骨骼肌损伤中自由基损伤机制的研究进展

骨骼肌损伤中自由基损伤机制的研究进展（精选6篇）

骨骼肌损伤中自由基损伤机制的研究进展 篇1

骨骼肌损伤中自由基损伤机制的研究进展

有研究认为运动本身产生的自由基对机体的攻击,是促进大负荷运动后肌肉的进一步损伤的`重要的机制.本文就这种机制的作用机理及其相关性的研究现状作以综述,旨在了解运动损伤研究的发展趋势.

作 者：董杰 作者单位：内蒙古民族大学体育学院,内蒙古通辽,028043刊 名：中国科技博览英文刊名：CHINA SCIENCE AND TECHNOLOGY REVIEW年，卷(期)：“”(4)分类号：U28关键词：自由基、骨骼肌损伤 相关性

骨骼肌损伤中自由基损伤机制的研究进展 篇2

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

4, 4’-MDI (纯度98%, Sigma公司) , SOD、MDA、GSH、NO和NO合成酶 (NOS) 检测试剂盒 (购于南京建成生物制品公司) , WT6002型电子天平 (杭州万特衡器有限公司) , UV2000型紫外可见分光光度计 (日本Unico) , F8型超细匀浆器 (德国Fluko) 。

1.2 动物分组与染毒

选择健康成年 (8周龄) 清洁级昆明雄性小鼠100只, 体重为35.3~46.2 g, 由山东大学实验动物中心提供, 实验动物许可证号SCXK (鲁) 2013-0001, 动物房许可证号SYXK (鲁) 2013-0007。动物饲养温度为 (23±2) ℃, 相对湿度为 (50±10) %, 自然光照, 普通饲料喂养。随机分为5组, 其中4组为染毒组, 1组为对照组, 每组20只。

根据4, 4’-MDI的化学品安全技术说明书 (MSDS) 资料, 小鼠吸入4 h半数致死浓度 (LC50) 约为430 mg/m3。2013年9月, 于50 L静式染毒罐中对4组小鼠进行染毒, 各组染毒剂量分别相当于1/2 LC50、1/4 LC50、1/8 LC50、1/16 LC50。连续染毒2周, 每天持续4 h, 染毒结束次日处死小鼠, 取肺、睾丸、肝脏组织, 用冰冷的生理盐水漂洗, 再用磷酸盐缓冲液 (PBS, p H=7.4) 制备10%的组织匀浆。

1.3 检测指标与方法

蛋白含量的测定采用考马氏亮蓝法, SOD活力测定采用邻苯三酚自氧化法, MDA含量测定采用TBA法, GSH含量测定采用二硫代二硝基苯甲酸法, NO水平测定采用硝酸还原酶法, NOS活力测定采用NOS催化L-Arg法。

1.4 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行方差齐性检验、单因素方差分析。进一步比较时, 若方差齐, 选择LSD检验;若方差不齐, 选择Games-Howell检验。实验数据以±s表示。

2 结果

2.1 MDI对小鼠肺脏的自由基损伤作用

2.1.1 MDI对小鼠肺脏的氧化损伤作用

随着染毒剂量的增加, 染毒组小鼠肺脏中SOD活力呈现明显下降趋势, 其中1/2 LC50、1/4 LC50、1/8 LC503组与对照组相比, 差异均有统计学意义 (均P<0.05) ;染毒组小鼠肺脏中GSH含量呈现明显下降趋势, 其中1/2 LC50、1/4 LC502组与对照组相比, 差异均有统计学意义 (P<0.01, P<0.05) ;染毒组小鼠肺脏中MDA含量呈现明显升高趋势, 与对照组相比, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

注:MDI—二苯基甲烷二异氰酸酯;SOD—超氧化物歧化酶;GSH—谷胱甘肽;MDA—丙二醛。与对照组相比, aP<0.05, bP<0.01。

2.1.2 MDI对小鼠肺脏中NO和NOS的影响

随着染毒剂量的增加, 染毒组小鼠肺脏中NO含量和诱导型NO合成酶 (i-NOS) 活力呈现明显升高趋势, 与对照组相比, 差异均有统计学意义 (均P<0.01) ;1/4 LC50染毒组小鼠肺脏中固有型NO合成酶 (c-NOS) 活力与对照组相比, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 其他3个染毒组小鼠肺脏中c-NOS活力与对照组相比, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。

注:MDI—二苯基甲烷二异氰酸酯;NO—一氧化氮;i-NOS—诱导型NO合成酶;c-NOS—固有型NO合成酶。与对照组相比, bP<0.01。

2.2 MDI对小鼠睾丸的自由基损伤作用

2.2.1 MDI对小鼠睾丸的氧化损伤作用

随着染毒剂量的增加, 染毒组小鼠睾丸中SOD活力呈现明显下降趋势, 其中1/2 LC50、1/4 LC50、1/8 LC503组与对照组相比, 差异均有统计学意义 (均P<0.01) ;染毒组小鼠睾丸中GSH含量呈现下降趋势, 其中1/2 LC50组与对照组相比, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;染毒组小鼠睾丸中MDA含量呈现明显升高趋势, 其中1/2 LC50、1/4 LC50组与对照组相比, 差异均有统计学意义 (均P<0.01) 。见表3。

