超微损伤

超微损伤（通用5篇）

超微损伤 篇1

在运动过程中大强度、超负荷、过量运动可导致肌肉质量以及肌肉抗负荷力量能力降低、运动能力下降,导致肌肉酸痛,肌细胞纤维损伤尤其是离心运动,容易导致骨骼肌损伤致使骨骼肌的超微结构发生变化,定义为运动性肌肉微损伤主要是骨骼肌组织结构以及功能的损伤。目前学者多数认可离心运动导致骨骼肌损伤后是组织内部的超微结构变化而不是损伤,在骨骼肌肌节重塑过程。对骨骼肌损伤的认识近年来主要集中在:骨骼肌超微结构变化、蛋白组织变异、骨骼肌线粒体ATP酶活性的研究,以及对损伤修复后的治疗手段主要以抗炎药物、外科外用药、伤科外用药、肌卫星细胞修复以及TNF_a在P38MAPK和NF-KB信号通路影响肌肉再生过程,在骨骼损伤和修复中起着重要的作用的相关因子的研究。运动可造成机体一定的损伤,引起细胞坏死和凋亡现象。也可加速机体的物质代谢和能量代谢,并使机体处于缺血、缺氧状态,引起ATP减少、自由基增多,Ca2+浓度改变、线粒体结构及功能变化等,导致细胞凋亡。不可逆转的损伤、过多的或离子的运动、自由基增多超过机体负荷并产生缺氧、缺血,在炎症反应后引起明显机械损伤导致过多的细胞凋亡和坏死。

运动性损伤(EIMD)定义为身体突然从事不习惯大高强度或和长时间超负荷运动后,发生骨骼肌纤维微细损伤。主要表现为:肌细胞超微结构破坏、细胞代谢功能异常、血液生化和肌电指标改变及收缩功能下降等,损伤具有延迟性特征,此期常伴随延迟性肌肉酸痛(DOMS)。骨骼肌伤后愈合时间长且愈合质量不可靠,容易疼痛、僵硬、再次损伤和肌萎缩、直至肌肉疤痕形成,导致运动能力丧失。运动损伤存在于我们日常活动中,运动时肌肉拉伤、运动训练及比赛都会出现肌肉拉伤。尤其是急性损伤在损伤界和运动训练中最常见,且发病率比较严重的运动损伤。对骨骼肌损伤作出及时准确的评定将不仅有利于运动员合理运动负荷的安排,而且对于减少运动所造成的损伤维持良好的竞技能力有着良好的重要价值。因此运动损伤的关注和探索一直备受人国内外学者的关注,因此,如何防治骨骼肌损伤、加快愈合速度和提高愈合质量,成为困扰运动员、教练员和医生的难题之一。

1 骨骼肌损伤的超微症状表现

运动性骨骼肌超微结构目前尚未明确集中,仍然在不断的探讨中。在骨骼肌超微结构发生变化,重塑过程中基质、肌膜、肌节随之损伤的变化。目前对肌肉损伤造成超微结构的损伤主要集中在: 肌细胞膜、细胞骨架、肌细胞收缩成分、物质能量耗竭以及代谢产物堆积、肌细胞内钙稳态的失调、自由基以及过氧化物失调学说、炎症反应引起骨骼肌离心运动导致骨骼肌肌节重塑,肌肉的超微结构发生改变血液中相关酶增加大强度、超负荷、过量运动致使肌肉力量下降、运动范围减少,肌肉酸痛,表现为骨骼肌损伤主要表现为大强度、超负荷运动对骨骼肌损伤,致使肌力下降、运动范围减少,肌肉酸痛。其中主要表现为包括:断裂、扭曲、分流、消失;肌节异常包括:长度不一致、界限模糊;肌原纤维异常包括:不同层面扭曲、区域性解体和细胞器的变化。

不同运动方式对骨骼肌损伤,血浆CK与同工酶CK-MM的变化与比目鱼肌Z线异常之间表现出明显的线形关系,骨骼肌质量和力量降低,机体活动功能下降,主要是激素水平的变化,蛋白质合成与分解失衡,神经-肌肉功能单位重组,线粒体染色体损伤,自由机氧化损伤以及骨骼肌修复机理受损,细胞碉亡,芥稳态失衡、热量和蛋白摄取的改变引起少肌症。肌力衰退,使老年人的活动能力下降,造成老人行走、坐立、登高和举重物等日常动作完成困难, 甚至导致平衡障碍、难以站立、极易摔倒,“与正常人相比,患者的体质量﹑去脂体质量明显降低,爆发力、握力等明显下降,下肢屈肌衰退甚于伸肌,下肢肌力的显著减退直接影响到平衡功能,由此导致老人频繁跌倒。”大强度的肌肉收缩可细胞膜产生牵拉,超过承受范围可使细胞膜、细胞骨架、细胞收缩成分,邻近肌节损伤细胞通透性增强,引起细胞内稳态失调导致骨骼肌微损伤,能量代谢絮乱细胞内稳态失调。

1 . 1骨骼肌损伤的分类

按照损伤原因大体上可分为运动损伤和疾病导致慢性肌肉损伤。骨骼肌广泛存在于人体各个部位,骨骼、内脏、血管各个部位, 是机体最重要的运动器官,其主要为损伤如:撕裂伤、钝挫伤、扭伤、肌缺血及延迟性肌肉疼痛等。其中肌肉最常见损伤是钝挫伤和牵拉伤。运动骨骼肌微损伤主要是由于运动过程中肌肉受到牵拉及肌肉内生化环境改变而造成的骨骼肌超微结构损伤。疾病中肌 肉质量的损伤,如:发生于失重状态、肾脏疾病、癌症、病危状态、糖尿病和艾滋病中。肌萎缩不仅是骨骼肌对废用、衰老、区神经支配发生的反应,也会系统地发生不良的营养状态和多种疾病状态, 包括癌症、无控制的糖尿病、AIDS、尿毒症和脓毒症。骨骼肌减少症,目前损伤的微细结构可分为机械损伤学说、代谢学说、炎症反应等。

