细胞实验细胞骨架组分的荧光染色观察

2024-08-07

细胞实验细胞骨架组分的荧光染色观察（精选3篇）

细胞实验细胞骨架组分的荧光染色观察篇1

细胞生物学实验

细胞骨架组分的荧光染色观察

一、实验目的

1、掌握细胞骨架的显示方法

2、掌握荧光显微镜的使用方法

3、了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构

4、了解荧光探针Hoechst 33342（Ho.33324）与细胞成分的结合特性和光谱特性

二、实验原理

1、微丝股价是一种高度动态的三维网状结构，与细胞的多种生理活动如细胞运动、胞质分离、细胞器的定位、细胞内物质的运输、吞噬作用、细胞极性生长等密切相关。

2、鬼笔环肽(phalloidin)是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反, 只与聚合的微丝结合, 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后, 抑制了微丝的解体, 因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。

3、由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白, 因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响.此外, 较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用.因此, 用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法。

三、实验材料

1、材料：CHO（中国仓鼠卵巢细胞）

2、试剂：

（1）PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM

EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇

（2）0.5% Triton X-100溶于PEM缓冲液中。

（3）4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液中。

四、实验步骤

1、取出上次实验爬片于小盖玻片上的CHO细胞；

2、取出培养有CHO细胞的盖片，于小平皿中37℃预温 PEM洗3次(每次 1mL)； 3、37℃预温 4%多聚甲醛固定细胞15min(1mL)4、37℃预温 PEM洗3次

5、加入0.5%Triton X-100处理约10min(1mL)；

6、取一洁净的载玻片，按照其的大小在其上放置一条封口膜，在封口膜上滴加20μL 60nM Alex-phalloidin 10L湿盒中室温染色30min；

7、在parafilm 膜上加PEM，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片； 8、37℃预温 PEM洗数3次；

9、滴加10L Ho.33342复染色；

10、荧光镜下观察。【注意事项】

1、注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面；

2、各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落；

3、荧光观察注意避光操作

4、节约试剂。

五、实验结果

图一：CHO细胞微丝荧光染色图

图二：CHO细胞细胞核荧光染色图

图三：CHO细胞微丝与细胞核荧光染色叠加图

六、实验结果分析

染色后微丝呈绿色，细胞核为蓝色，染色较为清晰。但细胞数量较多，导致有些染色结果重叠。

七、思考题

1、PEM缓冲液的作用是什么？

细胞内的微丝在含有ATP和Ca2+及低浓度的Na+，K+等阳离子溶液中，趋于解聚成G-actin；而在Mg2+和高浓度的Na+，K+等阳离子溶液中，G-actin则装配为F-actin。PEM缓冲液提供高Mg环境，让单体肌动蛋白（G-actin）聚合成丝状肌动蛋白（F-actin）。同时，EGTA能螯合Ca2+，使G-actin装配成F-actin，微丝骨架保持聚合状态且较为舒张。用PEM缓冲液处理细胞，能够模拟体内环境并提高细胞骨架的稳定性。2、0.5%Triton X-100处理细胞的作用是什么？

0.5%Triton X-100处理细胞的作用是溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，增加细胞膜的通透性，使荧光染料能够更容易地透过细胞膜与F-actin特异性结合。

3、鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优缺点是什么？

（1）鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优点：鬼笔环肽的分子量小，很容易通过细胞，不需要对细胞进行冷丙酮和TRITON X-100处理。鬼笔环肽可以与聚合的微丝结合，通过让这种毒素吸附于荧光染料上面，可以研究细胞的内部工作机制，窥视细胞如何分裂。（2）鬼笔环肽用于细胞骨架研究的缺点：对细胞有毒性，价格昂贵。

参考文献：细胞生物学实验(桑建利, 谭信)