注:MDI—二苯基甲烷二异氰酸酯;SOD—超氧化物歧化酶;GSH—谷胱甘肽;MDA—丙二醛。与对照组相比, aP<0.05, bP<0.01。

2.2.2 MDI对小鼠睾丸中NO和NOS的影响

随着染毒剂量的增加, 染毒组小鼠睾丸中NO含量和i-NOS活力呈现升高趋势, 其中1/2 LC50、1/4 LC502组与对照组相比, 差异均有统计学意义 (均P<0.01) ;4个染毒组小鼠睾丸中c-NOS活力与对照组相比, 差异无统计学意义 (均P>0.05) 。见表4。

注:MDI—二苯基甲烷二异氰酸酯;NO—一氧化氮;i-NOS—诱导型NO合成酶;c-NOS—固有型NO合成酶。与对照组相比, bP<0.01。

2.3 MDI对小鼠肝脏中自由基的影响

2.3.1 MDI对小鼠肝脏的氧化损伤作用

1/2 LC50组小鼠肝脏中SOD活力与对照组相比明显降低, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;1/2 LC50组小鼠肝脏GSH含量比对照组减少, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;随着染毒剂量的增加, 染毒组小鼠肝脏中MDA含量呈现明显升高趋势, 其中1/2 LC50、1/4 LC50组与对照组相比, 差异均有统计学意义 (均P<0.01) 。见表5。

2.3.2 MDI对小鼠肝脏中NO和NOS的影响

随着染毒剂量的增加, 染毒组小鼠肝脏中NO含量和i-NOS活力呈现升高趋势, 其中1/2 LC50、1/4 LC50、1/8 LC503组与对照组相比, 差异均有统计学意义 (均P<0.01) ;4个染毒组小鼠肝脏中c-NOS活力与对照组相比, 差异无统计学意义 (均P>0.05) 。见表6。

注:MDI—二苯基甲烷二异氰酸酯;SOD—超氧化物歧化酶;GSH—谷胱甘肽;MDA—丙二醛。与对照组相比, aP<0.05, bP<0.01。

注:MDI—二苯基甲烷二异氰酸酯;NO—一氧化氮;i-NOS—诱导型NO合成酶;c-NOS—固有型NO合成酶。与对照组相比, bP<0.01。

3 讨论

MDA是一种重要的脂质过氧化产物, 不仅反映自由基产生的程度, 而且还反映脂质过氧化的程度, 间接反映细胞损伤的程度。它是细胞发生脂质过氧化的代表性产物, 其含量多少预示脂质过氧化程度的轻重[4]。在本研究中, 染毒组小鼠靶器官中MDA含量明显升高, 提示小鼠吸入MDI后, 引起组织内氧化损伤效应, 造成组织损伤, 并且随着染毒剂量增加MDI在肺脏、睾丸、肝脏组织中累积。GSH是体内重要的非酶性抗氧化物质, GSH的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要标志。SOD是自由基的有效清除剂, 能催化过氧自由基分解形成过氧化氢, 使细胞免受过氧自由基的氧化损伤。SOD活力的降低, 说明体内需清除的自由基较多[4]。本研究结果表明, MDI染毒后, 抗氧化系统的代表性指标GSH和SOD在3种靶器官中均有损耗, 提示MDI可产生各种氧自由基消耗抗氧化物质, 从而导致组织对氧化损伤的敏感性增加。小鼠吸入MDI后, 通过产生各种自由基导致氧化物质与抗氧化物质失衡, 从而引起靶器官组织氧化损伤, 可能是其毒性作用的一种重要机制。

NO为高效能、半衰期短的气态基团。L-精氨酸在NOS的催化下生成NO。作为内源性血管舒张因子, NO由内皮细胞产生后弥散至血管平滑肌细胞, 激活可溶性鸟苷酸环化酶产生环鸟苷-磷酸 (c GMP) , c GMP通过抑制平滑肌细胞中Ca2+内流而使血管舒张。NOS分为c-NOS和i-NOS 2种。c-NOS在生理状态下生成少量NO, 发挥其生理功能;i-NOS在病理情况下生成大量NO, 发挥细胞抑制和毒性效应[5]。本研究结果提示, 吸入MDI可使得小鼠肺脏、睾丸、肝脏3种器官中NO水平升高, 且随着染毒剂量的增加, NO水平也有上升的趋势, i-NOS水平与NO水平具有较好的相关性, 说明MDI引起的NO水平升高是由于i-NOS被激活、诱导所致。

既往研究表明, MDI分子中的-NCO基因性质极为活泼, MDI蒸气被吸入气道后, 作为一种过敏原进入人体内, 不仅可造成化学刺激, 而且与呼吸道黏膜水分起反应, 造成气道上皮细胞的伤害, 使黏膜血管扩张、水肿, 并使支气管平滑肌痉挛, 造成气道狭窄。还可与体内蛋白质结合变成完全抗原, 并刺激敏感者生成特异性Ig E和Ig G抗体, 引起变态反应[6]。本研究中染毒组小鼠肺脏中i-NOS水平明显升高或许是因为气道上皮细胞、肺泡巨噬细胞、肥大细胞和淋巴细胞等在过敏原 (MDI) 及炎症刺激下激活所致。此外, 炎症细胞产生的IL-1、TNF-α、TNF-β等细胞因子亦可诱导i-NOS表达其活力。

