组在对照组常规治疗基础上，给予中药血府逐瘀汤为主的辨证治疗（桃仁15g，红花10g，当归10g，生地黄10g，川芎10g，赤芍12g，牛膝9g，桔梗9g，柴胡10g，枳壳10g，甘草3g），每日1剂，共7d。
13 疗效标准[1] 好转：肺部病灶明显吸收，活动后轻度气促，PO2>80mmHg，间断需要无创呼吸机治疗；明显好转：肺部病灶吸收，无气促，无需无创呼吸机治疗，PO2>80mmHg；氧合指数>300；加重恶化：呼吸困难无缓解，PO2<60mmHg，需要改用有创呼吸机治疗。
14 检测指标 分别于入院当天、治疗后的第8天清晨抽取患者的外周静脉血，采用流式细胞仪测定CD3+、CD4+、CD8+，计算CD4+/CD8+比值；同时检测血常规、血清白蛋白及血氧分压。
15 统计学方法 数据采用SPSS180软件进行统计学分析，计量资料数据以均数加减标准差（x±s）表示，进行方差齐性检验后，采用t检验；计数资料以（%）表示，采用χ2检验，P<005为差异有统计学意义。
2 结果
21 两组病情变化情况比较 治疗组2例患者，对照组5例患者由于病情加重行有创机械治疗，退出研究，余患者经治疗后症状、体征较治疗前有好转，无发生死亡患者。
22 两组治疗前后观察指标变化情况比较 治疗前两组患者白细胞（WBC）、血清白蛋白（ALB）、血氧分压（PO2）及氧合指数（PO2/FiO2）比较无统计学意义（P>005）；治疗后两组患者血氧分压均升高（P<005），氧合指数上升（P<005），且以治疗组差异更为显著（P<005）；治疗后两组白细胞均恢复正常（P<005），但组间差异无统计学意义（P>005）；两组患者血清白蛋白治疗前后比较无明显变化（P>005），组间差异也无统计学意义（P>005）。
23 两组治疗后T淋巴细胞亚群比较 治疗前两组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值偏低于正常范围，CD8+高于正常，两组差异无统计学意义（P>005）；治疗后两组CD3+、CD4+均有明显上升，CD8+下降，两组患者组内比较有统计学意义（P<005），治疗组治疗后又较对照组治疗后差异有统计学意义（P<001）。
3 讨论
ALI在发病机理上，目前较一致的观点是[2]：损伤→系统性炎症反应综合征（SIRS）→全身炎症反应失控→器官功能障碍 MODS这一动态，肺脏是这一连贯的病理过程中，最易受损伤的首位靶器官， ALI可看作是一种急性全身系统的炎症反应的增强，它不仅表现在肺的生理病理的改变，而且影响全身其他器官受累，机体促炎及抗炎反应的失衡。T淋巴细胞是检测机体细胞免疫功能的重要指标，它除了反应机体的细胞免疫能力，同时也参与B细胞的体液免疫反应。根据免疫应答中的功能不同，可将T细胞分成若干亚群，CD3+分子表达在人全部T细胞上，是鉴定T细胞的重要标记，代表了机体外周血成熟T细胞总数；CD4+分子分布在T细胞的辅助细胞诱导亚群和抑制细胞诱导亚群，应用Th细胞克隆培养技术和细胞因子产生的不同，可分为Th1和Th2，Th1以分泌干扰素（IFN）-γ等促炎细胞因子为主，Th2以分泌白介素（IL）-4等抗炎细胞因子为主，两者平衡实际反映了促炎和抗炎的平衡[3]，邱海波等[4]研究发现小鼠急性肺损伤模型中Th1向Th2漂移，说明了急性肺损伤时抗炎反应增强，其认为造成了机体细胞免疫功能低下，调控抗炎反应可能是治疗急性肺损伤的关键；CD8分子分布在抑制性T淋巴细胞和杀伤性T淋巴细胞表面，通过自身和抑制因子在免疫反应中起负向调节作用。T细胞调控的失衡，导致机体易发生感染不控制及出现过强的免疫反应，炎性因子的释放失衡。魏明等[5]研究发现输血相关性急性肺损伤患者的CD8+T淋巴细胞显著增加，而CD4+/CD8+比值降低，说明了机体细胞免疫处于抑制状态。
血府逐瘀汤出自清代王清任的《医林改错》，为活血化瘀的代表方剂。现代研究发现其可降低血液的黏、浓、聚、凝状态，减轻与消除微循环障碍，改善组织与血管血液循环，增加通气/血流比例，改善低氧血症，降低肺动脉压。在统计ALI患者临床症候时，可明显见到患者面色灰暗，唇甲紫绀，舌质暗，舌下瘀筋增粗，脉涩等血瘀证表现。郭昌星等[6]研究发现血府逐瘀汤能够清除SIRS患者氧自由基，阻止炎症反应进一步发展。雷氏[7]发现血府逐瘀汤可降低TNF-α、IL-1、IL-6水平，与急性肺损伤时高表达相反。因此从血瘀证方面研究ALI，从分子水平研究血府逐瘀汤对ALI的治疗是可行的。本研究发现ALI患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+值偏低于正常范围，CD8+高于正常，而经积极无创呼吸机及抗感染等治疗后可明显恢复，患者的血氧分压，氧合指数可明显上升，而治疗组又较对照组效果更为明显，也就从一方面提示了急性肺损伤患者出现了免疫抑制，病情的好转与机体自身免疫力上升是相关的，治疗组能更有效地纠正细胞免疫抑制状态，增加抗感染疗效相关；虽然在两组患者治疗好转率上无统计学意义（P>005），但在微观指标（PO2、PO2/FiO2）上治疗组的缺氧纠正情况更为显著（P<005），这可能与改善了ALI的微血栓形成及肺泡内纤维蛋白的沉积，抑制了机体的高凝状态，改善了氧合相关。ALI发生I型呼吸衰竭，是由于过度的呼吸运动，呼吸肌易发生疲劳，从而造成呼吸肌收缩能力减弱，而影响了肺通气功能，有研究[8]发现BMI与呼吸肌的肌力是呈正相关关系，在本研究中也显示短时间内机体的营养情况（ALB）变化没有统计学意义（P>005），因此迅速控制炎症反应是纠正呼吸衰竭的有效手段之一。
