细胞毒性实验方案

细胞毒性实验方案（共8篇）

细胞毒性实验方案 篇1

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细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结-CCK-8 法

实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

一、用途：

药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。

二、优点：

1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； 2.CCK-8法能快速检测；

3.CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度； 4.CCK-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；

5.而本方法产生的formazan是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；

6.CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；

7.CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

三、所需设备及仪器：

1.10ul，100-200ul及多通道移液器 2.酶标仪（带有450nm滤光片）3.96孔培养板

4.二氧化碳培养箱

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四、方法及步骤：

实验一：细胞增殖分析

1、制备细胞悬液：细胞计数。

2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基（现用现配），以换液的形式加入。

5、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件（建议预实验先摸清楚时间点）。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。

6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

实验二：细胞毒性分析

1、制备细胞悬液：细胞计数

2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约≥5×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。

4、加入不同浓度的毒性物质。5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间（例如：6、12、24、48、60、72小时）。

6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。

7、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。

8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

五、实验注意事项：

·若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

·如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

·当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔(100 μl 培养基)。检 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物

测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔(100 μl 培养基)。

·酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

· CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。

· CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。

·当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔加培养基或者PBS，不作为测定孔用。

·在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。

·金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。

·悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。

·加入CCK-8 时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或pH 值已变化，建议换用新鲜的培养基。

·用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定，且要擦拭干净样品板了。

六、经验总结及分享：

CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。但无论如何，做这个试验一定要摸条件。你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。以下言论全部以细胞毒性试验为前提，如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。

摸条件包括

1、种板数；

2、种板后细胞的贴壁生长时间；

3、加药后的孵育时间；

4、cck8试剂加入量；

5、cck8试剂加入后细胞孵育时间。看起来很多，其实这就是一个实验。而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和CCK8。

1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人有无做过，把范围大致找出。记住还要参考说明书，这个很重要。然后稀释一系列浓度种板。首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全，一般贴壁生长24小时。然后还有在你的实验时间内，不同细胞数下孔内生长情况。比如我拟定考察4天的时间，那么在4天内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？因为每块板都会设置对照孔，也就是含有细胞的培养基+CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物

值在1.0附近，所以这个最大数值最好能控制在1.0左右。我的实验经验是不要让细胞长满，一旦长满了很难去判断是否堆积生长了，对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一，其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大，而且OD值也很大。

2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了，这个时间细胞已经贴壁完全，而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便。没人愿意大半夜爬起来做实验吧。

3、加药后的孵育时间，我的实验摸了3个时间，24h，48h，72h。然后根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了，细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。

4、CCK8试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10%。这里有一个问题：假设我要孔内是200微升的体系，即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢，还是细胞悬液+药液=200微升，cck8不算在体系内呢。关于这一点文献报道不一致。本人最终采用的是后者。

5、cck8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再说一下关于种板设置问题。众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。一般每组样品我会设置6个复孔，得到的OD值去掉最大值与最小值，其余取平均值。我用的是排枪，会省很多力气，但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液枪和选用最适枪头了。

做这个实验我想大家遇到的最大问题应该是数据不稳定，组内数据偏差大。讲了很多怎样摸条件，其实就一个原则，把OD值控制在1.0左右。数据不稳定也只能通过增大样品数，借助数据处理来弥补。还有实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。

补充

突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题。比如孔里不能有气泡，如果有气泡，就用吸耳球吹掉，气泡会很影响检测结果。样品板要擦拭干净，当然了，盖子一定要记得拿掉啊Big Smile补充说明：这几天有同学提出了一个问题，这个问题非常好也非常关键：将OD值控制在1.0这个说法是否有依据？

这里我还是想提醒大家一定要认真阅读试剂盒的说明书，试想一个试剂盒的上市并且作为技术手段得到认可需要经过多少试验反复验证。我购买的是同仁化学研究所的CCK8试剂盒，说明书的P7Q23：OD值在什么范围比较合适？答：一般情况下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比较好。

再说到自己的实验设计，酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一样的，所以UV上很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用。这就能够理解为什么不能有气泡，为什么要擦拭干净样品板了。再者熟悉UV原理的同学会了解利用紫外检测有一个最佳检测范围，超过了这个范围，数值就会呈现出不稳定，无规律。（大家可以把自己的数据统计分析看看是不是数值控制在1.0附近更稳定。）而更有甚者就是超出了仪器的检测范围，仪器读数为—。一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物

我在摸条件的时候，cck8加入2.0h后检测就出现过酶标仪读不出数据的情况。

细胞毒性实验方案 篇2

1 实验材料

1.1 药物与试剂

黄药子:购于黑龙江省药材公司, 产地:河北, 经黑龙江省药检所鉴定为薯蓣科植物黄独 (Dioscorea bulbifera L) 的块茎。当归:购于黑龙江省药材公司, 产地:安徽, 鉴定为伞形科植物当归 (Angelica sinensis Diels) 的干燥根。谷丙转氨酶试剂盒 (GPT) 、 谷草转氨酶试剂盒 (GOT) 、乳酸脱氢酶试剂盒 (LDH) :均由南京建成生物工程研究所提供。四甲基偶氮唑盐 (MTT) :美国Sigma。二甲基亚砜 (DMSO) :AMRESCO。DMEM培养基:GIBCO公司产品。胎牛血清 (NBS) :杭州四季清公司。胰蛋白酶:美国Sigma公司。

1.2 实验动物

雄性SD大鼠, 体重 (200±20) g, 购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。许可证号:SCXK (沪) (2003-0003) 。

1.3 实验仪器

HF90 CO2培养箱:上海。超级洁净工作台:北京。CKX41倒置显微镜:Philippines。酶标仪:Austria。 Lisa 300全自动生化分析仪。KDC-160HR高速冷冻离心机:安徽合肥。

