信号损伤（精选7篇）
信号损伤 篇1
脂毒性是指血中的三酰甘油在脂蛋白脂酶的作用下水解成游离脂肪酸 (FFA) , 后者进入细胞内进行氧化代谢供应能量或储存在脂肪内。当体内FFA水平增高后, 超过脂肪组织的储存能力和各组织对FFA的氧化能力时, 过多的FFA即激活非氧化通路以三酰甘油的形式在非脂肪组织过度沉积, 即非脂肪组织的异位沉积, 从而造成该组织的损伤, 如心脏、胰腺、肝脏、血管等[1]。
脂毒性的发生主要与高水平的FFA相关。高水平的FFA短期内可以刺激胰岛素分泌, 长期则再脂化异位沉积于非脂肪器官, 致使周围组织对胰岛素的敏感性降低, 肝脏糖异生增加, 肌糖原生成降低, 并使胰岛B细胞功能受损, 最终导致胰岛素分泌障碍和胰岛素抵抗, 从而对非脂肪组织产生损伤。本文就脂质及其毒性对胰腺细胞信号转导系统的影响研究新进展作一综述。
1 转录因子途径
FFA主要通过环磷酸腺苷 (c AMP) 反应元件调控因子阻遏物 (CREM-17X及ICER-1) 和甾醇调节因子结合蛋白-1c (SREBP-1c) 来影响胰腺B细胞功能。CREM是转录因子ATF/CREB家族中的一员, 它控制着神经内分泌细胞多基因表达, 也是治疗肥胖症、降低动物体脂沉积的关键。固醇调控元件结合蛋白 (sterol regulatory element binding proteins, SREBPs) 是膜结合转录因子, 属于转录调控因子b HLH (helix-loop-helix) 家族。大量研究已证实:SREBPs是调控胆固醇、脂肪酸和三酰甘油及脂肪细胞分化过程的关键转录调控因子。在人和动物中, 存在3种形式的SREBP同分异构体, 即SREBP-1a, SREBP-1c和SREBP-2。SREBP存在于内质网, 主要功能是介导脂肪酸的合成, 并可通过影响碳水化合物代谢、脂质生物合成、细胞生长及凋亡多个靶基因改变而导致胰岛B细胞功能障碍[2]。SREBPs的组成结构包括480个氨基酸组成的N端、590个氨基酸组成的C端和中间的80个氨基酸的发夹结构, 后者被亲水环状结构分割。其中, N端的功能是启动转录, C端则负责转录的调控。SREBP的调控主要发生在3个水平:SREBP前体蛋白裂解过程、转录及SREB的翻译后调控。SREBP-1a和SREBP-2的调控主要发生在前体裂解阶段, SREBP-1c的调控主要发生在转录水平。
SREBP对脂质合成的调控与SREBP裂解激活蛋白 (SCAP) 和胰岛素诱导基因产物 (insulin-induced gene, Insig) 有关。当细胞内脂质水平下降时, SREBP与SCAP结合, 转入高尔基体, 在1位蛋白酶作用下清除SREBP的C端, 保留N端在细胞膜, 剩余部分返回内质网被2位蛋白酶清除。当细胞内脂质过量时, SCAP/SREBP复合体不能形成, 则SREBP介导的转录不能进行。另一方面, Insig可以与SCAP的转感结构域 (SSD) 结合, 当脂质浓度升高, Insig与SCAP结合而阻断SCAP-SREBP复合体的形成, 从而使脂质合成减少[3];相反, 当脂质浓度降低则这种结合降低, 而使SREBP有效地从内质网运输到高尔基体实现活化, 从而促进脂质的合成[4]。
SREBP-1c是胰腺重要的转录调控因子, 直接激活脂肪酸、三酰甘油合成和代谢的30多个基因, 同时SREBP-1c也是合成这些分子所必需的NADPH的协同因子。因此, SREBP-1c被称为“脂毒性的门卫”, 能调控脂肪酸和三酰甘油合成的多种基因, 如脂肪酸合成酶 (FAS) 。胰岛素能上调SREBP-1c的mRNA表达和脂肪酸合成基因的表达, 同时反应产物丙二酰Co A能抑制CPT1和线粒体FA氧化[5]。SREBP-1c对三酰甘油和脂肪酸的调节具有靶向性, 通过基因工程小鼠模型建立可以发现, SREBP-1c缺乏的脂肪组织不能有效储存三酰甘油, 从而使脂肪酸增加并储存在周围组织, 最终导致显性脂毒性和代谢综合征。不过, SREBP-1c是促进还是抑制生脂基因的表达, 目前还存有争议。有研究发现, 过度表达的SREBP-1c引起胰腺细胞内脂滴大量沉积, 并使葡萄糖刺激的胰岛B细胞胰岛素分泌 (GSIS) 受损[6], 而这一表现可能是通过FFA引发的内质网受损和内质网应激产生的[7]。
2 过氧化物酶增殖物活化受体 (PPARs) 系统
研究显示, PPARs作为一重要的细胞调节因子, 是脂肪酸代谢转录途径的主要决定因子[8,9]。PPARs属于配体介导的激素核内受体家族, 由PPARα、δ (β) 、γ组成。α受体主要分布在肝脏、心脏、肾脏和褐色脂肪组织, 与脂代谢有关;δ受体在各种组织均有丰富的表达, 可能与细胞的基础脂质代谢有关, 也可能协助PPARα、PPARγ的作用;γ受体主要在脂肪组织和大肠中表达, 具有多种生物效应, 在脂肪细胞分化、糖脂代谢、炎性反应中起重要作用。PPARs由保守的结构区组成功能结构区, 与其配体形成复合物后, PPARs在DNA结合区发生变构, 通过与视黄酸类受体α (RXRα) 形成异二聚体, 再和目的基因启动子上游的过氧化物酶增殖物反应元件 (PPRE) 结合而对靶基因进行调控。
PPAR由多不饱和脂肪酸、类花生酸类脂质和不同种的合成配基激活[10]。PPARα可以调控肝脏编码过氧化物酶体、线粒体和微粒体细胞色素P450中某些脂肪酸代谢酶的基因转录;PPARα还能诱导乙酰辅酶A合成酶, 促进肝脏提取脂肪酸并转化为乙酰辅酶A, 提高脂肪酸经β氧化途径的代谢分解率[11]。当脂肪酸摄入增加和β氧化增加时, PPARα通过增加肝脏脂蛋白脂酶的表达而降低Apo C-Ⅲ的产生, 逐渐降低三酰甘油的水平, 同时促进高密度脂肪酸 (HDL) 的主要载脂蛋白Apo A-Ⅰ和Apo A-Ⅱ在肝脏的表达, 以升高血浆HDL的水平。而PPARγ在脂肪酸增高时, 往往通过加强脂肪酸转运蛋白和酰基Co A合成而促进脂肪细胞摄取脂肪酸, 并增加脂肪细胞中脂质的存储, 刺激脂肪组织中参与脂肪酸代谢的多种基因的表达而降低血脂水平。而PPARγ的激活可以增加新分化的小脂肪细胞而减少肥大的脂肪细胞, 这样可增加细胞膜上胰岛素受体的数量, 同时促进脂蛋白脂酶、脂肪酸结合蛋白、脂肪酸合成酶表达增加, 从而减少FFA, 增加胰岛素敏感性[12]。
