巨噬细胞源性泡沫细胞

巨噬细胞源性泡沫细胞（精选4篇）

巨噬细胞源性泡沫细胞 篇1

摘要：目的 探讨脂联素对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1及胆固醇含量的影响及其可能的机制。方法 体外培养RAW264.7细胞, 加入20 mg/L氧化低密度脂蛋白 (ox-LDL) 共同孵育48 h, 将其诱导成泡沫细胞, 加入不同浓度 (0、1、5、10μg/mL) 的脂联素干预24 h, RT-PCR测定ABCA1 mRNA的表达, 高效液相色谱测定细胞内胆固醇含量。观察脂联素对泡沫细胞中ABCA1表达的影响。结果 脂联素显著增加RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1 mRNA的表达 (P<0.05) , 并增加细胞内胆固醇含量, 且呈浓度依赖性 (P<0.05) 。结论 脂联素可以增加巨噬源性泡沫细胞ABCA1转录水平, 促进胆固醇流出, 延缓AS的发生发展。

关键词：脂联素,巨噬细胞源性泡沫细胞,ABCA1,胆固醇含量

动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 是一种影响动脉血管的综合征。巨噬细胞摄入大量脂质形成泡沫细胞是动脉粥样硬化的一个早期重要特征, 因此促使细胞内脂质流出即胆固醇逆转运 (reverse cholesterol transport, RCT) 对防治AS具有重要作用。ATP结合盒转运子A1 (ATP binding cassettetransporter A1, A B C A 1) 是该过程中的一种重要转运体, 已有研究表明A B C A 1在RCT过程中与载脂蛋白结合参与高密度脂蛋白 (high density lipoprotein, HDL) 的形成, 促使细胞内多余脂质流出并运输至肝脏排出, 在细胞胆固醇代谢中起着关键的调控作用, 是RCT中的第一步也是关键的一步。脂联素 (Adiponectin, ADN) 是脂肪细胞分泌的特异性细胞因子, 它能抑制内皮细胞的炎性反应及血管平滑肌细胞增殖, 同时抑制巨噬细胞向泡沫细胞转化[1,2,3,4,5], 在肥胖相关疾病及多种心血管疾病中起保护作用。本研究旨在观察脂联素对巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达的影响及胆固醇流出的作用, 并进一步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞:

巨噬细胞株 (RAW264.7细胞) 来自本实验室。

1.2 主要材料、试剂及仪器:

人重组脂联素购自S i g m a公司, RPMI1640培养基购自武汉博士德生物工程有限公司, 胎牛血清购自杭州四季青公司, 氧化低密度脂蛋白购自北京协和三友科技开发有限公司;RT-PCR逆转录试剂盒和RNAiso购自Ta Ka Ra公司;ABCA1引物购自Abcam公司, β-actin (内参) 购自上海生物工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 泡沫细胞的制备及鉴定[6,7]:

泡沫细胞模型的建立参照文献[9, 10]进行:用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基, 于37℃、5%CO2培养箱中静置培养。待细胞长到80%满的时候, 进行传代, 传至4-5代时将生长良好的RAW 264.7细胞以2×104个/L的密度接种于6孔培养板, 培养24 h, 细胞贴壁后弃细胞液, 加入20 mg/Lox-LDL共培养48 h建立泡沫细胞模型。用油红O染色15 min, 再用60%油红O异丙醇清洗, 再立即用PBS清洗3遍, 显微镜下观察泡沫细胞形态, 显微镜下可见胞内亮红色脂滴即为泡沫细胞。

1.3.2 实验分组:

实验分为4组: (1) 对照组; (2) 加入1μg/m L脂联素组; (3) 加入5μg/m L脂联素组; (4) 加入10μg/m L脂联素组, 干预24 h。每组设3个复孔。