1 . 2骨骼肌损伤的原因

直接原因:运动是导致骨骼肌损伤最为直接的原因之一,骨骼肌细胞凋亡,使机体组织不同程度的疲劳和损伤。总结起来主要包括挫伤、慢性劳损、拉伤、撕裂伤、感染、自身免疫反应、非感染性炎症以及失神经营养、缺血缺氧等。细胞骨架蛋白水解是骨骼肌离心收缩的主要原因,肌细胞内的能量耗竭,代谢产物堆积,对肌纤维的功能及整个肌肉工作的能力均产生影响。蛋白的分解超过了蛋白的合成,发生肌肉萎缩。MAFbx和MuRF-1泛素连接酶的特异性表达,在细胞中降解快速肌萎缩主要是由于肌肉蛋白质降解加剧造成的。运动后,训练导致的肥大。血浆CK的变化以及同工酶的变化,引起骨骼肌损伤以及膜结构的变化。主要表现为收缩结构的改变,大致为Z线异常,大强度超负荷运动引起的机体内代谢絮乱,致使细胞内态失调引起骨骼肌微损伤。

2 骨骼肌损伤的治疗

肌肉损伤的程度和类型,决定了肌肉如何治疗。近几年的研究主要从生长因子、基因工程、组织工程其中包括从细胞增殖、迁移、和分化等复杂的过程的再调节。目前骨骼肌成肌细胞移植,可修复骨骼肌关节肌肉的损伤。在骨骼肌损伤与治疗中主要以药物治疗为主,结合运动运动治疗为辅助患者恢复。常见的措施主要有休息、冰敷、热疗、水浴、加压、制动、康复锻炼、手术等。骨骼肌成肌细胞移植,也是治疗损伤的手段之一深受人们的期待。针对肌肉减少症的治疗主要是应用激素代替法,营养支持疗法,维生素D补充疗法等干预措安全性有效性目前没有一致结论。但是双能X线MRI、CT机体物理功能测量等方法被应用于诊断或治疗少肌症,运动疗法是已经被证实了的既有效、大众化、简单方便、方便实施并且又能够很好的控制的治疗手段。生长因子的治疗,在骨骼肌损伤后的各个阶段都起着重要的作用,各种生长因子的协调可提高肌肉的愈合效果。在今后的研究中要着重探索活血生肌类药物细胞因子、物理因素、中医药等,开发更严谨有效的治疗手段以减少肌肉损伤在运动员、老年人、长期患病卧床患者的痛苦,更好的造福于人类社会,为人们的健康开辟新方法,为体育事业做贡献。

超微损伤 篇2

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级SD大鼠, 体重200 g～250 g, 共63只, 购自上海斯莱克实验动物有限责任公司, 许可证号:SCXK (沪) 2003～0003。

1.1.2 实验药物

益气活血通痹小复方:由生晒参 (上海万仕诚国药制品有限公司, 吉林, 批号:070115) 1.5 g, 三七 (上海万仕诚国药制品有限公司, 云南, 批号:070104) 1.5 g, 麝香 (中国阿坝洲医药公司总经销, 四川, 批号:20070628) 0.1 g组成, 由上海超微科技有限公司用超微6 L粉碎机粉碎成粗粉 (24目～65目/250μm～850μm) 、中粉 (65目～100目/150μm～250μm) , 超微细粉 (625目/20μm) 。粗粉组、中粉组、超微细粉组, 双蒸水溶解, 制备成每毫升含37.7 mg/mL的药液。煎剂组, 每毫升含生药量37.7 mg/mL。麝香保心丸 (上海和黄药业有限公司, 上海, 批号:A070402) 研磨成粉, 双蒸水溶解, 制备成每毫升含1.65 mg/mL麝香保心丸的药液。

1.1.3 主要仪器

小动物呼吸机ALC-V8 (上海奥尔柯特生物技术有限公司) ;Powerlab8/30生理记录仪 (AD Instrument, 澳大利亚) ;TP1020型组织自动脱水机, EG1160型全自动石蜡包埋机, RM2235切片机, Histobath型HI1210展摊片机, HistoplateHI1220型烘片机 (EICA, 德国) ;DHG-9140A电热恒温干燥箱 (上海跃进医疗器械厂) ;MV-CP410型摄像机 (Panasonic, 日本) ;CX31型显微镜, BH2型荧光倒置显微镜 (Olympus, 日本) 。

1.1.4 主要试剂

Krebs-Henseleit (K-H) 缓冲液:其组成成分为:NaCl 118.0 mmol/L, KCl 4.7 mmol/L, KH2PO41.2mmol/L, MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L, NaHCO325.0 mmol/L, Glucose 11.0 mmol/L, 以双蒸水溶解, 最后加入CaCl22.5mmol/L。溶液以95%O2+5%CO2的混合气体预充20 min以上, 灌流液pH 7.35～7.45。

1.2 分组与给药

共分7组, 每组大鼠9只。假手术组、模型组予生理盐水2 mL/d灌胃;粗粉组予粗粉136.8 mg/ (kg·d) ;中粉组予中粉136.8 mg/ (kg·d) ;超微细粉组予超微细粉136.8mg/ (kg·d) ;煎剂组予煎剂136.8mg/ (kg·d) ;麝香保心丸组予麝香保心丸12.3 mg/ (kg·d) 。每天灌胃, 连续14 d。

1.3 造模方法

最后1 d灌胃30 min后, 除假手术组外各组均行冠脉结扎。方法参考文献[3,4]稍作改动, 具体步骤:用3%戊巴比妥钠 (45 mg/kg) 行腹腔注射麻醉大鼠, 麻醉满意后固定于鼠板上, 用18号静脉留置针行气管插管, 连接动物呼吸机行人工呼吸 (呼吸比为1∶2, 潮气量20 mL/min～22 mL/min) 。四肢皮下连接心电图电极, 记录Ⅱ导联心电图。胸骨左侧剃毛, 于剑突上1.0 cm, 旁开约0.5 cm切开皮肤, 逐层钝性分离皮下组织、肌肉, 剪断第三根肋骨, 用开睑器撑开胸腔, 剥离心包膜暴露心脏, 在动脉圆锥和左心耳之间, 左心耳下方约1 mm～2mm, 用0/5号带线缝合针, 进针深度控制在0.1 cm左右, 宽度为0.1 cm～0.2 cm之间结扎冠状动脉左前降支, 结扎处放一长约0.5 cm、直径为1.5 mm软棉线, 用丝线活结结扎。结扎后迅速清除胸腔内多余血液, 观察心电图变化, 以心电图J点明显抬高 (>0.1 mV) 并稳定10 min以上, 心尖部心肌呈灰白色为模型制备成功标志。假手术组用同样大小的带线缝合针从左心耳下缘右侧进针, 从肺动脉圆锥左侧出针, 进针深度及宽度同上, 但缝合针不打结。其余操作同上。各组冠状动脉结扎60 min后, 腹主动脉取血, 迅速开胸取出心脏, 置入4℃含95%O2、5%CO2饱和K-H液中, 轻轻挤压心脏排出心脏内残血, 修剪出主动脉端口, 将离体心脏固定到Langendorff装置上, 恒温 (37℃) , 恒压 (80 cmH2O柱) K-H液灌流, 持续通入95%O2～5%CO2气体。用钩针挑松结扎丝线, 再灌注120 min。从左心耳插入带球囊的导管至左心室, 经压力换能器连接到Powerlab生理记录仪上。将灌流完毕的心脏取下, 用滤纸吸去心脏多余的灌流液, 剪去心房、结缔组织、大血管和心包组织, 沿室间隔分离左心室 (包括室间隔) 和右心室, 弃右心室, 左心室以冰生理盐水冲洗干净, 部分置中性甲醛溶液中固定, 剩余部分立即保存在-70℃冰箱中。

