指导细胞的超微结构及其基本病理过程

指导细胞的超微结构及其基本病理过程（共2篇）

指导细胞的超微结构及其基本病理过程 篇1

第二节 细胞的超微结构及其基本病理过程

virchow在19世纪中期所奠定的细胞病理学说，通过近代对细胞及其病变的超微结构以及结构与功能相结合的研究，已经获得了新的更广更深的基础，扩大和加深了对疾病的理解。

细胞是一个由细胞膜封闭的基本生命单元，内含一系列明确无误的互相分隔的反应腔室，这就是由细胞膜为界限的各种细胞器，是细胞代谢和细胞活力的形态支柱。细胞内的这种严格分隔保证各种细胞器分别进行着无数的生化反应，行使各自的独特功能，维持细胞和机体的生命活动。细胞器的改变是各种病变的基本组成部分。

一、细胞核

细胞核(nucleus)是遗传信息的载体，细胞的调节中心，其形态随细胞所处的周期阶段而异，通常以间期核为准。

细胞核外被核膜。核膜由内外二层各厚约3nm的单位膜构成，中间为2～5nm宽的间隙(核周隙);核膜上有直径约50nm的微孔，作为核浆与胞浆间交通的孔道，其数目因细胞类型和功能而异，多者可占全核表面积的25%;在肝细胞核据估算约有个核孔。

核浆主由染色质构成，其主要成分为脱氧核糖核酸(dna)，并以与蛋白质相结合的形式存在，后者由组蛋白与非组蛋白组成。染色质的nda现在已可用多种方法加以鉴定和定量测定。

核内较粗大浓缩的、碱性染料深染的团块状染色质为异染色质，呈细颗粒状弥散分布的、用普通染色法几乎不着色的染色质则为常染色质。一部分异染色质也可以上述两种状态存在。从生化角度看，异染色质不具遗传活性，相反，常染色质则大部分具遗传活性。

间期核的染色质模式还反映细胞的功能状态。一般而言，大而淡染的核(浓缩染色质少)提示细胞活性(如蛋白质和酶的合成)较高;小而深染的核(浓缩染色质较多)则提示细胞活性有限或降低。

指导细胞的超微结构及其基本病理过程 篇2

根据世界卫生组织的报道,角膜疾患是视力丧失和致盲的主要原因之一,其重要性仅次于白内障[1]。角膜盲使全世界超过一千万的个体受累(由美国眼库的视力同享协会估算),唯一被广泛接受的治疗是人类供体组织的移植[2]。尽管传统的同种异体角膜移植有超过80%的成功率[3],由于人口老龄化和预期寿命的延长,角膜供体库相对于不断增加的需求呈现逐步缩减(因为老年人更有可能需要移植物,而老年人的角膜往往不容易被受体接受)。感染性疾病(艾滋病,肝炎等)不断增长的发病率和屈光手术的逐步普及共同造成了这种不足,因为这些经过外科手术的角膜是不可接受的供体组织。供体移植物的另一个选择是用人工替代物置换被破坏的角膜。目前,还没有可利用的替代物被广泛接受[4]。目前已发明了很多角膜假体,但是没有一个可以没有痕迹的与受体组织融为一体[4]。人们逐渐关注异种移植,排斥是异种移植中的重要问题,脱细胞角膜基质由于没有细胞组织,免疫排斥应较单纯异种移植要小得多。本实验进行脱细胞组织的制备,研究其超微结构,并利用异种脱细胞角膜基质新西兰白兔进行角膜囊袋内移植,评价生物相容性,为下一步临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新西兰白兔9只,雌雄兼有,体重2～2.5 kg,眼部无明显异常。由北京大学第三临床医院实验动物中心提供。

1.2 脱基质狗角膜基质植片的制备

取新鲜实验动物狗眼球冲洗后,置于0.1%庆大霉素PBS液中1 min,沿角巩膜缘取下角膜。实验狗眼由北京大学第一临床医院动物实验室提供。取新鲜狗角膜植片后,马上固定于包含于PBS的2%甲醛中约2 h,蒸馏水对其洗涤几次后,放于1.5 N的氢氧化钠中进行4℃～60℃孵育,从而除去固定组织中细胞,蒸馏水洗涤30 min后,置于0.5%天门冬氨酸中孵育以消除残余的游离固定剂并降低pH至7.4,单独置于无菌包装内。

1.3 透明脱细胞基质植片的制备

手术前依次置于15%,30%,50%甘油中各10min,植片变为透明,PBS冲洗后备手术用。(甘油:厦门鱼肝油厂)