2 实验方法

2.1 药物的制备

黄药子饮片头煎10倍量水, 二煎8倍量水浸泡后煎煮2次, 合并煎液, 浓缩, 超速离心8000r/min, 3小时, 继续浓缩至每ml含生药材1.0g, 冷冻干燥制成粉末。用时用蒸馏水溶解稀释至所需浓度。黄药子与当归 (1:2) , 依上法煎煮制备。

2.2 含药血清的制备

雄性SD大鼠, 随机分为3组:黄药子 (0.4g/kg) 组、黄药子配伍当归组 (1.2g/kg) 和空白组。各组连续给药3天, 最后一天全天量一次灌胃后1小时, 1%戊巴比妥钠麻醉, 经肝门静脉取血, 离心后吸取上清液, 经56℃、30分钟灭活处理, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃保存备用。

2.3 肝细胞的分离及培养

取SD大鼠, 无菌条件下剖腹取出肝脏, 生理盐水漂洗, 用剪刀剪成约为1mm3大小的碎块。移入0.25%胰蛋白酶中4℃冷消化, 经200目筛网研磨、过滤, 用PBS缓冲液吹打后获单细胞悬液。置离心管中离心5分钟, 弃去上清液, 离心。沉淀为肝实质细胞, 再以含10%胎牛血清的 DMEM培养液悬浮细胞, 分离的肝细胞经0.4%苔盼蓝拒染法测得细胞活力大于90%。调整细胞密度为 ( 3～5) ×104个, 并将肝细胞悬液加入96孔培养板与培养瓶内, 置于5%CO2培养箱中培养, 待肝细胞贴壁生长后, 供实验用。

2.4 肝细胞形态学观察

在倒置显微镜下观察分离的肝细胞形态

2.5 细胞毒性检测

贴壁生长的肝细胞, 弃去原培养液, 加入含药血清和空白血清, 使其血清终浓度为20%, 于37℃、5%CO2培养箱孵育24、48、96小时后收集培养上清液, 按试剂盒说明检测GPT、GOT、LDH活性;同步以MTT (5mg/ml) 的培养液, 继续培养4小时后, 弃去培养液, 加入DMSO 200μl/孔, 旋涡震荡器上震荡10分钟, 使结晶物充分溶解, 于490nm波长处用酶标仪测0D值。记录结果。计算细胞相对存活率。存活率 (%) =含药血清组OD值均数/空白血清组OD值均数×100%。

2.6 统计学方法

各组数据均用undefined表示, 应用SPSS14.0统计软件进行t检验。

3 实验结果

3.1 肝细胞形态观察

倒置显微镜下观察新鲜分离的肝细胞为透亮圆形, 呈单个分散状态, 细胞直径约2μm, 细胞边界轮廓清晰。贴壁生长的肝细胞呈典型的上皮细胞样多角形, 胞体变平变薄, 体积明显增大, 细胞间开始出现岛状连接, 少数活力差的细胞悬浮于培养液中, 换液时可除去。见图1～2。

3.2 体外肝细胞毒性检测结果

3.2.1 各组肝细胞存活率的观察

黄药子对正常大鼠肝细胞有明显细胞毒性, 其不同时间的存活率分别为85.86%、59.95%、55.65%。在48小时存活率明显下降, 而72小时趋于稳定, 呈现一定的时效关系。配伍组与空白组无显著性差异 (P>0.05) , 结果见表1。

与空白组比较△P<0.05, △△P<0.01;与黄药子组比较*P<0.05, **P<0.01

3.2.2 各组肝细胞培养液GPT、GOT、LDH活性测定

黄药子组GPT、GOT、LDH水平明显升高, 与空白血清比较有显著差异 (P<0.01) , 与当归配伍组GPT、GOT、LDH水平明显下降, 与空白组比较无明显差异, 结果见表2。

与空白组比较△P<0.05;△△P<0.01;与黄药子组比较*P<0.05, **P<0.01

4 讨论

黄药子对肝脏具有毒性, 其毒性严重制约了其临床疗效的发挥。中医学认为, 当归味甘温补, 擅活血补血, 扶助正气及补益阴血, 从而监制黄药子之苦寒伤阴之弊。有研究发现[4]当归配伍黄药子后, 可明显减轻黄药子对肝细胞的损害程度, 并且对肾脏的损害也有一定的缓解作用。目前, 临床医生也擅用黄药子配伍当归, 经临床验证, 很少发生毒副作用。因此, 黄药子配伍当归是制约黄药子毒性的有效手段。

近年来中草药引起的肝中毒屡见不鲜, 并呈逐年上升趋势。肝脏是人体重要的消化和代谢器官, 也是研究药物毒性的重要靶器官。目前, 肝脏体外模型发展很快, 其中原代肝细胞模型最为常用, 并被认为是药物临床前毒性检测的可靠模型。肝细胞培养模型主要包括游离肝细胞和原代肝细胞培养模型。主要特点是可以结合细胞功能和细胞毒性的研究方法来研究药物的肝脏作用机制。但目前肝细胞培养模型的稳定性问题也是研究者研究的重点, 有研究表明, 有3种因子可以维持原代肝脏细胞功能的稳定性, 即可溶性因子、细胞外基质成分和细胞间的相互作用[5]。因此, 研究者应不断改善肝脏体外模型的培养条件, 尽可能地维持肝脏细胞在体外的功能, 同时将肝脏细胞体外模型应用于长期毒性实验和致癌实验。目前, 原代肝细胞模型已成为体外药物实验的“金标准”[6], 并广泛应用于药物代谢和毒理学研究中。本实验采用原代肝细胞培养进行黄药子的肝毒性研究, 结果发现黄药子对正常大鼠肝细胞有明显细胞毒性, 其24、48、72小时的存活率分别为85.86%、59.95%、55.65%, 而配伍组与空白组无显著性差异。黄药子对肝细胞有损伤作用, 不仅引起肝细胞的存活率下降, 还可以引起细胞内LDH、 GPT、GOT泄漏, GPT和GOT为肝细胞受损的特征性酶谱, LDH活性的升高提示细胞膜完整性受损, 说明黄药子具有潜在肝毒性。配伍组LDH, GPT, GOT的活性受到抑制, 说明当归具有一定的防护作用。

参考文献

[1]刘树民, 李玉洁, 罗明媚.当归对黄药子的减毒作用.中西医结合肝病杂志, 2004, 14 (4) :216.

