细胞过程

细胞过程（通用10篇）

细胞过程 篇1

微小RNA (micro RNA, mi RNA) 是一类非编码的单链小分子RNAs, 长度约为20~24个核苷酸, 由高等真核生物基因组编码, 在细胞核与细胞质中由RNA聚合酶通过序列加工而成。与靶基因信使RNA (m RNA) 通过碱基配对方式引导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC) 降解m RNA或阻碍其翻译, 在转录后水平调控基因的表达[1]。mi RNA具有空间和时间特异性, 利用此特点, 有的学者将特异性表达在B淋巴细胞上的mi RNA表达在造血干细胞中, 成功增加了分化出B细胞的数目[2]。由此, 筛选调控分化发育的mi RNA将为细胞的基因干预提供可能。

有研究表明mi RNA与干细胞的自我更新、多能性的维持、分化和分裂增殖等过程有关[3,4]。本研究采用哺乳动物micro RNA表达谱芯片技术检测大鼠卵圆细胞分化为肝癌细胞过程中micro RNA的差异表达变化, 以发现可能参与调控卵圆细胞分化为肝癌细胞的相关micro RNA, 从而为阐明并掌控卵圆细胞向肝癌细胞分化的micro RNA调控机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

SPF级健康的Wistar大鼠40只, 体质量 (120±20) g, 雄性30只, 雌性20只, 由南方医科大学实验动物中心提供 (动物合格证号:2002-2009, 2004B023, 2004A068) , 大鼠按标准实验室动物要求, 正常饲料喂养。

1.2 试剂

3'-甲基-4-二甲基偶氮苯 (3'-Me-DAB) (日本东京化成工业株氏会社) , 他克莫司 (Tarcrolimus) (日本藤泽药厂) , 小鼠抗大鼠c-kit单克隆抗体、Thy-1单克隆抗体 (Santa Cruz, USA) , FITC标记山羊抗小鼠Ig抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司提供, DMEM (高糖) (北京鼎国生物技术有限责任公司) , 胎牛血清、F12、Hanks液、PBS (广州威佳责任有限公司) 。mir Vana TM mi RNA Isolation Kit (Ambion, USA) , mi RNA Complete Labeling and Hyb Kit (Agilent) 。DNA抽提试剂盒、Taq DNA聚合酶 (1.667×108) nkat/L (北京鼎国生物技术有限责任公司) , Marker (100 bp DNA Ladder) 及引物合成 (北京鼎国生物技术有限责任公司) 。

1.3 大鼠肝卵圆细胞增殖模型的建立

30只雄性Wistar大鼠稳定饲养1周后, 改喂含0.06%3'-Me-DAB的饲料, 饲养温度为28℃, 湿度为40%~70%。4周后, 参照SIRICA等[5]介绍的PER-COLL密度梯度离心法进行卵圆细胞分离。2 m L DMEM悬浮细胞, 接种于含20%小牛血清、20 g/m L表皮生长因子 (EGF) 及各种氨基酸的DMEM/F12培养液。在37℃、50 m L/L二氧化碳孵箱中培养[6]。新分离的细胞用0.25%台盼蓝染色观察细胞活力和进行干细胞表面标志鉴定。台盼蓝染色细胞活力达95%。调整细胞浓度为5×105/m L接种于血清培养基。

1.4 肝卵圆细胞的鉴定和恶性分化

1.4.1 激光共聚焦扫描显微镜 (LSCM) 观察

细胞爬片, 0.01 mol/L PBS漂洗1 min×3, 4℃下4%PFA固定15 min, 0.01 mol/L PBS漂洗3 min×3;加入一抗 (小鼠抗大鼠Thy-1单抗和C-kit单抗) , 4℃过夜, 洗涤5 min×4, 移入适当稀释度的荧光素FITC标记抗体二抗, 4℃孵育数小时, 避光洗涤5min×4, 室温下封片, 避光保存。在LSCM下进行荧光素抗体标记的图像采集、合并和分析, 激发波长为488 nm, 发射波长为504 nm。胞浆和胞膜呈绿色为阳性。

1.4.2 观察

前10代每2代观察1次, 自第10代开始, 每5代观察1次, 并提取mi RNA。

1.4.3 利用大鼠Y染色体特异性PCR技术检测卵圆细胞源性肝癌细胞

按25 mg/kg的戊巴比妥腹腔麻醉20只雌性Wistar大鼠, 随机平分为实验组和对照组, 实验组消毒开腹, 用4号针头吸取新分离的雄性Wistar大鼠卵圆细胞悬液, 接种至肝包膜下, 每点106个细胞。两组雌性Wistar大鼠0.06%3'-Me-DAB的饲料饲养14周, 促进肝肿瘤的生成, 并用免疫抑制剂他克莫司0.1 mg/ (kg·d) 喂饲抑制免疫排斥反应。

1.5 基因芯片分析

根据mir Vana TM mi RNA Isolation Kit生产厂商提供的标准操作流程进行样品总的mi RNA抽提, 抽提所得总mi RNA经安捷伦Agilent Bioanalyzer2100生物分析仪电泳质检合格后备用。将准备好的总mi RNA样品用Cy3标记, 然后与Agilent Rat mi RNA芯片 (Agilent rat mi RNA (8×15K) V16.0Kit, 该款芯片覆盖676条大鼠相关mi RNA) 杂交, 杂交后芯片清洗扫描, 芯片结果采用Agilent Microarray Scanner (Agilent) 进行扫描, 用Feature Extraction software 10.7 (Agilent) 读取数据, 对原始数据进行预处理, 信号值去除背景, 然后进行中值归一化, 将每个micro RNA对应的四个探针信号值计算均值作为micro RNA的信号值, 并用此均值计算ratio (Si/N) 。同时, 用T-test计算P-value, 表示micro RNA在两个样品间差异的显著性。ratio大于2倍, 且P-value<0.001的micro RNA作为上调micro RNA被筛选出来;ratio小于0.5倍, 且P-value<0.001的micro RNA作为下调micro RNA筛选出来。

1.6 生物信息学分析

1.6.1 差异micro RNA靶基因预测

非编码区靶基因预测由mi Randa等多个软件 (Pic Tar、Target-Scan、mi Randa等) 分别进行预测, 对于有些无法对应的micro RNA, 则参考了mi RGator软件。我们取几种软件预测结果的交集, 即overlap部分。

1.6.2 功能分析 (GO-Analysis)

将得到的靶基因进行GO分析, 根据P-value大小判断靶基因中具有显著性意义的GO term。

1.6.3 信号转导通路分析 (Pathway-Analysis)

将得到的靶基因进行Pathway显著性分析。分析每个Pathway中所包含的靶基因个数, 用超几何分布的统计检验方法计算出反映Pathway中靶基因分布富集显著性的P-value, 根据P-value大小找出与靶基因功能显著相关的生物通路。

1.7 大鼠Y染色体的标本收集、引物的设计和PCR检测

1990年由SINCLAIR[7]发现在哺乳动物包括人类的Y染色体短臂上存在着决定性别的主宰基因SRY (sex-determining regin of the Y) , 并定位于Yp11.3。我们利用Y染色体的这种特异性PCR技术检测卵圆细胞源性肝癌细胞。实验组和对照组共10只雌性Wistar大鼠均诱发出肝癌结节, 提取肝癌组织, 提取DNA。从Gen Bank调出雄性大鼠的SRY基因, 用ABI公司prime express引物设计软件设计如下:SRY 68F:5'-AGGCGCAAGTTGGCTCAAC-3';SRY 168R:5'-GGCCTTTTTTCGGCTTCTG-3'产物长度296 bp。SRY PCR反应体系:反应总体积25μL, 5×PCR Buffer 5μL, d NTP (10 mmo L/L) 0.5μL, 引物SRY 1μL, Taq DNA聚合酶 (1.667×108nkat/L) 0.15μL, 模板DNA 1μL, 补足灭菌去离子水至总体积25μL。PCR反应条件:PE 9600扩增仪上, 93℃预变性3 min, 93℃30 s, 55℃25 s, 72℃45 s, 共30个循环, 72℃延伸10 min。反应后检测:取8μL扩增产物在20 g/L琼脂糖凝胶电泳25 min后, 紫外灯下观察、拍照。

1.8 统计学处理

数据用mean±SD表示, 应用SPSS 17.0统计软件分析, 基因芯片分析进行t检验。

2 结果

2.1 激光扫描共聚焦显微镜结果

肝卵圆细胞胞浆和胞膜表达干细胞标志物Thy-1及C-kit (见图1) 。

A:Thy-1;B:C-kit

2.2 卵圆细胞的生长速度及倍增时间

卵圆细胞呈多角型, 椭圆形或圆形。在体外培养传代后, 繁殖速度加快, 细胞质逐渐增多, 并分化为圆形的肝癌细胞和细长纺锤样胆管细胞。细胞的群体倍增时间逐渐延长。

2.3 基因芯片结果

基因芯片样品总RNA的质量鉴定:紫外分光光度计检测结果表明, RNA的A260/A280比值介于1.89~2.02;凝胶电泳结果提示各样本的18 S和28 S条带清晰, 28 S条带无明显降解。见图2。总RNA质量完好, 结果合格, 可以进行芯片实验。