1.4 主要观测指标及测定方法

1.4.1 血流动力学

将带有球囊的导管从左心耳插入至左心室, 经压力换能器连接到Powerlab生理记录仪上连续记录左室收缩压 (LVSP) 、左室舒张末压 (LVEDP) 、左心室内压最大上升/下降速率 (±dp/dtmax) 等血流动力学指标。

1.4.2 冠脉流量 (coronary flow, CF)

收集平衡后10 min、30min、60 min、90 min、120 min五个时间点1 min内的冠脉漏出液, 使用量筒测量各组1 min内冠脉流量。

1.4.3 心肌HE染色

大鼠在心脏灌流120 min后, 摘取心脏, 取结扎点以下5 mm处心肌组织周径容积, 中性甲醛溶液固定心脏, 按常规石蜡包埋后, 每个组织块做切片 (厚度4μm) , 行苏木素-伊红 (HE) 染色。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。数据用均数±标准差 (x±s) 表示。符合正态分布的多组样本间比较采用oneway ANOVA检验;不符合正态分布的均数比较用非参数检验。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血流动力学变化

2.1.1 左室收缩压

在各时间段, 模型组与假手术组比较LVSP降低明显 (P<0.01) 。与模型组同时间点相比, 各治疗组均能改善LVSP的降低 (P<0.05或P<0.01) 。灌流30 min、90min、120min时, 中粉组、超微细粉组优于麝香保心丸组 (P<0.05) ;灌流10min时, 超微细粉组优于麝香保心丸组 (P<0.05) 。在各时间点, 超微细粉组优于粗粉组 (P<0.05) , 在灌流90min时, 中粉组优于粗粉组 (P<0.05) 。与煎剂组相比较, 灌流30 min时, 中粉组优于煎剂组 (P<0.05) ;灌流10 min、30 min、120 min时, 超微细粉组优于煎剂组 (P<0.05) 。中粉组和超微细粉组比较无统计学意义 (P>0.05) 。详见表1。

mmHg

2.1.2 左室舒张末压

与假手术组比较, 在各时间点, 模型组LVEDP升高明显 (P<0.01) 。与模型组相比, 在各时间点, 中粉组、超微细粉组、麝香保心丸组能改善LVEDP的抬高 (P<0.05或P<0.01) ;灌流90 min、120 min时, 粗粉组优于模型组 (P<0.05或P<0.01) 。与粗粉组相比较, 在灌流10 min时, 中粉组、超微细粉组优于粗粉组 (P<0.01) ;在灌流30 min时, 超微细粉组优于粗粉组 (P<0.05) 。与煎剂组比较, 在各时间点, 中粉组、超微细粉组优于煎剂组 (P<0.05或P<0.01) ;在灌流120 min时, 粗粉组、麝香保心丸组优于煎剂组 (P<0.01) 。中粉组和超微细粉组比较无统计学意义 (P>0.05) 。详见表2。

mmHg

2.1.3 左心室内压最大上升速率

在各时间段, 与假手术组比较, 模型组+dp/dtmax下降明显 (P<0.01) 。与模型组比较, 麝香保心丸组、益气活血通痹小复方各组在各时间点均能显著改善+dp/dtmax的变化 (P<0.01) , 但两组间比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。在灌注30 min时, 超微细粉组优于煎剂组 (P<0.01) 。详见表3。

2.1.4 左心室内压最大下降速率

在各时间点, 与假手术组比较, 模型组-dp/dtmax下降明显 (P<0.01) 。与模型组比较, 在灌流30 min时, 中粉组、超微细粉组、煎剂组、麝香保心丸组对此有一定的改善作用 (P<0.05或P<0.01) ;在灌流60 min时, 中粉组与模型组比较有统计学意义 (P<0.01) ;麝香保心丸组与各益气活血通痹小复方组比较无统计学意义 (P>0.05) ;益气活血通痹小复方各组间比较也无统计学意义 (P>0.05) 。详见表4。

2.2 各组CF的变化

在各时间点, 模型组冠脉流量减少明显, 与假手术组比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。在各时间点, 超微细粉组与模型组比较, 能显著改善冠脉流量的减少 (P<0.05或P<0.01) 。中粉组在除灌流10 min外其他各时间与模型组比较有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。麝香保心丸组与益气活血通痹小复方各组比较无统计学意义 (P>0.05) 。益气活血通痹小复方各组间比较也无统计学意义 (P>0.05) 。详见表5。

mL

2.3 心肌HE染色

光镜下观察可见:假手术组心肌组织未见充血、出血或炎细胞反应, 心肌细胞排列整齐, 核大, 染色较淡。模型组各例均有不同程度因缺血而引起的心肌损害, 主要表现为心肌纤维变长, 排列紊乱而疏松, 呈波浪形, 肌纤维间距增宽, 间质轻度水肿, 充血或出血, 少许炎细胞反应, 并出现局灶性坏死。治疗组心肌细胞的损伤程度较轻, 主要表现为肌纤维排列呈波浪形, 细胞肿胀, 偶见少量淤血, 但未见肌纤维变形断裂。其中, 超微细粉组损伤最轻, 仅见小部分细胞水肿。

3 讨论

近年随着介入性心脏学、冠脉内球囊扩张血管成形术、冠脉内溶栓、激光汽化等冠脉血管再通和再造术的完善, 使冠脉血栓和严重狭窄的心肌缺血重新恢复了血液供应, 心肌的再灌注损伤也越来越受到人们的重视, 揭示心肌缺血与再灌注损伤的发生机制, 己经成为现代心血管疾病防治中的关键课题之一。