1.4 板层囊袋内移植

取新西兰白兔9只,雌雄兼有,体重2.0～2.5kg。30 mg/kg盐酸氯胺酮,5 mg/kg盐酸塞拉嗪肌肉注射麻醉动物,局部用0.5%盐酸丙美卡因后开睑。分别在近角膜缘及角膜中央区1/3基质内做一直径7 mm的囊袋在囊袋内剪除约1/3厚度角膜基质,然后,将一直径约4 mm,厚约200μm无菌脱细胞狗角膜基质放入囊袋内做间断缝合将囊袋口封闭。所有手术移植白兔术前及术后均未给予全身或局部任何抗生素或免疫抑制剂。

1.5 临床观察

1.5.1 脱细胞基质的大体性状观察

脱细胞基质及其脱水处理后大体观对比,HE染色及扫描电镜观察。

1.5.2 角膜术后各组临床眼表观察评定

兔角膜每天进行日常观察,每周两次裂隙灯照像观察角膜透明度,血管生长情况,眼内反应情况。

1.6 组织学观察

于术后7、30及90 d不同时间点处死术后兔子,过量水合氯醛麻醉处死,取角膜,4%多聚甲醛4℃固定24 h,O.C.T包埋,行HE染色。脱细胞基质分别进行HE染色,扫描和透射电镜观察其结构及细胞情况。

2 实验结果

2.1 脱细胞角膜基质大体观察和组织学观察

脱细胞角膜基质大体呈灰白色,半透明,其后经甘油脱水处理后的脱细胞基质呈完全透明,组织结构与未脱水的相比没有明显区别,见图1。HE染色光镜下脱细胞角膜基质经脱细胞后未观察到蓝染细胞核及细胞碎片残留,胶原组织排列规则疏松,可以保持理想的三维网状结构,同时也未见其他微生物污染,见图2。

扫描电镜下可见脱细胞角膜基质胶原组织排列好,呈三维网状结构,未见细胞成分。低倍下可观察到胶原板层清晰,结构完整,板层厚度均匀,层间致密,板层内胶原纤维束纵行排列,粗细均匀,互相平行似波浪状,高倍下可观察到胶原纤维束内胶原纤维互相构织成网状,网眼大小略不同,但网眼内未见任何微生物,见图3。

2.2 生物相容性

板层间囊袋内植入脱水处理后的脱细胞基质HE染色结果,见图4。狗脱细胞角膜基质植入兔眼角膜基质板层囊袋内,术后第14天术眼角膜基质囊袋内脱细胞角膜基质和周围受体角膜基质间紧贴无炎症细胞和新生血管侵入,可见少量角膜基质细胞进入脱细胞角膜基质。

2.3 临床观察

术后植入处角膜水肿,呈半透明状:角膜移植术后1周左右,植片基本透明,与缝线处水肿,中央区透明,可以清晰观察到前房内情况,前房内无明显炎症反应,前房维持好。术后第2～3天水肿消失,观察兔子行动自如,无明显分泌物。至术后1个月角膜仍可保持透明,前房内无明显炎症反应。术后近3个月逐渐出现新生血管,这种新生血管常累计创口及缝线周围,见图5。

A:脱细胞狗角膜基质脱水之前角膜基质呈混浊状;B:甘油脱水后角膜基质透明清晰可见下方英文字母;C:塑料皿做对照;D:复水1小时后角膜透明度下降

狗脱细胞角膜基,全层均未见蓝染细胞核,HE染色左图:×100;右图:×400

左图:狗脱细胞角膜基质植入兔眼角膜基质板层囊袋内。(HE染色×400)右图为正常兔角膜。(HE染色×100)

左图:脱细胞狗角膜基质植入术后第一天,角膜植入物仍有轻水肿;右图:裂隙光下可见基质中央植入区水肿

3 讨论

由于不断增长的角膜供体需求的增长,寻找或重建角膜移植替代物成为当今研究的热点。理想的角膜支架材料应具备下列特点:(1)良好的生物相容性。自身及其降解产物对机体无毒性,不引起排斥反应和炎性反应,不致畸变。(2)材料携带具有生物诱导性的多种角膜细胞生长因子,可诱导自体多种角膜细胞沿材料支架生长繁殖。(3)支架材料的降解速率与植入角膜细胞形成组织器官的速率相匹配,在支架完成为角膜组织提供模板功能后,可被完全降解吸收、或成为与新生组织相互融和的组成部分。(4)可按角膜组织的特点和缺损情况进行塑形,形成一定的曲率,达到完善的形态修复。(5)具有一定的坚韧性和与人体角膜相似的各种物理和化学性能,可加工成型,能形成三维立体结构,为细胞在支架中生长和物质代谢提供足够的空间[5,6,7,8,9]。

作为细胞生长的基质,羊膜是现今研究的热点,然而它并不能替代较深层的角膜基质,移植后很快溶解,并不是理想的角膜替代物,笔者准备选用经组织工程脱细胞处理的异种角膜作为组织支架,这项技术已应用于口腔科和皮科,但少用于眼科。