基因芯片检测结果及验证:mi RNA芯片杂交代表性图像显示荧光信号分布均匀, 信号点饱满, 背景较低, 杂交效果理想。将芯片扫描图像导入Feature Extraction software 10.7读取数据, 从中共鉴定到1210个mi RNAs, 将数据导人Gene Spring Software11.0分析, 得到差异表达mi RNAs 22个 (P≤0.001, fold change≥2) , 其中上调19个, 下调3个。见图3。

1:卵圆细胞分离后即测组;2:恶性分化后的卵圆细胞组

2.4 生物信息学分析

基于Sanger数据库对差异micro RNAs进行靶基因预测, 共得到1 295个靶基因;将上述差异micro RNA预测的靶基因基于Gene Ontology数据库进行GO注释, 并进行了生物学功能分类与整合, 其中主要涉及轴突导向 (axon guidance) 、血管发生 (angiogenesis) 、转录后蛋白修饰、小分子代谢过程、O-连寡糖过程 (O-glycan processing) 、胰岛素受体信号转导途径、对缺氧的反应、信号转导、对药物反应等。将上述差异micro RNA预测的靶基因基于KEGG数据库进行Pathway注释, 其中主要涉及癌症途径 (pathways in cancer) 、细胞-基质黏附途径 (focal adhesion) 、Hedgehog信号途径、MAPK信号途径、O-连寡糖生物合成、胰岛素信号通路、胞吞作用、黏附连接、细胞外基质受体相互作用、类固醇激素生物合成等信号通路。

2.5 SRY基因检测

连续喂DAB 14周后, 20只雌性Wistar全部肝脏组织都有肿瘤生成, 肿瘤组织呈现结节状或者菜花状。由电泳条带 (图4) 可见:雄性大鼠与实验组雌性大鼠的肿瘤组织样本 (T) 有相同的电泳条带 (M与T1、T2和T3相同) , 雄性大鼠与对照组雌性大鼠有不相同的电泳条带 (M与F不相同) 。

1:Marker为100 bp DNA ladder 100~2 000 bp;2:正常雄性大鼠;3:正常雌性大鼠;4~6:移植的雌性大鼠的肿瘤组织样本

3 讨论

mi RNA为22个左右核苷酸的小分子RNA, 具有强大的调控功能, 成为当前研究的热点。mi RNA与目的基因3'非编码区 (3'UTR) 结合降解m RNA和抑制其翻译, 控制着细胞的分化、增殖和凋亡等重要的生命活动, 与肿瘤的发生、发展密切相关[8,9];mi R-NA在肿瘤干细胞的“干性”相关基因和信号通路调控方面发挥着重要作用, 被称为Stem Cells mi R-NAs[10]。例如:mi R-135a和mi R-135b家族在结肠腺瘤和腺癌中表达上升, 他们调控着APC基因的表达, 并参与Wnt信号通路的激活, 在结肠癌干细胞中发挥重要作用[11]。let-7在乳腺癌干细胞中的表达缺失, 从而导致它负性调控的HMGA2基因高表达, 而后者对于乳腺癌干细胞的自我更新发挥着重要作用[12]。mi R-34家族在胰腺癌中低表达, 通过靶向Bcl-2、HMGA2和Notch等信号通路在胰腺癌干细胞中起抑制作用[13]。本研究基于上述研究观点, 采用mi RNA芯片技术分析大鼠肝卵圆细胞向肝癌细胞分化过程中mi RNAs表达差异有显著性, 这些mi R-NAs可能从一个侧面反映其与肝癌干细胞“干性”的关系。

虽然缺乏直接的证据, 但越来越多的实验结果支持肝癌起源于肝干细胞“成熟受阻”的观点。DUMBLE等[14]对敲除p53基因的小鼠喂缺乏胆碱却补充乙硫氨酪酸的饮食, 从而诱导卵圆细胞的大量增生, 随后分离出卵圆细胞进行培养后, 将这些细胞接种于裸鼠皮下后长出与肝细胞癌相似的肿瘤, 并确定其由卵圆细胞分化而来, 该细胞种植成瘤实验提示卵圆细胞可能参与肝癌的发生。GROZ-DANOV等[15]报道癌胚蛋白Gpc3可以做为肝祖细胞的标志物, 并通过建立Solt-farber肝癌模型研究证实肝祖细胞/卵圆细胞与肝癌的发生有关。最近研究在肝癌组织中的具有干细胞特征的Ep CAM+细胞引导了肝癌细胞的生长和转移, 进一步提示肝干细胞与肝癌的发生有着密切的联系[16]。

本研究基于上述研究观点, 采用mi RNA芯片技术分析肝卵圆细胞分化为肝癌细胞过程中的mi R-NAs差异有显著性, 这些mi RNAs可能从一个侧面反映其与肝癌干细胞“干性”的关系。为了确认试验用的卵圆细胞为“干性”的肝癌干细胞, 笔者利用Y染色体体细胞的特异性来寻找卵圆细胞分化为肝癌细胞的直接证据, 并获得了证实, 从而为本研究提供理论依据。国外有人用Y染色体荧光原位杂交法追踪骨髓源干细胞[17]。由于真核表达载体表达效率和表达时限[18,19]的限制, 移植到体内的基因标记的干细胞常不能被检测到。相反Y染色体是雄性个体的特异性基因结构, 不受时间和细胞表型变化的影响[20]。为此, 笔者用Y染色体体细胞的特异性来寻找卵圆细胞在体内分化为肝癌细胞的直接证据。把分离出的雄性大鼠肝脏卵圆细胞接种于雌性大鼠肝内, 然后对雌性大鼠进行致癌剂诱导, 分析雌性大鼠肝癌细胞的来源。如果在癌细胞中发现有Y染色体 (+) 的细胞, 则可以证明植入的卵圆细胞可以在体内分化为肝癌细胞, 从而得出肝癌细胞可以来源于卵圆细胞的直接证据。

本芯片研究显示:在肝卵原细胞向肝癌细胞分化过程中, 具有显著性差异且差异倍数在2倍及以上的mi RNAs 22个, 其中上调表达19个, 下调表达3个。笔者进一步采用荧光定量PCR验证22条差异micro RNAs, 22条均与芯片结果相符, 表明实验芯片结果可靠。

TERRIS等[21,22]发现:在高表达上皮细胞黏附分子Ep CAM且甲胎蛋白阳性的癌细胞中, mi R-181家族表达上升。而这类细胞通常被认为是肝细胞肝癌的肿瘤干细胞。转染mi R-181后, 发现Ep CAM表型的癌细胞增多。mi R-181能激活肿瘤信号途径Wnt/β-catenin, 并抑制一些促分化分子。调节细胞分化的COX2和GATA6, 以及抑制Wnt/β-catenin通路的激酶NLK是mi R-181的直接靶点, 使它们沉默能导致Ep CAM+癌细胞数量的增加。这些说明mi R-181对维持肝癌干细胞Ep CAM表型即其“干性”具有重要意义。与本研究结果相似, CARD等[23]的研究也发现, 多能性因子Oct4/Sox2结合在mi R-302的启动子上, 可以上调mi R-302的表达, mi R-302可直接作用于细胞周期调控蛋白Cyclin D1和D2, 过表达mi R-302可使S期延长, G1期缩短。另有研究发现, mi R-92b可抑制细胞周期抑制因子p57的翻译, 促进胚胎干细胞迅速通过G1/S限制点[24]。由此可以推论, 干细胞特异性mi RNAs可促进干细胞通过G1/S限制点, 保持其快速增殖的特性。上述筛选的差异mi RNAs可能参与肝癌干细胞的“干性”, 有深入研究的价值。

mi RNAs作为新的治疗靶点主要优点就是调控多个基因和信号通路[25], 而si RNA则是通过特异的序列作用于单个靶基因[26]。因此, 对mi RNAs调控靶基因及其信号通路的生物信息学分析尤为重要。基于Sanger数据库对差异mi RNA进行靶基因预测是常用的预测mi RNA靶基因方法, Sanger数据库即mi RBase, 它是整合了micro Cosm、Target Scan和Pictar 3个数据库, 本组选用了Target Scan 6.0数据库进行靶基因预测共得到2 895条靶基因, 将上述差异mi RNA预测的靶基因基于Gene Ontology数据库进行GO注释, 并进行了生物学功能分类与整合, 使大家了解这些mi RNA在整体水平发挥的主要生物学功能。笔者的分析结果显示, 它们主要涉及轴突导向、血管发生、转录后蛋白修饰等。信号通路的研究一直是研究生物学功能的机制及设计药物治疗靶点的主要方法, 笔者将上述差异mi RNA预测的靶基因基于KEGG数据库进行Pathway注释, 其中主要涉及癌症途径、细胞-基质黏附途径、Hedgehog信号途径、MAPK信号途径等, 对这些信号通路在肝癌干细胞的“干性”中的作用深入研究, 有望发现新的肝癌干细胞发生机制。总之, 本组通过芯片技术筛选了22条与肝癌干细胞相关的mi RNAs, 并对他们进行了生物信息学分析, 这些mi RNAs及其靶向的基因和信号通路可能涉及调控肝癌干细胞的各种生物学特性, 进一步对他们的生物学功能和调控机制进行研究, 并结合全基因组学及蛋白组学方法, 有助于从整体上分析肝癌干细胞的发生机制, 寻找并设计新的治疗靶点。