1.3.3 RT-PCR法检测细胞中ABCA1 m RNA的表达:

采用Trizol法提取各组细胞总m RNA, 合成c DNA第一链, 以其为模板进行扩增, 以β-actin为内参, 引物由生工生物工程 (上海) 有限公司合成。ABCA1上游引物序列为:TGGATGGATTAGATTGGACTG, 下游引物序列为TGTTGATGAGCCTGACTTC, bp为201, β-actin上游引物序列为GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT, 下游引物序列为AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT, bp为184。ABCA1反应条件为:94℃预变性2 min;94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72延伸30 s, 共35个循环;72℃再延伸5 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定, 并用Quantitity One凝胶图像分析系统分析, 以目的基因与β-actin基因区带面积积分灰度值的比值表示目的基因的相对表达量。试验重复3次。

1.3.4细胞内胆固醇含量的测定:

酶法结合高效液相色谱法测定各组细胞内胆固醇含量。RIPA裂解液裂解细胞, 使蛋白含量在100~200 mg/L。取2份各100μL, 采用酶法结合高效液相色谱法测定各组细胞内总胆固醇 (total cho-lesterol, TC) 和游离胆固醇 (free cholesterol, FC) , TC与FC的差值为胆固醇酯 (cholesterol ester, CE) , 胆固醇酯与总胆固醇的比值 (CE/TC) , 实验重复2次。

1.3.5 统计学分析:

应用SPSS13.0软件进行统计分析, 实验数据以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较采用析因设计资料的方差分析, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 泡沫细胞的鉴定:

细胞吞入脂质形成的泡沫细胞经油红O染色, 镜下可见细胞内脂质染成亮红色, 见图1、图2。

2.2 细胞中ABCA1 m RNA的表达:

RT-PCR结果显示, 与对照组相比, 不同浓度脂联素干预组ABCA1 m RNA的表达均明显升高, 且呈浓度依赖性, 见表1、图3。

2.3 不同浓度脂联素对泡沫细胞内胆固醇含量的影响:

检测结果显示, 与对照组比较, 不同浓度的脂联素干预组胆固醇含量, 均明显增高, 且呈浓度依赖性, 见表2。

1为DNAMaker, 2为对照组, 3为β-actin (184bp) , 4为1μg/m L脂联素组, 5为5μg/m L脂联素组, 6为10μg/m L脂联素组。

注:与同时间点对照组比较, aP<0.05;与同时间点1μg/m L脂联素组比较, bP<0.05;与同时间点5μg/m L脂联素组比较, cP<0.05

3 讨论

胆固醇逆转运 (RCT) 是指胆固醇从外周细胞中流出[11,12,13,14,15,16], 与载脂蛋白A-Ⅰ (Apo A-I) 结合, 形成HDL, 转运至肝脏排出的过程, 是体内抗动脉粥样硬化 (AS) 的生理性保护机制, 也是防止泡沫细胞形成的重要途径。ABCA1是ATP结合盒转运子超家族的成员, 是RCT过程中的一种重要转运蛋白, 介导细胞内胆固醇流出, 是起始步骤的关键。脂联素在心血管疾病中起保护作用, 大量研究显示脂联素具有广泛的抗AS作用, 能抑制巨噬细胞清道夫受体的表达, 促使细胞内胆固醇外流。研究发现, 冠状动脉病变的严重程度与脂联素水平呈负相关。还有研究提示, 脂联素可能对心肌肥厚具有抑制作用。在抗AS中, 脂联素可抑制血管平滑肌细胞的增殖、迁移, 促使巨噬泡沫细胞内胆固醇流出, 抑制动脉斑块形成及稳定斑块。但脂联素促使细胞内胆固醇流出上调ABCA1表达, 其机制尚不明确[17,18,19]。

注:与同时间点对照组比较, aP<0.05;与同时间点1μg/m L脂联素组比较, bP<0.05;与同时间点5μg/m L脂联素组比较, cP<0.05

本实验结果显示, 脂联素能呈浓度依赖性地上调巨噬细胞源性泡沫细胞中ABCA1基因的转录水平, 提示脂联素可能通过上调ABCA1的表达[20], 增加细胞内胆固醇流出率, 促进胆固醇外流, 从而延缓AS的发生、发展。

巨噬细胞源性泡沫细胞 篇2

1 材料和方法

1.1 材料

RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品;ox-LDL购自羽易生物科技有限公司;胎牛血清购自杭州四季青科技有限公司;MDA、SOD、T-AOC和GSH-PX试剂盒为南京建成生物工程研究所产品;牛血清白蛋白、佛波酯(PMA)、油红O等均为Sigma公司产品;实验过程中所用水均为去离子三蒸水;枸杞多糖由宁夏乐杞生物科技公司提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组