心肌缺血时由于代谢障碍致ATP减少, 细胞内K+丢失, 无机磷酸盐增多, 细胞内酸中毒, 引起心肌的兴奋-收缩耦联障碍, 心肌收缩力减弱[5], 所以心肌缺血往往伴随血流动力学及心脏功能的改变。影响心功能的主要因素包括心肌收缩功能、心率和前后负荷。其中, 心肌收缩功能是决定心功能的内在因素。在血流动力学各项指标中, +dp/dtmax间接地反映了心肌纤维收缩成分的缩短速度, 对变力性干预较敏感, 具有较大的实用价值, 是反映心肌收缩功能的较好的指标。LVSP升高在一定程度上反映了心肌收缩力的增加[6]。-dp/dtmax反映了心室舒张时心肌纤维伸长的最大速度, 是衡量左心室舒张期顺应性及心肌僵硬度的重要指标之一, 可间接反映左心的舒张功能。LVEDP升高除表示心脏前负荷增加外, 也间接反映心肌的舒张顺应性。总的来说, LVSP、+dp/dtmax反映左室收缩功能, LVEDP、-dp/dtmax反映左室舒张功能[7]。

心肌缺血时, 钙超载、能量代谢障碍、自由基的大量产生及乳酸和H+等酸性产物的堆集均可引起细胞的结构和功能受损, 使缺血细胞发生病理形态学改变[8]。

上海中医药大学附属龙华医院周端教授在长期的临床实践中认识到, 疾病发生的根本原因在于阴阳失调, 疗疾病的目的就是“谨察阴阳所在而调之, 以平为期”。认为冠心病属中医胸痹范畴, 证属本虚标实, 气虚血瘀是冠心病发病的病理基础, 故治疗以益气活血通痹为主要治法, 生晒参、三七、麝香此三药是导师根据主要治则及多年临床经验优选出来的三味药, 生晒参为君, 大补元气, 广益五脏, 针对气虚的主要病机;三七为臣, 活血通络, 止血消瘀, 消肿止痛, 两药相合, 气行则血行, 血行则气实;麝香为佐, 辛香走窜, 开窍通络, 宣痹止痛, 引药直达病所。三者配伍, 共奏益气活血, 通痹止痛之功。三药药少精当, 配伍合理, 切中病机。

前期研究[1,2]提示:三七和人参及其复方制剂微粉中的三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的体外溶出速度和溶出量不比常规机械粉碎的粉末有优势。在不同目数的粉末中, 中粉 (65目～100目) 指标成分的溶出速度和累计溶出量较其他目数更好。因此本实验保留了中粉组与超微细粉组作对照。本研究发现:通过形态学观察表明, 缺血60 min, 再灌120 min存在明显的心肌缺血/再灌注损伤, 益气活血通痹小复方可减轻心肌缺血的病理性损伤程度。益气活血通痹小复方能够改善缺血心肌收缩功能 (LVSP、+dp/dtmax) , 以中粉、超微细粉效果最佳。

摘要：目的 观察具有益气活血通痹作用的中药超微细粉小复方对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。方法 63只大鼠随机分假手术组、模型组、中粉组、超微细粉组、煎剂组、麝香保心丸组7组, 灌胃14 d, 冠脉结扎60 min联合Langendroff灌流120 min复制心肌缺血/再灌注模型, 观察左室收缩压 (LVSP) 、左室舒张末压 (LVEDP) 、左心室内压最大上升/下降速率 (±dp/dtmax) 、冠脉流量 (CF) ;采用HE染色观察心肌病理变化。结果 益气活血通痹小复方各组均能减轻心肌缺血的病理性损伤程度, 改善左心室收缩功能 (LVSP、+dp/dtmax) 的降低 (P<0.05或P<0.01) , 其中以中粉组、超微细粉组效果最佳。在改善舒张功能 (LVEDP、-dp/dtmax) 、冠脉流量方面效果不明显, 仅在个别时间点中粉组、超微细粉组与模型组比较有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。结论 益气活血通痹小复方可减轻心肌缺血的病理性损伤程度, 能够改善缺血心肌收缩功能, 以中粉、超微细粉效果最佳。

关键词：超微细粉小复方,益气活血通痹,冠脉结扎,Langendroff灌流

参考文献

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[2] 周昕, 谢瑞芳, 周端, 等.三七微粉与普通粉中有效成分的含量和溶出度比较[J].上海中医药杂志, 2009, 43 (10) :79-81.

[3] 周文武, 林玲, 陈军, 等.冠脉结扎法制作大鼠心肌缺血模型[J].中国实验动物学报, 2004, 12 (4) :226-230.

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[6] 邵耕.现代冠心病[M].北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社, 1998:53-54.

[7] 云霞.心肌力学和心肌收缩性能的评定[J].生理科学进展, 1980, 11 (3) :212.

超微损伤 篇3

关键词：杞菊地黄丸,血管内皮细胞损伤,AngⅡ,高血压病

原发性高血压是以体循环动脉压增高为主要表现的一类疾病,其发病机制目前尚未完全明确。近年来研究表明,血管内皮细胞受损、内皮功能失调在高血压病的发生发展中起重要作用,高血压病患者的内皮功能均存在不同程度的异常[1]。多种因素可导致内皮细胞损伤,其中肾素-血管紧张素系统(RAAS),尤其是局部RAAS所产生的AngⅡ起着重要的病理生理作用[2]。

中医学认为高血压病的基本病机为本虚标实,其中肾虚是根本。采用益肾法治疗高血压病,可以明显改善患者的临床症状,取得较好的疗效。有实验和临床研究证实[3,4,5],益肾法能够保护血管内皮细胞,防治和减轻高血压病血管内皮细胞损伤的效果显著。课题组前期在益肾法对自发性高血压大鼠(SHR)肾保护作用的研究中发现:益肾中药复方可通过改善SHR的肾血流量,改善肾血管重塑,并降低血压,尤其以滋补肾阴的杞菊地黄丸的降压作用更为明显[6]。为了进一步明确杞菊地黄丸的降压机制,本研究拟通过采用AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞损伤,建立细胞损伤模型,应用电子显微镜观察杞菊地黄丸对内皮细胞超微结构的影响,从细胞、分子水平探讨杞菊地黄丸对血管内皮细胞的保护作用,为临床提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