细胞过程 篇2

线粒体为线状、长杆状、卵圆形或圆形小体，外被双层界膜。外界膜平滑，内界膜则折成长短不等的嵴并附有基粒。内外界膜之间为线粒体的外室，与嵴内隙相连，内界膜内侧为内室(基质室)(图1-8)。在合成甾类激素的内分泌细胞(如肾上腺皮质细胞、卵甾滤泡细胞、睾丸的leydig细胞等)，线粒体嵴呈小管状。内外界膜的通透性不同，外界膜的通透性高，可容许多种物质通过，而内界膜则构成明显的通透屏障，使一些物质如蔗糖和nadh全然不能通过，而其他物质如na+ 和ca 2+等也只有借助于主动运输才能通过。线粒体的基质含有电子致密的无结构颗粒(基质颗粒)，与二价阳离子如ca2+及mg2+具有高度亲和力。基质中进行着β氧化、氧化脱羧、枸橼酸循环以及尿素循环等过程。在线粒体的外界膜内含有单胺氧化酶以及糖和脂质代谢的各种转移酶;在内界膜上则为呼吸链和氧化磷酸化的酶类。

线粒体是对各种损伤最为敏感的细胞器之一。在细胞损伤时最常见的病理改变可概括为线粒体数量、大小和结构的改变：

1.数量的改变 线粒体的平均寿命约为10天。衰亡的线粒体可通过保留的线粒体直接分裂为二予以补充。在病理状态下，线粒体的增生实际上是对慢性非特异性细胞损伤的适应性反应或细胞功能升高的表现。例如心瓣膜病时的心肌线粒体、周围血液循环障碍伴间歇性跛行时的骨骼肌线粒体的呈增生现象。

线粒体数量减少则见于急性细胞损伤时线粒体崩解或自溶的情况下，持续约15分钟。慢性损伤时由于线粒体逐渐增生，故一般不见线粒体减少(甚至反而增多)。此外，线粒体的减少也是细胞未成熟和(或)去分化的表现。

2.大小改变细胞损伤时最常见的改变为线粒体肿大。根据线粒体的受累部位可分为基质型肿胀和嵴型肿胀二种类型，而以前者为常见。基质型肿胀时线粒体变大变圆，基质变浅、嵴变短变少甚至消失(图1-9)。在极度肿胀时，线粒体可转化为小空泡状结构(图1-10,图1-11)。此型肿胀为细胞水肿的部分改变。光学显微镜下所谓的浊肿细胞中所见的细颗粒即肿大的线粒体。嵴型肿较少见，此时的肿胀局限于嵴内隙，使扁平的嵴变成烧瓶状乃至空泡状，而基质则更显得致密。嵴型肿胀一般为可复性，但当膜的损伤加重时，可经过混合型而过渡为基质型。

线粒体为对损伤极为敏感的细胞器，其肿胀可由多种损伤因子引起，其中最常见的为缺氧;此外，微生物毒素、各种毒物、射线以及渗透压改变等亦可引起。但轻度肿大有时可能为其功能升高的表现，较明显的肿胀则恒为细胞受损的表现。但只要损伤不过重、损伤因子的作用不过长，肿胀仍可恢复。

细胞过程 篇3

关键词：苍术；减数分裂；花粉母细胞；繁殖方式；花粉育性

中图分类号：S567.23+9.03文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）11-0273-02

药用植物苍术（Atractylodeslancea）为菊科苍术属多年生草本植物，分布并栽培于我国的许多地区，收获其根状茎干燥后作药用。根茎含挥发油，主要成分为茅术醇、桉叶油醇、苍术酮等；可制成祛湿药、健脾药、解表药，主治湿困脾胃、胞痞腹胀、食欲不振、呕吐泄泻、湿肿、夜盲等症。湖北省罗田和英山一带的苍术植株、叶、头状花序及花的各部均较大，与其他地区的苍术有明显的形态和地理分布差异，罗田苍术含丰富的挥发油，含量比其他产地的高，因此被分为一个新亚种（Atractylodeslanceassp.luotianensis）[1]。罗田苍术的特征是根状茎香味浓郁、横断面有橙黄色或棕红色油点，俗称“珠砂点”，于2011年获中国地理标志产品保护。近期细胞学研究表明，该地区苍术的染色体数为2n=24，与其他地区的相同，但只有1对染色体的短臂上出现随体[2]，相关报道表明，相同染色体数的苍术均有2对染色体带有随体[3-4]。另用荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）技術，在罗田苍术的染色体上检测到1对染色体带有5SrDNA位点，另外2对染色体带有45SrDNA位点，其中1对为随体染色体[2]。故1对染色体上的45SrDNA位点没有表达，没有随体的形成。因此，罗田地区的苍术可能在占据该地区后发生了染色体水平上的分化，为其亚种的分类地位提供了细胞学证据。

由于苍术产生两性花或单性花，两者多异株，单性花一般为雌花；两性花植株具有一定结实率而产生种子。苍术的繁殖方法有种子繁殖、分株繁殖、根茎繁殖，但仅两性花产生种子，且种子成熟后易霉烂，致使种子繁殖较困难。鉴于罗田苍术较其他苍术有不同的形态及细胞学特征，本研究观察了花粉母细胞减数分裂过程，为罗田苍术繁殖方式提供细胞学证据。

1材料与方法

1.1材料制备

苍术花序采自湖北省英山县陶家河乡。在7月苍术的初花期，上午在地里辨认两性花植株，将花序取下直接投入准备好的固定液中（95%乙醇∶冰醋酸=3∶1），带回武汉换入新鲜固定液，放置过夜，次日将固定的材料转入70%乙醇溶液中置于4℃的冰箱中备用。

1.2细胞学观察

观察花粉母细胞减数分裂时，将固定的花序用自来水洗去乙醇后，用解剖针挑出不同时期的花药，放于盛1mol/L盐酸溶液的小杯中，于60℃水浴锅中酸解3min；将花药置于清洁载玻片中央的1小滴水中，用解剖针捣碎并挑除大块花药壁杂质，加1滴卡宝品红染色液染色，取干净的盖玻片盖上，用滤纸包住盖片，用手指轻轻挤压盖片除去多余的染色液，并使细胞散开。然后在显微镜下观察细胞学制片，辨认细胞分裂的时期，将合适及清晰的细胞图像储存于计算机中供分析。

1.3花粉育性观察

观察花粉育性时，在晴天采当天开放的花朵，用镊子取出花药置于载玻片上，加1滴醋酸洋红染色液，用镊子挤压出花粉粒并去除药壁组织后，盖上盖玻片，用滤纸包住盖片并用手指轻轻挤压盖片除去多余的染色液，在光学显微镜下观察。可育的花粉大而圆并能着色，不育花粉小而瘪并不能着色。每个单株观察200～300个花粉粒。

2结果与分析

2.1取材时间及方式

因苍术的两性花与单性雌花多异株，要在开花后才能在群体中分辨出两性花植株，取其花序固定观察花粉母细胞减数分裂。苍术为头状花序，单个花蕾很小，特别是处于花粉母细胞减数分裂期的花蕾更小。固定的未开放的不同大小的花序中，处于花粉母细胞减数分裂期的花序比例较小，有时即使很小的花序里面的花药都已产生花粉。要从大量固定的花序中才能挑选到合适的花药，观察到减数分裂的全过程。表明苍术花粉母细胞减数分裂在花序与花发育的较早时期进行，始花时1株苍术上大多数花序的分裂高峰已过。较理想的取材方式为在第1年鉴定出两性花植株，第2年将其无性繁殖，在未开花前取幼小的花序固定。

2.2花粉母细胞减数分裂过程

在第1次减数分裂的前期I，细线期花粉母细胞（pollenmothercells，PMCs）的细胞轮廓清晰可见，呈圆形或卵园形，细胞质染色均匀，染色体呈一团细线缠绕在一起，只在线团的边缘可见向外伸展的单条染色体，仅占据细胞的较小体积（图1-a）；但在少部分细胞中，除大的染色体团外，还观察到1至数个染色较深、体积小很多的染色团，从染色特性及形态判断不是外来的杂质，而可能是染色质，这些额外染色质的来源可能是PMCs间的细胞融合（cytomixis）时发生的染色质穿壁，使其他细胞的部分染色体转移过来。这种现象在某些植物的减数分裂过程中已有报道，可引起群体中染色体数目的变异[5-6]。该结果为苍术种间与种内的染色体数目变异提供了解释，在苍术中常观察到非整倍体的细胞[2-3]。在偶线期，染色体变粗，分布在整个细胞内（图1-b）；但未能观察到染色体形态理想的粗线期PMCs。在双线期及终变期PMCs内，染色体变得粗短，可见多数染色体并排成对出现，没有明显的交叉结；只在较大的染色体对（二价体）间可见明显的交叉结，可区分每个二价体，计数有12个二价体（图1-c）；在中期I时，二价体排列在细胞中央，二价体中每条染色体定向细胞两极，可见较小二价体的2条染色体已分开但仍有染色质丝相联，而较大二价体的2条染色体还由末端交叉结连接（图1-d）；在后期与末期I时，染色体达到两极后形成2个子细胞（图1-e），但没有细胞质分裂而进入第2次减数分裂。在显微镜下较难区分后期/末期I与前期IIPMCs。在中期II，在同一个细胞内染色体分两组呈一字形排列（图1-f）；在后期/末期II，染色体分裂后产生4个子核/子细胞，细胞外的胼胝质壁出现（图1-g）；最后由4个子细胞发育成花粉粒（图1-h）。花粉的可染率（可育率）为93.7%。故苍术表现的是同时型小孢子发生，即在减数分裂的2次分裂中细胞质只分裂1次，且具有3孔花粉（图1-g）。染色体间的长短差异显著，与染色体核型分析结果一致，最长染色体与最短染色体的长度比超过2∶1[2]（图1-i）。

nlc202309032132

3讨论

在观察的材料中，苍术花粉母细胞减数分裂过程中没有出现染色体落后及微核，显示正常的染色体配对与分离，最后产生较高可育的花粉。为苍术的较高结实率提供了细胞学解释。正常的减数分裂也保证了苍术染色体数目的稳定，因苍术属所有种（包括白术，AatractylodesmacrocehpalaKoidz）和亚种的染色体数都为2n=24[2-4]。少数细胞中出现的其他染色体数的原因有待进一步研究。