另外, 过量的NO会导致精子活力、活率下降, 脂质过氧化反应加强, 抑制生殖细胞的呼吸, 从而造成生殖系统的损害作用[7]。本研究中NO水平的变化趋势表明, MDI可能作为一种小分子外来抗原增加了i-NOS的活力, 产生大量的NO引起细胞毒作用, 造成对睾丸组织的氧化损伤作用, 从而对小鼠睾丸产生损害。

综上所述, 呼吸道暴露于MDI可引起多个靶器官的自由基损伤, 主要表现为抗氧化物质的减少和自由基增多, 同时激活i-NOS诱导NO水平升高, 从而对组织产生损伤。接触MDI的劳动者应采取个人防护措施。

参考文献

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运动性骨骼肌微损伤机制研究进展 篇3

摘 要 竞技体育为了突破极限、改善体能、提高运动成绩进行大运动量重复训练导致运动性骨骼肌微损伤（exercise-induced muscle damage，EIMD）在所难免。由于损伤后骨骼肌组织的病理改变会干扰运动员的心理，直接威胁着运动员运动能力、运动成绩乃至运动寿命，因此，充分研究其损伤机制，了解其超微结构变化的规律，探讨行之有效的预防、治疗、康复措施，缩短骨骼肌损伤的修复时间，对提高训练效果具有重要意义。

关键词 运动 骨骼肌 损伤

一、运动对骨骼肌超微结构的影响

研究发现，重复力量性运动训练，可以使骨骼肌体积增大，力量增加。同时引起骨骼肌超微结构的改变，表现为肌纤维中肌红蛋白含量增多，肌糖原、磷酸肌酸含量增加，线粒体数目增多、体积增大，并能使肌纤维中毛细血管增多，毛细血管网增生，这种异常性变化可以延续到运动后数天，运动早期可以出现一过性运动能力下降、疲劳感，影响运动员的正常训练和比赛。

二、运动性骨骼肌超微结构变化及损伤机制

（一）运动性骨骼肌超微结构变化的机械因素学说

关于运动性骨骼肌超微结构变化及损伤机制学者从多种不同的角度进行了阐释，从最早的组织撕裂假说，到能量代谢学说和高机械张力假说，以及近年来的钙离子损伤学说和自由基损伤学说等。

运动性骨骼肌超微结构变化起因于机械因素似乎多数学者已经达成共识，主要依据Morgan等提出的离心运动时肌节长度不均一性学说（sarcomere lengthnon-uniformities）和肌节爆裂学说（popping sarcomerehypothesis），认为离心运动时由于肌节被动牵拉的长度不均一，另外，肌节长度--张力曲线处于降支状态时肌节结构稳定性最差，导致较弱肌节被过度牵拉，如果在这种状态下肌节反复被牵拉，较弱肌节的粗细肌丝将牵拉出重叠区，导致肌节被撕裂或撕断，最后肌膜被撕裂，至此，损伤是不可逆的。然而，Rassier等采用扫描线性光电二极管阵列图像技术，观察大白兔腰肌单条肌原纤维时并没有发现肌节爆裂现象，随后多位学者证实了这一现象。这提示机械因素学说尚存争议，不能从根本上解释运动性骨骼肌超微结构变化的起因，运动性骨骼运动性损伤的机制仍在探讨中。

（二）细胞骨架与EIMD 的关系

运动性骨骼肌微损伤（exercise- induced muscle damage，EIMD）和延迟性肌肉酸痛（delayed onset muscle soreness，DOMS），多年来一直是运动医学的研究热点。许多研究已表明，离心收缩引起的肌肉酸痛在运动后2-3d达到高峰，DOMS伴随着一系列结构的、组织学的和生物化学的改变，所以又称为离心运动后的微损伤。运动过程中，高张力的机械牵拉会使细胞骨架的正常结构受到影响，从而造成肌肉收缩蛋白结构破坏

（三）骨骼肌超微结构变化后的重塑过程

运动性骨骼肌超微结构变化具有延迟性特点，即运动后即刻结构变化程度较轻，运动后24～72h逐渐加剧。

多数学者认为：运动后骨骼肌结构变化加剧是肌节重新组装合成新肌节的过程。Matsuura等通过电刺激大鼠后肢（50Hz、30min）产生运动，6h后比目鱼肌肌节Z线呈波形（Z线流），12h时Z线断裂、肌节撕裂，24h部分区域肌丝稀疏、出现空白区。但运动后12h、24h，在紊乱的肌丝中出现呈纵向排序的成簇核糖体，从而认为紊乱的肌丝不是损伤加重而是修复过程，此观点也被随后的研究所证实。Yu等的研究提示离心运动导致了骨骼肌肌节重塑。Butterfield等研究通过长期离心运动训练，得出结论：1.同一块肌肉不同区域存在不同的肌纤维结构，施加于肌肉肌腱同等强度的张力，不同区域的不同肌纤维受力不同。2.不同肌纤维受到的中间丝和结缔组织保护程度不同，也可能造成不同肌纤维的肌节适应能力不同。提示离心运动导致的骨骼肌超微结构变化不是损伤，而是肌节对运动的适应过程，直接证实了骨骼肌肌节重塑观点。