细胞实验细胞骨架组分的荧光染色观察篇2

然而, 在应用流式细胞仪检测T细胞亚群过程中, 许多因素均可以直接或间接影响检测及分析结果, 主要分为荧光染色前及染色后两方面影响因素。

本研究拟对荧光染色后的T细胞亚群检测样本, 在不同的储存时间及温度等储存条件下, 经流式细胞术检测结果的差异进行研究, 明确荧光染色后样本储存条件对计数结果的影响, 优化检测条件, 为流式细胞术T淋巴细胞亚群的临床检测工作提供参考信息。

资料与方法

被检血样:中国医科大学附属一院门诊、住院及体检中心T细胞亚群检测患者240例。按照其0:00 T细胞亚群检测结果及参考值范围分为CD4+T细胞高 (>900) 、中 (410~900) 、低 (<410) 3组, 每组80例。

检测试剂:荧光染料:EDTA抗凝负压真空采血管;CD4/CD8/CD3Tricoun T试剂;Cali BRITETM 3色微球、APC微球;10×免洗溶血素;绝对计数管;Tru COUNT质控微球;鞘液。

检测仪器:流式细胞仪 (FACScalibur) ;Ⅱ级生物安全柜NU425-400E;旋涡震荡器;电动移液器;20μL、200μL和1 000μL加样器。

流式细胞仪校准:为保证实验准确性, 本实验室使用Cali BRITETM 3色微球和APC微球校准流式细胞仪, 使用Tru COUNT质控微球 (包括低、中、高3种微球) 进行室内质控, 检测仪器的准确性, 并参加国际 (UKNEQUS) 及国家CD4+T淋巴细胞检测的质控项目。

T淋巴细胞计数:将20μLBD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 Per CP试剂加入绝对计数管中, 逆向加入50μL混匀的抗凝全血, 室温避光15 min, 加入1×免洗溶血素450μL, 室温避光15 min, 应用FACS Calibur流式细胞仪进行检测, Multi SET软件分析结果, 得到CD4+T淋巴细胞的绝对值。将检测后样本分别于室温 (18~24℃) 和4℃避光放置6 h、24 h、48 h、72 h后重新上机 (流式细胞仪) 进行T细胞亚群计数。

统计学方法:应用SPSS 11.5软件包进行统计, 结果进行配对t检验分析。P<0.05为有差异统计学意义。

结果

血样经染色后, 在常温下检测结果:CD4+T淋巴细胞在410~900个/μL时, CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞放置24 h即出现改变 (P<0.05) , 而CD4+T淋巴细胞在<410个/μL和>900个/μL时在放置72 h后出现变化 (P<0.05) , CD8+T淋巴细胞随时间没有显著变化 (P>0.05) , 见表1。

血样经染色后, 在40℃下检测结果:CD4+T淋巴细胞在<410个/μL时CD3+T淋巴细胞24 h即出现变化, CD4+T淋巴细胞在48 h后出现变化, 见表2。

讨论

T淋巴细胞是人体内重要的免疫细胞, 主要参与细胞免疫。而CD4+T细胞和CD8+T细胞是T淋巴细胞系统重要的组成部分。CD4+T细胞的作用有抗瘤作用[4], 是艾滋病辅助诊断、判断疾病进程、抗病毒治疗效果及预后的主要检测指标[5]。CD8+T淋巴细胞除行使杀伤效应外, 亦具有强烈的调节效应, 并可类似于Th1/Th2而分化出Tc1/Tc2, 从而参与针对癌症、病毒、胞内菌和自身免疫病的调节[6]。因此, T淋巴细胞的准确检测对疾病的进程及指导用药有非常重要的意义。由于条件的限制, 有时不能对其进行及时检测而影响结果, 本实验由于条件制约只是简单进行分析, 结果反映出了常温条件下更影响T淋巴细胞计数的检测。本实验有足够的样本进行检测, 更好地避免了抽样误差的出现。因此, 可以对日常检测提供一些存储条件的依据, 从而保证T淋巴细胞检测的准确性。但本实验只是对已经标记后的血样进行分析, 没有解答未标记样本存储条件对检测结果的影响, 这是进一步工作的基础。

参考文献

[1]王兰兰.临床免疫学与检验[M].北京:人民卫生出版社, 2007:118-119.