细胞损伤 篇12
1 材料与方法
1.1 试验药物与试剂
苦参素(南京泽朗医药科技有限公司,批号:20141025,纯度≥98%);舒血宁注射剂(神威药业有限公司,7.0 mg/2 m L,批号:Z14030182);DMEM培养基、小牛血清(美国Gibco公司);MTT(美国Sigma公司);谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CPK)含量测定试剂盒(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司);caspase-3单抗(碧云天生物技术有限公司);RNA提取液TRIzol试剂盒(北京Trans Gen公司);c DNA逆转录试剂盒(上海斯信生物科技有限公司);B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、bcl-2S相关X蛋白(bax)的上下游引物(上海博亚生物公司)。
1.2 实验动物
清洁级SD大鼠1 d~3 d乳鼠[8],雄性,购自河北省实验动物中心,许可证号:SCXK(冀)2008-1-003,动物批次号:20150324。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞分离与培养
参照闵清等[8]报道的方法,无菌条件下开胸取心脏并剪取心室组织,剪碎后加入0.1%的胰酶,37℃振荡消化6 min,去上清,沉淀继续用0.1%胰酶于37℃振荡消化6 min,直至组织碎块消化完毕,收集消化上清液,1 500 r/min离心10 min,取沉淀物,加入心肌细胞培养基(10%胎牛血清DMEM,内含105 U/L青霉素和链霉素),垂打均匀,立壁1.5 h。收集未贴壁细胞,调整细胞至6×108个/L,接种于35 mm培养器皿中,37℃,5%CO2,100%湿度,培养72 h,用于实验。
1.3.2 分组与H/R模型制备
取经培养72 h后状态良好的原代乳鼠心肌细胞,随机分为空白对照组、缺氧/复氧(H/R)模型对照组、OMT(20μg/m L、40μg/m L和80μg/m L)干预组和舒血宁注射液(SXN,100μg/m L)干预组(阳性对照组),每组设10个复孔。除空白对照组外,其余各组均参照闵清等[4]的方法制备H/R损伤肌细胞模型:弃去培养基,每孔加入预先以95%N2、5%CO2混合气饱和15 min无糖台氏液2 m L;敞盖放入缺氧盒内,通入95%N2、5%CO2混合气,流速1 L/min;15 min后,夹闭进气管和出气管,将缺氧盒置于细胞培养箱内2.5 h,此过程为缺氧。打开缺氧盒,取出培养皿,吸出上清液,每孔加入2 m L 2.5%胎牛血清DMEM培养基,置于培养箱内继续培养2 h,此过程即为复氧。复氧后各组立即给药进行干预,干预时间为6 h。
1.4 检测指标
1.4.1 细胞存活率检测
将各组细胞分别接种于96孔培养板内(n=8),每孔加入噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/m L)2 0μL,3 7℃孵育4 h后弃上清,每孔加入150μL二甲基亚砜(LDMSO),振荡15 min后用酶标仪测定波长490 nm处的OD值,各组取平均值,然后计算细胞存活率:细胞存活率(%)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。
1.4.2 AST、CPK、LDH含量检测
分别取各组心肌细胞培养液,按照试剂盒操作方法步骤,通过全自动生化分析仪平行测定各组细胞培养液中AST、CPK、LDH活性。
1.4.3 SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量检测
弃去培养基取细胞,每孔加入2 m L磷酸盐缓冲溶液(PBS),通过超声波细胞破碎仪冰浴中处理30 s,经3 500 r/min低温(4℃)离心10 min后取上清液,然后按试剂盒操作方法步骤,通过紫外-可见分光光度计平行测定各组细胞裂解液中SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。