经过多步骤脱细胞处理,组织中的可溶性蛋白及细胞成分被去除,保留下来的是具有完整外观形态和组织学超微结构的不溶性基质成分,主要包括胶原、弹性蛋白、非胶原糖蛋白、蛋白多糖和糖胺多糖。脱细胞基质基本上保持了细胞外基质的主要成分和结构。现采用除垢剂-酶消化法和酶-冰冻法等对牛和兔角膜进行适当的脱细胞处理,将处理后的角膜与正常角膜比较,组织学超微结构有胶原蛋白多糖和糖蛋白,肉眼观察和正常角膜无明显变化。保留基质及网状结构,有良好的细胞相容性和组织相容性,可作为组织缺损材料及组织工程的角膜支架材料。同时具有角膜的透明性,这是其他支架所没有的优点。

脱细胞处理并不仅仅去除组织中的细胞成分的作用,笔者通过制备一个完好保留的细胞外基质,目前大量的研究已经证明了细胞外基质对与其相接触的细胞的各种行为起着非常重要的调节作用,围绕在细胞外的基质是一种相对很稳定的结构物质,但是只认为围绕在细胞外的基质对于细胞仅仅起着惰性的支持和框架的作用,新观点认为构成细胞外基质的每一种成份对于与它相接触的细胞的生长,分化都有着特殊的功能,由他们结合而构成的三维立体空间的细胞外基质,对于细胞的生长,分化,代谢,调节都起着不可替代的作用,反过来由于这些细胞外基质是由细胞所产生,所以细胞对于围绕在起周围的细胞外基质起着这样或那样的作用和影响,其空间结构对于细胞的代谢,形态生长分化有着密切相关的作用。因此,对于通过该技术特殊处理过的组织,由于所有能够被宿主识别出对宿主表达组织免疫抗原性的细胞物质被去除,而完整保留下来的细胞外基质其形态,组织结构,超微结构,定位和耐受性等都与原有组织的基质一样。

生物相容性是该活性角膜基质能否应用于临床的先决条件,笔者将脱细胞角膜基质进行角膜板层囊袋内移植,研究发现可以长期存留,保持透明性,未诱导出现特异性变态反应,这是因为基质层在角膜3层中免疫原性最低,仅占角膜总免疫原性的1.62%和6.12%,材料经处理后,免疫原性进一步降低[7]。直接将脱细胞基质埋在宿主角膜层间可直接观察角膜载体移植后的炎症反应,组织愈合,材料转归等组织相容情况,本实验中观察期内角膜修复较透明,无明显的炎症反应及排斥反应,宿主基质细胞可以很快移行进入植片内,提示其具有成为细胞载体的潜能,对于脱细胞基质对诱导宿主角膜各种细胞的影响,胶原组织代谢,在角膜重构中的作用在本实验尚缺乏相关的实验跟踪研究。

与以往的脱细胞基质相比,笔者的脱细胞处理方法可以有效的脱净细胞,并保持角膜三维结构,和透明性,植片生物相容性好。

异种来源的生物组织用于临床可能仍需要很长的道路,因为存在伦理学的争论,同时人们担心异种移植可能带来动物源性逆转录病毒与人类细胞的整合从而出现新的致病因素,尽管如此,由于移植器官的缺乏,人们仍在尝试各种方法使之成为可能,异种脱细胞角膜基质因为没有细胞的存在而大大降低了此种可能性,同时由于角膜部位属于相对免疫赦免器官,进行移植的成功率和可能性大大超过其他器官[10,11,12,13,14]。尽管异种脱细胞角膜基质为基础作为角膜移植替代物仍需更多更深入的研究,异种脱细胞角膜基质具有角膜组织的三维结构和透明性,组织内胶原分布均匀,良好的生物相容性这些均是其他生物材料所不能比拟的,宿主细胞可以在脱细胞基质内的移行和良好生长为进一步以其为载体体外构建生物工程角膜提供了良好的基础与前景。

摘要：目的探讨异种角膜脱细胞基质的制备方法,观察异种脱细胞角膜基质的超微结构。方法取新鲜狗角膜进行脱细胞处理,用光学显微镜和扫描电镜观察植片的形态学改变。从一脱细胞狗角膜基质取1mm厚组织片,植入兔角膜囊袋中,分别于术后不同时间点对其进行临床观察及组织切片看形态学改变,及其与受体组织融合情况。结果脱细胞后的狗角膜组织呈现无细胞的三维网状,肉眼观察为灰白色半透明组织,经脱水处理后呈透明状,组织切片中未见蓝染的细胞核结构,扫描电镜示基质纤维完好,呈有序的平行结构排列的透明结构。植入囊袋中可见局部水肿不明显,呈半透明状,术后1个月可见有新生血管长入。结论脱细胞处理方法可以有效的脱净细胞,并保持角膜三维结构和透明性,宿主细胞可以长入异种脱细胞角膜基质植片中并在植片中增殖,与其他方法处理的脱细胞基质相比,组织的生物相容性更好。