24只清洁级Wistar大鼠,体重(250±20)g,雌性(购自中国医学科学院实验动物研究所,许可证编号:SCXK(京)2005-0013),饲养在清洁级动物房,正常光照条件,食、水可自由摄取,室温控制在(18～22)℃之间。

1.2 实验细胞

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购自南京凯基生物科技发展有限公司),由本实验室复苏、传代保存。

1.3 药品与试剂

完全RPMI-1640培养液(含10%小牛血清,抗青链霉素)、不完全RPMI-1640培养液、青链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化液(南京凯基生物科技发展有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);杞菊地黄丸(浓缩丸)(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂,生产批号:9071151);兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.4 实验仪器

恒温CO2培养箱(英国RS Biotech公司);相差倒置显微镜(北京欣惠泽奥科技有限公司);超净工作台(天津泰斯特仪器有限公司);离心机(上海安亭科学仪器厂);电子显微镜(北京恩环泰科技发展有限公司)。

2 方法

2.1 含药血清制备

2.1.1 实验分组

将大鼠24只随机分成两组:空白组、杞菊地黄丸组。

2.1.2 给药方法及剂量

将配制好的杞菊地黄丸药液(0.15g/ml)按每只每日2ml/100g体重(相当于60kg体重成年人每日临床剂量的20倍)分上、下午2次给大鼠灌胃,空白组给予同体积的生理盐水,连续给药4天。

2.1.3 含药血清制备与保存

末次给药2小时后无菌条件下取血,血液静置4h,待血清析出后,3 000rpm/min离心20min分离血清。将同种条件的血清混匀,56℃30min灭活,0.22μm微孔滤膜除菌后分装,-20℃冻存。

2.2 细胞培养与鉴定

2.2.1 细胞培养

将人脐静脉内皮细胞接种至25cm2培养瓶中,加入含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培养液(6～8)ml,置CO2培养箱中于37℃、5%CO2、完全饱和湿度条件下培养,每48h换液1次,至细胞长满瓶底后即可传代。当细胞传至第3代时进行实验。

2.2.2 细胞鉴定

采用兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒。

2.3 实验分组与处理因素

2.3.1 分组将培养好的细胞分成4组:

正常对照组、AngⅡ损伤组、AngⅡ损伤+空白血清组、AngⅡ损伤+杞菊地黄丸血清组。

2.3.2 加药正常对照组:

加不完全RPMI-1640培养液(含20%小牛血清及青链霉素);AngⅡ损伤组:加不完全RPMI-1640培养液(含20%小牛血清及青链霉素)、AngⅡ(终浓度为10-6mol/L);各血清组:预先加不完全RPMI-1640培养液(不含小牛血清,含青链霉素)、AngⅡ(终浓度为10-6mol/L),30min后再加入各含药血清(终浓度为20%)。

2.4 检测指标

电子显微镜观察细胞超微结构将细胞以(1×105)/ml浓度接种于25cm2培养瓶中。待细胞长至60-70%融合状态时吸弃培养液并加药。加药24h后,吸弃培养液,并用0.1mol/L PBS(pH7.2～7.4)洗细胞2次。培养瓶中留少量PBS液,用细胞刮刮取细胞,收集至1.5ml离心管中。800rpm/min离心5min,去上清,加入用0.1mol/L PBS(pH7.2～7.4)稀释的2.5%戊二醛固定液100μl,4℃固定。按常规方法,制作超薄切片,电子显微镜下观察、摄片。

3 结果

透射电镜观察结果正常对照组细胞胞浆内可见内质网呈扁平囊状、线粒体呈棒状,胞核明显(见图1)。AngⅡ损伤组细胞胞浆内可见内质网扩张,线粒体肿胀呈圆形或椭圆形,线粒体嵴模糊甚至消失,细胞明显受损(见图2)。AngⅡ损伤+空白血清组细胞胞浆内可见内质网扩张,线粒体肿胀,损伤特征同AngⅡ损伤组(见图3)。AngⅡ损伤+杞菊地黄丸血清组细胞胞浆内可见内质网呈扁平囊状,线粒体呈棒状,结构基本正常(见图4)。

4 讨论

AngⅡ是引起高血压、动脉硬化等心血管疾病内皮细胞损伤的重要因素之一,其损伤机制目前公认的有以下几方面:AngⅡ可促进内皮细胞表达单核细胞化学吸引蛋白1型(MCP-1)、Ⅰ型细胞间粘附分子(ICAM-1)、白细胞介素6(IL-6)等因子,加重内皮细胞的炎症反应[7];激活内皮细胞膜表面的NADH/NADPH氧化酶,产生大量活性氧(ROS),导致内皮细胞发生氧化应激[8],改变内皮细胞的氧化/还原状态[9];通过其受体激活蛋白激酶C等途径,诱导内皮细胞凋亡[10]等。

益肾法是临床治疗高血压、冠心病等心血管疾病的常用治法,大量实验和临床研究均证实[3,4,5]益肾法能够保护血管内皮细胞,防治和减轻内皮细胞损伤。课题组前期研究发现益肾中药杞菊地黄丸降低SHR收缩压的作用明显,为进一步从细胞水平评价杞菊地黄丸对血管内皮细胞的保护作用,初步探讨其可能作用机制,本研究以AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞损伤为实验模型,采用杞菊地黄丸干预内皮细胞,对内皮细胞超微结构进行了观察。

电子显微镜观察结果显示:AngⅡ作用于血管内皮细胞后,与正常对照组细胞相比,细胞超微结构发生明显改变,具体表现为线粒体肿胀、内质网扩张。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所,是对各种损伤最为敏感的细胞器之一,在细胞损伤时最常见的改变为线粒体肿大。其肿胀可由多种损伤因子引起,其中最常见的为缺氧。内质网是参与细胞钙稳态、蛋白质合成和凋亡调节的重要细胞器,在由各种原因引起的细胞变性和坏死过程中,粗面内质网的池一般出现扩张。本实验中线粒体和内质网出现肿胀、扩张,提示内皮细胞受到损伤。杞菊地黄丸血清干预后,线粒体肿胀、内质网扩张程度明显减轻,提示杞菊地黄丸对受损细胞有一定的保护作用。我们推测其机制可能是益肾中药杞菊地黄丸通过发挥一定的抗氧化作用,减轻了由AngⅡ引起的内皮细胞氧化损伤,从而对细胞超微结构发挥了一定的保护作用。