THP-1单核细胞用含100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素及10%小牛血清的RPMI 1640培养液,于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养。将培养好的细胞用PBS洗涤3次,每次于37℃水浴箱中震荡10 min,然后以含0.2%BSA的无胎牛血清RPMI1640培养液稀释细胞密度为1×106/ml继续培养,并分为三组:(1)对照组:对细胞没有任何干预;(2)ox-LDL+PMA组:培养细胞中加入终浓度为0.5mg/L的PMA、100mg/L的ox-LDL;(3)枸杞多糖低剂量组:培养细胞中加入终浓度为0.5mg/L的PMA,100mg/L的ox-LDL,500mg/L枸杞多糖;(3)枸杞多糖低剂量组:培养细胞中加入终浓度为0.5mg/L的PMA,100mg/L的ox-LDL,500mg/L枸杞多糖;(4)枸杞多糖高剂量组:培养细胞中加入终浓度为0.5mg/L的PMA,100mg/L的ox-LDL,1000mg/L枸杞多糖;各组继续培养72h。

1.2.2 油红O染色和泡沫细胞的半定量

用橡皮刮子刮下培养的细胞,低速离心制成细胞悬液,涂于干净的被有1%明胶的玻片上,自然晾干,2.5%戊二醛固定3 h,然后2.5%重铬酸钾处理16 h,新鲜配制的1%油红O染色20 min,苏木素染2 min,1%HCl分色及返蓝,各步骤间均用双蒸水冲洗干净。显微镜下观察,细胞内脂质呈红色、细胞核呈蓝色的为泡沫细胞。400倍光镜下非重复计数100个细胞,计出泡沫细胞所占的百分比。

1.2.3 细胞内脂质过氧化产物含量的分析

用橡皮刮子刮下培养的细胞,PBS洗涤3次,重悬于0.5 ml磷酸钠缓冲液(pH 7.4,0.1 M)中,超声波裂解细胞1 min,按试剂盒要求用亚硝酸盐生成抑制法测定血浆的SOD、T-AOC活性[4],按夏奕明等方法测定GSH-PX活性[5],按TBA法测定MDA的含量[6]。

1.2.4 细胞内胆固醇积聚的分析

按文献[7]用荧光分光光度法测定各样品的胆固醇浓度,测定游离胆固醇时,反应液中省去胆固醇酯酶,胆固醇酯的含量用总胆固醇与游离胆固醇的差值获得。

1.3 统计学方法

各样本测值以平均值±标准差表示。定量资料行方差分析(ANOVA)及多样本均数的两两比较(LSD);定性资料行χ2检验分析。以统计学软件SPSS 11.0进行分析,P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 枸杞多糖对泡沫细胞中SOD、MDA、T-AOC及GSH-Px活性的影响

对照组和枸杞多糖低、高剂量组中MDA含量明显低于ox-LDL+PMA组,而SOD、T-AOC、GSH-Px活性又显著高于ox-LDL+PMA组(P<0.05),提示LBP在泡沫细胞形成中能显著增强抗氧化能力。

2.2 枸杞多糖对单核细胞源性泡沫细胞数量变化的影响

THP-1单核细胞与ox-LDL培养过程中,当被PMA激活时,油红O染色阳性的细胞显著高于对照组,达到3倍以上。但是当培养过程中加入枸杞多糖时,泡沫细胞的油红O染色阳性率降低,表明枸杞多糖有抑制了细胞泡沫化形成的作用,见表2。

注:*P<0.05 vs对照组;#P<0.05;##P<0.05 vs ox-LDL+PMA组

2.3 枸杞多糖对单核细胞源性泡沫细胞内胆固醇积聚的影响

经ox-LDL处理后单核细胞内TC、FC、CE含量均增加(P<0.05),枸杞多糖低、高剂量组可减少ox-LDL+PMA所致的单核细胞内TC、FC、CE的含量的增加(P<0.05),见表3。