[2]刘树民, 张琳, 李颖.黄药子与当归配伍对大鼠肝脏CYP1A2、CYP2E1mRNA表达的影响.中药药理与临床, 2006, 22 (3～4) :97.

[3]索晴, 崔立然, 刘树民, 等.黄药子及配伍当归含药血清抗肿瘤作用的研究.中国中医药科技, 2008, 15 (2) :113.

[4]丁国明, 唐迎雪.当归对黄药子解毒作用的实验观察.中草药, 1992, 23 (4) :192.

[5]Li AP.Primary hepatooyte culture as aninvitrotoxicological systemof the liver.In:Edited by Shayne CG.In Vitro Toxicology.New York:Raven Press, 1994:195.

实验室毒性试剂自查报告 2 篇3

自接略卫发【2013】6号文件起，检验科主任高度重视，带领大家把临检室生化室免疫室各个试剂柜逐一再次统一归类，未发现以下毒性试剂：

致癌物质

黄曲霉素B1、亚硝胺、3-4苯并茈等（以上为强致癌物质）；2-乙酰氨基酸、4-氨基联苯、联苯胺及其盐类、3，3-二氯联苯胺、4-二甲基氨偶氮苯、1-萘胺、2-萘胺、4-硝基联苯、N-亚硝基二甲胺、β-丙内脂、4，4-甲叉（双）-2-氯苯胺、乙撑亚胺、氯甲甲醚、二硝基萘、羧基镍、氯乙烯、同苯二酚、二氯甲醚等。

剧毒

六氯苯、羧基铁、氰化钠、氢氟酸、氯化氰、氯化汞、氢氰酸、砷酸汞、汞蒸气、砷化氢、光气、氟光气、磷化氢、三氧化二砷、有机砷化物、有机磷化物、有机氟化物，有机硼化物、铍及其化合物、丙烯腈、乙腈等。

高毒

氟化钢、对二氯苯、甲基丙烯腈、丙酮氰醇、二氯乙烷、三氯乙烷、偶氮二异丁腈、黄磷、三氯氧磷、五氯化磷、三氯化磷、五氯化二磷、三氯甲烷、溴甲烷、二乙烯酮、氯化亚氮、铊化合物、四乙基铅、四乙基锡、三氯化锑、溴水、氯气、三氧化二钒、二氧化锰、二氯硅烷、三氯甲硅烷、苯胺、硫化氢、硼烷、氯化氢、氟乙酸、丙烯醛、乙烯

酮、氟乙酰胺、碘乙酸乙脂、溴乙酸、乙酯、氯乙酸乙酯、有机氰化物、芳香胺、迭氮钠砷化钠等

中毒

苯、四氯化碳、三氯硝基甲烷、乙烯吡啶、三硝基甲苯、五氯酚钠、硫酸、砷化镓、丙烯酰胺、环氧乙烷、环氧氯丙烷、烯丙醇、二氯丙醇、糖醛、三氟化硼、四氯化硅、硫酸镉、氧化镉、硝酸、甲醛、甲醇、胼（联氨）、二硫化碳、甲苯、二甲苯、一氧化碳、一氧化氮等。

低毒

三氯化铝、钼酸胺、间苯二胺、正丁醇、叔丁醇、乙二醇、丙烯酸、甲基丙烯酸、顺丁烯二酸酐、二甲基酰胺、已内酰胺、亚铁氰化钾、铁氰化钾、氨及氢氧化胺、四氯化锡、氯化锗、对氯苯氨、硝基苯、三硝基甲苯、对硝葳氯苯、二苯甲烷、苯乙烯、二乙烯苯、邻苯二甲酸、四氢呋喃、吡啶、三苯基磷、烷基铝、苯粉、三硝基酚、对苯二酚、丁二烯、异戊二烯、氢氧化钾、盐酸、氯磺甲、乙醚、丙酮等。

强酸

硫酸 盐酸 硝酸

强碱

氢氧化钠

氢氧化钾

开展实验室毒性试剂的清理整治工作，对我科试剂管理工作的进一步促进和完善起着非常重要的意义，我科将严格按照实验室管理规定，逐条逐项学习，把此项工作落实到实处。

略阳中医院检验科

细胞工程实验报告 篇4

实验一 培养基母液的配制

一、实验目的

通过配置MS培养基母液，掌握母液的配置和保存方法 二、实验原理

配置培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配置，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配置即可。三、实验材料、试剂和仪器设备 1.试剂

NH4NO3 ,KNO3 ,KH2PO4 ,CaCl2·2H2O ,MgSO4·7H2O,FeSO4·7H2O Na2-EDTA,MnSO4·4H2O,ZnSO4·7H2O，KI,CuSO4·5H2O,CoCl2·6H2O,肌醇，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸，蒸馏水NAA,6-BA 2.仪器设备

电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml、1000ml）量筒（1000ml、100ml、25ml），容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，试剂瓶，玻璃棒数支，药芍，称量纸等。

四、实验步骤 1 大量元素母液的配制

先用量筒称量适当蒸馏水放入500ml烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3 ,KNO3 , KH2PO4 , MgSO4·7H2O, CaCl2·2H2O，待第一种化合物完全溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液转移至500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至500ml，然后转移至细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。2 微量元素母液的配制

按照配方表中用量用电子天平依次称取MnSO4·4H2O, ZnSO4·7H2O H3BO3, KI, Na2MoO4·2H2O，CuSO4·5H2O, CoCl2·6H2O,按制备母液I的方法逐个溶解，转移至容量瓶中，然后定容至500ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。3铁盐母液的制备 把FeSO4·7H2O和Na2-EDTA分别置于适量蒸馏水中，加热搅拌使之完全溶解，保持加热，把FeSO4倒入Na2-EDTA溶液中并搅拌，接近沸腾时停止加热，冷却后调PH到5.5，将溶液转移至500ml容量瓶中，用蒸馏水定容至500ml，转入细口试剂瓶中，用力振荡1～2min，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。4有机化合物母液的制备