总之,本实验的初步研究结果表明:滋补肾阴的杞菊地黄丸对内皮细胞的线粒体、内质网等超微结构具有一定的保护作用,至于其具体作用机制,今后还需要进一步深入研究。

参考文献

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[3] 郝群,梁元姣,吴元褚,等.补肾中药血清对血管内皮细胞损伤的保护作用[J].中国老年学杂志,2007;27(11) :1035～1037

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超微损伤 篇4

1 材料和方法

1.1 材料

选用普通级SD雄性成年大鼠 (重庆市中药研究院实验动物中心提供, 生产许可证号:SCXK (渝) 2007-0006) 50只, 体重250～280 g。

1.2 仪器

BSM-7105K 床边监护仪 (上海光电医用电子仪器有限公司) ;动物人工呼吸机 (浙江大学医学仪器厂DH150) ;UV751GD紫外/ 可见分光光度计 (上海分析仪器厂) ;J E M-1200EX型透射电子显微镜 (日本电子公司) ;LKB 超薄切片机 (LEICA EMC6型LEICA公司) ;流式细胞仪 (美国贝克曼库尔特有限公司) 。

1.3 试剂

葡萄糖酸锌: 天津市光复精细化工研究所 (批号: 2010-05-10) ;肌酸激酶试剂盒、乳酸脱氢酶试剂盒: 南京建成生物工程有限公司。Annexin-V- FITC∕ PI细胞凋亡检测试剂盒 :北京宝塞生物技术有限公司。

1.4 方法

1.4.1 心肌缺血再灌注损伤模型制备

大鼠心肌缺血再灌注损伤实验模型[1]:取雄性SD大鼠, 以乌拉坦 (1 g/kg) 腹腔注射。描记肢体Ⅱ导联心电图。气管插管, 自左侧第1～3肋开胸, 采用人工呼吸机正压呼吸。暴露大鼠心脏后, 拉紧结扎线, 使硅胶管压迫冠状动脉左前降支而致闭塞, 切断结扎线再通。①假手术组, 只穿线不结扎;②葡萄糖酸锌167 (1/15LD50) , 250 (1/10LD50) , 357 (1/7LD50) mg/kg剂量组, 分别以相应剂量葡萄糖酸锌 (溶于蒸馏水中, 2 ml) 灌胃, 2 ml/次, 上下午各1次, 依据葡萄糖酸锌的半衰期:t1/2= (2.46±0.30) h[2], 故两次灌胃给药间隔时间为2.5 h。于末次灌胃1 h后行冠状动脉左前降支结扎30 min, 再灌注60 min;③缺血再灌注模型组, 给予葡萄糖酸锌各剂量组等容量的0.9%氯化钠注射液灌胃, 其他处理同上。

1.4.2 CK和LDH活性测定

于实验结束后立即于左颈总动脉取血5.0 ml, 待测血清肌酸激酶和乳酸脱氢酶活性。

1.4.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

于实验结束后立即取心尖及左室心肌组织5 mm3, 4℃冰0.9%氯化钠注射液洗去血污, 用Annexin-V-FITC/PI流式细胞仪检测细胞凋亡。将心肌组织制成细胞悬液, 细胞浓度为1×109/L。取1 ml细胞, 1000 r/min, 4℃离心10 min, 弃上清。加入1 ml冷的磷酸盐缓冲液, 轻轻震荡使细胞悬浮。重复上述步骤2次。将细胞重悬浮于200 μl BindingBuffer。加入10 μl AV和5μl PI, 轻轻混匀, 室温避光反应15 min。加入300 μl Binding Buffer, 在1 h内上机检测。

1.4.4 电镜观察心肌细胞超微结构

于实验结束后立即取心尖及左室心肌组织1 mm3, 4℃冰0.9%氯化钠注射液洗去血污, 常规电镜样品包埋, 半薄切片, 光镜选区定位, 超薄切片, 铀、铅双染, 透射电镜下观察心肌细胞超微结构变化。

1.5 统计学分析

采用SPSS 12.0软件进行统计学处理。所有数据以$(\overline{x}\pm s)$表示, 组间比较采用单因素方差分析及t检验进行统计学处理。P<0.05为差异有显著性意义, P<0.01认为差异有非常显著性意义。

2 结果

2.1

各组大鼠心肌缺血再灌注心律失常发生率及ST段指标的变化, 见表1。

2.2

各组大鼠血清中CK、LDH活性及心肌细胞凋亡指数的变化, 见表2。

注:与假手术组相比aP< 0. 01; 与缺血再灌注模型组相比bP< 0. 01

注:与假手术组相比aP< 0. 01; 与缺血再灌注模型组相比bP<0. 01

2.3

各组大鼠心肌细胞超微结构的变化, 见图1。

2.3.1 假手术组

心肌细胞肌丝排列整齐, 粗细肌丝清晰可见, 肌节明暗带清楚, 线粒体结构正常, 嵴排列规则, 核膜清晰完整。

2.3.2 缺血再灌注模型组

心肌细胞肌丝排列疏松、紊乱, 局部肌丝断裂、溶解, 肌丝明暗带模糊不清, 线粒体嵴部分断裂, 有空泡, 核膜不清晰。

2.3.3 葡萄糖酸锌低剂量组

较模型组心肌纤维超微结构损伤程度有所减轻, 心肌细胞肌丝排列较规则, 肌丝明暗带欠清楚, 局部肌丝断裂、溶解, 线粒体肿胀减轻, 嵴部分断裂, 有空泡, 核膜不清晰。

2.3.4 葡萄糖酸锌中剂量组

心肌细胞肌丝排列较规则, 肌丝明暗带较清楚, 线粒体肿胀, 嵴部分断裂, 有空泡, 核膜较清晰。

2.3.5 葡萄糖酸锌高剂量组

心肌细胞肌丝排列规则, 肌丝明暗带清楚, 线粒体肿胀, 嵴部分断裂, 有空泡, 核膜较清晰。

3 讨论

细胞凋亡是缺血再灌注 (I/R) 损伤早期细胞死亡的主要方式。其发生机制包括氧自由基学说、钙超载学说、凋亡学说等。研究者在心、脑、肝、肺、肾、肠等多种器官缺血再灌注损伤模型上均观察到细胞凋亡[3,4]。Rentsch[5]等研究证实随着冷灌注保存及再灌注时间的延长大鼠移植肝细胞凋亡数显著增加, 而且bax表达增强。张浩[6]等研究表明大鼠冷灌注保存及再灌注后肝脏均有肝细胞凋亡发生, 且呈阶段性。在冷灌注保存肝组织中可检测到Bax及Fas, 未检测到Bcl-2, 肝移植再灌注后肝组织中可检测到Bax、Fas及Bcl-2。许多研究表明, 锌可调控细胞凋亡。多数学者认为锌可抑制细胞凋亡, 其机制可能与其阻断Ca2+凋亡信号的传导系统、影响蛋白激酶C信号系统以及抑制核酸内切酶等有关[7]。有研究表明补充携硒、锌、维生素E的大豆磷脂脂质体可通过保护生物膜尤其是线粒体膜而减少心肌细胞的凋亡和坏死, 发挥保护缺血心肌的效应[8]。