三、结论

学者对运动性骨骼肌损伤进行了各种研究，但值得实践借鉴的项目有限，仍有大量的科研方法尚未臻善。

参考文献：

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骨骼肌损伤中自由基损伤机制的研究进展 篇4

1 骨骼肌损伤病理进程

骨骼肌损伤是临床常见损伤性疾病, 患者具有一定伤后自愈能力, 但愈合过程中常出现肌纤维化过程, 影响恢复效果。骨骼肌损伤主要包括四项病理过程:坏死、炎症、再生以及纤维化。以下对这四种病理过程进行详细分析。

1.1 坏死:

骨骼肌在损伤后其相关神经、血管、肌纤维等骨骼肌的其他组成部位均会受到损伤, 当患者肌纤维膜受到破坏后, 将会导致患者肌肉细胞内部钙离子外漏, 引起患者损伤部位钙离子明显升高, 引起患者相关蛋白酶活性增加, 线粒体呼吸过程抑制, 导致肌纤维出现坏死、变性状况, 导致患者病灶部位出现肌肉萎缩, 在病灶部位形成缺口[2]。骨骼肌中存在许多血管, 当人体出现骨骼肌损伤时, 将会引起患者毛细血管损伤, 导致病灶部位出现血肿, 多种细胞因子、生长因子将在病灶处聚集, 加重病灶损害, 影响病灶恢复, 严重时将扩展至患者正常肌纤维及相关组织, 引起肌肉功能损伤甚至丧失, 导致肌肉萎缩。

1.2 炎症:

炎性反应是在肌纤维出现坏死后, 自身免疫系统将出现相关应激反应症状。炎性反应是肌纤维再生、肌纤维纤维化的基础。当毛细血管损伤后, 病灶部位出现血肿, 且血肿多在患者损伤24~72 h内出现。血肿形成后, 患者相关巨噬细胞、中性粒细胞会产生促炎因子, 引起患者炎性反应加强, 加速患者肌纤维进一步退化, 并能促进患者肌肉再生。中性粒细胞是肌纤维损伤后出现最早, 随后巨噬细胞将在炎性细胞因子作用下聚集到损伤部位, 且巨噬细胞在吞噬细胞碎片的同时, 将伴随释放细胞因子。细胞因子中包含诸多细胞毒性物质, 将会导致肌纤维退化加快。此外, 当前相关研究结果显示, 肌原细胞能分别细胞因子和生长因子, 从而促进骨骼肌病理进展[3]。

1.3 再生:

患者肌纤维在炎症刺激下, 也会出现再生状况, 但其再生常出现延迟状况, 约在伤后7 d出现。星状细胞、卫星细胞是促进肌肉再生的常见细胞, 其可持续增殖分化, 形成肌小管、肌纤维。星状细胞多在基底膜及肌纤维膜中, 处于无活性状态, 而当基底膜和肌纤维膜出现破坏时, 星状细胞将会被激活[4]。从而进行增殖分化过程, 促进肌肉再生。卫星细胞在增值分化过程中常常先形成多核肌小管, 再进行不成熟的肌小管, 最后再分化为成熟肌纤维, 促进肌肉再生。且患者病灶处将释放诸多生长因子, 促进患者细胞增值、分化、再生。

1.4纤维化:

纤维化过程因细胞质再生过度导致, 其多在伤后2周出现, 在伤后4周将出现增值明显加速状况。成纤维细胞是细胞外基质的主要细胞, 其中含有多种蛋白质。骨骼肌损伤后, 相关生长因子、细胞因子等均会促进细胞外基质增殖分化过程, 与此同时, 外骨骼肌再生过程将在72 h内现在受限。部分转化生长因子在该过程中会促进纤维化过程, 转化生长因子过多时会引起患者细胞外基质沉积, 引起骨骼肌出现慢性炎症, 且转化生长因子会抑制细胞外基质降解过程, 引起肌纤维细胞生成过度, 导致肌纤维化。纤维化后, 将引起肌肉功能受限, 影响患者肌肉功能恢复。

2 骨骼肌损伤治疗措施

根据上述骨骼肌损伤的病理进展, 骨骼肌损伤坏死、炎症、再生以及纤维化四项病理过程是临床治疗骨骼肌损伤的重要突破点。在骨骼肌损伤的治疗中, 可抑制各项病理过程, 从而抑制纤维化过程, 促进患者骨骼肌恢复。

2.1 抗氧化剂治疗:

骨骼肌损伤患者会出现血肿, 而血肿会引起患者形成氧自由, 氧自由基的出现将引起患者坏死部位扩散, 导致病灶周边健康肌纤维组织损伤。因此临床治疗时, 可通过减少患者病灶坏死状况来提高患者治疗效果。可使用抗氧化剂来抑制氧自由基的形成。当前临床研究中, 在动物实验中使用的抗氧化剂包括维生素C、维生素E、乙酰基半胱氨酸等, 其治疗效果得到研究肯定[5]。

2.2 生长因子:

上文中提到生长因子在骨骼肌再生中具有重要促进作用, 其能增强星状细胞活性, 并促进相关细胞增值分化。因此, 临床可给予患者损伤部位生长因子治疗, 以促进骨骼肌再生, 提高治疗效果。由于生长因子促进肌肉再生需一定的浓度, 对剂量依赖性较大。因此, 给予患者生长因子治疗时, 需保证病灶部位生长因达到一定浓度。目前研究的重点是如何提升局部生长因子浓度。当前研究结果中, 采取直接肌肉注射生长因子是提升局部生长因子浓度的有效方法[6]。该方法操作简单, 且其应用安全性得到了临床肯定。

2.3 阻断转化生长因子:

转化生长因子过度表达将会导致肌纤维化, 因此在治疗过程中, 可通过抑制转化因子活性, 来抑制肌细胞纤维化, 从而促进骨骼肌愈合。当前用的抗纤维化药物有苏拉明、核心蛋白聚糖等。

2.4 炎症:

炎症是骨骼肌损伤后的重要病理过程, 临床多使用抗炎药物阻断前列腺素的生成过程, 从而减少患者疼痛状况及炎性反应过程, 促进患者骨骼肌愈合, 常用的药物为非甾体类抗炎药, 但非甾体类抗炎药的治疗效果仍待研究。

3 小结

骨骼肌损伤是临床常见损伤, 但当前治疗效果不佳, 患者预后较差, 严重时甚至会影响患者骨骼肌功能。当前治疗骨骼肌损伤主要通过骨骼肌损伤的病理过程进行针对性治疗, 但其临床具体实践效果仍待研究, 仍需提出更加安全、有效的治疗方案, 改善患者预后。

摘要：骨骼肌损伤是当前临床常见的损伤类型, 骨骼肌受损患者虽能自主再生, 但其易出现纤维化, 导致肌肉不完全再生, 导致瘢痕出现, 严重时甚至会引起患者出现肌肉收缩性降低, 引起患者出现再次损伤, 影响患者日常生活。骨骼肌损伤后会经历坏死、炎症、再生、纤维化四个阶段, 因此, 加强对骨骼肌损伤的病理进程研究, 是给予患者针对性治疗, 提高治疗效果的关键。本文从骨骼肌损伤的病理进程出发, 总结当前骨骼肌损伤的治疗方法, 并对骨骼肌损伤的治疗发展方向进行展望。

关键词：骨骼肌损伤,病理进程,治疗措施

参考文献

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骨骼肌损伤中自由基损伤机制的研究进展 篇5

外用消痛贴的主要成分是独一味、水柏枝等中药材。临床多次证明,消痛贴在慢性软组织损伤的治疗中有着较为明显的作用[5,6,7]。扶他林软膏的主要组成是双氯芬酸纳,属非甾体类抗炎类药物,有研究证实外用扶他林膏对于炎症的减轻有着明显的作用。因此,探讨二者在运动性骨骼肌慢性损伤中与肌细胞IL-6之间的相互作用和关系,为IL-6新的应用做基础性的理论建设。

1 材料与方法

1.1 实验对象和分组

实验对象为体重在2.2kg—2.5kg间成年雄性新西兰兔42只,购自北京科宇动物养殖中心,实验动物许可证号:SCKK2009-0005,在中国中医科学研究院基础理论研究所实验动物中心,按照国家标准的兔饲养常规分笼饲养。所有动物随机分为对照组(n=21)、外用扶他林组(n=21)和外用消痛贴组(n=21),其中每组分别为4、5周组,分组如下:

1.2 运动方案

动物的训练在中国中医科学研究院中医理论研究所动物房进行,依据有关研究运动性骨骼肌损伤的造模方法以及有关文献和预实验确定运动方案,采用高压低流电刺激仪刺激实验组动物,使其产生跑跳运动,具体方案如下:

每只动物每隔12秒刺激一次,每次刺激时间持续0.1-0.2秒,每天训练60分钟,分3次进行,两次训练间隔20分钟。每只兔子每天跑跳约300次,每周连续训练5天,每天的训练的开始时间不变。在训练过程中观察记录动物每天的精神状态、体重变化、进食情况,检查是否受伤等。

1.3 给药

将外用消痛贴组和扶他林组中4、5周组动物小腿部位毛发剔除,将消痛贴和扶他林软膏均匀涂抹于该皮肤处,并用纱布缠裹。给药在每天训练结束后进行,每日一次,下次训练前将药包拆除。

1.4 取材

分别在第4、5周训练结束后,使用空气栓塞法处死动物后立刻取动物左腿腓肠肌内测头,分两块置入4%多聚甲醛固定液中进行固定。

1.5 肌组织HE染色、观察

将所取标本分别进行常规HE染色处理,并在光镜下观察肌细胞、肌细胞核、肌内衣、肌外衣、炎症细胞等,采用奥林巴斯数码显微镜进行拍照。

1.6 免疫组化标本制作及图像分析

制作免疫组标本,并采用奥林巴斯D3.2图像处理软件对片子图像进行采集,在判定肌细胞IL-6的表达中:棕褐色的区域为表达区,密度的深度、面积与IL-6的表达量呈正相关;

1.7 数据处理

随机取免疫组化图像5个不同的视野记录,使用MIAS4.0对所采图像进行分析(平均光密度值),得出组织图片IL-6表达的平均光密度值。采用SPSS17.0软件对所结果进行处理,用均值±标准差(X±s)表示。不同用药组间横向比较采用单因素方差分析法进行(a=0.05)。