按配方表中用量依次称取：维生素B, 烟酸, 甘氨酸，用蒸馏水溶解后定容后，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。5植物生长物质母液制备

NAA母液:准确称取20mg,先少量95%乙醇引溶后加水定容至100ml,即配制成0.2mg/ml的NAA母液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存备用。6–BA母液配制方法相似，浓度为2mg/ml。

五、试验结果分析及注意事项 配制母液时注意药品只能出不能进。

实验二 培养基的配制与灭菌 一、实验目的

学习母液法配制培养基以及掌握培养基灭菌的方法 二、实验原理

组织培养所用的培养基含有植物生长所必需的各类营养物质，同时也是微生物繁殖的极好场所，因此必须对培养基灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。三、实验材料、试剂和仪器设备

1.试剂： 琼脂，蔗糖，蒸馏水，1mol/L NaOH,各类母液

2.仪器设备：电子天平，烧杯，量筒，移液管，玻璃棒，药芍，称量纸，PH试纸，锥形瓶瓶等。

四、实验步骤

1.将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿放在指定位置 2.取50ml烧杯一个，将大量、有机、肌醇、镁盐，钙盐、按配方表中的用量依次称取并倒入烧杯中。.取 50ml烧杯一个，将微量和铁盐按配方表中的用量称取并倒入烧杯中。4.取瓷盆一个，加入300ml蒸馏水，置于电磁炉上加热，称量琼脂6克，白砂糖 40 克，依次倒入瓷盆中，待琼脂和白砂糖完全溶解后，将称量好的所有母液倒入瓷盆中，用玻璃棒不断搅拌，并定容至 1 L。5.用1mol/L NaOH调PH 至 5.8 6.把培养基分装到广口瓶中，用牛皮纸包扎好，待灭菌。7.培养基灭菌

五、试验结果分析及注意事项

配制培养基前先大致估计一下药品数量，不够时提前配制。培养基灭菌时注意要放干净冷空气。

实验三 愈伤组织的诱导

一、实验目的

通过实验，初步掌握外植体材料消毒及在超净工作台上接种的方法与注意事项 二、实验原理

植物细胞具有全能型，其外植体接种在无菌的人工培养基上，能长成完整的无菌植株。

三、实验材料、试剂和仪器设备

超净工作台、培养基，大号镊子，剪刀，酒精灯，喷雾器

四、实验步骤

1.准备 打开超净工作台，用紫外灯烧2h,关闭紫外灯，将灭菌溶液，无菌水，豌豆，大烧杯等放入超净工作台，在台上点燃2个酒精灯。

2.灭菌 在超净工作台上取经浸泡处理的豌豆，先用84消毒液摇晃清洗清洗3次，每次5分钟，后用0.5%HgCI摇晃清洗，处理2次，每次5分钟。后用无菌水摇晃清洗3次。

3.接种 将灭菌处理好的材料在超净工作台上用镊子靠近酒精灯的外焰放入倾斜的锥形瓶杯中，每个瓶内装5粒豌豆，接种过程中锥形瓶应一直保持倾斜，直到接种完毕盖上棉塞。

4.接种完毕后，用棉线绑好用铅笔标上制作人编号。

五、试验结果分析及注意事项

注意事项： 做本次实验时在豌豆灭菌时注意升汞、酒精灭菌时间应严格注意，过长会对种子活性造成影响 实验图片见图1。

实验四 组织培养芽、根诱导

一、实验目的

通过诱导豌豆根、茎、叶形成愈伤组织 学习愈伤组织的建立方法 二、实验原理

细胞全能性，已经分化的植物细胞在适宜条件下可脱分化形成愈伤组织。三、实验材料、试剂和仪器设备

超净工作台、无菌豌豆苗、培养基、剪刀、喷雾器

四、实验步骤 准备歩骤同实验三

接种 在超净工作台外用酒精将装无菌豌豆苗的锥形内灭菌。用灭菌后的弯头剪刀分别剪取长势良好，无病菌污染的豌豆的根、茎、叶每个锥形内各接一种，每种接3瓶。

标记 将接种好的锥形瓶标记，根为R,叶L,茎S。标记好后放置在暗处。

五、试验结果及注意事项

注意事项

1、接种根时注意取接近根尖但不能直接是根尖部分

2、接种时总体为接种材料大小越少越好，越有利于愈伤组织的形成

细胞生物学实验报告 篇5

1、通过对原核和真核各种形态细胞的光学显微镜观察，了解细胞的形态及其显微结构;

2、学习显微测量的方法，对细胞的大小有一直观认识。

二、实验材料和仪器：

小白鼠肝细胞切片;鸡血红细胞;蚕豆叶片横切片;

普通光学显微镜;目镜测微尺;镜台测微尺;载玻片;盖玻片。

三、实验步骤：

(一)细胞形态观察

l、动物细胞的观察

(1)人肝细胞切片：在显微镜下仔细观察肝细胞的形态构造。

(2)鸡血细胞涂片的观察：观察血细胞的组成;红细胞、白细胞、血小板的形态特点。

2、植物细胞的观察

取蚕豆叶片横切片的观察：注意表皮细胞和叶肉细胞的基本结构。

(二)细胞的大小和测量

1、卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺刻度向下装在目镜的焦平面上，再旋上目镜的上透镜。

2、将镜台测微尺刻度向上放在镜台上夹好，使测微尺分度位于视野中央。调焦至能看清镜台测微尺的分度。

3、小心移动镜台测微尺和转动目镜测微尺(如目镜测微尺分度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦)，使两尺左边的一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重合的直线。