此外, PPAR对于脂肪细胞的信号传导作用还表现在对其分泌的多种激素和细胞因子的调节功能。肿瘤坏死因子 (TNF-α) 能抑制前脂肪细胞的分化以及胰岛素刺激的葡萄糖转运, 加速脂肪细胞脂肪分解, 增加血FFA水平。当脂肪酸摄入增加时, PPAR激活后减缓脂解速度, 从而降低FFA[13]。这种抗脂肪分解的作用可能由TNF-α水平及活性改变而介导。肥胖常伴有胰岛素抵抗和慢性炎症反应, 而慢性炎症反应是导致胰岛素抵抗的关键原因[14,15]。TNF-α是主要的致炎因子, TNF-α刺激可以引起PPARγ下降, 另外已证实PPARγ配体具有抗炎效应, 激活PPARγ可减轻炎症反应, 炎症因子表达减少[16]。体外实验证明, 噻唑烷二酮 (TZD) 类药物可以降低TNF-α基因表达, 抑制TNF-α刺激的脂肪分解[17]。PPAR激活可能阻断了TNF-α在信号传导途径中对胰岛素受体及胰岛素受体底物磷酸化的抑制作用。研究显示, 用脂肪酸或TNF-α处理内皮细胞, 可见细胞内氧化应激增强, IL-8增多, 细胞核因子κB (NF-κB) 活性增强和细胞黏附分子-1含量增加[18];若同时使用脂肪酸和TNF-α处理, 则细胞内氧化应激进一步增强, 推测TNF-α在脂肪酸对内皮细胞的凋亡中起作用。另外, 大量试验已证明, TZD类药物通过激活PPAR可以降低leptin mRNA及蛋白水平, 提示PPAR在高脂状态下亦可能通过调控脂质水平表达来降低FFA[19]。
3 Toll受体途径
Toll受体 (Toll-like receptors, TLRs) 是免疫细胞表面识别病原相关分子模式的一个模式识别受体家族, 最新研究显示其在自身免疫疾病和慢性炎症的相互作用方面起着重要的桥梁作用。TLRs是近年来发现的跨膜信号传递受体蛋白。迄今为止, 在哺乳动物体内已经发现12个TLRs家族的成员, 分别命名为TLR1~12。Toll属Ⅰ型跨膜蛋白, 其家族成员的结构非常相似, 由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成。胞外区富含亮氨酸重复基序 (leucine-rich repeats, LRR) , 有利于对病原体或其产物的识别;胞内区与IL-1受体的胞内区相似, 因而被称为Toll IL-1受体同源区 (toll IL-1 receptor homologous region, TIR) , 在信号转导中具有重要作用[20]。有研究显示TLR4、TLR1、TLR2和TLR5在巨噬细胞和内皮细胞高表达, 从而在高脂血症引起的动脉粥样硬化中发挥作用。其中, TLR4在低密度脂蛋白胆固醇 (LDL) 作用下在巨噬细胞表达上调。TLR4受饱和脂肪酸激活, 细胞内炎症通路均被上调, 如JNK、KKB/LKBα/NF-κB, 进而诱导胰岛素抵抗[21,22], 因而TLR4是炎症与脂质代谢信号通路的交叉点。胰腺B细胞可对脂肪酸反应, 主要经由TLR4/My D88信号通路并产生一系列趋化因子, 最终引起CD11b+Ly-6C+M1型促炎单核巨噬细胞向胰岛聚集, 引起炎症反应进而损伤B细胞[23,24,25]。
4 蛋白激酶C (PKC) 信号转导通路
PKC信号转导通路是FFA作用的经典途径, 目前已发现12种PKC同工酶, 并根据作用机制分为3类:传统型, Ca2+和二脂酰甘油 (diacylglycerol, DAG) 依赖;非传统型, 仅依赖DAG;非典型型, 非Ca2+和非DAG依赖。FFA通过PKC途径能介导下列反应: (1) 促进升高的Ca2+和DAG进一步刺激胰岛素的释放; (2) 激活腺苷酸环化酶, 继而提高胞内c AMP浓度, 升高的c AMP和PKA反馈抑制磷脂酰肌醇和PKC通路[26,27]。
血浆FFA提高导致细胞脂酰辅酶A和DAG的增多, 二者是PKC强有力的激活剂, PKC能使胰岛素受体和胰岛素受体底物-1 (insulin receptor substrate, IRS-1) 的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化, 而IRS-1的酪氨酸磷酸化受抑, 从而使胰腺组织中磷脂酰肌醇3激酶 (phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K) 的活性降低, 导致葡萄糖转运载体-4 (glucose transporter-4, Glut-4) 向细胞表面转位减少, 胰岛素介导的葡萄糖摄取减少;同时抑制糖原合成酶活性, 使糖原储备能力下降[28,29]。
另外, FFA引起的氧化应激也可激活PKC, 有证据表明FFA引起的氧化应激对PKC的作用可能由NF-κB抑制物激酶 (IKK) 介导。IKK是NF-κB抑制物 (IκB) 激酶, 而NF-κB是炎症启动、调节的关键核因子。NF-κB与抑制物IκB结合, 以无活性的形式存在于细胞浆内。经氧化应激激活后, IKK使IκB磷酸化并与NF-κB解离。解除抑制的活性NF-κB进入细胞核内, 调节一系列炎症因子及相关物质的基因转录和蛋白合成, 即IKK是激活NF-κB调节炎症的重要因素。IKK又是胰岛素受体和IRS-1丝氨酸磷酸化激酶, 可使IRS307位的丝氨酸磷酸化, 导致正常的酪氨酸磷酸化受抑制, 减弱胰岛素受体与IRS的结合、妨碍胰岛素信号向PI3K传递[30]。
5 脂毒性靶向治疗
随着对脂质毒性对信号传导途径影响机制的深入认识, 通过信号传导途径靶向治疗也日益成为热点, 主要集中于以下2方面。
5.1 PPAR途径的调节
包括PPARγ激动剂、维甲酸受体 (RXR) 激动剂、β3肾上腺素能受体激动剂、PPARα/γ双重激动剂等。TZDs是一类直接针对胰岛素抵抗的药物, Rosiglitazone和Pioglitazone已用于临床, 其作用机制是通过结合和活化PPARγ, 促进脂肪细胞的分化, 减少FFA、TNF-α和resistin的生成。PPARγ在脂肪组织中与RXR组成杂合二聚体, 所以RXR激动剂也可激活PPARγ而发挥作用。RXR激动剂LG100268在动物实验中已经显示了良好的降低食欲和体质量的作用, 有望用于肥胖相关的胰岛素抵抗患者[31]。另外, 目前研制出的几种化合物均具有PPARα/γ的共激活作用, 如Wy-1464、Ragaglitazar、KBP297等。
5.2 PKC抑制剂
PKC抑制剂有多种。Inoguchi等[32]研究发现FFA水平升高时, PKC依赖的NADPH氧化酶激活, 增加反应性氧化产物 (ROS) 的产生, 从而可加速胰岛素抵抗综合征患者动脉粥样硬化的发生。选择性PKC抑制剂GF109203X可抑制ROS的产生。维生素E可激活DAG激酶使DAG转化为磷脂酸, 从而降低DAG浓度, 减少PKC的活化。但是维生素E对已激活的PKC没有影响。选择性PKCβ抑制剂LY333531可阻断PKCβ, 目前主要用于糖尿病患者视网膜血流动力学异常的改善。
综上所述, 脂毒性可通过多种转导机制对不同靶器官造成损伤, 其各种机制之间的联系还需进一步的研究。明确脂毒性的转导机制对理解疾病的病理生理过程和保护靶器官都具有重要的意义和价值。通过对脂毒性信号通路的深入研究, 选择靶向治疗各种脂毒性相关性疾病, 可有效地减轻不良反应和提高疗效, 或许可以作为一种新的治疗思路。