[2]Schellekens PT, Koot M, Roos MT, et al.Immunologic and virologtic markers determining progression to AIDS[J].Netherlands Journal of Medicine, 1994, 45 (6) :238-243.

[3]Pattanapanyasat K, Thakar MR.CD4+T cell count as a tool to monitor HIV progression&anti2retroviral therapy[J].Indian J Med Res, 2005, 121 (4) :5392-5491.

[4]黄辉, 俞红, 林云璐, 等.CD4+T细胞的抗肿瘤作用[J].国外医学免疫学分册, 2000, 23 (1) :81-82.

[5]陈艳芝, 陈紫微, 林云璐, 等.艾滋病抗病毒治疗疗效检验指标的研究及应用[J].中华中西医杂志, 2010, 11 (6) :981-982.

细胞骨架的观察篇3

细胞骨架的观察

姓名：邓燕玲学号：201011202912 专业：生命科学生物科学实验时间：20121030 指导老师：张伟同组同学：张丽华

细胞生物学实验

实验目的

1.了解细胞骨架的组成、结构和功能。2.学习细胞骨架标记的原理和方法。3.学习用鬼笔环肽标记微丝的方法步骤。

4.观察小鼠胚胎成纤维细胞和中国仓鼠卵巢细胞的细胞微丝骨架。5.讨论细胞骨架在中学中教学的重点与难点。

实验原理

1.细胞骨架一般是指真核细胞质内的蛋白质纤维网架系统。广义大的细胞骨架包括细胞膜骨架、细胞核骨架和细胞质骨架。直至1963年，科学家用戊二醛在室温下固定成功后，人们才广泛地观察到各类细胞骨架纤维的存在。细胞骨架包括微管、微丝和中间纤维。不同成分有不同的结构和功能。细胞骨架处于不断地动态平衡中，并且有极性。2.微丝的标记方法可分为在固定细胞中标记和在活体中标记。本实验采用的是固定细胞标记，主要运用带荧光探针的抗体或鬼笔环肽标记，这需要对样品进行化学固定和膜的通透。

3.荧光探针是一种标记物，其中包含的荧光物质在从外界吸收能量后变成激发态，在回到基态时以电磁波的形式释放能量，从而产生荧光。荧光物质在受到长时间的照射后会淬灭。

4.鬼笔环肽（phalloidin）是一种剧毒生物碱，能结合F-actin，而不与G-actin结合，并且在结合后可以抑制微丝的解聚，破坏微丝聚合和解聚的动态平衡。鬼笔环肽对细胞有毒害作用，因此不利于活体细胞的研究。

5.荧光显微镜是用于观察和分析样品中产生的荧光物质的成分和定位的一种光学显微镜，荧光物质在受到激发光的激发下，会发出比激发光波长更长的光，从而在显微镜下观察。

实验器材

1.材料：小鼠胚胎成纤维细胞、CHO中国仓鼠卵巢细胞

2.试剂：PEM缓冲液（50 mM pipes,5 mM EGTA, 5 mM MgSO4, 0.225M 山梨醇），0.5 % Triton X-100（溶于PEM缓冲液），4%多聚甲醛（溶于PEM缓冲液），55nM Alex-phalloidin 3.器械：荧光显微镜实验步骤

1.将小培养皿中的培养液用移液枪吸掉，加入预热的1mlPEM清洗，注意不要打在盖玻片

细胞生物学实验

上，洗三次。

2.加入1ml37°C预热的0.5 % Triton X-100，放置10min。3.加入预热的1mlPEM清洗，洗三次。4.加入预热的4%多聚甲醛1ml，放置15min。5.加入预热的1mlPEM清洗，洗三次。

6.剪下一段与载玻片宽度一样的封口膜，将封口膜包在在玻片上，在玻片上的封口膜上加10L的 55nM Alex –phalloidin，将载玻片有细胞的一面朝下盖片，在暗盒中静置25min。7.用37°预热的PEM洗三次，将载玻片有细胞的一面朝上转移到一个新的载玻片中，在荧光显微镜下观察并拍照。

实验结果思考题