4、记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每格等于多少μm：

镜台测微尺的格数

目镜测微尺每格的微米数=————————— × 10

目镜测微尺的格数

四、实验结果：

1、目镜校正：40倍显微镜目镜测微尺每格的微米数=17/70=0.24

2、细胞大小的测量：

五、作业与思考：

1、血细胞按含量高低，主要含有：红细胞，白细胞，血小板。

白细胞最大，红细胞次之，血小板最小。红细胞：主要的功能是运送氧。 白细胞：主要扮演了免疫的角色，当病菌侵入人体时，白细胞能穿过毛细血管壁，集中到病菌入侵部位，将病菌包围，吞噬。血小板：止血过程中起着重要作用。细胞形态见下图。

2、植物细胞一般比动物细胞大一些。形态图见下。

细胞毒性实验方案 篇6

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验细胞选取L929小鼠成纤维细胞株,购自中国科学院上海细胞所。主要药品与试剂:RPMI1640培养液(GIBCO,USA),胎牛血清(杭州四季青生物工程公司),MTT(AMRESCO,USA),DMSO(AMRESCO,USA)。

1.2 试验方法

1.2.1 MTT(四唑盐)比色法

取无菌型与消毒型医用超声耦合剂,按照1 mg/mL、5 mg/mL、25 mg/mL、100 mg/mL及200 mg/mL的比例分别加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,并置于37 oC放置24 h制备浸提液。取高密度聚乙烯浸提液作为阴性对照品;5%的DMSO溶液作为阳性对照。将培养至近汇合的L-929细胞消化,稀释为1×104 U/mL与1×105 U/mL,分别接种于96孔培养板中,每孔加入100μL。在37 oC、5%CO2培养箱中培养24 h,待细胞贴壁后将每孔中原培养液吸除。空白对照组加新鲜培养液200μL,各组加样品200μL:阴性与阳性对照样品浸提液,置CO2培养箱中继续培养。于更换培养液后的24 h将细胞接种密度为105个的培养板取出,置倒置显微镜下观察细胞形态。并每孔加入20μL质量浓度为5 g/L的MTT溶液,继续培养4 h后弃去孔内液体,加入200μL DMSO,置振荡器上振荡10min后,选择570 nm在ELX800UV型酶标仪上测定光密度(optical density,OD)值,按以下公式计算相对增殖率(relative growth rate,RGR):RGR=试验组吸光度值/对照组吸光度值×100%,并判定细胞毒性级别。

于更换培养液后的72 h将细胞接种密度为104个的培养板取出重复以上MTT试验。

1.2.2 琼脂覆盖法

将培养至近汇合的细胞稀释成2.5×105 U/mL接种于6孔培养板中,设阴性对照组、阳性对照组及样品组,每组设3个平行样,各孔加入2 mL,放于CO2培养箱中培养至近汇合状态。将溶化的琼脂培养基与2倍浓缩的含10%血清的RPMI 1640培养基等比混合制成混合琼脂培养基,使琼脂的最终浓度为2%。弃去上清后每孔加入2 mL混合琼脂培养基,待琼脂层凝固后,分别加入2 mL新鲜配制的0.01%中性红活体染色剂,置于暗处染色20 min后取出,吸除多余的染色剂,分别取无菌型及消毒型医用超声耦合剂均匀涂布于无菌滤纸片上并放置于固化的琼脂层上,样品约覆盖细胞层表面十分之一,阴性对照选用直径约5 mm、厚约2 mm的高密度聚乙烯圆片,阳性对照选用直径约5 mm用20%苯酚溶液浸湿的医用明胶海绵,置CO2培养箱中继续培养24 h后于倒置显微镜下观察细胞溶解及褪色的情况,并对细胞毒性的级别进行判定。

1.3 数据处理

数据以平均值±标准误(Mean±SEM)表示,用计算机统计软件包Statistica对数据作Students’t检验,确定差异显著性。

2 结果

2.1 MTT(四唑盐)比色法

表1、表2分别为无菌型医用超声耦合剂在不同的浸提比例情况下,不同接种密度对L-929细胞增殖度的影响与细胞毒性的级别。由表1可以看出,在细胞接种密度为104 U/mL时,超声耦合剂对L-929细胞的增殖率存在影响。在浸提比例为1 mg/mL、5 mg/mL时,细胞毒性反应为1级、2级,而当浸提比例超过5mg/mL时,耦合剂对细胞的毒性作用极其显著,达到3、4级。表2显示,当细胞密度为105 U/mL时,浸提比例达200 mg/mL时,无菌型超声耦合剂才对细胞有显著的毒性作用,细胞毒性达3级。

2.2 琼脂覆盖法

表3显示,用琼脂覆盖法检测无菌型医用超声耦合剂的细胞毒性为1级。

3 讨论

临床操作中,普通(外用)耦合剂需与皮肤、探头辐射面密切接触,故除声学特性外,耦合剂还须满足不刺激皮肤、不损坏探头、不脏污衣物的要求。随着医学的发展,医用超声耦合剂的配方已几经更新换代,现国内正式生产的产品多为卡波姆凝胶型,除了在完好皮肤上使用的通用型制剂外,还有用于腔内和术中的无菌型凝胶制剂,少数企业已研制生产了消毒型制剂。为了保证临床使用的安全性,新版的医用超声耦合剂标准按照生物学评价的思路,将老版本上的“卫生要求”改为了“生物相容性”,分别对细胞毒性、皮肤致敏和刺激作出了要求。可见,医疗器械生物安全性评价在产品性能指标中占有十分重要的地位。标准中要求用直接接触法检测耦合剂的细胞毒性,但是该方法对材料的要求较高,耦合剂产品为凝胶状无固定形状,并且具有一定的水溶性,故采用该方法在实际操作中会出现很多问题。