1.4.4 细胞凋亡检测
用不含EDTA的胰酶(0.25%)消化细胞,离心后弃上清液,经PBS溶液洗涤两次后,按照Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒操作方法步骤:加入5 0 0μL Binding Buffer、5μL Annexin V、5μL PI,混匀,室温避光孵育10 min后采用流式细胞仪进行检测,观察各组细胞凋亡情况并在流式二维图中计算凋亡率。
1.4.5 bcl-2mRNA、Bax mRNA表达的检测及bcl-2/Bax表达比值的计算
从基因库中查阅大鼠bcl-2、Bax基因c DNA序列,应用Oligo软件程序设计上、下游引物;bcl-2引物:上游5'-GGGATGCCTTTGTGGAACTA-3',下游5'-TGATTT GACCATTTGCCTGA-3';Bax引物:上游5'-ATCCAGGATCGAGCAGGGAGGATGG-3',下游5'-AGATGGTCACTGTCTGCCATGTGGG-3';β-actin引物:上游5'-CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3',下游5'-CCATCTCTTGCTCGAAGTCT-3'。常规消化并收集各组细胞,加入适量TRIzol试剂提取总RNA,测定总RNA浓度,取1μgRNA反转录为c DNA,然后进行PCR反应,扩增完毕后,取PCR产物于琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像仪观察并照相。以β-actin为内参,通过灰度值进行半定量分析bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达,并计算bcl-2/Bax比值。
1.4.6 caspase-3蛋白表达检测
低温离心取细胞后经PBS溶液洗涤3次,超声波细胞破碎仪冰浴中处理30 s,12 000 r/min低温(4℃)离心20 min取沉淀,通过BCA法进行蛋白定量,蛋白变性后上样、电泳:待溴酚蓝接近胶底部时停止、转膜、春红溶液染色,室温下5%脱脂奶粉封闭2 h,一抗(caspase-3,β-actin)4℃过夜;洗膜,二抗室温摇床上孵育1 h后经ECL显色,实验结果应用Quantity One软件进行分析。
1.5 统计学处理
采用SPSS15.0统计软件进行分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间均数比较采用单因素方差分析;计数资料采用χ2检验;以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组细胞存活率比较
与空白对照组比较,H/R模型对照组乳鼠心肌细胞存活率显著降低(P<0.01);与SXN干预组H/R模型对照组比较,OMT 40μg/m L、80μg/m L干预组乳鼠心肌细胞存活率显著升高(P<0.05或P<0.01),差异有统计学意义。详见表1。
%
2.2 各组细胞培养液心肌酶含量比较
与空白对照组比较,H/R模型对照组乳鼠心肌细胞培养液中AST、CPK、LDH含量均显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);与H/R模型对照组比较,OMT40μg/m L、80μg/m L干预组、SXN干预组乳鼠心肌细胞培养液中AST、CPK、LDH含量显著降低(P<0.05或P<0.01),差异有统计学意义。详见表2。
2.3 各组细胞抗氧化酶活性和MDA含量比较
与空白对照组比较,H/R模型对照组乳鼠心肌细胞中SOD、GSH-Px、CAT活性显著降低且MDA含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与H/R模型对照组比较,OMT40μg/m L、80μg/m L干预组、SXN干预组乳鼠心肌细胞中SOD、CAT活性显著升高且MDA含量显著降低(P<0.05或P<0.01),其中OMT80μg/m L干预组GSH-Px活性显著升高(P<0.05),差异有统计学意义。详见表3。
2.4 各组心肌细胞状况
通过流式细胞术分析发现:H/R模型对照组乳鼠心肌细胞凋亡细胞数量较正常对照组明显增多,而经OMT40μg/m L、80μg/m L干预6h能明显减少凋亡细胞数量;计算凋亡率发现,与空白对照组比较,H/R模型对照组乳鼠心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.01);与H/R模型对照组比较,OMT40μg/m L、80μg/m L干预组、SXN干预组乳鼠心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.01),差异有统计学意义。详见图1和表4。