2 结果

2.1 肌细胞形态学比较(光学镜)

2.1.1 横向比较4周组

4周对照组:细胞间结缔组织增生,细胞染色不均,出现红染,细胞核肿胀,巨噬细胞进出现在坏死、变性或结构被破坏的肌细胞中(图1)。

4周扶他林组:呈现单相多灶性炎性细胞浸润,核固缩明显,细胞排列较为整齐,染色不均,有颗粒性变性(图2)。4周消痛贴组:有较少的炎性细胞,未见明显的炎性细胞浸润灶,细胞排列较为整齐、致密,染色均匀(图3)。

2.1.2 横向比较5周组

5周对照组:出现大量的炎性细胞浸润灶,细胞核肿胀,细胞间隙开始变得模糊不清,细胞肿胀呈现圆形,炎性细胞侵入坏死细胞内,细胞内出现的免疫细胞,细胞变性坏死,结够不完整(图4)。相比之下,5周消痛贴、扶他林组有较少的炎性细胞,未见明显的炎性细胞浸润灶,细胞排列较为整齐、致密,染色均匀(图5、6)。

2.2 骨骼肌细胞IL-6免疫组织化学图像分析

2.2.1 纵向比较4、5周对照组中不同用药组肌细胞IL-6平均光密度值的变化

*:与4周照组比较P<0.05

研究结果显示,与4周对照组比较5周对照组肌细胞IL-6平均光密度值显著升高(p<0.05)。随着训练时间的推移,骨骼肌细胞IL-6的表达明显增多。

2.2.2 横向比较4周组中不同用药组肌细胞IL-6平均光密度值的变化

*:与对照组比较P<0.05#:与4周扶他林组比较P>0.05

研究结果显示,与4周对照组相比较,4周扶他林组、消痛贴组肌细胞IL-6的平均光密度值较低,且存在显著性差异(P<0.05);与4周扶他林组相比较,4周消痛贴组的肌细胞IL-6平均光密度值无明显差异(P>0.05)。不同外用伤科药在以降低慢性骨骼肌损伤中肌细胞IL-6的表达有相同影响,都可以降低其表达。

2.2.3 横向比较5周各组肌细胞IL-6平均光密度值的变化

*:与5周对照组比较P<0.01#:与5周扶他林组比较P>0.05

与5周对照组相比较,5周扶他林组、消痛贴组肌细胞IL-6的平均光密度值较低,且存在显著性差异(P<0.05);与5周扶他林组相比较,5周消痛贴组肌细胞IL-6平均光密度值无明显差异(P>0.05)。在运动性慢性骨骼损伤中,外用伤科药对肌细胞IL-6的表达有降低作用。

3 讨论

3.1 不同外用药对骨骼肌形态学变化的影响

外用消痛贴主要的药学是多种中药成份组成,在消除、减轻局部炎症反应,促进受损组织修复方面有着明显的作用。加之其所采用的药贴技术,可以将药物直接覆于受损肌组织,外用效果明显。外用消痛贴外在急性软组织损伤中有着明显的作用,这与局部受损组织的炎症反应有关。扶他林软膏的主要组成是双氯芬酸纳,属非甾体类抗炎类药物,有研究证实外用扶他林膏对于减轻细胞炎症反应有着明显的作用。通过研究同表明,通过对比外用贴药和外用扶他林发现二者有着相似的药用价值。

运动性骨骼肌慢性损伤中,不同的外用药对不同组别肌细胞有着较为明显的影响。观察对比用各对照组(4、5周)和各给药组的肌组织切片,发现:与对照组相比较,扶他林组和消痛贴药组都有着各自变化的特点。对照组可看到明显的肌纤维坏死、变性,多发生变性,坏死,肌纤维异染,泡体溶解。从组织中可观察到机化了的瘢痕组织,坏死肌细胞增多,大量巨噬细胞浸润、侵入坏死肌细胞,提示肌细胞结构受到破坏,受损程度较为严重。扶他林组和外用贴药组炎性细胞较为减少。这与高杨等人的研究结果是相吻合的,外用消痛贴对于局部的炎症有着抑制作用[5]。

3.2 不同外用药对运动性骨骼肌慢性损伤中肌细胞IL-6的表达影响

从纵向来看,5周对照组肌细胞IL-6的表达,明显高于4周训练组,结合肌组织形态学的观察结果可知,随着训练时间的延长,骨骼肌细胞损伤中的炎症在增多,同时肌细胞IL-6的表达也在增多。这也就是说运动性慢性骨骼肌细胞损伤中肌细胞IL-6的表达与肌细胞炎症反应存在一定的联系。从不同用药组横向比较的结果来看,与对照组相比较,消痛贴组、扶他林组肌细胞IL-6的表达值有着显著性差异。就说明在用药2周后,扶他林组和消痛贴组相似的效果,都能够降低肌细胞IL-6的表达水平。