本实验研究结果表明, 与模型组相比, 补锌组心律失常发生率、CK和LDH活性、细胞凋亡指数均降低, 电镜观察显示补锌组心肌细胞超微结构损伤明显减轻, 心肌细胞肌丝排列规则, 肌丝明暗带清楚, 线粒体肿胀, 嵴部分断裂, 有空泡, 核膜较清晰。本研究证实葡萄糖酸锌具有保护缺血再灌注损伤心肌的作用, 其机制可能通过抑制心肌细胞凋亡和减轻心肌细胞超微结构损伤实现的。传统的补锌剂硫酸锌不易吸收, 对消化系统有副作用, 而葡萄糖酸锌则具有显效快, 生物利用度高, 副作用小, 使用方便等优点。本实验结果可为临床应用锌制剂治疗心血管疾病提供一定的理论基础。

参考文献

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超微损伤 篇5

关键词：葡萄糖胺,罗格列酮钠,细胞线粒体,超微结构

胰岛素抵抗 (IR) 和β细胞功能紊乱是2型糖尿病最主要的两个病理生理缺陷。2型糖尿病是以血糖升高为标志的慢性病, 高血糖造成的病理生理改变称为糖毒性。高糖状态下, 细胞代谢和功能发生紊乱, 其作用机制目前还未完全阐明[1,2]。长期高糖情况下, 葡萄糖进入己糖胺生物合成旁路 (HBP) 途径代谢的量大大增加, 导致细胞内此代谢途径产物GLcN的含量升高。外源性的GLcN能依靠细胞膜上的葡萄糖转运体进入细胞内, GLcN进入细胞后, 能绕过谷氨酰胺-6-磷酸果糖氨基转移酶 (GFAT) 的作用步骤, 被己糖激酶直接磷酸化为6-磷酸葡萄糖胺而进入HBP, 因此, GLcN能被用作HBP的激活剂。根据GLcN进入脂肪细胞的速度仅为葡萄糖的1/4, 而要产生相同的葡萄糖利用 (MIR) 的抑制效应, 所需GLcN的浓度仅是葡萄糖的1/10, 反映GLcN致胰岛素抵抗的作用强度约为葡萄糖的40倍[3]。因此, GLcN被认为是糖毒性的重要中介体, 也是研究糖毒性的重要物质。1991年, Marshall等[3]首先提出细胞内的GLcN代谢介导了高浓度葡萄糖导致的细胞胰岛素抵抗状态。以后的几年中, 一系列的实验为这一理论提供了依据, 并且已经证实己糖胺旁路流量的增加在糖诱导的胰岛素抵抗中起着重要作用。最近, 其它研究也显示在动物模型和人体均发现GLcN对胰岛素分泌有抑制作用[4], 但对胰岛β细胞超微结构的影响尚未见报道。噻唑烷二酮类 (TZDs) 药物为胰岛素增敏剂, 由于能降低β细胞的负荷而对胰岛β细胞有“保护”作用, 从而使β细胞储备功能增强, 表现为β细胞分泌颗粒的增多及葡萄糖刺激的胰岛素分泌的增加[5,6]。大量离体和在体研究表明TZDS药物有改善外周胰岛素的敏感性且对胰岛β细胞具有一定直接保护作用[7,8,9]。罗格列酮钠属于TZDs药物, 目前在临床上广为使用。本研究观察葡萄糖胺 (GLcN) 对HIT-T15细胞 (以SV40病毒转化的叙利亚仓鼠胰岛β细胞株) 超微结构的影响以及罗格列酮钠对β细胞的直接保护作用。

1 材料和方法

1.1 HIT-T15细胞复苏、培养、传代与实验分组

经0.125%胰酶消化, 分散成单个细胞, 以4×105个/mL接种到含15%小牛血清的DMEM培养基, 置于37℃, 5%CO2培养箱中孵育2～3d, 细胞融合生长后即可用于实验。

实验分为4组, 每组均设3个复瓶。

对照组:葡萄糖浓度为5.5mM;GLcN8mM+GS11mM组 (GLcN浓度8mM、葡萄糖浓度为11mM) ;GLcN8mM+GS11mM+RSGN10-6M组 (GLcN浓度8mM, 葡萄糖浓度11mM, RSGN浓度10-6M) ;GLcN8mM+GS11mM+RSGN10-8M (GLcN浓度8mM、葡萄糖浓度11mM, RSGN浓度10-8M) 。

以上各组均在37℃下培养48h。

1.2 主要试剂

HIT-T15细胞 (购自American type culture collection) 新生小牛血清 (成都哈里生物工程有限公司) 葡萄糖胺 (Sigma公司) 罗格列酮钠 (重庆太极集团惠赠) 。

1.3 主要仪器设备与器材

CO2孵育箱 (Sanyo MCO-15AC 日本) 倒置相差显微镜及照相系统 (OLYMPUS IX70日本) 、H-600IV型透射电镜 (日立, 日本) 。

1.4 HIT-T15细胞复苏、培养、传代与鉴定

1.4.1 HIT-T15细胞复苏

将保存于液氮冷冻的HIT-T15细胞取出, 迅速置于37℃水浴中快速震荡至溶解, 后置于离心管中, 以1500转/分的速度离心5min。在无菌超净台上, 弃去上清液, 加入培养液, 轻轻吹吸均匀, 将细胞悬液移入培养瓶, 加培养液在37℃培养箱中培养。