苍术在自然條件下通过根茎无性繁殖，但同时仍进行较正常的种子繁殖。这与天南星科的半夏（Pinelliaternata）有明显差别，因其以珠芽和块茎繁殖的无性繁殖为主，因种子结实率低及种子发芽差而有性繁殖退化。细胞学观察表明，染色体数变化较大的多倍体系列群体，减数分裂过程常出现不配对染色体、落后染色体及微核，导致花粉育性很低[5]。三百草科的鱼腥草（Houttuyniacordata）也是多倍体系列，主要以地下茎繁殖；花粉母细胞减数分裂中发生高频率的细胞融合及异常，花粉育性极低；但可能由孤雌生殖产生较多种子，且种子萌发好[6]。苍术为二倍体物种（2n=2x=24），不能忍耐染色体数的变化，至少罗田一带苍术的有性生殖还未退化，而其他苍术的减数分裂过程还有待进一步研究。

参考文献：

[1]胡世林，冯学锋，王玠，等.中国苍术属一新亚种[J].植物分类学报，2001，39（1）：84-86.

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细胞过程 篇4

当前, 在医学、病毒学、细胞遗传学以及卫生检验等诸多领域, 细胞体外培养发挥重要作用。但是在细胞培养过程中, 污染问题始终受到人们的关注。对于自然界中的所有微生物而言, 都是细胞培养过程的污染来源和威胁, 如昆虫、霉菌、细菌、病毒等。当微生物进入到培养体系中, 就会频繁地增值和代谢, 尤其以生物性污染的危害最为严重。一般情况下, 如果发生了真菌污染问题, 需要进行灭菌处理并将培养物直接废弃。但是对于一些细胞具有难以复制性、实验过程复杂等现实问题, 就不得不采取有效的污染清除方法, 才能保留较为珍贵的细胞, 降低成本损失。如果一些培养的细胞非常重要, 或者受到的污染并不严重, 就可以消除污染或者想方设法控制污染。以常规采用的广谱抗真菌药 (如两性霉素B) 对细胞会产生额外的毒性作用, 在细胞培养中不适用;专门在细胞培养中采用的水溶性两性霉素B大多来自国外进口, 成本相对较高。本文根据实验室小鼠成肌细胞C2C12培养过程产生白色念珠菌污染的实际情况, 试图采用大扶康进行预防和控制, 取得了一定的效果。

2 实验过程与观察方法

在室温37℃的环境下, 满足5%的CO2以及一定的湿度条件, 在含有10%的胎牛血清DEME培养基中, 培养小鼠成肌细胞C2C12。具体检测项目和方法分析如下:

2.1 污染的检测方法

在培养小鼠成肌细胞C2C12过程中, 细胞培养液没有出现任何的颜色变化现象;经过显微镜进一步观察, 细胞的活力弱化, 生长速度逐渐缓慢, 甚至出现个别死亡现象。显微镜中可以看到单个或者成串、成团的贴壁白色椭圆形菌落, 对受到污染的细胞培养液进行收集, 采取离心处理措施, 对沉淀涂片实行革兰氏染色、检验结果为白色念珠菌。

2.2 白色念珠菌的防控

合理控制大扶康在细胞发生毒性中的剂量, 针对产生白色念珠菌污染并且污染程度相近的细胞, 采取三种防控方法:其一, 采用高浓度的大扶康和PBS进行洗涤、冲击, 起到控制作用;其二, 采用低浓度的大扶康和DEME培养基继续进行培养控制;其三, 大扶康和硫酸阿米卡星+头孢他啶配伍, 继续维持培养过程, 预防真菌污染问题。具体分析如下:

(1) 大扶康毒性水平的确定。在不含有抗生素的培养基中, 对细胞进行计数、消化及稀释作用, 一般稀释为常规细胞传代浓度即可, 将细胞悬液分散到12孔的培养板中。在不同浓度的梯度范围之内, 分别添加大扶康, 每孔中的培养基数量为1ml;根据细胞毒性指标, 每天观察细胞是否脱落, 出现空泡、汇合度下降和变圆。处理后用台盼蓝染色法检测细胞生存率, 确定大扶康的最佳使用浓度。

(2) 合理控制高浓度洗涤冲击。将2倍控制浓度的大扶康及1ml的PBS加入到白色念珠菌污染的细胞培养皿中, 静置约15min。通过显微镜观察这种方法的抑制效果, 并注意C2C12细胞生长的情况, 每日定期重复以上操作。

(3) 维持培养策略。向发生白色念珠菌污染的细胞培养皿中加入控制浓度的大扶康培养液培养细胞2~3代, 隔天换液。连续培养1周后, 显微镜下观察该方法的抑菌效果及对细胞生长情况的影响。改用低于治疗浓度一半的剂量进行维持培养, 连续培养1周。在无抗生素的培养基中培养4~6代, 确定污染是否已被消除。

(4) 预防真菌污染措施。染消除后的细胞, 采用30μg/ml大扶康与20μg/ml硫酸阿米卡星+50μg/ml头孢他啶配伍的方法继续培养, 连续观察2周。新复苏的细胞和同一培养箱中的其他细胞均可用此方法进行真菌污染的预防。

3 实验结果分析

3.1 大扶康的毒性水平

当细胞处理完毕24h左右, 一些孔中大扶康的浓度就会降低到250μg/ml以下, 而抗生素浓度的下降, 白色念珠菌的活动更加频繁;在大扶康浓度达到60020μg/ml的孔中, 基本已经控制细菌污染问题, 但是大多细胞发生脱壁、死亡现象;在大扶康浓度达到30020μg/ml的孔中, 效果良好。经过24h处理之后, 其中的污染基本控制, 剩余细菌的数量较少、游走缓慢, 仅有少量细胞发生脱壁或死亡问题, 更多的细胞处于增值状态;48h之后污染完全控制。

3.2 高浓度冲击的控制效果

白色念珠菌污染的细胞培养皿中加入600μg/ml的大扶康与1ml PBS, 培养箱中静置15min。显微镜下观察到细胞稍有变形, 即将脱壁。立即换完全培养基培养细胞。此方法每天重复1次, 共7d, 7d后污染完全被控制。细胞较处理前数目增多, 处于增殖状态。

3.3 维持培养的控制效果

在白色念珠菌污染的细胞培养皿中加入300μg/ml大扶康培养液培养细胞2~3代隔天换液。1周后, 显微镜下观察到细胞污染被完全控制, 少量细胞脱壁死亡。用150μg/ml大扶康进行维持培养1周后在显微镜下观察, 无白色菌落, 细胞污染被完全控制。

4 结论与思考

在细胞培养过程中, 白色念珠菌较为常见, 可通过空气、培养液或者器皿传播。如果发生白色念珠菌污染问题, 需要立即采用抗真菌药物并切断污染源。污染的细胞要及时灭菌销毁, 以免污染其他细胞。由于一些细胞很珍贵, 因此不得不设法清除。事实上, 经真菌污染的细胞, 在抗菌素作用下, 细胞原有的许多生物学特性 (如基因的表达, 抗原性和代谢特点) 也随之发生了相应的改变, 对研究结果造成严重影响。所以在采用每一种治疗方案时必须对其效果以及对细胞可能产生的毒性影响进行监测。

经本实验表明, 大扶康有广谱抗真菌作用, 主要用于治疗念珠菌、隐球菌等, 尤其适用于不能耐受两性霉素B毒性作用的细胞, 而且价格低廉, 容易获得。利用大扶康和硫酸阿米卡星+头孢他啶配伍的方法, 可有效防范真菌污染问题。其中, 硫酸阿米卡星抗菌谱与庆大霉素相似, 对需氧革兰氏阴性杆菌有较强的杀灭作用。头孢他啶抗菌活力较强, 抗菌谱较广, 对革兰氏阳性或阴性菌均具有较强的抗菌作用, 可用于治疗由两种以上敏感菌引起的混合感染。因此采用3种抗菌素配伍的方法可代替两性霉素B用于细胞污染白色念珠菌的防控。但是该方法的运用, 是否影响了C2C12细胞的转染效果和分化能力, 今后仍需进一步探讨。

摘要：基于细胞培养过程, 采用大扶康对白色念珠菌污染问题的形成加以控制, 对不同浓度的大扶康进行观察、培养, 了解其对小鼠成肌细胞C2C12的生长影响, 判断应用效果。

关键词：细胞培养,白色念珠菌,污染,防控

参考文献

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[5]邵建波, 金庆辉.一种细胞培养微芯片的制作及应用[J].生物工程学报, 2008 (7) .