本试验采用的MTT比色法是浸提液法的一种,用于细胞毒性的定性和定量评价,该法对受试材料溶出物的毒性检测敏感性较高,也比较符合动物体内的毒性试验结果[2]。结果显示,医用超声耦合剂对L-929细胞具有毒性作用,且与其产品类型及添加成份相关,并表现出一定的剂量依赖性。利用MTT法检测耦合剂的细胞毒性时,同一浸提比例的试验结果在不同的细胞接种密度及作用时间下显示出较为明显的差异。如在浸提比例为1 mg/mL、5 mg/mL及25 mg/mL时,细胞接种密度为1×104 U/mL、作用时间为72 h无菌医用超声耦合剂的细胞毒性分别为1、2、3级,而密度为1×105 U/mL、作用时间为24 h均未表现出细胞毒性。这些结果提示,细胞毒性检测结果与浸提液制备方法、细胞接种密度以及浸提液作用时间密切相关。浸提液制备方法直接决定了作用于细胞的毒性物质的多少,而细胞接种密度关系到细胞对一定量的毒性物质的敏感程度。本研究试验结果显示,在同一浸提比例下,细胞接种密度大的所反映出的毒性作用小,即高接种密度降低了细胞对毒性的敏感程度。当毒性物质的量一定而细胞接种密度适宜时,作用时间越长,试验组与空白对照组的正常细胞差距越大,表现出的毒性作用越明显。

本试验采用的另一种方法琼脂覆盖法是间接接触法的一种,该方法对材料的要求比直接接触法低,使用的材料范围广,其缺点是受溶出物在琼脂上扩散程度的影响,当溶出物分子量小,易溶于水,其敏感性就高,反之则低[2]。该方法是一种定性评价方法,在结果判定时褪色区域的大小及溶解细胞的比例都是通过试验者的观察实现的,受到一定的主观影响。在本试验中,结果显示该无菌型耦合剂体外细胞毒性为1级,但不能对其结果作出量化的比较。

由此可见,各类型细胞毒性检测试验的原理与方法各不相同,而各方法中又有很多影响检测结果的参数,根据试验材料本身的理化性质、毒性作用强弱及其用途正确的选择试验方法及相关参数十分重要。孙皎认为,生物学评价试验的现行标准不完善,生物学评价试验的方法和评判依据主要参照现行的相关标准文件,而标准推荐的方法并非一定代表当今生物学和医学领域中最先进、最有效和最适合的检测手段[5]。对于医用超声耦合剂产品而言,如何更科学、更准确的评判其细胞毒性的方法尚有待进一步的研究和明确。

摘要：应用MTT比色法和琼脂覆盖法检测无菌耦合剂的细胞毒性。MTT比色法检测时,同一浸提液在细胞接种密度高时,毒性级别低,反之亦然。同一材料琼脂覆盖法检测的细胞毒性结果与MTT法的结果也不一致。由于MTT比色法具有定量评价的优点,更适合耦合剂的细胞毒性检测,但是必须明确试验条件以及浸提液制备方法。建议进一步完善医用超声耦合剂体外细胞毒性检测方法。

关键词：医用超声耦合剂,细胞毒性,琼脂覆盖法,MTT比色法

参考文献

[1]国家食品药品监督管理局.YY0299-2008医用超声耦合剂[S].

[2]贾文英,史弘道.细胞毒性试验评价医用装置生物相容性的研究概况[J].实用美容整形外科杂志,2001,12(5):253-255.

[3]由少华.解读GB/T16886《医疗器械生物学评价》系列标准[J].中国医疗器械信息,2005,11(1):15-19.

[4]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T16886.5-2003医疗器械生物学评价第5部分体外细胞毒性试验[S].

细胞毒性实验方案 篇7

小肠上皮细胞(IEC)是机体消化、吸收营养物质的主要场所[6],主要参与肠道内酶的活动和免疫屏障等功能[7]。肠上皮细胞已经成为研究细胞增殖及药物转运和代谢[8]的理想模型。试验旨在体外培养猪小肠上皮细胞,研究添加不同浓度肉桂醛对猪小肠上皮细胞的增殖作用,以及对细胞内p H值的影响,从而了解肉桂醛对猪小肠上皮细胞毒性的大小,为将肉桂醛投入到动物生产中并获得更有效、更广泛的应用提供试验依据。

1 材料

1.1 试验用细胞

猪小肠上皮细胞系,由中国农业大学惠赠。

1.2 主要试剂

DMEM-F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶,均为Gibco公司产品;肉桂醛,购自上海源叶生物科技有限公司;尼日利亚菌素,购自福建科研所;噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)和BCECF-AM,均为Sigma公司产品;其他试剂均为国产分析纯。

1.3 主要仪器

酶标仪(型号为680型XR),美国BIO-RAD公司生产;超净台[型号为MCV-131BNF(T)]、CO2培养箱(型号为MCO-15A),日本SANYO公司生产;倒置荧光显微镜(型号为ECLIPSE Ti-S),日本NI-KON生产;荧光分光光度计(型号为LS45),美国PE公司生产;6孔细胞培养板(货号为3516)和96孔细胞培养板(货号为3513),美国Coing公司生产。

2 方法

2.1 猪小肠上皮细胞的传代培养

传代时弃去培养基,用PBS缓冲液冲洗2次,加0.25%胰蛋白酶消化,置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养中4 min;待细胞之间断裂脱离培养瓶底,加入含有5%胎牛血清的培养基终止消化,反复吹打,按1∶3的比例分成3瓶,于37℃、5%CO2培养箱中培养,待用。

2.2 MTT法检测肉桂醛对猪小肠上皮细胞活力影响

取对数生长期猪小肠上皮细胞,用红细胞计数板计数后稀释成浓度为1×106/m L的细胞悬液,每孔加入150μL细胞悬液,培养24 h;待细胞完全铺开,弃掉培养基,由高浓度到低浓度每孔加入150μL含不同浓度肉桂醛的培养基,每个浓度重复3孔,对照组为不含肉桂醛、相同体积的细胞培养基。37℃、5%CO2培养箱中培养24 h;加20μL MTT,培养4 h;弃悬液,加150μL DMSO,30 min后在波长为520 nm处测定OD值,并计算细胞相对增殖百分率(RGR)。计算公式:RGR=(试验组OD值/对照组OD值)×100%,根据每个浓度组的RGR,按照表1转化为细胞毒性等级[9]。