注:*P<0.05;**P<0.001 vs对照组;#P<0.05;##P<0.05 vs ox-LDL+PMA组

3 讨论

动脉粥样硬化(AS)是心血管疾病的一个重要的特征性基础病变泡沫细胞的形成是AS发生的早期事件和关键环节[8],在AS过程中大部分泡沫细胞来自血液循环中迁移进入的巨噬细胞,中后期病变则以泡沫细胞为主要病理细胞成分,脂质在活性氧分子的作用下LDL被氧化形成ox-LDL,ox-LDL可被单核/巨噬细胞表面的清道夫受体摄取,促使细胞内胆固醇酯的积聚,最终导致泡沫细胞的形成[9]。本实验发现LBP可抑制或减轻泡沫细胞对胆固醇酯的积聚,同时,LBP可显著增加泡沫细胞的脂质过氧化程度,显著提高泡沫细胞中SOD、T-AOC、GSH-Px的活性,降低MDA的含量,维持机体氧化及抗氧化系统的动态平衡,从而使泡沫细胞免受自由基的侵害,表明LBP具有抗动脉粥样硬化的作用。

本文的初步研究表明,LBP具有抗动脉粥样硬化作用且其机制涉及降低血脂、清除自由基、提高机体抗氧化应激能力等,但其机制有待进一步研究。

摘要：目的 探讨枸杞多糖对THP-1单核细胞源性泡沫细胞形成和胆固醇脂流出的影响。方法 将THP-1单核细胞与氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、佛波酯(PMA)、枸杞多糖共同培养,油红O染色检测泡沫细胞的形成,同时测定泡沫细胞中SOD、GSH-Px、T-AOC活性和MDA的含量,并检测枸杞多糖对单核细胞源性泡沫细胞胆固醇脂流出的影响,观察枸杞多糖对THP-1单核细胞泡沫化形成的影响及可能机制。结果 枸杞多糖抑制了ox-LDL和PMA激活的THP-1单核细胞内脂质过氧化产物的产生、胆固醇脂的积聚和泡沫细胞的形成。结论 枸杞多糖对泡沫细胞的形成和胆固醇脂流出有一定的抑制作用,其抗氧化作用是重要机制之一。

关键词：枸杞多糖,泡沫细胞,动脉粥样硬化

参考文献

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[8]Plenz GAP.Differential Modulation of Caveolin-1Expression in Cells of the Vasculature by Statins[J].Circulation,2004,109(35):e7~e8.

巨噬细胞源性泡沫细胞 篇3

1资料与方法

1.1研究对象为2013年3月—2013年12月山西医科大学第一医院心内科住院ACS患者38例,急性心肌梗死(AMI)18例,不稳定型心绞痛(UA)20例。 所有患者进行冠脉造影或心电图、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白等心肌标志物检查确诊。剔除:合并脑卒中、严重肝肾功能不全者;周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病;恶性肿瘤和风湿性疾病;合并感染性疾病以及应用炎症抑制药物如非甾体类抗炎药、类固醇及鸦片类药物等。

1.2外周血单核源性巨噬细胞分离培养按照Taylor等[3]方法培养,流式细胞术检测CD14对其进行鉴定。将磁珠分选细胞调整细胞数至2×106/mL,用含20%新生牛血清的RPMI-1640培养液重悬接种于六孔板,加入10ng/mL重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的1640培养液,培养7d后即获得单核细胞源性巨噬细胞。

1.3分组将分离培养的单核细胞源性巨噬细胞分为4组。1ACS:不加任何药物孵育24h;2氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)组:加入ox-LDL(50 mg/L) 刺激24h;3低浓度组:同时加入ox-LDL(50 mg/L, 广州中山医科大学)及10μmol/L阿托伐他汀(辉瑞公司)共刺激24h;4高浓度组:同时加入ox-LDL(50 mg/L)及40μmol/L阿托伐他汀共刺激24h。所有细胞培养均于37℃,5%CO2条件下进行,之后收集上清液冻存于-80℃备用,收集巨噬细胞用于下一步研究。