细胞过程 篇5

哈佛大学的干细胞研究人员提出了，在发育过程中决定干细胞分化命运的新理论。他们发现，前列腺素E2的浓度能够决定干细胞是成为肝细胞还是胰腺细胞。前列腺素E2是一种炎症性因子，在炎症和疼痛中起重要作用。

这项研究于二月十三日发表在Cell旗下的Developmental Cell杂志上，这一成果将帮助人们更好的生产肝细胞和胰腺细胞，并将其用于科学研究或临床治疗。

哈佛大学干细胞研究所HSCI的Wolfram Goessling博士与Trista North博士合作，对斑马鱼胚胎进行了研究。他们发现，在干细胞分化形成内脏的区域中，前列腺素E2的含量存在一个梯度。肝脏和胰腺来源于共同的内胚层前体细胞。研究显示，在这些负责肝脏/胰腺形成的干细胞上，存在着特殊的细胞膜受体，这些受体可以检测周围的前列腺素E2含量，并在此基础上指引细胞分化为特定的器官类型。

“感知较多前列腺素的细胞成为肝脏，而感知较少前列腺素的细胞形成胰腺，”Goessling说，他是哈佛医学院的一名助理教授。“我们这是首次发现，前列腺素可作为引导干细胞分化的因子，发出决定细胞命运的基础指令。”

随后研究人员发现，前列腺素E2在哺乳动物中也能起到类似的作用。他们用不同浓度前列腺素E2处理小鼠干细胞，成功诱导它们向肝细胞或胰腺细胞分化。此外，研究还显示前列腺素E2也能促进肝脏的生长和肝细胞的再生。

Goessling和他的搭档North早在2005年就对前列腺素E2产生了兴趣。当时他们用2500种已知药物对斑马鱼胚胎进行化学筛选，以寻找能够令造血干细胞增多的化合物。他们发现前列腺素E2的效果最好，它是首个被发现有此效果的分子。最近，前列腺素E2作为脐带血移植药物，已经成功完成了1b期临床试验

“在不同器官中，前列腺素可能是细胞生长的主要调控因子，”Goessling说。“我们知道它可以用于脐带血移植，也能够在肝脏中起作用，那么很可能前列腺素还能影响更多的其他器官。” 鉴于前列腺素E2的上述新功能，研究人员希望能够将其用于诱导多能干细胞iPSC，控制它们向肝细胞或者胰腺细胞分化。iPSC是将对成熟细胞进行重编程形成的，具有与干细胞类似的特性。研究人员指出，这样的方案将能帮助人们，治疗那些需要移植肝细胞或者相关器官受损的患者。

Prostaglandin E2 Regulates Liver versus Pancreas Cell-Fate Decisions and Endodermal Outgrowth The liver and pancreas arise from common endodermal progenitors.How these distinct cell fates are specified is poorly understood.Here we describe prostaglandin E2(PGE2)as a regulator of endodermal fate specification during development.Modulating PGE2 activity has opposing effects on liver versus pancreas specification in zebrafish embryos as well as mouse endodermal progenitors.The PGE2 synthetic enzyme cox2a and receptor ep2a are patterned such that cells closest to PGE2 synthesis acquire a liver fate, whereas more distant cells acquire a pancreas fate.PGE2 interacts with the bmp2b pathway

细胞过程 篇6

关键词：中职,工作过程系统化,教学情境设计

职业教育必须注重学习能力的培养, 使学生具有职业迁移能力, 能够可持续发展。而课程在职业教育的人才培养中占核心地位, 结合学生职业能力的培养需求, 我校组织教师学习工作过程系统化设计理念, 重构课程内容, 以真实工作任务为载体, 对“血细胞计数”教学情境进行设计和探索。

一、工作过程系统化设计内涵

一个职业之所以能够成为一个职业, 是因为它具有特殊的工作过程, 这个工作过程, 是指个体“为完成一件工作任务并获得工作成果而进行的一个完整的工作程序”, 它是一个综合的, 时刻处于运动状态但结构相对固定的系统。工作过程系统化, 强调的是过程的回归, 它的设计与实施, 既满足在社会或职业的需求基础上对教育或个性的需求, 也进一步推进实现个体在职业生涯中的可持续发展。

二、工作过程系统化设计思路

(一) 教学内容的选择

临床检验是中职医学检验技术专业的一门核心课程, 主要学习血液、尿液、粪便等标本检测, 其中血液常规检测尤为重要。血液常规检测又可分为血细胞数量和血细胞形态检测两个方面, 在传统以学科为主的教学模式下, 白细胞、红细胞、血小板等不同细胞计数分散在不同章节, 使学生在学习过程中无法将知识和技能进行有效的迁移。

基于工作过程系统化教学, 可将血细胞计数设置为一个教学情境, 根据不同类型细胞将其划分为白细胞计数、红细胞计数、血小板计数以及全血细胞计数四个子情境。四个子情境, 虽内容上有所不同, 但是细胞计数流程一致, 即准备—采血—稀释—充液—计数—计算—报告, 四个子情境顺序在设置上应满足由简单到复杂, 由单一训练到综合训练, 故安排为白细胞计数—红细胞计数—血小板计数—全血细胞计数。

(二) 教学内容的基本特征

1. 综合性

基于工作过程系统化教学, 可综合考察学生的知识、能力、态度, 在教学过程中强调三种能力的训练和提升。

专业能力包括: (1) 熟练使用牛鲍计数板; (2) 会吸量管的选择与操作; (3) 熟练使用光学显微镜; (4) 辨识不同类型血液细胞; (5) 准确计数细胞; (6) 正确计算结果; (7) 结合临床分析检测意义; (8) 掌握细胞操作流程。

方法能力: (1) 通过案例分析, 掌握提取信息能力; (2) 查阅资料, 掌握搜集整理资料能力; (3) 发现不同细胞计数异同, 掌握归纳总结能力。

社会能力: (1) 具有较强的口头和书面表达能力; (2) 通过小组合作, 提升团队协作能力。

2. 稳定性

客观分析检验工作行动领域的工作过程, 选择3个以上同一范畴内容进行教学设计, 实现教学情境的同一性, 即内容虽有所不同, 但相同的是步骤。教学中强调工作过程中的六个基本步骤, 即资讯—决策—计划—实施—检查—评价, 真正实现“理实一体化”教学, 体现“以学生为主”的教学思想。

三、教学情境具体设计与实施

(一) 资讯

根据案例引出问题:如何计数血液中血细胞数量。分小组讨论问题, 教师引导学生思考, 或由学生自主提问。学生将问题记录在问题任务单上, 通过查阅资料, 提出解决问题方案。因中职学生查阅资料能力欠佳, 教师可提供相关参考书籍。

(二) 决策

小组分享查阅结果, 教师总结, 教师提供必备的理论知识。知识构建做到:以“新知识、难点知识, 实用知识”为原则, 用红字突出重点知识。图文并茂、生动形象, 配同步练习, 巩固新知。知识要点逐步减少, 而技能在一次次训练中巩固提升。最后通过列表, 总结不同细胞计数异同。

(三) 计划

根据查阅资料及教师提供信息, 制定细胞计数流程, 其中包括实验准备、步骤、计算及临床意义。

(四) 实施

学时安排由多到少, 白细胞计数4学时, 红细胞计数、血小板计数、全血细胞计数各2学时。教师在实施中做到“现场示教、巡回指导、纠正问题、检查结果”, 学生在实施中做到“规范操作、熟悉流程、报告结果、理解原理”, 最后完成结果报告单。

(五) 检查

标本计数结果与教师数据进行比较, 完成分析讨论单, 分析实验过程中存在的问题。

(六) 评价

评价可分为学生自评、小组评价、教师评价。学生自评要求学生对实验结果进行分析, 找出实验中存在的问题, 做到自我总结。小组评价主要由组长评价和成员互评, 查找彼此的不足之处, 共同提高。教师评价, 包括随堂考核和操作考核, 通过考核帮助学生分析其所存在的问题, 了解学生对技能的掌握情况。通过此评价办法, 可实现学生、小组、教师的三方评价, 由随堂考核到最终考核的动态评价以及不同项目、不同评价标准的梯度评价。

参考文献

[1]赵志群.职业教育与培训新概念[M].北京:科学出版社, 2003.