信号损伤 篇2
1 高速光纤通信系统中信号损伤与补偿
高速光纤通信系统在传播过程中常常会发生信号损伤的问题, 色散和光纤耗损是导致高速光纤通信系统中信号损伤的主要原因。传统光纤系统中, 多模光纤较为常见, 在不同模式下光纤的信号传播速度不同, 证明了信号传播过程中存在模间色散。随着科技的发展, 单模光纤在光纤通信系统中使用广泛, 在一定程度上减少了色散, 也就缓解了模间色散的问题。 但是, 随着通信容量的不断扩大, 信号传输距离也越来越远, 新的问题也随之出现, 长距离运输过程中的光纤虚耗成为制约信号传播的关键。单模光纤能够解决模间色散问题, 但是会受到材料和波导色散的干扰, 导致色度色散问题的存在, 在传播过程中损伤通信信号。
因此, 人们开始采用色散补偿光纤来补偿色散问题, 促进单载波速率的提高, 进而解决信号损伤的问题。大量实践经验也表明, 采取措施缓解和补偿高速光纤系统中的信号损伤能够大大提高通信的速率。
近年来, 我国科学技术不断发展, 偏振模色散使用广泛, 相干接收和高级码型调制格式也获得了广泛的应用, 导致偏振模色散和偏振串扰成为损伤通信系统的主要因素, 加上光纤非线性和激光器的相位噪声的制约, 信号损伤问题仍然是通信系统研究的主要问题。
2 高速光纤通信系统中偏振模色散
2.1 高速光纤中偏振模色散概念
单模光纤中, 一个基模由两个相互之间垂直的偏振模组合而成, 但是, 单模光纤在实际运行过程中, 会受到多种因素的制约, 导致两个偏振模间的无法保持运行速度一致, 导致脉冲展宽, 进而导致偏振模色散的产生, 偏振模色散产生的主要原因是:
首先, 光纤自身具有双折射, 光纤在运行过程中会有一些不规则的应力的产生, 导致光纤信号发生折射;
其次, 在铺设光缆时, 光缆会受到不同程度的挤压, 进而有些部位会发生弯曲和变形, 加上在环境的制约下, 信号在传播过程中出现偏振模的祸合效应, 影响偏振模传播速度, 导致偏振模色散的产生。
最后, 一些信号需要经过通信器, 例如滤波器和隔离器等, 这些通信器的材料和结构缺陷会在一定程度上影响信号传播, 导致双折射的产生, 引起偏振模色散现象。在常规数学中, 描述双折射和祸合效应一般采用参量和琼斯矩阵, 也在很大程度上便于人们对双折射和祸合效应的理解。在理想状态下, 光波速率不会导致双折射, 双折射也与传送距离无关, 但是, 在实际运行过程中, 双折射和祸合效应与距离和光波速率关系重大。
2.2 高速光纤中偏振模色散测量方式
偏振模色散能够以一个统计量来计算, 也在一定程度上受到时间和温度变化的制约, 同时测量环境也会影响到偏振模色散的测量。也就是说在不同的时间进行同一光纤的测量会有一定误差的存在。目前, 国际上通行的偏振模色散测量方法有四种。本文暂不介绍波长扫描傅立叶变换法和波长扫描极值数计算法。
2.2.1 Jones矩阵本征值测量法
Jones矩阵本征值测量法最常用于测算偏振模色散值的计算依据测量光纤的偏振传输函数这种情形。Jones矩阵本征值测量法是测量光纤某一处的偏振传输函数, 然后依据测试准确全面描述偏振模色散特征。在进行测试时, 要采用激光器和分析仪来对光纤上等间距波长的矩阵进行测量, 然后依据矩阵将本征矢量和本征值算出来, 从而依据一定公式计算出PSP和DGD, 然后将他们的平均值求出来, 最后变可以得到偏振模色散的值。Jones矩阵本征值测量法具有一定优势, 能够全面测量偏振模色散值, 甚至能够十分准确地进行最小值的测量。但是Jones矩阵本征值测量法也存在一定的缺陷, Jones矩阵本征值测量法的测量结果受到外界干扰大, 且需要较长时间, 测量速度慢, 测量效率低, 只适用于科学研究中。
2.2.2 干涉仪法
干涉仪法适用于一定时间段内的测量, 主要是通过试光纤将端电场将自相关函数输出, 然后将振模色散的传输时间均方差计算出来。宽带LED是干涉仪法中需要使用到的光源, 干涉仪扫描光纤输出端, 确保在这个时间段内相关信号的存在, 偏振模色散值即为测量出的自相关函数的二阶矩均方值。干涉仪法具有速度快且效率高的优点, 具有较强的外界干扰抵御能力, 但是, 干涉仪法也存在一定的缺陷, 这种方法难以提供一些相关信息。
3 高速光纤通信系统中信号损伤补偿技术
在实际运行过程中, 长距离输送时, 偏振模色散速度为10Gb/S时, 输送功率会在很大程度上受到损伤, 影响信号传输速率, 造成信号损失。因此, 高速光纤通信系统中信号损伤补偿技术研究时要考虑相关影响因素。据相关研究显示, 信号损伤的主要原因是一阶偏振模色散效应, 在此基础上, 高阶偏振模色散会加剧信号损伤的恶化。因此, 一阶偏振模色散效应的研究成为高速光纤通信系统中信号损伤补偿技术研究的关键。光路和电路上的补偿是目前最常用的高速光纤通信系统中信号损伤补偿技术。光路和电路上的补偿主要原理是采取措施延迟光或者电, 然后控制反馈回路, 进一步将偏振模色散中的两个偏振模之间的时差进行延长, 来补偿高速光纤通信系统中的信号, 然后统一输出两个偏振模的信号。大量实验表明, 光路和电路上的补偿能够对高速光纤通信系统中信号损伤进行补偿。在此对光补偿进行一个案例分析。
光补偿案例分析:在此方案中, 增设光延迟线, 对两个偏振模间的时差进行调整, 最终进行补偿来保证偏光纤。同时, 在以上基础上安装偏振模控制器, 来调整输入光的偏振态, 确保光的偏振态与光纤切合, 需要注意的是, 在此过程中, 控制器反应速度必须大于偏振器变换速度, 从而确保光纤输出光信号, 控制偏振器的信号。这种方案能够补偿高速率高速光纤信号, 也能够补偿长距离高速光纤信号, 同时在一定程度上降低功率损失。
4 结束语
总而言之, 偏振模色散是引起高速光纤通信系统中信号损伤的主要原因, 目前, 高速光纤通信系统中信号损伤已逐渐成为通信系统研究的重点。随着我国科学技术的发展, 我国对高速光纤通信系统中信号损伤缓解与补偿技术有待进一步发展, 希望在未来我国能够采用更加科学的手段来解决高速光纤通信系统中信号损伤问题, 为人们通信需求提供更好的服务。
摘要：近年来, 我国光纤通信系统发展起来, 其应用规模也呈现出不断扩大的趋势, 但是, 在信号传输过程中, 信号损伤问题越发严重, 高速光纤通信系统中信号损伤主要由偏振模色散引起。本文主要从高速光纤通信系统中信号损伤与补偿介绍出发, 具体阐述了高速光纤中偏振模色散概念及其测量方式, 并提出了相应的高速光纤通信系统中信号损伤补偿技术, 希望对高速光纤通信系统中信号损伤缓解与补偿有所帮助。
关键词：高速光纤,通信系统,信号损伤缓解,补偿技术
参考文献
[1]鲁力.高速光纤通信系统中电子色散补偿技术的研究[D].华中科技大学, 2012.
[2]翁轩.高速光纤通信系统中信号损伤缓解与补偿技术的研究[D].北京邮电大学, 2013.