1.4实时定量RT-PCR检测Lp-PLA(2)mRNA的相对表达取收集的巨噬细胞,采用Trizol一步法抽提总RNA,利用TAKARA逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA,逆转录条件为50 ℃30 min,95℃15℃ min灭火逆转录酶;使用ABI7900实时定量PCR仪采用TAKARA SYBR-Green试剂盒进 行PCR反应。 引物均由上海生物工程公司合成,计算机分析得到Ct值。基因相对表达量以2-△△Ct值计算分析。

1.5 Western-blot法检测Lp-PLA(2) 蛋白的相 对表达BCA法测蛋白 浓度 ,Western-blot法检测Lp-PLA(2)蛋白的相对表达。

1.6 ELISA法检测细胞上清液Lp-PLA(2)及炎症因子的表达 试剂盒购 自Bender MedSystems公司。 采用双抗夹心法,标准曲线求得样品中Lp-PLA(2)、 超敏C反应蛋白(hsCRP)、单核细胞趋化因子(MCP-1)、 肿瘤坏死因子-6(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的浓度。

1.7统计学处理采用SPSS13.0统计软件,计量资料以均数±标准差( ±s )表示,各组数据进行正态性和方差齐性检验,组间均数比较采用ANOVA方差分析,两两比较用SNK法检验。P <0.05为有统计学意义。

2结果

2.1各组巨噬细胞分泌Lp-PLA(2)及炎症因子水平ox-LDL可以诱导 冠心病患 者外周血 单核细分 泌Lp-PLA(2)及炎症因 子hsCRP、MCP-1、TNF-α、 IL-6的水平 (P <0.05),而阿托伐 他汀可以 显著降低 其诱导的Lp-PLA(2)及炎症因 子分泌 (P < 0.05),且此种效应呈浓度依赖性。详见表1。

与 ACS组相比,1)P <0.05,与ox-LDL组相比,2)P <0.05。

2.2各组巨噬细胞内Lp-PLA(2)mRNA的表达ox-LDL可以诱导ACS患者外周血单核细胞源性巨噬细胞内Lp-PLA(2)mRNA的表达(P <0.01),阿托伐他汀可以显著降低其诱导的Lp-PLA(2)mRNA表达(P <0.05或P <0.01),且此种效应呈浓度依赖性。 详见图1。

2.3各组巨噬细胞内Lp-PLA(2)蛋白的表达ox -LDL可以诱导 冠心病患 者外周血 巨噬细胞Lp-PLA(2)蛋白的表 达 (P <0.01),阿托伐他 汀可以显 著降低其 诱导的Lp-PLA(2)蛋白表达 (P < 0.05或P <0.01),且此种效应呈浓度依赖性。详见图2。

3讨论

慢性炎症能增加冠状动脉疾病风险。各种炎症细胞及炎症因子的局部浸润、循环中炎症细胞的活化,血小板的活化及黏附均可导致斑块破裂及ACS发生[4]。 Lp-PLA(2)是近年来新发现的与动脉粥样硬化密切相关的新型炎症因子,它不仅具有促进动脉粥样硬化的作用,同时与斑块的易损性密切相关,可作为独立预测冠心病事件的新的危险因子[5]。

Lp-PLA(2)属于磷脂酶A2超家族成员,主要由炎症细胞分泌,与磷脂酶A2家族其余成员不同的是, Lp-PLA(2)不依赖钙离子维持其催化活性。人循环中的Lp-PLA(2)可以以与 脂蛋白颗 粒结合的 形式存在 ,其中2/3与LDL结合 ,1/3与HDL/VLDL结合 。 Lp-PLA(2)可以通过水解Sn-2位含有多不饱和脂肪酰基的氧化磷脂,使循环中LDL相关Lp-PLA(2)复合物进入内膜,在内膜LDL被氧化,LDL上的卵磷脂变成氧化卵磷脂,而Lp-PLA(2)随即水解氧化卵磷脂生成溶血卵磷脂和氧化型游离脂肪酸,后两者均为促炎介质,能刺激黏附因子和细胞因子的产生,促进单核细胞 向巨噬细 胞的转化 及泡沫细 胞的形成 , Lp-PLA(2)具有促动 脉粥样硬 化形成的 作用 。 Lp-PLA(2)还有降解血小板活化因子的作用,减轻其促进血栓形成和炎症反应的作用而发挥抗炎和抗动脉粥样 硬化的作 用 。但临床及 实验室研 究均证实 , Lp-PLA(2)在血浆中占优势的作用是很强的促动脉粥样硬化形成作用[4]。最新流行病学和临床前瞻性研究发现,冠心病事件人群与正常对照组相比Lp-PLA(2) 表达及活性显著升高,从而提出Lp-PLA(2)质量或活性升高是冠状动脉粥样硬化或冠心病事件的独立危险因子[6,7,8]。因此,抑制Lp-PLA(2)的活性为治疗血管慢性炎症,减少心血管事件的风险提供了可能。