细胞过程 篇7

1 资料与方法

1.1 实验资料

采用临床在19~29岁因正畸及阻生而拔除的磨牙, 并在无菌的条件下取出其牙周膜, 剪碎, 之后获取其牙周膜组织来做细胞培养。

1.2 实验方法

首先可以使用有限稀释法, 单克隆培养来获得PDLSCs, 并且利用免疫细胞化学以及流式细胞术对其进行检测。在mi RNA的分离与标记中, 分别取PDLSCs和诱导后的成骨细胞, 采用液氮研磨法, 把该组织磨成粉末之后, 再加入到Trizol中进行混合, 然后按照Trizol的说明抽提细胞中的总RNA。取50~100μg总RNA, 采用mi RNA分离试剂盒分离富集mi RNA, 利用T4RNA连接酶进行Cy3荧光标记, 无水乙醇沉淀, 吹干。

其次, 在基因芯片微阵列杂交检测诱导前后细胞mi RNA表达谱中, 将被荧光标记后的小分子RNA, 溶在16μL的由15%甲酰胺、0.2%SDS、3×SSC、50×Denhardt's组成的杂交液中, 保持42℃的温度施行微阵列杂交过夜。实验重复2次。

然后, 利用荧光实时定量PCR检测目的mi RNA表达量, 取0.05μg总的RNA, 在SuperscriptⅡ的反转录酶作用下, 产生反转录而形成第一链c DNA, PCR反应中就是实时定量mi RNAs特异引物和第一链c DNA为模板而产生的反应, PCR反应以U 6RNA作为内参照。在mi RNA差异表达分析中, 可以应用mi Randa、mi RBase等软件联合的方式, 对具有显著差异的mi RNA进行分析。

1.3 观察指标

可以先将25μg/L胰岛素样生长因子及0.5 nmol/L的成纤维细胞生长因子, 放入到培养PDLSCs的成骨细胞培养液中进行诱导, 在持续诱导7、14 d后, 有效观察PDLSCs向成骨细胞分化过程。

2 结果

在差异表达的mi RNA上有差异, mi R-125 b、mi R-31、mi R-512、mi R-145在不同样本中的扩增曲线图以及扩增后的融解曲线图中, 存在一定的差意, 其中mi R-125b、mi R-31、mi R-512、mi R-145以及mi R-100的倍数分别是15倍、21倍、2倍、4倍以及6倍。其扩增曲线图见图1。

在PDLSCs表面分子鉴定中, 通过流式细胞仪, 检测干细胞特异性中的CD分子, 验证培养的是不是干细胞, 其结果如图2中所示, 在流式细胞仪的分析下, 本次分离培养的PDLSCs中, 可以表达干细胞相似表面的分子中阴性表达为CD14、CD34、STRO-1, 阳性表达为CD29、CD90。

在显微镜下观察PDLSCs, 可发现其发生形态学改变, 呈长梭形的类似成纤维细胞, 然后再传代培养大约4 h之后就开始贴壁, 在进入2~3天的指数生长期后, 细胞的增殖速度很快, 4~6 d就可以进入平台期, 细胞的生长速度平稳, 并且持续呈单层贴壁生长。

在PDLSCs成骨诱导后, 进行化学染色, 在胰岛素样生长因子与成纤维细胞生长因子共同诱导下, 7d后进行碱性磷酸酶染色就可发现, PDLSCs成骨细胞分化明显, 并且继续诱导14 d后, 其中细胞钙开始沉积, 而且茜素红染色也将会成为黑褐色, 可见PDLSCs对修复牙周炎有良好的效果。

3 讨论

据美国的牙颌面研究协会统计, 70岁以上老人中80%都患有牙周炎, 然而, 牙周炎是引起牙周组织缺损并最终导致牙齿缺失的常见病因, 患病之人不仅牙齿功能下降, 还会严重影响他们的健康以及生活质量。故此, 怎样利用组织工程方法确保牙周组织再生已成为国内外学者着力研究的热点。由于目前针对在牙周膜干细胞 (PDLSCs) 中mi RNA的研究还处于起步阶段, 并且还有大量的相关mi RNA等待发现。那么在PDLSCs内的mi RNA是怎样通过调控靶基因去影响其生物学特性的, 它又是怎样改变mi RNA的表达去定向诱导PDLSCs的, 这些问题都要得到解决[1]。本研究拟从人牙周膜内分离PDLSCs, 之后会采用基因芯片技术, 筛选出PDLSCs分化过程内的特异表达mi RNA, 以此为着眼点来比较成骨系在诱导前后mi RNAs表达谱的变化, 筛选出具有特异表达的mi RNA, 再利用生物信息学方法去预测这些mi RNA靶基因, 这样就可以初步阐明在PDLSCs向成骨细胞分化的过程中, 其mi RNA分子调控机制的重要性[2,3]。本研究也可以为PDLSCs向成骨系分化提供有效的新基因靶点, 为以后治疗牙周炎提供新的思路与方案, 具有深远的社会意义。

PDLSCs是指在牙周膜中, 拥有自我更新以及有着多向分化潜能的未分化干细胞群。其不仅是牙周组织中最直接、最可靠的再生种子细胞, 也是形成牙周新附着的细胞来源, 更是在牙周缺损细胞学中细胞治疗以及基因治疗的基础[4]。多年以来, PDLSCs一直是众多学者研究的热点, 在牙周病治疗、修复种植体周围软硬组织缺损及正畸牙移动的修复过程中, 都发挥着重要作用, 更是近年来牙周病治疗领域中的焦点之一。

PDLSCs向成骨细胞的分化, 一直都是牙周组织工程中的重要步骤, 其分化过程涉及多个蛋白编码基因及多条信号通路[5]。如果单纯地控制一个分子乃至一条通路, 将无法高效地促进干细胞的骨系分化。其中关于PDLSCs的生物学作用、来源、组织学定位及分离方法等方面的研究, 都取得了不小进展, 将为重新认识PDLSCs生物学特性提供新的参考依据。

随着近年来mi RNA数量的爆炸式增长, 据悉在2004年中, mi RNA的数量只有719个, 到了2010年9月, 其mi RBase数据库内的mi RNA序列信息则已超过15000条。故此应用基因芯片分析牙周炎治疗情况, 对于检测PDLSC向成骨细胞分化过程中mi RNA表达谱的变化, 具有深远的意义。

本研究首次探讨了PDLSCs向成骨细胞分化的过程, 并分析其中mi RNA表达谱的差异, 探讨在成骨诱导中, 胰岛素样生长因子以及成纤维细胞生长因子对PDLSCs成骨能力的影响, 通过应用基因芯片技术, 分析在PDLSCs往成骨分化中mi RNA表达谱的差异, 证实了其对修复牙周炎的作用, 以及Micro RNA对PDLSCs向成骨细胞分化中的控制, 可以有效促进PDLSCs的分化。在PDLSCs中观察到茜素红阳性面积增大, 并且钙化结节也变大、且着色深, 表明PDLSCs拥有很强的成骨能力[6]。

本研究是基于干细胞理论及相关技术基础上提出的, 从以上利用基因芯片技术对PDLSCs成骨细胞分化过程的研究中, PDLSCs具有分化成牙槽骨以及牙周膜、牙骨质的潜能, 并且还在牙周生理、病理以及牙周病再生的治疗中发挥重要作用。

综上所述, 在应用基因芯片分析PDLSCs向成骨细胞分化过程中, 可以有效观察到mi RNA表达谱的差异, 而且PDLSCs具有成骨潜能, 这对治疗牙周炎提供新的研究思路和方案, 高效地促进干细胞的骨系分化, 具有一定的社会意义和经济价值。

摘要：在人牙周膜干细胞 (PDLSCs) 成骨分化过程中, 可以利用基因芯片技术, 观察miRNA表达谱的变化, 从而为人牙周膜干细胞成骨分化机制提供研究基础。本研究应用基因芯片来分析牙周膜干细胞向成骨细胞分化过程中miRNA表达谱的差异, 对治疗牙周炎提供了新的研究思路和方案。

关键词：基因芯片,miRNA表达谱,牙周膜,干细胞,成骨,细胞分化

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细胞过程 篇8

无论是哺乳动物还是禽类,在出生时其卵巢拥有数以万计的原始卵泡,而最终发育成熟并排卵的卵泡所占比例不足1%。绝大多数卵母细胞在发育过程的各个阶段,如:卵子发生、减数分裂、原始卵泡形成以及卵泡选择等均可发生凋亡,以确保最终卵巢池中有适量优质卵泡维护卵巢功能。一般认为,卵母细胞的凋亡主要在发育早期的卵泡闭锁中起主导作用,而颗粒细胞凋亡主要在发育晚期卵泡的闭锁中起主导作用。

在哺乳动物胚胎发育阶段,当原始生殖细胞迁移到还未开始分化的胚胎生殖脊组织后,生殖细胞发生的发育程序就被启动了,此时的雌性生殖细胞称作卵原细胞(oogonia),卵原细胞持续进行活跃的有丝分裂,不断增殖形成许许多多的卵原细胞,扩大生殖系(germline)的规模,直到卵原细胞完成最后一次有丝分裂后,即进入第一次成熟分裂前期(prophasel)细线期[1]。进入第一次成熟分裂的卵母细胞,称为初级卵母细胞。这标志着雌性生殖细胞增殖终结,进入卵母细胞阶段,而在卵子发生过程中有超过三分子二的卵母细胞会发生凋亡,这一自然凋亡的生物学过程叫做胚胎卵母细胞磨损(Fetal oocyte attrition,FOA)[2]。Safia Malki等发现在FOA过程中,卵母细胞细胞核内转座子LINE-1编码的蛋白L1ORF1p表达水平与卵母细胞的存活有关,当其上调表达后,可导致卵母细胞出现更多的减数分裂缺陷,减数分裂细胞非整倍型增加,进一步引起卵母细胞的凋亡和胚胎致死[3]。卵母细胞减数分裂过程易出错,一旦出错机体便会自动启动凋亡程序,清除受损细胞。Touati,S.A等发现Bub R1在第一次减数分裂过程染色质的分离作用中扮演重要角色,包括维持纺锤体组装监测点活性、定时第一次减数分裂启动时间和增强着丝粒和微管的相互作用等,并进一步表明Bub R1会随年龄增加而下调表达,这解释了年老雌性动物卵巢出现非整倍体的卵母细胞概率增加[4,5]。