信号损伤 篇3
1材料与方法
1.1动物模型
成年健康雄性Wistar大鼠90只,体重220~ 250 g,无特定病原体级,青岛市药品检验所实验动物中心提供[SCXK(鲁)20100010]。随机选择15只为对照组,其余75只应用线栓法[8]经左侧颈外 - 颈内动脉插线建立大脑中动脉阻塞模型。动物术前禁食12 h,腹腔注射10%水合氯醛3 ml/kg麻醉动物,仰卧位固定、无菌操作。将术后2 h死亡的15只大鼠剔除,改良神经功能缺损评分(modified neurological severity score,m NSS)7~12分为模型成功的标志[9]。 将成功的60只动物模型随机分为模型组、治疗组、 脂多糖组及U0126组,每组15只。对照组动物除不插线进入颅内外,其余操作同实验组。
1.2干预措施
1.2.1胡黄连苷组将胡黄连苷Ⅱ(天津奎青有限公司)用生理盐水配制成1%溶液,在缺血后2 h腹腔注射20 mg/kg。
1.2.2脂多糖将炎症诱导剂脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(北京索莱宝科技有限公司) 用生理盐水溶液配制成1%溶液,在缺血后2 h腹腔注射LPS 20 mg/kg和胡黄连苷Ⅱ 20 mg/kg[10,11,12]。
1.2.3U0126组将ERK1/2通路抑制剂U0126Et OH(美国Selleck公司)用10%二甲基亚砜配制成1%溶液,在缺血后2h腹腔注射U0126-Et OH 20mg/kg和胡黄连苷Ⅱ 20 mg/kg[10,11,12]。
1.2.4模型组和对照组同步腹腔注射等体积的生理盐水。
1.3评价指标
1.3.1行为测试各组治疗前(造模后2 h)和治疗后(给药后24 h)应用m NSS评分评定动物神经行为功能,最高18分,评分越高说明动物神经行为功能损伤越重,反之则较轻微。
1.3.2原位末端标记法 (terminal deoxynucleotidyl transferase d UTP nick end labeling,TUNEL) 染色治疗后每组随机选取5只动物,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,经心脏灌注生理盐水200 ml,完整取脑, 切取缺血部位脑组织100 mg提取总蛋白。其余脑组织置4%多聚甲醛后固定2 h,蒸馏水浸泡4 h。常规脱水、透明、包埋,连续冠状切片5μm,贴片。石蜡切片常规脱蜡水化 , 按TUNEL凋亡检测 试剂盒 (KGA7025-50assays,北京凯基生物公司)说明书进行操作,3、3'- 二氨基联苯胺(3,3'-diaminobenzidine,DAB)显色,苏木素复染。光镜下胞核有棕色颗粒者为凋亡细胞。阴性对照样本不加末端脱氧核苷转移酶,不出现阳性着色。400倍显微镜下,每张切片随机观察皮质区4个不重叠视野,细胞计数,取其均值。以凋亡细胞指数(凋亡细胞指数 = 凋亡细胞数 / 细胞总数)表示损伤程度。
1.3.3 Western blot检测取缺血部位脑组织100 mg, 加细胞裂解液(上海碧云天生物技术研究所)1 ml, 4℃冰浴中研磨,置于4℃摇床30~60 min充分裂解, 4℃、12 000 r/min离心15 min,去沉淀组织留上清液, 二辛可宁酸(bicin chonininc acid,BCA)法测定蛋白浓度。取蛋白样品20μg,应用烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,半干法转膜,含吐温 -20℃ 的三羟甲基氨基甲烷氯化钠缓冲液(tris-buffered saline containing tween-20,TBST)室温封闭1 h,兔抗鼠磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1/2(phosphorylation extracellular signal-regulated kinase,p ERK 1/2)单克隆抗体(1∶2 000)一抗4℃孵育过夜,TBST洗膜10 min×3次,用HRP标记的羊抗兔二抗(1︰ 10 000)(美国Abcam公司)室温孵育1 h,TBST洗膜10 min×3次。Vilber Fusion FX7化学发光多色荧光成像系统(法国Vilber公司)曝光显影,Quantity one软件分析各条带灰度值。计算目的蛋白相对值, 目的蛋白相对值 =p ERK1/2灰度值 /ERK1/2灰度值。
1.4统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,多组间比较用析因分析及最小显著差数法,以P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1神经行为功能
对照组动物活动正常,造模动物表现不同程度的神经行为功能障碍。治疗组和U0126组的m NSS评分较治疗前显著下降(t =5.668和4.081,P <0.05)。模型组和LPS组治疗前后的m NSS评分比较,差异无统计学意义(t =1.819和0.276,P >0.05)。治疗后,治疗组m NSS评分较模型组和LPS组显著下降(t =5.143和6.276,P <0.01);U0126组m NSS评分较模型组和LPS组亦显著下降(t =2.368和2.812,P <0.05)。模型组与LPS组,治疗组与U0126组比较,差异无统计学意义(t =2.004和1.143,P >0.05)。
2.2细胞凋亡
TUNEL染色显示,各组大鼠神经细胞有不同程度的凋亡,胡黄连苷组和U0126组表达显著低于模型组(t =3.124和5.231,P >0.05)。对照组大鼠皮质区神经细胞凋亡数量较少;模型组大鼠皮质区凋亡细胞明显增多。胡黄连苷组大鼠皮质区出现少量凋亡细胞,各时间比较差异无统计学意义(t =1.043、 0.932和1.817,P >0.05)。LPS组大鼠凋亡细胞比治疗前略有下降(t =2.967,P <0.01),但凋亡细胞仍然较多。U0126组大鼠皮质区出现少量凋亡细胞,其程度最接近对照组,两者比较差异无统计学意义(t = 0.936,P >0.05)。见图1。
2.3Westernblot检测
胡黄连苷组和U0126组神经细胞p ERK1/2蛋白表达显著低于模型组(P =3.025和2.436,P <0.05)。 对照组p ERK1/2蛋白表达较治疗前略高(t =2.012, P >0.05)。治疗后,模型组p ERK1/2蛋白表达显著高于其他各组(t =3.162、5.103、4.925和6.124,P <0.01)。 胡黄连苷组p ERK1/2较治疗前略有提高(t =1.893, P >0.05),但与模型组比较显著降低(t =4.171,P < 0.01)。治疗后,LPS组p ERK1/2表达仍高于胡黄连苷组和U0126组(t =5.362和4.324,P <0.01);U0126组p ERK1/2水平较低。模型组与LPS组各时间p ERK1/2表达较高,模型组显著高于其他组(t =3.76、 3.893、4.176和6.132,P <0.01);LPS组p ERK1/2表达也显著高于其他组(t =4.126、3.675、4.539和7.316, P <0.01)。见图2。
3讨论
信号损伤 篇4
近20年来,基于结构全局振动信号进行局部损伤位置和损伤程度检测受到了研究人员和工程领域的广泛关注[1,2,3,4,5,6,7].
复合材料层合板以其可设计性、各向异性和高强度比等优点一直受到广泛的工程应用.层合板结构在加工和使用过程中难免存在各种损伤,其中分层损伤尤为严重,因此层合板分层损伤检测一直是复合材料的研究热点[2]但是应用人工神经网络技术和基于振动特性来识别层合板结构分层损伤研究不是很多,特别是对多层损伤程度同时识别更是欠缺.
神经网络[3]用于结构损伤检测的基本原理是:通过实测或数值模拟方法,提取对整体结构损伤敏感的全局标识量(如固有频率、模态振型、应变模态、曲率模态、时域、频域响应信号等),然后直接或适当组合处理后作为神经网络的输入样本,以结构的损伤状态(位置、程度等)作为网络理想输出,对神经网络进行反复训练学习和检测,建立输入样本与损伤状态之间的非线性映射关系.训练成功后的神经网络具有模式分类记忆功能,可应用于实际复杂结构损伤的在线检测.