2.3 细胞内p H值的测定

2.3.1 溶液的配制

p H值缓冲溶液(A液)和稳态液(B液)的配制,参照参考文献[10]。A液的p H值分别为6.5,6.7,7.0,7.2,7.4,7.6,7.8,B液p H值为7.4。A液和B液的组成见表2。1 mg BCECF-AM溶于1.45 m L DMSO中,-20℃冰箱中避光保存,测定时每毫升液体加3μL BCECF-AM工作液。以无水乙醇将尼日利亚菌素配制成5 mg/m L的储备液,再用纯化水稀释成浓度为1 mg/m L的工作液,-20℃冰箱中保存,测定时每毫升液体加尼日利亚菌素供试液1μL。

mmol·L-1

2.3.2 p H值标准曲线的绘制

在无菌条件下收集接种在6孔细胞培养板中的猪小肠上皮细胞,1 000 r/min离心8 min;用B液漂洗2次,每次3 min;加BCECF-AM,37℃、5%CO2培养箱中孵育30 min;离心弃废液,将细胞悬浮于不同p H值的A液中,漂洗2次,每次3 min;离心弃废液,再次悬浮于不同p H值的A液中,加入尼日利亚菌素,37℃、5%CO2培养箱中孵育15 min;取出并用荧光分光光度计分析。设置荧光分光光度计,其中发射光波长为530 nm,狭缝为10 nm,每份标本测定时间设定为1 min。以OD495/OD440荧光强度比值对应不同p H值绘制标准曲线。

2.3.3 小肠上皮细胞内p H值的测定

细胞接种在6孔细胞培养板中,培养24 h后分别添加0.031 25,0.062 5,0.125μg/m L肉桂醛刺激细胞,分别在刺激后8,16,24小时时收集无菌细胞,1 000 r/min离心8 min;将收集的细胞分别加入B液中,漂洗2次,每次3 min;离心弃废液,悬浮在B液中,加BCECF-AM,37℃、5%CO2培养箱中孵育30 min;离心弃废液,用B液清洗2次,每次3 min;应用荧光分光光度计进行测定。

2.4 统计学分析

应用SPSS17.0软件包进行统计分析,试验数据用±s表示,采用单因素方差进行差异显著性比较。

3 结果与分析

3.1 MTT法检测肉桂醛对猪小肠上皮细胞活力影响的结果(见表3)

由表3可知,当肉桂醛浓度为0.125,0.062 5,0.031 25μg/m L时,细胞数量与其他浓度组相比差异显著(P<0.05),0.125μg/m L肉桂醛对细胞增殖作用最强。0.003 9~2μg/m L肉桂醛对猪小肠上皮细胞没有显示出毒性。由于0.031 25,0.062 5,0.125μg/m L肉桂醛对猪小肠上皮细胞有较好增殖作用,因此本试验选用这3个浓度进行后续研究。

注:同列数据肩标,字母完全不同表示差异显著(P<0.05)。

3.2 细胞内p H值的测定结果

3.2.1 猪小肠上皮细胞p H值标准曲线

结果见图1。

由图1可知,细胞内p H值与荧光强度比值存在线性正比关系。标准曲线的方程为:y=2.343x-12.34,R2=0.972。

3.2.2 不同浓度、不同时间对猪小肠上皮细胞内p H值的影响

结果见表4。

注:空白组p H值为7.21,n=9;各试验组n=3。

由表4可知,0.031 25,0.062,5,0.125μg/m L肉桂醛对猪小肠上皮细胞内p H值无影响。

4 讨论

营养物质的消化、吸收主要是在肠道,肠上皮细胞受到损伤不仅阻碍营养物质的吸收、利用,对机体免疫功能也会产生不同程度的影响。肉桂醛抑制肠道病原菌时,对肠上皮细胞是否具有毒性作用不得而知。目前,有关肉桂醛毒性大小的报道很少。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和曲霉菌是动物肠道内常见的几种致病菌。研究发现,肉桂醛对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和曲霉菌的最小抑制浓度在0.05~0.25μg/m L之内[4,5]。因此,本试验选用肉桂醛终浓度为0.003 9~2μg/m L的培养基培养猪小肠上皮细胞,观察肉桂醛控制病菌繁殖的较小浓度范围对猪小肠上皮细胞的影响。

细胞毒性实验方案 篇8

关键词：根尖边缘细胞,重金属,毒性效应,污染胁迫

1 引言

大气、水体等各环境介质中的污染日益严重, 环境污染治理已刻不容缓, 尤其是重金属环境污染问题日益提上主要议程。重金属污染是因人类活动, 如采矿、废气排放、污水灌溉和使用重金属制品等人为因素, 导致环境中的重金属含量增加, 超出正常范围, 使得环境质量恶化的现象。近年来, 植物根尖边缘细胞作为陆生植物抵御土壤重金属元素毒害的第一道屏障, 对植物对重金属的抗性、吸收机理研究都有很重要的指示作用, 已得到了较大的关注。植物根尖边缘细胞能作为较为敏感的重金属元素毒性的标志物, 越来越多的研究者从不同植物种类、不同重金属元素等多角度报道了重金属对其的毒性效应, 并正进行更深入的研究。

2 根尖边缘细胞的定义、特征及功能

2.1 根尖边缘细胞的定义

区别于传统认为的根尖边缘细胞就是根冠更新过程中脱落下来的垂死副产物, 现代科学已证实根尖边缘细胞离体时仍能存活数月, 绝大多数物种的根冠脱落细胞是有活性的, 其发育受胞内外信号调控的。根尖边缘细胞 (Root border cells, RBCs, 下同) [1]是从根冠表皮游离出来并聚集在根尖周围的一群特殊细胞, 其发育是受遗传调控, 并在逆境中起着多种生物学功能。边缘细胞起源于根冠组织的有丝分裂, 经过一系列的不同发育时期, 包括淀粉合成期、重力感受期、粘液分泌期等, 最后在根冠外围形成细胞层。