2 卵泡形成发育阶段的卵母细胞质量控制

初级卵母细胞被单层扁平上皮细胞所包围,聚集在卵巢皮质部位,形成原始卵泡;不断增多的原始卵泡构成了原始卵泡池,原始卵泡形成前卵母细胞的凋亡以及静止期原始卵泡的凋亡是决定原始卵泡池大小和原始卵泡储备量的关键因素,其大小间接影响了动物的繁殖潜力,而在形成原始卵泡库前,卵巢会出现一卵母细胞凋亡高峰。Zhao,L等研究发现原始卵泡池的建立与一些特殊的基因表达有关,其中Rac1基因在原始卵泡形成过程中不可或缺,如果缺失Rac1弱化原始卵泡形成,并出现卵泡结构异常,而卵母细胞特异性表达的一些基因Jagged1,GDF9和BMP15能够消除Rac1的弱化作用,并能通过Notch2信号通路促进原始卵泡的形成[6];Choi,Y等发现Notch2缺失的雌性小鼠卵巢虽能形成原始卵泡,但原始卵泡周围的单层扁平颗粒细胞不会转化柱状多层颗粒细胞,并且出生后14d卵巢中检测不到卵母细胞的存在[7];Castro,F.C等发现GDF9和BMP15参与原始卵泡向初级卵泡转变的过程,能够通过诱导体细胞和颗粒细胞表达与卵泡生长和成熟有关的基因[8]。

大部分原始卵泡会一直处于静息状态直至器官的性成熟前,以维持雌性动物随后漫长的繁殖期。Adhikari,D等发现肿瘤抑制结节性硬化复合体蛋白1(the tumor suppressor tuberous sclerosis complex 1,Tsc1)能够负调节与蛋白合成、细胞生长增殖相关的雷帕霉素复合体蛋白1(rapamycin complex 1,m TORC1)这一条通路来维持原始卵泡的长期静息状态,缺失了Tsc1基因的小鼠卵巢原始卵泡会过早过快激活,表现出早衰的症状[9];他们也发现Tsc/m TORC1信号通路能够与PTEN/PI3K信号通路相互协作来调控原始卵泡的激活与休眠,以维持雌性动物正确的繁殖期[10];Castrillon DH等发现小鼠缺失了转录因子Foxo3后卵巢内的原始卵泡会大量的不受控制的激活,使得小鼠在15周龄时出现不育[11];Pelosi,E等也证实Foxo3能维持卵巢内卵泡储备,延缓绝经期,提高小鼠繁殖力[12]。原始卵泡中的少部分会渐渐的经过不可逆的激活并开始发育,经初级生长、次级生长卵泡和成熟卵泡并排卵。然而大部分卵泡只能发育到有腔卵泡阶段后发生闭锁。卵泡的优势选择机制监控了卵母细胞的质量。早期的研究发现激素参与了优势卵泡选择,如FSH和雌二醇(estradiol,E2)等。Mihm,M等研究发现,优势卵泡中含有浓度的雌二醇和低浓度的胰岛素样生长因子结合蛋白(insulin-like growth factor binding proteins,IGFBP)[13,14];随后的研究也发现颗粒细胞表达的一些细胞因子,如3β-HSD、IGFs、BMPs和Inhibins等均可影响优势排卵卵泡选择[15]。

卵母细胞发育过程中的选择对于确保生殖质量和维持遗传资源的稳定性有着重要意义。而发生于整个卵母细胞发育进程中的质量监控与选择是一个复杂的调控网络,涉及到细胞凋亡、激素、生长因子和基因调控元件等多种调控途径。随着研究的发展与深入,相信会有更全面的机制来阐述雌性生殖的质量控制原理。

摘要：物种种群的遗传稳定与其生殖细胞质量的精准选择密切相关。细胞凋亡是机体清除体内多余或受损细胞的重要途径,卵母细胞适当的凋亡对于确保物种的生殖质量,维持遗传资源的稳定性有着重要作用,而卵母细胞在不同时期的质量控制是一个复杂过程,受多种调控因子与调控元件的控制。对卵母细胞发育过程中的几个重要时期,精准调控卵母细胞质量的分子机理作了一些梳理和总结。

细胞过程 篇9

关键词：Micro-RNA,人肾细胞癌,深度测序技术

Micro-RNA (mi RNA) 是一类由22~23个核苷酸组成的短分子RNA, 能在转录和翻译后水平调节各类基因。mi RNA广泛作用于细胞生长、发育、代谢、凋亡等多种生物反应进程, 其表达量的改变与多种疾病直接相关[1,2], 是近十年来生命科学领域的研究重点和热点之一。利用新的生物学技术与计算机技术探索和发现新的mi RNA、研究mi RNA表达谱、确定mi RNA作用靶标以及研究体内mi RNA表达等, 是目前mi RNA研究的重点, 旨在揭示mi RNA在生命进程与疾病中起到的重要作用。

肾细胞癌 (renal cell carcinoma, RCC) , 起源于肾脏的肾小管或集合管的上皮细胞, 具有不同的病理类型, 其发病原因还不十分明确[3]。miRNA在肾的正常发育、肾细胞癌病变过程中的作用还没有明确的报道, 需要深入研究。笔者利用小分子RNA深度测序技术[4], 在培养的人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1与人胚肾细胞细胞系HEK293中建立了相应的miRNA表达谱, 分析与人胚肾细胞正常生长于癌细胞分化过程中特定miRNA的表达差异, 为揭示miRNA在相应过程中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1与人胚肾细胞细胞系HEK293购自中科院上海细胞所。

1.1.2 RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司, DMEM培养基购自GIBCO公司, 其他相关生物材料与试剂由国内生物公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的培养

常规条件培养HRC-DH1与人胚肾细胞细胞系HEK293, 37℃, 5%CO2, DMEM培养基培养。

1.2.2 RNA的提取

提取细胞总RNA前, 弃培养基上清, 加入PBS洗两次, 弃去PBS后, 加入Trizol, 刮下细胞, 按说明书步骤提取细胞总RNA, 整个RNA提取过程, 在低温或者冰上进行, 以减少RNA降解。

1.2.3 小分子RNA的深度测序

提取实验组细胞总RNA跑胶回收30 bp以下小分子RNA, 在5’和3’分别加上一对Solexa Adaptor, 这些小分子RNA再用Adaptor引物经17个循环的扩增, 回收90 bp (小分子RNA+Adaptor) 左右片段, 送武汉华大基因生物公司测序。

2 结果

2.1 人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1分化不同阶段miRNA表达量变化

人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1分化的不同阶段, 多数miRNA表达量 (拷贝数) 相对恒定, 这些表达量恒定的miRNA具有维持正常细胞功能的作用。而miR-16, 21, 29a/b, 27a, 424/322簇, 99b, 374a等miRNA在HRC-DH1细胞分化过程中, 表达量下降, 降幅超过2倍, miR-368则有两倍以上的表达量增加 (表1) 。这种表达量变化, 与分化时间, 即分化程度相关 (图1) 。

2.2 人胚肾细胞细胞系HEK293不同生长状态miRNA表达量变化

培养人胚肾细胞细胞系HEK293细胞, 分别收获正常生长状态、指数生长期和接触抑制期的细胞, 提取总RNA进行小分子RNA深度测序。结果显示, 不同生长状态下, 特有miRNA表达量有显著变化, 见表2。在对数生长期状态下, miR-142、16、32、92a、424/322簇、20a、19a、10a等miRNA有两倍以上表达量上升, 提示这些miRNA在细胞快速生长过程中起到重要作用。相对于对数生长状态, 接触抑制生长状态下的HEK293细胞其miR-142、32、19a、196b和10a等miRNA表达量有一定程度减少, 其中miR-142下降幅度超过2倍, 见图2。

3 讨论

目前发现的人类miRNA已超过1000种, 越来越多的miRNA的确切功能正逐渐被确定。如miR-133a参与肌细胞发育, 内皮细胞, 血管构造, 功能及血管再生等。miRNA同样也参与了复杂的疾病调控, 如miR-378, miR-296等调控肿瘤血管生成。心室肥厚、心律紊乱、心力衰竭等心脏疾病中也存在miRNA的调控作用[5], 但是miRNA在肾的正常发育、肾细胞癌病变过程中的作用还没有明确的报道。本研究发现, 特定mi RNA在肾细胞不同生长状态, 或不同分化状态下表达量呈现一定规律。如上所述mi R-16、21、29a/b、27a、424/322簇、99b、274a等miRNA在HRC-DH1细胞分化过程中, 表达量下降, 降幅超过2倍, 而miR-368则有两倍以上的表达量增加。但其中miR-21、29b、27a、29a、374a在HEK293细胞生长状态下则检测到的拷贝数很低, 亦无明显表达量的改变, 因此推测这类miRNA可能为与肾癌细胞的分化相关, 与人胚肾细胞生长关系不紧密。相反, miR-142、19b、32、92a、20a、19a、196b与10a等miRNA则在人胚肾细胞生长过程中起到一定作用, 而在肾癌细胞分化过程中作用不明显。