本文基于振动信号研究复合材料层合板分层损伤的神经网络检测技术.对层合板分层损伤区域,采用相同坐标不同节点建立了分层损伤区的有限元模型;通过数值模拟提取结构无损和不同程度面积分层损伤的全局振动标识量;重点研究神经网络对层合板多处同时存在分层损伤位置和损伤程度的检测技术.研究表明,用结构全局振动标识量作为人工神经网络的输入,对层合板结构多处分层损伤检测是一种很有效的工程实用方法.
1 层合板分层损伤模态分析
本文以16层复合材料层合板结构为例,具体铺设方式按[0/90/0/90/0/90/0/90]s对称铺设,计算模型几何尺寸为:长500 mm,宽200 mm,厚48 mm.约束为一边固定,三边自由.材料参数如表1所示.
首先对分层区域采用了相同坐标不同节点的方法,建立层合板单处和多处分层损伤数值计算模型,然后对完好和不同位置、不同面积分层损伤板进行模态分析,获得各种工况下板的模态数据作为神经网络输入样本数据.限于篇幅,图1仅给出层合板结构第3层和第4层之间存在不同面积分层损伤(百分比:0%,5%,10%,15%,20%,30%,40%,50%,60%,70%)的前12阶固有频率对比.
从图1明显可见:
(1)当结构存在损伤时,结构刚度降低,固有频率变小,且低阶差异小、高阶变化大;
(2)随着结构分层损伤程度逐渐加大,固有频率降低差别愈大.
2 层合板分层损伤人工神经网络无损检测技术
2.1 神经网络结构设计
应用神经网络对结构进行损伤检测,首先需要根据具体检测问题设计网络结构,根据经验一般采用3层BP神经网络(图2)就能够保证识别精度.另外每层神经元数目的确定也是关键问题,尤其对输入层,神经元多、样本数据多、信息充分,识别精度高,但是计算量大.本文采用24个输入层神经元,分别对应每层不同程度损伤工况下结构固有频率组合参数.输出层神经元分别用15和4,对应层合板连续损伤层或部分间隔层的损伤.隐含层的神经元数分别取8和6.即分别采用24-8-15和24-6-4两种神经网络结构,研究层合板分层损伤结构的神经网络检测技术.
2.2 神经网络输入样本库构造
在确定了BP神经网络结构之后,输入样本库的构造也是关键,参见文献[4].本文针对层合板结构分层损伤,采用结构固有频率的变化率FFCi和正则化的频率变化率NFCi以及频率的平方变化率NFSRi作为对层合板分层损伤检测的输入样本.即
式中,fui和fdi分别表示层合板在无损和受损状态下的第i阶模态频率,m为系统固有频率的截断阶数,本文取m=12进行数值模拟研究.
2.3 神经网络分层损伤(层)位置检测
首先设层合板前8层存在连续分层损伤.用第1层到第4层分层损伤面积达40%的模态数据为网络训练学习样本,用第5层到第8层的损伤面积达30%的模态数据为测试样本,网络输入参数为FFCi和NFCi.输出单元1.0对应该层有分层损伤,0.0对应该层无分层损伤.网络结构用24-8-15,网络实际输出结果与期望输出最大误差见表2.
从表2可以看出最大误差为9.15%,小于工程上的基本要求10%.因此可认为该神经网络用于层合板损伤层位置识别结果有效.
再设层合板第2,4,6,8层间隔分层损伤.分别以间隔层面积损伤40%的FFCi和NFCi为网络输入数据,网络结构选为24-6-4.网络期望输出和实际输出结果及最大误差见表3.
表2和表3对比可见,在网络同样输入单元情况下,表3中最大误差(5.9%)远小于表2中的最大误差(9.15%),主要是网络输出层单元少的缘故.因此在实际应用中尽可能减少网络的输出层单元数,即减少网络每次同时识别的损伤位置.
2.4 神经网络分层损伤程度检测
先采用神经网络结构为24-8-15,以第1层至第8层分层损伤程度(分层面积与整层面积比值)分别为20%,20%,40%,40%,30%,30%,50%,50%的NFCi和NFSRi数据为网络输入样本,网络期望输出与实际输出及最大误差见表4.
从表4可以看出最大误差为9.89%,小于工程上的基本要求10%.因此可以认为该神经网络用于层合板连续分层损伤程度检测是有效的.
2.5 神经网络的内插和外推能力检验
为了验证神经网络的内插和外推检测能力.采用神经网络结构为24-6-4,即输入层仍为24个神经元,对应系统受损后的前12阶频率变化组合参数,隐层为6个神经元,输出层为4个神经元,分别对应层合板2,4,6,8层间隔分层损伤程度.分别以每层分层损伤面积10%,15%,20%,40%,50%,60%的数据为网络训练学习样本,以每层分层损伤面积30%和70%的损伤数据为网络的内插和外推能力检测样本.限于篇幅,表5仅给出第2,8层分层损伤时网络期望输出和实际输出结果及最大误差.
由表5可见:
(1)网络结构在同样输入样本数的情况下,输出单元数少,误差相对较小.因此,实际应用中尽可能缩小网络结构,减少输出层单元数,即缩小同时损伤识别的区域层数.这不仅可以提高网络运算速度,而且可提高网络识别精度.
(2)神经网络的内插能力一般要优于外推能力,个别情况下外推能力优于内插能力
3 结论
本文对复合材料层合板分层损伤检测研究结果表明,基于结构振动标识量的人工神经网络损伤检测技术是一种很有效的快速全局损伤检测方法,既可以检测层合板的单损伤和多损伤位置,也可以检测层合板任何部位的分层损伤程度.该方法是一种很有效的工程实用无损检测方法,可应用于实际结构损伤的在线检测.当然,检测精度主要取决于输入样本的精度.作者正在进一步研究用结构曲率模态、应变模态以及结构动态响应信号及其组合标识量,作为人工神经网络输入样本数据库,进一步研究提高人工神经网络对层合板结构分层损伤以及其它工程结构损伤检测能力和检测精度.