他汀类药 物是3-羟基3-甲基戊二 酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂,作为治疗冠心病的常规用药,大量的临床试验证实他汀类具有独立于降脂作用之外的多效性作用,包括抗炎、稳定斑块、改善血管内皮、抑制血管平滑肌的增殖、抑制血栓等作用,近年来其非调脂作用已越来越受到人们的重视[9]。辛伐他汀可以 明显减少 兔动脉粥 样硬化模 型中大动 脉内Lp-PLA(2)的表达及 其活性[10]。本研究结 果显示 , ox-LDL刺激可以明显增加Lp-PLA(2)转录水平及蛋白水平的表达,而给予阿托伐他汀共刺激后可以明显抑制ox-LDL诱导的Lp-PLA(2)及炎症因子的表达, 此效应呈浓度依赖性。

在人的单核细胞源性巨噬细胞中证实,阿托伐他汀可以 通过抑制ox-LDL诱导的新 型炎症因 子Lp-PLA(2)表达而起到调节免疫反应及稳定斑块的作用。

ox-LDL可以通过诱导单核细胞产生Lp-PLA(2) 而参与了冠心病的发生发展过程。而阿托伐他汀可以抑制该效应而起到稳定斑块的作用,为深入理解其作用机制及临床科学的应用提供了理论基础。

摘要：目的 观察阿托伐他汀对急性冠脉综合征(ACS)患者外周血单核细胞源性巨噬细胞脂蛋白相关磷脂酶A2[Lp-PLA(2)]的影响。方法 入选2013年3月—2013年12月ACS患者38例,分离培养ACS患者外周血单核细胞源性巨噬细胞,分为4组:空白对照组、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)组、阿托伐他汀低浓度组和阿托伐他汀高浓度组。分别给予不同处理,收集培养细胞上清液及巨噬细胞,实时定量RT-PCR法检测巨噬细胞Lp-PLA(2)mRNA表达,Western-blot法检测巨噬细胞Lp-PLA(2)蛋白表达,ELISA法检测培养细胞上清液Lp-PLA(2)、超敏C反应蛋白(hsCRP)、单核细胞趋化因子(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)水平。结果 ox-LDL刺激可以明显增加ACS患者外周血单核细胞源性巨噬细胞Lp-PLA(2)mRNA与蛋白的表达,而阿托伐他汀可以显著降低其诱导的Lp-PLA(2)表达增加及炎症因子分泌,且该反应呈浓度依赖性。结论 阿托伐他汀抑制ACS患者外周血单核细胞源性巨噬细胞Lp-PLA(2)的表达,从而起到调节炎症反应,稳定斑块作用。

巨噬细胞源性泡沫细胞 篇4

1 材料与方法

1.1 主要药品、试剂及仪器

黄芪注射液 (成都地奥公司) ;低密度脂蛋白 (low density lipoprotein, LDL) ;佛波酯 (PMA, Sigma公司) ;胎牛血清 (杭州四季青公司) ;淋巴细胞分离液 (天津市灏洋生物公司) ;Hank’s缓冲液 (Genom公司) ;乙腈、异丙醇、正庚烷、正己烷 (美国天地公司) ;改良Lowry法蛋白定量试剂盒 (北京Applygen基因技术有限公司) ;丙二醛 (MDA) 测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所) ;超速离心机 (OptionTM L-80 XP, Beckman, USA) ;ELX800酶标仪 (BIOTEK) , Nikon Microphot-FXA倒置显微镜 (重庆光学仪器厂) , 高效液相色谱分析系统 (美国惠普公司) 。