值得注意的是, miR-16在两组实验里都有显著表达量的改变。miR-16在肾癌细胞分化过程中表达量显著下降, 但在人胚肾细胞HEK293生长过程中则表达量大幅上调, 显示miR-16在肾细胞生长周期中起到了关键的作用。

临床上肾细胞癌对化疗和放疗均不敏感, 现有治疗手段有限, 早发现对于治疗及预后有重要意义。本研究通过检测miRNA在人胚肾细胞和人肾细胞癌细胞系中的表达谱变化, 明确有意义的特定miRNA的序列, 既有助于肾细胞癌早期检测, 也为深入研究肾细胞癌的发生机制奠定一定基础。

深度测序技术是最新测序技术之一, 能提供文库中分子序列及拷贝数等详细信息。小分子RNA深度测序技术有其精确的测序和拷贝读数的优势, 不仅能精确定量已知miRNA的拷贝数, 而且能发现新的小分子RNA和新的miRNA;而以往的miRNA的微阵列芯片 (miRNA microarray) 则只能提供已知miRNA的相对表达量, 不仅存在假阳性现象, 且不能发现新的miRNA。因此, 小分子RNA测序能弥补miRNA microarray的相应不足, 逐渐成为主要的miRNA研究工具之一。本研究以人肾细胞癌分化细胞系HRC-DH1与人胚肾细胞细胞系HEK293为研究对象, 精确地提供了肾细胞在分化与生长过程中特定miRNA表达变化信息, 可以为相关研究提供直接的数据支持。

除了在结果中所示的miR-21等miRNA可能参与肾癌细胞分化过程, miR-142可能参与人胚肾细胞生长过程外, 笔者特别留意到miR-16在肾细胞不同生长分化状态表达量呈现规律性变化。miR-16是人类细胞中非常重要的一种miRNA, 发现较早, 在不同生理病理条件下在不同细胞状态中表现出不同的功能, 如在乳腺癌中, miR-16能下调抑癌基因表达, 有助于乳腺癌的发生[6];miR-16亦可加强人类骨髓间质干细胞的分化[7]。本研究数据显示, miR-16可能在肾细胞癌分化过程和胚肾细胞生长过程中起到了关键作用, 其调控机制需进一步研究。

参考文献

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细胞过程 篇10

关键词：IL-2,大鼠,肝癌,ELISA

肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma, HCC) 是我国常见的恶性肿瘤之一, 早期诊断较困难, 一旦发现, 大多已属肝癌晚期。白细胞介素-2 (IL-2) 于1976年由Morgan等在小鼠脾细胞培养上清液中发现。作为免疫调节网络中的核心物质, IL-2激活单核-吞噬细胞, 并增强其杀伤肿瘤活性;解除肿瘤浸润淋巴细胞的免疫抑制状态并增强其免疫功能等。本研究通过检测大鼠肝癌过程中血清IL-2水平, 以期能阐明IL-2在肝癌发生、发展中的作用, 为肝癌的早期诊断及治疗提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 建立肝癌模型

体重150-200g清洁级雄性Wistar大鼠150只 (由山东大学实验动物中心提供) 。将大鼠随机分为模型组和对照组。模型组饲以含二乙基亚硝胺 (DEN, sigma公司, 76mg/L) 饮水, 连续12周。对照组则常规喂养。

1.2 标本采集

于实验第4、8、12、16、18、20、22、24、25周, 随机抽取模型组动物各10-15只, 心尖取血并分离血清后置-80℃保存备用。肝组织4%多聚甲醛缓冲液固定24小时, 常规石蜡包埋。对照组于第4、12及24周分别取5只, 予以同样处理。

1.3 病理组织学检查

石蜡包埋肝组织, 5?m厚切片, HE染色, 光镜观察。

1.4 采用酶联免疫吸附法检测血清IL-2水平

大鼠IL-2 ELISA检测试剂盒购自上海轩昊科技发展有限公司。具体步骤按说明书进行操作。

1.5 统计学分析

运用SPSS 13.0统计软件, 采用单因素方差分析及q检验对相关数据资料进行统计处理, 所有数据以±s表示。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠肝脏病理学改变

对照组大鼠肝脏肉眼观未见明显异常。光镜下肝组织结构正常, 肝细胞排列呈索状, 围绕小叶中央静脉呈放射状排列。肝细胞胞浆嗜酸性, 核嗜碱性, 多为单核, 位于细胞中央。模型组大鼠肝脏病理学改变可大致归纳为3期: (1) 诱癌早期-肝细胞损伤期 (第1~8周) , 光镜下可见大鼠肝脏呈弥漫性肝细胞水肿, 部分肝细胞可见嗜酸性变。肝小叶有灶性坏死伴炎性细胞浸润; (2) 诱癌中期-增生-硬化期 (第9~16周) , 肝脏表面逐渐出现数量不等、大小不一、弥散分布的灰白色病灶。光镜下见肝细胞水肿进一步加重, 出现嗜酸性或透明细胞增生灶, 并逐渐形成肝细胞增生结节及非典型增生结节, 第12周起可见典型假小叶形成; (3) 诱癌晚期-癌变期 (第17~25周) , 肝脏表面布满多个大小不一的灰白色结节, 切面可见出血和坏死。镜检为肝细胞癌, 癌周组织有肝细胞增生灶、增生结节及非典型增生结节。

2.2 大鼠血清IL-2水平见表1。

与癌变组比较△:P<0.05;*:P<0.01

3 讨论

1976年Morgan等发现小鼠脾细胞培养上清液中有一种能够促进和维持T细胞在体外长期生长的因子, 将其称为T细胞生长因子 (T cell growth factor, TCGF) , 1979年统一命名为IL-2。IL-2主要由CD4+和CD8+T细胞产生, 此外, 淋巴因子激活的杀伤细胞 (lymphokine activated killer cell, LAK细胞) 、自然杀伤细胞 (natural killer cell, NK细胞) 、转化的B细胞、白血病细胞等亦可产生。

研究发现[1], IL-2对肝癌有直接抗癌作用, 可明显抑制肝癌细胞的侵袭力和转移力。但IL-2并无直接杀灭肿瘤细胞活性, 其抗肿瘤机理在于刺激、活化其效应细胞, 间接发挥抗肿瘤作用[2]。尤天庚等[3]的研究显示, 移植肝癌大鼠脾内转染白细胞介素2和/或12基因后CD4+细胞数量显著增加, 病理观察显示肿瘤局部有大量淋巴细胞浸润, 提示可明显增强T细胞活性。杜俊蓉等[4]报道, 重组人白介素2腺病毒 (advh IL-2) 肿瘤局部注射可明显增强皮下接种肝癌H22荷瘤小鼠脾细胞的LAK与CTL杀伤活性, 增加肿瘤组织内CD4+与CD8+T淋巴细胞浸润, 具有显著的抗肿瘤作用。同时, IL-2可抑制肝癌细胞CD44表达并明显增强细胞间粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1) 和人白细胞抗原-Ⅰ (human leucocyte antigen-Ⅰ, HLA-Ⅰ) 的表达, 使肝癌细胞对细胞外基质的亲和力及肝癌细胞的聚集作用减弱, 因此具有抑制肝癌细胞的侵袭力和转移力的作用[1]。

应用鼠脾细胞增殖检测法, 毛华等[5]发现在DAB诱发大鼠肝癌过程中非特异性肝炎组、肝硬化组及肝癌组IL-2活性明显低于正常对照组, 而肝癌组又低于非特异性肝炎组, 提示癌变过程中IL-2活性呈进行性下降。对原发性肝癌患者和肝硬化患者外周血的检测得到同样的结论[6]。Kong L等[7]的研究也显示慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌患者血清IL-2水平较正常人明显降低, 而且随着肝癌患者病情进展及肿瘤不断生长, 血清IL-2水平降低更趋明显。

本研究显示在诱癌过程中, 大鼠血清IL-2水平随肝组织学形态的改变呈一定的变化趋势, 表现为正常对照组>肝细胞损伤组>增生-硬化组>癌变组。其中, 正常对照组、肝细胞损伤组和增生-硬化组之间表现出来的的IL-2浓度差异无统计学意义, 癌变组大鼠血清IL-2浓度低于正常对照组 (P<0.01) 、肝细胞损伤组 (P<0.01) 及增生-硬化组 (P<0.05) 。诱癌过程中IL-2水平的降低, 考虑可能由于产生IL-2的CD4+T细胞亚群数量减少和功能不全, 或荷瘤宿主体内产生了肿瘤诱导的非特异性免疫抑制因子, 或生成IL-2所必需的IL-1等淋巴因子活性降低等原因所致。大鼠血清IL-2水平随病变进展而逐渐降低, 提示检测血清IL-2水平有助于了解病情发展和机体免疫状态, 是早期发现癌变的敏感指标。

参考文献

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