注:A为空白对照组;B为H/R模型对照组;C为OMT 20μg/m L干预组;D为OMT 40μg/m L干预组;E为OMT 80μg/m L干预组;F为SXN100μg/m L干预组。
%
2.5 各组心肌细胞bcl-2 mRNA、Bax mRNA和bcl-2/Bax比较
经RT-PCR检测并进行半定量分析发现:与空白对照组比较,H/R模型对照组乳鼠心肌细胞中bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达均显著升高(P<0.05或P<0.01),但bcl-2/Bax表达比值显著降低(P<0.01);与H/R模型对照组比较,OMT40μg/m L、80μg/m L干预组、SXN干预组乳鼠心肌细胞中bcl-2mRNA表达显著升高且Bax mRNA表达显著降低,bcl-2/Bax表达比值显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。详见表5。
2.6 各组心肌细胞caspase-3表达
通过Western blot方法检测发现:与空白对照组比较,H/R模型对照组乳鼠心肌细胞caspase-3表达量显著升高(P<0.01);与H/R模型对照组比较,OMT40μg/m L、80μg/m L干预组、SXN干预组乳鼠心肌细胞caspase-3表达量显著降低(P<0.05或P<0.01),差异有统计学意义。详见图2和表6。
注:A为空白对照组;B为H/R模型对照组;C为OMT 20μg/m L干预组;D为OMT 40μg/m L干预组;E为OMT 80μg/m L干预组;F为SXN100μg/m L干预组
3 讨论
冠心病急性心肌梗死已逐步发展成为严重危害人类生命健康的主要疾病之一,通过溶栓、介入手术等使冠状动脉恢复血流供应,可极大降低心肌梗死病人死亡率,但再灌注损伤严重影响病人愈后。缺血再灌注损伤病理机制复杂,至今尚未明确。近年来随着病理生理学研究的深入,发现再灌注后出现的氧化应激损伤及继发细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤发生发展过程的重要环节[9,10,11],为今后研发抗心肌缺血再灌注损伤药物提供方向。
OMT是一种具有多种药理学作用的喹诺西啶类生物碱;舒血宁注射液具有扩张血管、改善微循环的功效。本实验通过分离培养并建立缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞模型、以舒血宁注射液为阳性对照研究发现,OMT能有效改善缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞形态、提升细胞存活率并抑制其凋亡率,提示OMT对缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞具有保护作用。
心肌酶学检查是诊断心肌细胞损伤的重要技术手段,临床上多以血清中AST、CPK、LDH含量水平升高作为心肌细胞损伤诊断指标[12]。SOD被称为体内防御氧自由基损伤的第一道屏障,它能提供氢原子配体而催化还原氧自由基生成过氧化氢[13],且在GSH-Px或CAT催化下能进一步生成对人体无害的水和氧[14];心肌组织脂质过氧化终产物MDA含量能间接反映心肌细胞氧化应激损伤程度。本实验研究发现,OMT干预组能显著降低乳鼠心肌细胞培养液中心肌酶(AST、CPK、LDH)含量,提高抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性并降低MDA含量,提示OMT能有效提高缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞自由基清除能力、降低氧化应激损伤。
bcl-2和Bax基因都属于Bcl-2基因家族,其中bcl-2为抑凋亡基因、Bax为促凋亡基因,二者间相互作用、共同调控细胞凋亡过程[15];进一步研究发现,细胞凋亡调控可能更依赖于bcl-2/Bax表达比值,bcl-2/Bax比值越低,提示凋亡状况严重[16]。半胱天冬酶(caspases)蛋白家族是细胞调控基因中非常重要的成员,其中caspase-3参与细胞凋亡的启动以及整个过程的调节。徐强等[17]研究发现cspsase-3激活并介导的心肌细胞凋亡是缺血再灌注损伤的重要机制之一。本实验发现,OMT干预能有效上调缺氧复氧损伤乳鼠心肌细胞bcl-2 mRNA表达,下调Bax mRNA表达,提高bcl-2/Bax表达比值,并下调caspase-3表达,提示OMT具有抑制缺氧复氧损伤乳鼠心肌细胞凋亡的作用。