1.2 实验方法

采用密度梯度离心法和塑料吸附法从人外周血中分离出单核细胞, 以50 nmol/L佛波酯刺激48 h使之转化为巨噬细胞。细胞分为对照组与实验组。正常人血浆LDL的制备参见文献[3,4]进行改进。 人外周血单核细胞的制备, 对常规分离单核细胞的密度分离法[5]和塑料吸附法略作改进。 PMA诱导单核细胞转化为巨噬细胞, 待上述细胞静止12 h后, 换入含50 nmol/L PMA的RPMI-1640完全培养基刺激48 h使之转化为巨噬细胞[6], 换入无血清培养液待处理[7]。

1.3 实验分组

按黄芪注射液的终浓度分为0、0.000 1mg/mL、0.001 mg/mL、0.01 mg/mL组以及ox-LDL组。首先按不同浓度黄芪注射液预处理巨噬细胞1 h, 后加入ox-LDL, 使其终浓度为80 mg/L, 共孵育24 h。由以上结果确定黄芪注射液降低细胞总胆固醇/蛋白 (TC/Pro) 比值的最佳浓度, 作出量效关系曲线;以黄芪注射液的最佳浓度预处理巨噬细胞1h后, 加入ox-LDL (80 mg/L) 共孵育不同的时间, 即0、6 h、12 h、24 h。确定黄芪注射液降低细胞TC/Pro的最佳时间, 作出时效关系曲线, 检测相关指标。

1.4 观察指标

油红O染色观察细胞内脂滴变化, 高效液相色谱分析细胞内胆固醇酯的变化[8,9,10]。

1.5 统计学处理

实验结果采用均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 组间差异进行方差分析后, 再用 t 检验。用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析, 以P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 模型的建立

2.1.1 单核细胞的形态学改变

单核细胞经50 nmol/L的PMA诱导48 h后, 10×10倍光学显微镜下观察, 部分细胞由圆形变成多角形状, 并易于聚集, 贴壁, 说明细胞已由单核细胞分化为巨噬细胞。

2.1.2 泡沫细胞模型的建立

分化成巨噬细胞的单核细胞与80 mg/L 的共ox-LDL孵育24 h, 结果显示细胞内胆固醇含量明显增加, 细胞内胆TC/Pro>50%, 且与对照组比较有统计学意义。油红O染色显示, ox-LDL处理组细胞内有大量的红色脂滴颗粒存在, 并且发现个别细胞由于吞噬的油滴过多而使得这些细胞体积增大符合泡沫细胞的形态特征, 而不加ox-LDL的组细胞内无明显红色油滴状颗粒。

2.2 不同浓度黄芪注射液干预后细胞内胆固醇含量与蛋白含量的改变

黄芪注射液在浓度为0～0.01 mg/mL, 细胞中TC/Pro随黄芪注射液浓度的增加呈剂量依赖性降低, 由24.2 mg/mL±1.1 mg/mL下降到6.0 mg/mL±1.0 mg/mL, 其中采用0.01 mg/mL的黄芪注射液处理细胞后降低细胞内TC/Pro的作用最为显著 (P<0.01) 。详见图1。

2.3 黄芪注射液处理后细胞内胆固醇与蛋白含量的改变

选定0.01 mg/mL浓度的黄芪注射液作为最佳处理浓度, 观察黄芪注射液与80 mg/L ox-LDL共同处理人单核细胞源性巨噬细胞不同的时间 (6 h、12 h、24 h) 后对细胞内TC/Pro的影响。在0 至24 h范围内, 细胞中TC/Pro随黄芪注射液处理时间的延长呈时间依赖性降低 (P<0.01) 。详见图2。