参考文献
[1]闫桂荣,段忠东,欧进萍.基于结构振动信息的损伤识别研究综述.地震工程与工程振动,2007,27(3):95-103(Yan Guirong, Duan Zhongdong,Ou Jinping.Review on structural damage detection based on vibration data.Journal of Earth- ??quake Engineering and Engineering Vibration,2007,27(3): 95-103(in Chinese))
[2]顾志芬,崔德渝.复合材料层合板分层损伤研究.第十一届全国复合材料学术会议.2000.806-811
[3]张际先,宓霞.神经网络及其在工程中的应用(第一版).北京:机械工业出版社,1996
[4]李学玉.基于BP网络的高层框架结构损伤检测.[硕士论文].西安:西安建筑科技大学,2006
[5] Cawley P,Adams RD.The location of defects in structures from measurements of the natural frequencies.Journal of Strain Analysis,1979,14(2):49-57
[6] Wang JTS,Liu YY,Gibby JA.Vibtrtions of split beams. Journal of Sound and Vibration,1992,84(4):491-502
信号损伤 篇5
JNK又称c-Jun N-末端激酶或者应激活化的蛋白激酶 (stress activiated protein kinas e, S A P K) , 是促分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 超家族成员之一[1], 是一类丝氨酸/苏氨酸激酶, 位于细胞胞质之中, 相对分子量为46×103和54×103, 存在特定的功能区 (Thr-Pro-Tyr) , 其编码基因为JNK1、JNK2和JNK3, 其中JNK1和JNK2存在于全身各组织中, 而JNK3主要存在于脑、心脏和睾丸等组织[2,3]。JNK的活化是通过氨基末端残基磷酸化实现的, 而JNK的激活可以受多种细胞外因素的刺激而启动, 包括生长因子、细胞因子 (TNF-α、IL-1等) 、应激刺激 (紫外线、细胞高渗透压、缺血再灌注损伤) 等[4]。一旦JNK激活, JNK将由细胞质转入细胞核中, 广泛参与细胞凋亡、增殖、代谢及DNA损伤修复等多种生物学反应, 而其功能的失调可造成神经退行性病变、缺血再灌注损伤、糖尿病和肿瘤等多种疾病[5,6]。
1.1 JNK信号通路调节因子
JNK信号通路的调节因子可分为三类:上游调节因子、下游调节因子和支架蛋白。JNK信号通路通过三级酶促级联反应而激活, 即MAPKKK-MAPKK-MAPK[7]。JNK的直接上游激酶目前确认的有MKK4和MKK7, 二者通过双磷酸化JNK的Thr183和Tyr185位点而激活JNK, 但是二者有功能上的区别, MKK4优先磷酸化Tyr185位点, MKK7优先磷酸化Thr183位点[8]。MAPKKK主要有MEKK1-4、ASK1、TAK1等, Rho家族的小分子量GTP结合蛋白, 也可作为JNK级联反应的上游调节因子。下游调节因子, 也就是JNK信号通路的底物, 最初研究发现, JNK活化后可激活调控c-Jun, 提高其转录活性, 进一步提高活化蛋白1 (activator protein1, AP-1) 的转录活性, 发挥其生物学特性。随着进一步的研究发现, ATF2、P53、Elk-1、ets-2、SMAD4、c-Myc2和Bcl-2家族也是JNK的核内底物。这些底物, 可以调节核内靶基因的转录, 可以直接调节胞质底物的结构和功能, 快速发挥生物学效应。JNK信号通路中还有些支架蛋白, 在JNK信号通路的调节中起着重要的作用, 如JNK相互作用蛋白 (JNK-interacting proteins, JIPs) 、JNK相关亮氨酸拉链蛋白 (JNK-associated leucine z i p p e r p r o t e i n, J L P) 、接头蛋白C r kⅡ、细丝蛋白、抑制蛋白 (β-arrestin) 等。这些底物与特定的MAPKKK、MAPKK、JNK等相互作用, 形成功能性复合体, 调控JNK通路[9]。
1.2 JNK介导细胞凋亡的机制
JNK能够介导多种细胞的凋亡, 参与细胞凋亡的发生, 其介导凋亡的机制目前认为主要有两个[10]:一个是转录因子途径, 即通过转录方式调节下游调节因子的转录和凋亡蛋白的表达而介导死亡受体途径和线粒体途径的细胞凋亡。如活化的JNK由细胞质进入细胞核, 激活相应转录因子AP-1蛋白、ATF-2等, 诱导FasL、TNF等死亡配体的表达, 启动死亡受体介导细胞凋亡[11], 活化的JNK进入细胞核后, 激活相应转录因子后还可以诱导BH3-only蛋白的表达, 然后活化Bax等促凋亡蛋白, 进入线粒体, 破坏线粒体膜的通透性, 引起细胞凋亡。二个是非转录因子途径。在JNK活化过程中, 有一部分活化的JNK留在了细胞质中, 并未进入细胞核, 这部分活化的JNK通过磷酸化作用直接作用与Bcl-2家族, 调节他们的活性而介导线粒体途径的细胞凋亡, 此过程没有新基因的表达[12]。
2 JNK信号通路与缺血再灌注损伤的相关性
缺血再灌注损伤是指缺血一定时间的组织和器官, 在重新恢复血供之后, 不仅不能恢复改善组织器官的功能, 反而加重了功能代谢障碍及组织结构的破坏, 是包括脑、肝、心、肺及眼等许多器官面临的重要的临床问题。大量实验证明, JNK介导的细胞凋亡参与IRI的发生。在沙鼠脑IRI模型中应用JNK抑制剂AS601245可以明显降低缺血再灌注引起的神经细胞的凋亡[13];同时有研究者研究局部IRI模型发现, 缺血区JNK活性明显增加, JNK抑制剂SP600125可以阻断Bax从细胞质转入细胞核, 抑制了神经元的凋亡, 减轻了病理变化[14]。Carboni等[13]研究发现, 死亡受体途径和线粒体途径均参与了神经元的凋亡过程, 并且用JNK抑制剂阻断JNK活性后, 均可以缓解这两种途径。有研究者通过研究大鼠肝脏IRI模型, 发现IRI后JNK的活性明显提高[15], Uehara等[16]也研究表明, JNK信号通路是肝脏IRI的一个主要介导者, JNK抑制剂可以缓解肝细胞的凋亡。在大鼠心肌IRI模型中, JNK抑制剂AS601245可以减少心肌细胞的凋亡, 减少心肌梗死面积, 在此模型中, JNK主要出现在再灌注之后, 针对活性氧的产生[17]。同样, JNK抑制剂也可以减少肺IRI的损伤。何跃[18]利用慢性高眼压制作青光眼模型, 实际是缺血再灌注的一个过程, 然后利用此模型, 进行JNK3在视网膜的表达测量, 结果发现, JNK3mRNA在正常和高眼压模型小鼠视网膜中均有表达, 而在不同的时间点对照眼和实验眼视网膜中JNK3mRNA表达量有明显的差异 (P<0.05) , 但是在各个时间段实验眼视网膜中JNK3mRNA的表达量无明显差异 (P>0.05) , 此结果证实了在高眼压状态下, JNK3被激活且与视网膜神经节细胞的凋亡密切相关。
3 结论
近年来, JNK信号通路的研究已经取得了很大的进步, 发现了越来越多的JNK调节因子。大量的实验也证明, JNK介导的细胞凋亡在多种疾病的病理变化中发挥着重要的作用。而在这些疾病中, JNK介导的细胞凋亡机制, 尚不十分明了, 还需要进一步的研究, 探索其机制, 从而为抑制各种疾病的病理改变, 给疾病提供新的治疗方法。
摘要：缺血再灌注损伤 (ischemia-reperfusion injury, IRI) 是一种重要的临床问题, 在缺血性疾病和器官移植等疾病的治疗过程中常见。随着研究的发现, 对组织造成损伤的主要因素不是缺血本身, 而是恢复血供以后, 大量的组织细胞死亡。实验证明, JNK (c-Jun N-termianlkinase) 参与了细胞的凋亡, 在IRI的病理变化中起重要作用。因此, JNK信号通路与IRI具有高度的相关性, 通过调节JNK信号通路可作为治疗IRI的新的靶点。本文对JNK信号通路以及与IRI的相关性研究进行综述。