扶他林软膏的主要组成是双氯芬酸纳,属非甾体类抗炎类药物,有研究证实外用扶他林膏对于炎症的减轻有着明显的作用。消痛贴主要的药学成分是独一味等多种中药成份,在消除、减轻局部炎症反应,促进受损组织将复有着明显的作用。加之其所采用的要贴技术,可以将药物直接覆于受损肌组织,外用效果明显。临床上外用消痛贴对各种急、慢性软组织损伤都有着较为明显的疗效[8,9,10]。李敏、何朝永等2008年的研究中,以周istar大鼠作为实验对象,采用自制撞击器造成动物急性软组织损伤,分别给以不同组别的动物不同的药,通过对比外用消痛贴组和随机模型对照组动物血浆中TNF-α、IL-1βmRNA表达水平后发现,外用消痛贴组动物血浆中TNF-α、IL-1βmRNA较随机模型组低,进而得出:外用消痛贴治疗急性软组织损伤的机制可能是通过抑制炎症因子IL-1β和TNF-α表达来发挥其抗炎作用[11]。本研究通过光镜观察组织的形态学变化,可发现外用消痛贴对于运动性骨骼肌慢性损伤也有着较为明显的疗效。

在运动性骨骼肌慢性损伤中,IL-6在肌细胞中的表达机制还不甚明了,在运动性损伤中的作用也存在着较多的疑问。运动性骨骼肌损伤中,短期(2周)的外用伤科药对于骨骼肌IL-6的表达有着影响,对运动性骨骼肌慢性损伤有着一定的疗效。

4 结论

(1)骨骼肌损伤中,肌细胞的炎性因子与肌细胞IL-6的表达存在一定的联系;

(2)外用伤科药对慢性骨骼肌损伤中肌细胞的修复有着较明显的作用;

(3)运动性慢性骨骼肌损伤中,不同外用伤科药(扶他林与消痛贴)都可以显著降低骨骼肌IL-6的表达影,二者没有显著差别。

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骨骼肌损伤中自由基损伤机制的研究进展 篇6

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

健康清洁级SD大鼠12只, 雌雄不限, 体重220~250 g, 由广东省医学实验动物中心提供。实验期间, 室内温度保持在20~25℃, 相对湿度保持在50%~70%, 每天光照12 h。正常饲养的1周时间内所有大鼠自由进食 (普通饲料) 和饮水。

1.1.2 主要实验试剂

氯胺酮、速眠新Ⅱ、palcos R骨水泥、多聚甲醛、庆大霉素、生理盐水.

1.1.3 主要实验仪器

鼠台、针式温度计、石蜡包埋机、HM315轮转式石蜡切片机 (德国/Microm) 、水浴锅、负压吸引器。

1.2 动物模型建立及分组

选取健康清洁级SD大鼠12只, 雌雄不限, 体重220~250 g, 手术前1 d下背部脊柱两侧备皮。速眠新Ⅱ与氯胺酮1︰1配比0.4 m L/kg肌肉注射麻醉, 取背部正中纵行切口, 剪开肌筋膜, 沿肌纤维方向钝性分离左侧臀大肌, 注入现配骨水泥1 m L共2枚, 平行于脊柱, 离中线约10 mm, 各植入物间隔约10 mm。同法在对侧对称部位注入1 m L骨水泥, 并加用4℃生理盐水灌注, 同时接负压吸引器引流。两组互为对照。连续测量骨水泥-肌肉界面温度变化, 待骨水泥完全固化冷却, 逐层缝合至皮肤。术后切口以安尔碘消毒, 以庆大霉素 (2万U/kg) 肌注, 每天3次。待动物苏醒, 放回笼中继续饲养。

1.3 取材

分别于术后1 d、4 d、7 d后, 各处死4只实验动物。沿肌纤维方向切取小块与骨水泥接触的臀大肌, 大小约4 mm×4 mm×6 mm, 自然伸直 (勿牵拉) , 置于多聚甲醛溶液固定24 h, 用于石蜡切片。

1.4 切片和HE染色

石蜡切片:HM315轮转式石蜡切片机切片, 厚为2μm, 然后贴于涂有APES载玻片上, 60℃烘烤30 min后, 室温保存, 常规HE染色。

1.5 统计方法

全部计量资料采用 (±s) 表示, 统计处理软件系统采用SPSS 19.0。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验测得数据

骨水泥组和骨水泥+4℃水组局部最高温度分别为 (61.58±2.75) ℃和 (44.73±2.03) ℃, 40℃以上持续时间分别为 (227.83±22.21) s和 (53.33±15.79) s, 均P<0.01, 差异有显著统计学意义。混匀至最高温度时间分别为 (571.67±7.92) s和 (575.00±8.00) s, P>0.05, 差异无统计学意义。

2.2 两组大鼠骨水泥接触界面肌肉的变化

2.2.1 肉眼观察

骨水泥组:术后1 d局部肌纹理排列稍紊乱, 呈暗红色, 可见少量渗出;术后4 d, 肌纹理紊乱, 界限不清, 颜色暗红, 可见明显渗出;术后7 d, 肌纹理模糊, 表面可见点状坏死灶及肉芽组织生长。骨水泥+4℃组:术后1 d肌纹理较清晰, 浅红色;术后4 d, 肌纹理稍紊乱, 界限尚清, 暗红, 可见少量渗出;术后7 d, 肌纹理可见, 稍模糊, 与正常组织无明显差异。