1.4.2 HIT-T15细胞培养、传代

细胞培养48～72h弃去培养基, 以D-Hank’s液洗两次后加入新的培养液, 显微镜下观察细胞生长情况, 可见细胞呈圆形, 团状生长。细胞生长至融合后, 吸出培养液后以D-Hank’s液清洗2次, 再加入消化液, 轻摇培养瓶使消化液遍布所有细胞表面, 置于37℃, 5%CO2培养箱中孵育5min, 在倒置显微镜下密切观察, 见贴壁的细胞呈游离状, 立即加入加血清的培养基4mL终止消化, 吹打混匀后分装至2个培养瓶中, 放进CO2培养箱前轻轻摇动几次, 48～72h换液1次, 细胞2～3d可融合生长。以4×105个/mL接种到培养瓶中2～3d后即可用于实验。

1.4.3 HIT-T15细胞鉴定

形态学鉴定与细胞分瓶计数:用相差倒置显微镜进行HIT-T15细胞的光学鉴定。培养48～72h如有80%细胞融合, 即可分瓶计数。

1.5 透射电镜观察

按上述实验分组, 培养48h后用PBS液洗1次, 用0.25%胰酶消化收集细胞。加入0.3%戊二醛 (原液1∶9稀释) 固定液, 混匀固定15min, 混匀过程中始终保持4℃。小心吸入EP管中, 3000r/min离心15min, 弃去上清液。用吸管沿管壁缓慢加入3%戊二醛固定液。1%四氧化锇再固定, 丙酮逐级脱水, Epon812包埋, 半薄切片光学定位, 超薄切片, 醋酸铀及枸橼酸铅双重染色, 透射电镜观察并摄片。

2 结果

2.1 HIT-T15细胞光镜下形态

该细胞为贴壁生长细胞, 存活的细胞贴附在培养瓶细胞生长面生长, 起初为呈圆形单个散在细胞, 细胞分裂增殖3～4d后可融合成团状、岛状生长。细胞核清晰, 细胞排列紧密, 有少数细胞悬浮于培养基中, 不贴壁, 为死亡细胞。见图1。

注: 存活的细胞贴附在培养瓶细胞生长面生长, 起初为呈圆形单个散在细胞, 细胞分裂增殖3～4d后可融合成团状、岛状生长。细胞排列紧密, 细胞核清晰, 有少数细胞悬浮于培养基中, 不贴壁, 为死亡细胞。

The surviving β-cells attach on the culture flask-wall, may conjugat together 3 or 4 days of division. The normal cells have clear nucleus, while the floating objects untached on the wall are dead cells.

2.2 48h后HIT-T15细胞透射电镜观察

对照组:电镜下正常β细胞结构完整, 细胞界限清晰。细胞核呈卵圆形, 核仁清晰, 染色质均匀。胞浆内有大量密度不一的颗粒及丰富的结构正常的粗面内质网和散在的线粒体, 未见凋亡和坏死的β细胞。见图2。

注:β细胞结构完整, 细胞界限清晰。细胞核呈卵圆形, 核仁清晰, 染色质均匀胞浆内有大量密度不一的颗粒及丰富的结构正常的粗面内质网和散在的线粒体, 未见凋亡和坏死的β细胞。

Normal β-cells have clear nuclei and the organelles with integrated structure. No appoptosis or necrosis were observed.

GLcN组:电镜下观察到GLcN组某些β细胞呈现凋亡早期的改变。可见细胞体积变小, 染色质边集, 核周隙扩张。细胞核固缩变小, 核仁消失, 多数线粒体结构模糊不清甚至肿胀, 内质网扩张, 可见坏死细胞。见图3、图4、图5。

注:β细胞体积变小, 染色质边集, 核周隙扩张。细胞核固缩变小, 核仁消失, 可见凋亡和坏死的β细胞。

The shriky Β-cells without nucleoli were seen with karyopyknosis. The apoptosis was observed.

注:可见坏死β细胞。

The necrotic B-cells were seen.

注:线粒体肿胀、空泡变性。

The swellen mitochondria and degeneratic vacuolar were observed.

RSGN组:RSGN10-8M组β细胞超微结构接近正常。细胞界限较清晰。细胞核呈卵圆形, 核仁清晰, 染色质较均匀。细胞器无明显变性。线粒体无明显肿胀变性, 嵴较清晰, 未见空泡变性, 内质网无明显扩张。未见凋亡及坏死细胞 (见图6) 。但RSGN10-6M组较GLcN组变化不明显, 即在正常线粒体中仍可见有结构模糊甚至肿胀的线粒体 (见图7) 。表明预先加入适当浓度的RSGN, 可以有效地防止GLcN诱导的β细胞的病理损害, 浓度过高反而无明显保护β细胞的作用。

注:β细胞结构接近正常。

Almost nomal β-cells without appoptosis were observed.

注:基本正常的线粒体中仍可见有结构模糊的甚至肿胀的线粒体

The unclear structure or even swollen mitochondrias were observed in the almost normal mitochondrias.

3 讨论

许多研究均已证明在糖耐量低减和2型糖尿病阶段可见β细胞数量减少, 细胞核和细胞器的改变, 以致胰岛出现胰淀素沉积、玻璃样变等不可逆改变[10,11]。我们的实验结果显示GLcN和高浓度葡萄糖一样均能影响胰岛β细胞超微结构, 导致胰岛β细胞出现凋亡, 坏死细胞增多, 线粒体结构模糊不清甚至肿胀, 内质网扩张。说明糖毒性可导致β细胞的线粒体的损伤。

我们的实验结果显示RSGN10-8M组β细胞超微结构接近正常, 未见凋亡及坏死细胞。但RSGN10-6M组较GLcN组变化不明显, 表明预先加入适量RSGN可以有效地防止GLcN诱导的β细胞的病理损害, 同时说明RSGN对β细胞有直接保护作用。

以前的研究也证实, TZDs对胰岛β细胞的直接保护作用可能涉及以下多种因素:①激活胰岛β细胞的PPARγ受体, 人类β细胞上存在PPARγ受体[12,13], PPARγ受体激活后, 从转录水平上增强胰岛素的作用[14];②下调炎症反应延缓或阻止免疫细胞对胰岛β细胞的破坏:罗格列酮可抑制核因子-κB (NF-κB) , 活化蛋白-1等多种炎症通路使T细胞产生白介素 (IL-2) 减少, 诱导T细胞凋亡, 从而下调炎症和免疫反应[15];③减少β细胞的氧化应激:氧化应激能增加β细胞的凋亡、抑制胰岛素的生物合成[16,17]。GLcN产生增加和线粒体氧化应激导致的活性氧族和β细胞死亡有关[18], 减少氧化应激可以保护胰岛β细胞的数量[10]。