信号损伤 篇6
1 材料与方法
1.1 材料
实验中用到的3 d龄SD大鼠 (SPF级, 雌雄不计,体重8~10 g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2007-0001],充入的氮氧混合气体(8%O2+92%N2) 由首都医科大学附属北京友谊医院(以下简称“我院”)提供,本实验室自制封闭容器。
1.2 缺氧模型的建立
实验所用到的3 d龄SPF级SD大鼠, 日常在我院SPF级动物房饲养,条件如下,照明时间;黑暗时间=12 h∶12 h,温度:23~25℃,湿度保持在40%。将乳鼠随机分为两组:对照组和缺氧组,每组各24只,对照组不做处理, 缺氧组放入本实验室自制容器,在37℃水浴中充以氮氧混合气 (O2占8%),持续时间为90 min,之后回笼,继续行母乳喂养。
1.3 大鼠脑组织标本获取
分别于缺氧模型建立后第1、3、7、14、21天和第28天6个时间点处死两组大鼠 , 其中每个时间点对照组和缺氧组大鼠各4只,每组大鼠的左侧脑组织立即放入10%的中性福尔马林溶液固定,之后进行切片、备用,右侧大脑立即放入液氮保存,用于进行Westernblot检测。
1.4 HE 染色
将脑组织用10%的中性福尔马林液中固定8 h,依次放入20%、30%蔗糖溶液分别过夜(24~48 h)沉底,组织沉底之后即可进行冰冻切片,切片厚度为12μm,进行HE染色,参见既往发表文章[9],拍照保存。
1.5 Western blot 检测 ERK-1 表达量
预冷RIPA蛋白抽提试剂, 加入蛋白酶抑制剂Protease inhibitor cocktail(Roche)。按组织重量9倍比例加入裂解液,冰上用组织匀浆器进行匀浆3次。冰上进行孵育20 min后,4℃15 000 r/min离心20 min,取上清,分装深低温冰箱保存,按照BCA蛋白定量试剂盒(cwbiotech)测定蛋白浓度。之后进行蛋白PAGE凝胶电泳,10%分离胶,5%浓缩胶(丙烯酰胺,双丙烯酰胺,TEMED,Amresco)。电泳条件:浓缩胶恒压90 V,约20 min;分离胶恒压130 V,通过预染蛋白Marker(Biomed)来确定电泳停止时间。湿转法 ,转膜条件 :300 m A恒流 ;0.45μm孔径PVDF膜 (Millipore),转膜时间1 h。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色,观察转膜效果。之后将膜完全浸没TBST溶液中(含5%脱脂牛奶),室温下摇床孵育1 h。将膜与ERK-1一抗(Santa cruz)或者β-actin一抗(Santa cruz,封闭液稀释)一起孵育,ERK-1的一抗稀释浓度1∶500,β-actin的一抗稀释浓度1∶1000,4℃冰箱过夜。次日TBST洗膜3次。二抗孵育:羊抗兔Ig G HRP(1∶20 000),孵育40 min(在室温),洗膜。滴加ECL,反应3 min;曝光,显影,定影。照相,用Lab Works软件对图像进行灰度分析,计算出每个样本的ERK-1灰度值与相应的β-actin的灰度值,取其比值进行计算,并进行统计学分析。
1.6 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验 ;计数资料用率表示 ,组间比较采用χ2 检验 ,以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠乳鼠缺氧后表现
缺氧后早期大鼠出现兴奋症状的表现: 躁动不安、翻滚,呼吸加深加快,45 min~1 h后逐渐出现抑制症状:反应迟缓淡漠、间断发作的痉挛、抽搐等。最后进入比较稳定的反应淡漠期,此反应一直持续至缺氧完成,恢复氧供后乳鼠反应逐渐恢复正常。
2.2 HE 染色结果
对照组大鼠脑组织结构清晰, 海马锥体细胞致密、完整,缺氧组大鼠海马锥体细胞核淡染、甚至细胞核缺如,见图1。
2.3 两 组大鼠 不同时间点 细胞外 信号 调节蛋白激酶 1表达情况比较
缺氧组ERK-1表达呈现动态性变化, 与对照组相比, 缺氧后ERK-1表达量基本处于低于正常对照的水平,但是与对照组的变化趋势趋于一致,第14天时ERK-1的表达较对照组有所升高, 到第21、28天时ERK-1的表达与对照组比较又有所降低。虽然有变化趋势,但是经过统计学t检验分析,差异均无统计学意义(P > 0.05),具体见表1,图2、3。
3 讨论
缺氧性脑损伤的病理发生是一个多因素的复杂过程,在此过程中,众多分子参与其中,ERK-1蛋白在脑内广泛存在,是脑功能活动中重要的信号转导分子[10],ERK-1接受刺激信号后活化为磷酸化的ERK-1,从胞浆转位至胞核,通过磷酸化转录因子等途径发挥细胞调节作用。脑缺血再灌注损伤中有ERK-1广泛参与, 但其所发挥的是保护性作用还是损伤性作用,目前仍存在很大争议[11,12,13]。有文献报道, 自由基清除药———依达拉奉可以通过激活ERK-1来减轻缺氧/复氧诱导的神经元损伤中毒[14]。Ban等[15]的研究发现抑制ERK-1能够恶化肠缺血/再灌注损伤。缺氧发生之后ERK-1的表达模式如何尚不明确, 本研究通过探讨缺氧发生后ERK-1的动态表达模式来进一步明确缺氧发生过程中ERK-1的可能作用,研究发现,缺氧后脑组织ERK-1表达水平呈现动态变化, 缺氧后第1天开始ERK-1表达降低, 一直到缺氧后第7天达到表达的最低值,之后出现表达情况的上升,缺氧后第14天时表达高于正常情况, 表达情况一直持续到缺氧后第21天达到最高峰,但是低于正常情况,缺氧后第28天时表达又有所降低。根据折线图可以看出,ERK-1在大鼠乳鼠发育过程中呈现一种动态模式的表达情况, 存在一个表达高峰和一个表达低谷,提示ERK-1在细胞的正常发育过程中也发挥着重要作用,缺氧组的ERK-1的表达总体比正常情况低下,虽然经过分析差异无统计学意义(P > 0.05),但是存在降低的趋势,提示在大鼠乳鼠脑组织缺氧损伤过程中ERK-1也存在剂 量的变化 。需要进 一步研究ERK-1基因与其他缺氧相关的基因 , 如缺氧诱导因子(hypoxia induced factor-1α,HIF-1α)等基因表达的相互关系,从而更加明确其参与缺氧脑损伤过程的作用机制。
摘要：目的 通过了解细胞外信号调节蛋白激酶1(ERK-1)在缺氧脑损伤大鼠脑中的表达,了解其参与缺氧脑损伤的过程。方法 48只3 d龄新生SD大鼠,随机分成2组:对照组和缺氧组,每组各24只,缺氧组SD大鼠置于自制密闭容器中,充以含8%氧气的氧氮混合气体,时间为90 min,对照组SD大鼠不进行处理。分别于造模后6个时间点——1、3、7、14、21 d和28 d后留取两组SD大鼠脑组织,采用Western blot检测ERK-1总蛋白在脑组织中的表达情况。结果 缺氧组大鼠脑组织ERK-1呈现动态表达;变化规律:在缺氧早期(缺氧后1~7 d),ERK-1总蛋白的表达均有降低的趋势,缺氧后第14天开始其表达具有升高的趋势,缺氧后第21天和第28天ERK-1表达量又有所下降,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 缺氧造成新生大鼠脑损伤时,ERK-1总蛋白的表达谱没有明显变化的趋势,提示在早产儿缺氧性脑损伤时ERK-1并不通过剂量的变化对缺氧后脑组织损伤进行调节。
信号损伤 篇7
1材料与方法
1.1材料
SPF级雄性小鼠(C57B1/6J)48只,体重25~30 g, 购自泸州医学院实验动物中心。α-tubulin抗体、 LPS购自美国Sigma公司,即用型ABC试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司,兔抗小鼠p-JNK多克隆抗体、兔抗小鼠p-c-Jun单克隆抗体购自美国San Diego公司,白细胞介素 -1β(interleuleukin-1β, IL-1β)酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自美国Leinco公司,肿瘤坏死因子 -α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA试剂盒购自美国R&D Systems公司。