3 讨 论

黄芪具有利尿、降压、强心, 减轻蛋白尿、抗动脉粥样硬化以及增强机体免疫力等功效[11]。黄芪还被称为“生物调节剂”, 现代医学研究证明黄芪是机体自由基的清除剂和抗氧化剂, 具有调节血脂和抗动脉粥样硬化的作用。童红莉等[1]研究发现黄芪能使高脂血症大鼠血清TC、TG、LDL-C明显降低, 明显升高HDL-C, 同时能升高肝脏超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 及脂质过氧化物 (LPO) 。黄芪有良好的调脂作用和增强抗脂质过氧化的作用。

升高HDL-C治疗的潜在益处已经引起了人们的重视, HDL-C通过多种机制发挥其抗动脉粥样硬化作用, 其中最重要的是参与RCT, 阻止巨噬细胞转化为泡沫细胞, 防止胆固醇在动脉壁沉积, 并将胆固醇从血管壁运送至肝脏被清除, 但目前尚无升高HDL-C的特效方法。冠心病患者HDL-C亚组分的颗粒结构的变化亦与脾虚证密切相关[12]。中医认为脾主运化, 为后天之本, 气血生化之源。血脂乃血中之膏脂, 水谷精微和血中膏脂的化生和输布均依赖于脾的运化。脾气健旺, 运化正常, 水谷精微和膏脂输布正常, 痰浊不生, 血络通畅;血脂代谢异常可理解为脾虚失运, 痰瘀内阻。中医脾的运化和转输功能可能与HDL-C代谢及RCT有密切的关系。健脾益气和活血化痰浊的中药能降低TC和升高HDL-C[13], 也证明了这一点。为进一步揭示中医中药的作用机制, 从细胞水平观察和探讨中药黄芪的调脂机制。

本研究通过观察黄芪注射液对体外培养的人单核细胞源性泡沫细胞内胆固醇流出的影响, 发现经不同浓度黄芪注射液作用后, 细胞TC/Pro随黄芪注射液浓度的增加而呈剂量依赖性降低, 细胞泡沫化程度也随着药物浓度的升高而降低 (P<0.01) , 且在药物浓度一定的情况下, 细胞中TC/Pro比值随黄芪注射液处理时间的延长而呈时间依赖性降低 (P<0.01) 。 以上结果表明, 黄芪注射液一定程度上减轻巨噬细胞的泡沫化程度, 推测可能与其抑制巨噬细胞上SR-B1受体功能从而抑制细胞对胆固醇摄取, 或是通过增强巨噬细胞上ABCA1转运体的功能而促进了细胞内胆固醇的外流有关。本研究结果为健脾益气法能够升高HDL-C和调节RCT的假说提供了部分证据, 后续研究将进一步从分子水平和受体水平对黄芪抗AS和抑制细胞泡沫化的机制进行探讨, 为研发调节RCT的中药新药和防治冠心病提供线索。

摘要：目的观察黄芪注射液是否对人外周血单核细胞源性泡沫细胞内胆固醇外流产生作用和影响, 从机体胆固醇逆转运 (RCT) 的角度探讨黄芪的调脂机制和抗动脉粥样硬化的作用。方法采用密度梯度离心法和塑料吸附法从人外周血中分离出单核细胞, 以50nmol/L佛波酯 (PMA) 刺激48h使之转化为巨噬细胞。细胞分为对照组与实验组, 以黄芪注射液干预后分别测定细胞内总胆固醇 (TC) 、游离胆固醇 (FC) 与蛋白 (Pro) 含量的变化, 观察黄芪注射液对细胞内TC/Pro比影响的量效关系和时效关系。结果成功建立人单核细胞源性泡沫细胞模型。经不同浓度黄芪注射液作用后, 细胞中TC/Pro随黄芪注射液浓度的增加而呈剂量依赖性降低, 细胞泡沫化程度也随着药物浓度的升高而降低 (P<0.01) , 且在药物浓度一定的情况下, 细胞中TC/Pro随黄芪注射液处理时间的延长而呈时间依赖性降低 (P<0.01) 。结论黄芪注射液通过降低细胞内TC含量, 一定程度上减轻巨噬细胞的泡沫化程度, 推测可能与其抑制巨噬细胞上SR-B1受体功能从而抑制细胞对胆固醇摄取, 或是通过增强巨噬细胞上ABCA1转运体的功能而促进了细胞内胆固醇的外流有关, 或者是两者共同作用的结果。