2.2.2 镜下观察

正常肌肉组织细胞大小一致, 呈多角形相嵌分布, 多核, 位于周边, 未见炎细胞浸润、肌纤维坏死及再生等变化 (见图1) 。

3 讨论

本文通过在大鼠身上模拟单纯骨水泥外溢在骨骼肌中的固化放热过程, 并加于4℃水局部冷却进行对比, 由大体观察及HE染色镜检结果, 1 m L骨水泥的聚合放热可导致骨骼肌细胞的损伤甚至坏死, 而4℃水冷却可显著降低局部最高温度, 缩短40℃以上持续时间, 有效减轻骨骼肌的组织形态学改变。

众所周知, 局部软组织的损伤情况与感染有着密切的关系。而感染作为关节置换术后常见并发症之一, 在过去的几年里, 虽其发生率已降到1%~2%, 但对于外科医生来说, 仍旧是一个严峻的挑战。因为它会增加治疗成本, 延长治疗时间, 且难以治愈, 功能预后不佳, 致死致残率高[3]。随着我国人口老龄化的到来, 老年性股骨颈骨折、股骨头坏死的病例越来越多, 人工关节手术的发展也十分迅速, 尤其髋、膝关节置换手术例数每年倍增, 不可避免地涉及到骨水泥的安全问题。骨水泥聚合反应放热可不同程度地损伤到周围组织, 常导致局部感染、患处的感觉或功能障碍、无菌性骨溶解及假体的早期松动, 从而影响手术成功率及远期疗效[4]。因此, 有效地减轻或预防局部软组织的损伤, 可一定程度上降低感染的发生率, 提高手术疗效, 从而减少经济成本及社会成本。

针对如何减轻或预防骨水泥聚合反应的热损伤, Krrholm[5]总结前人已有的经验提出以下方案:a) 减少骨水泥用量;b) 使用金属植入物;c) 预冷假体植入物、骨水泥或骨;d) 通过添加重金属或熔化结晶单体来增加骨水泥的热容量;e) 减慢骨水泥聚合反应速率;f) 通过增加粉液比、添加含水凝胶或粒状聚合物来降低单体比例。不少专家学者也正在不懈努力的探索可行方案, 但尚未系统运用于临床。

骨水泥单体与粉剂, 从开始混合至最终固化, 可分为湿砂期、粘丝期、面团期、固化期四个时期。本实验中, 选择在面团期注入骨水泥, 加用低温生理盐水灌注, 并无改变骨水泥的粉液比。另外, 冷水灌注局限于骨水泥表面, 降低外部温度, 而有学者研究发现, 在改变外部温度的情况下, 并不改变骨水泥的生物力学特性[6]。Belkoff等[7,8]临床医生在椎体成形术中, 降温处理骨水泥, 也并没有发现任何不良副作用。Rothstock等[9]在髋关节置换术中, 使用水冷却与两种不同材质髋臼杯 (钴铬合金和聚乙烯) 进行对照研究, 测量髋臼水泥界面的骨水泥固化温度, 发现两种材质髋臼杯的未冷却组峰值温度均达70℃, 而钴铬合金髋臼杯的冷却组可降至50℃以下。作者认为水冷却和 (或) 使用金属植入物, 可有效降低骨水泥固化温度, 而并未发现对骨水泥性能有明显影响。

综上所述, 临床上在使用骨水泥的同时, 加于可控温度的冷水局部灌注冷却, 方法操作简单, 材料容易获得, 减轻炎症反应及组织损伤明显, 而对骨水泥的性能无明显影响, 若能合理地应用于临床, 将对预防术后感染有一定的参考价值。

摘要：目的 模拟骨水泥外溢在周围骨骼肌中的固化放热过程, 研究其聚合放热对骨骼肌的损伤作用及加予4℃生理盐水局部灌注冷却对损伤的影响。方法 选取健康清洁级SD大鼠12只, 雌雄不限, 体重220250 g, 采用左右侧对照, 分别在左右侧臀大肌注入现配骨水泥1 mL, 同时右侧加予4℃生理盐水局部灌注冷却。采用针式温度计连续测量两组骨水泥固化过程中骨水泥-肌肉界面的温度变化情况。分别于术后1 d、4 d、7 d各处死4只, 切取与骨水泥接触部位的肌肉, 行常规石蜡切片, HE染色镜检。对比两组局部温度的变化情况以及肉眼、镜下观察骨水泥-肌肉界面的肌肉组织形态学的改变。结果 两组局部最高温度分别为 (61.58±2.75) ℃和 (44.73±2.03) ℃, 40℃以上持续时间分别为 (227.83±22.21) s和 (53.33±15.79) s, 均P<0.01, 有显著统计学意义。混匀至最高温度时间分别为 (571.67±7.92) s和 (575.00±8.00) s, P>0.05, 无统计学意义。组织学上, 与骨水泥组相比, 骨水泥+4℃水组的局部肌肉组织细胞形态改变较轻, 炎性细胞浸润少, 组织修复时间短。结论 骨水泥聚合反应可对周围骨骼肌造成热损伤, 加于4℃水局部冷却可明显降低局部最高温度及缩短40℃以上持续时间, 有效减少炎症反应和缩短修复时间。若能合理地应用于临床, 将对预防术后感染有一定的参考价值。

关键词：骨水泥,骨骼肌,热损伤,冷却

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