1.2方法
1.2.1急性肝损伤模型的制备将雄性C57B1/6J小鼠随机分为两组,每组24只。模型组按LPS 10 mg/kg一次性腹腔注射给药;对照组腹腔注射等体积磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)。 在给药后1、2、4和30 h分别心脏取血并处死动物, 采集血清和每只动物的部分肝脏样本置于 -80℃冰箱储存备用,另一部分肝脏样本使用4%中性多聚甲醛溶液固定,以备制作石蜡切片。
1.2.2肝功能血清学指标及肝脏病理学检测采用日本日立7600全自动生化分析仪测定血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)活性。肝脏样本经4%中性多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋,常规制片及苏木素 - 伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色, 光学显微镜下观察。
1.2.3免疫组织化学染色按照免疫组织化学检测试剂盒说明书,ABC法进行操作。石蜡切片,常规脱蜡至水,正常山羊血清封闭,滴加一抗37℃孵育1 h, PBS冲洗3次,5 min/ 次,加二抗室温孵育30 min, PBS冲洗,滴加ABC复合物孵育30 min,DAB显色后脱水、透明、中性树胶封片。以出现棕黄色颗粒为阳性信号。
1.2.4 Western blot检测p-JNK和p-c-Jun蛋白的表达取0.1 g肝脏组织匀浆,4℃、12 000 r/min离心后取上清为样本,Bradford法测定蛋白浓度,以总蛋白0.04 mg上样,使蛋白变性,配胶,10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离后转膜,浸入封闭液室温孵育60 min。加p-JNK抗体(或p-c-Jun抗体)一抗4℃冰箱保存,加入荧光标记的羊抗兔抗体37℃ 孵育1 h,ECL试剂显色,曝光成像。以 α-tubulin为内参照,用Image J软件对灰度值进行定量分析。
1.2.5血清TNF-α 及IL-1β 水平测定按照ELISA试剂盒说明书进行操作。
1.3统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组间比较用方差分析,组内比较用t检验,P <0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1肝功能及肝脏病理学检查
与对照组比较,模型组小鼠注射2 h后血清AST及ALT水平开始明显升高,在30 h时上升最明显(见图1)。HE染色结果显示,LPS作用1 h时,肝组织未见明显异常;2 h时可见少数肝细胞浊肿及少量炎症细胞浸润;4 h时可见肝窦充血、淤血,肝细胞浊肿, 散在炎症细胞浸润,以中性粒细胞为主;30 h时见肝窦扩张,明显充血、淤血,肝细胞浊肿、空泡样变性, 肝细胞灶性液化坏死,大量炎症细胞浸润。
2.2免疫组织化学检测
对照组小鼠肝组织中p-JNK和p-c-Jun蛋白仅有微量表达,着色较浅,胞核呈淡棕色;模型组小鼠p-JNK和p-c-Jun蛋白在LPS注射1 h后表达显著增强,着色较深,可见大量肝细胞胞核呈棕黄色, 但随时间增加而逐渐减弱,30 h时p-JNK、p-c-Jun蛋白的表达与对照组比较,差异无统计学意义。见图2。
2.3Westernblot检测
以 α-tubulin为内参照,与同时间对照组比较,注射LPS 1 h时p-JNK蛋白含量显著升高并达峰值,此后逐渐下降,2、4和30 h时p-JNK蛋白水平与对照组比较,差异无统计学意义(P >0.05),见图3。 p-c-Jun蛋白于LPS作用后1 h达峰值,然后逐渐下降,30 h时与对照组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。见图4。
2.4血清TNF-α和IL-1β水平比较
小鼠注射LPS后1 h血清TNF-α、IL-1β 水平与对照组比较显著升高,4 h达峰值后有逐渐回降趋势,30 h时仍高于对照组,差异有统计学意义(P < 0.01)。见图5。
3讨论
目前,脓毒症肝损伤仍无统一的共识定义或诊断标准,往往以碱性磷酸酶升高和高胆红素血症(胆红素和胆汁代谢障碍)为主要临床表现。KOBASHI等[2]最近进行的一项较大样本的回顾性研究显示, 499例脓毒症患者肝损伤的发病率为34.7%。赵伟等[3]对160例脓毒症患者的研究表明,急性肝损伤的发生率约为15.6%。脓毒症急性肝损伤是一个炎症级联反应过程,发病机制复杂,涉及多种因素的参与及相互作用。LPS是革兰阴性细菌外膜上的主要成分,可以导致内毒素血症甚至脓毒症休克和多器官功能障碍综合征。本研究发现,腹腔注射LPS可导致小鼠迅速出现肝功能不全及肝组织病理损伤, 成功诱导小鼠脓毒症急性肝损伤模型。
JNK信号通路是促分裂原活化蛋白激酶信号通路的重要通路之一,位于胞质,包含双磷酸化功能区 (由3种氨基酸Thr、Pro和Tyr组成)与c-Jun N端的活化区结合,并使其第63、73位丝氨酸残基磷酸化。一旦被激活(磷酸化后形成p-JNK),胞浆中的JNK迅速移位到细胞核并发挥作用[4,5],参与细胞生长、发育、凋亡等多种病理生理过程。既往研究发现, JNK信号通路与肝脏疾病关系密切,多种肝脏应激与损伤均存在JNK信号通路的激活。KOHL等[6]在糖尿病大鼠肝脏的研究中,发现在肝功能损害的过程中存在着JNK通路的激活。GUNAWAN等[7]通过小鼠和体外细胞培养研究发现,在对乙酰氨基酚(aceta minophen,APAP)导致的肝损伤中JNK被持续激活, 而给予JNK抑制剂SP600125后,在体外和体内对APAP肝毒性均有显著的保护作用。WIN等[8]也发现,抑制JNK的持续激活及JNK在线粒体膜上定位, 可以对APAP诱导的肝脏损伤起到保护作用。MOHAMMAD等[9]研究发现,丙烯醛能够导致肝脏细胞迅速出现谷胱甘肽耗竭,内质网中e IF2α、ATF-3和ATF-4激活,同时激活JNK通路,出现内质网应激反应和线粒体功能紊乱,而使用JNK抑制剂能够减弱丙烯醛诱导的细胞死亡和内质网应激反应。DEVEY等[10]在小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型中发现, JNK2-/-的肝细胞具有对抗肝脏缺血再灌注损伤的作用。仇爱刚等[11]研究发现,给予JNK的特异性抑制剂SP600125抑制JNK通路后,可防止继发于肝脏缺血再灌注损伤的细胞凋亡,进一步防止肝脏损伤。然而JNK信号通路在LPS诱导的急性肝损伤中激活的研究还少有报道。
本研究采用LPS诱导脓毒症急性肝损伤小鼠模型,腹腔注射LPS后,肝组织中迅速出现p-JNK及p-c-Jun蛋白的大量表达,此后逐渐下降,30 h时表达与对照组无明显差异。血清TNF-α、IL-1β 在LPS注射1 h时较对照组也明显上升,4 h时达峰值,30 h时仍高于对照组。本研究中TNF-α、IL-1β 及JNK的动态变化趋势表明,脓毒症时促炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β)的升高与JNK的活化明显相关,JNK信号传导通路活化后可诱导TNF-α 和IL-1β 的释放,从而介导急性肝损伤的发生、发展。 既往研究也证实,JNK广泛参与免疫应答及炎症反应,能调节多种炎症蛋白基因的表达,在炎症反应中起关键作用[12]。LEE等[13]用LPS刺激RAW264.7细胞,可使JNK的表达上升,并分泌促炎症介质一氧化氮NO及前列腺素E2。SOLINAS等[14]发现,JNKl基因缺失可以减轻炎症以及高脂饮食诱导的继发性胰岛素抵抗和肝脏脂肪变,进而防止肝脏炎症和纤维化。MARRA等[15]对人肝星状细胞体外培养时发现,JNK的特异性抑制剂SP600125可抑制炎症趋化因子MCP-1的分泌和基因表达,进而防止肝脏损伤。