2.2 根尖边缘细胞的特征及功能

RBCs大部分呈椭圆形或方形, 长50~80μm, 宽20~25μm。不同物种产生的RBCs的外形不同。一般来说, 豆科植物的RBCs比玉米稍大、稍长;胡萝卜的RBCs比豆科植物和禾谷类作物小且形状更均一;松树和小麦边缘细胞淀粉粒之类的细胞内容物更明显可见;而在高梁和甘蔗RBCs中有色素表达, 呈现粉红色或紫色[2]。处于不同生长时期的RBCs的外形也略有不同, 浸入溶液后RBCs的形状也会有所改变, 依不同生长时期变成较为光滑的蠕虫形或短棒状[3]。一条根系产生的RBCs数目因物种的差异而不同, 从烟草的十几个到棉花、松树的上万个RBCs, 这与边缘细胞发育起始时间、生成速度及其死亡速度有关[4], 同一科的植物根系产生RBCs的数量是大致相当的。RBCs从根尖脱离后, 能够自主进行新陈代谢, 即能单个生存, 并在遭受逆境时向外特异性合成分泌一系列具有生物活性的物质, 形成一个独立的胞际空间, RBCs的粘液层是很重要的屏障, 如能防止和减少铝的吸收, 能抑制和促进根际周围微生物的生长。

3 典型金属元素对植物根尖边缘细胞的毒性效应

RBCs用于金属元素毒性实验主要源于Al对水稻根尖的毒性效应研究。水稻是重要的单子叶植物, 也是小谷类作物中Al抗性较强的作物之一[5]。研究者逐渐将金属元素对植物生长的影响研究的植物受体从水生植物扩宽到了陆生植物, 从单子叶植物扩宽到双子叶植物, 从封闭型双子叶植物扩宽到能产生更大活性和更多数量RBCs的开放型双子叶植物中。研究的金属元素种类也慢慢从单一的Al元素扩展到Fe、Cu、As、Cd、Hg、Pb、Cr等毒性较大的重金属元素。无论选取何种植物种类和金属元素, 其毒性效应研究选择的毒作用指标主要是通过对离体或活体RBCs存活率的影响和对RBCs活性和酶含量的毒性影响等为主。下文将以几种典型金属元素为例介绍金属对植物RBCs的毒性效应。

3.1 Al元素

戚伟刚[6]等人以水稻为材料, 研究了水稻RBCs数目和存活率的变化及不同Al处理对水稻RBCs的影响。第1个水稻RBCs的出现几乎与初生根根尖同步, RBCs数目达到最大值时, 根长大约为25~30mm, ;当根长超过5mm时, RBCs的存活率维持在一定的水平上;水稻RBCs的存活率随着Al浓度的递增而减小, Al毒明显降低水稻RBCs的存活率。对铝毒的研究当然不仅仅局限于对于水生植物的研究, 并且对于陆生植物也得到了类似的结论。杜幸[7]等人以红豇豆为材料, 采用悬空气培法, 研究红豇豆RBCs产生的数目、活性及对铝胁迫的响应。结果表明:红豇豆的RBCs数目先随着根的伸长而迅速增加, 到根长为10mm时达到最多, 约为5300个;随后, RBCs数目稍有减少, 且较为稳定。RBCs的存活率较高, 都大于85%, 随着红豇豆根长的伸长, RBCs的活性逐渐增高。冯英明[1]等人以豌豆为材料, 研究了不同铝浓度AlCl3与离体豌豆 (Pisum Sativum) RBCs共培养一段时间后RBCs存活率粘胶层厚度及细胞数量的变化, 通过实验得到在一定铝浓度范围RBCs存活率随铝浓度升高而降低。铝毒对RBCs具有致死效应, 这种致死效应在一定浓度范围符合剂量依数性关系高浓度时则RBCs存活率反而升高。与前者不同的是, 后者还引入了时间变量, 也证明了RBCs的存活率明显随着处理时间的延长而下降。而对于离体与活体根尖边缘细胞的活性及耐铝性, 张淑娜[8]等人以荞麦为材料也做了说明:Al 3+降低荞麦相对根长和RBCs活性;相同Al 3+浓度处理下, 附着于根尖的RBCs活性要大于离体RBCs。细胞黏液层厚度与Al 3+浓度相关, 且离体RBCs黏液层厚度要大于原位RBCs, 耐铝品种中表现得更为明显。邢成华[5]等人以两镉大豆品种 (耐铝性大豆和铝敏感性大豆) 为材料, 比较研究了Al 3+对根尖原位边缘细胞释放以及对离体边缘细胞的毒害作用。结果显示:Al 3+对离体边缘细胞有明显的毒害作用, 100μmol/L Al 3+处理1~6h就表现出细胞死亡症状, 毒害作用最大时出现在6h之后, 其中Al 3+对敏感型大豆的毒害作用高于耐铝型大豆。100μmol/L Al 3+处理的离体边缘细胞存活率已大幅度下降, 400μmol/L Al 3+时, 存活率已不过半。外界Al 3+浓度增加影响边缘细胞的释放, 并且显著降低离体边缘细胞的存活率。对于不同品种的大都对Al 3+的反应的最大差异性出现在6h处。对于铝毒对植物根尖边缘细胞的研究较普遍, 都得到类似以上结论。

3.2 Fe元素

Fe是植物生长发育过程中必不可少的元素, 但少量或过量的Fe都会对植物产生不良作用。章艺[9]等人以铁耐型 (Azucena) 和铁敏感型 (IR64) 两种不同水稻品种为材料, 研究了Fe2+胁迫下RBCs的数目、存活率, RBCs形态结构, 根尖保护酶活性的变化, 结果显示:Fe2+对RBCs的产生有抑制作用;相对于铁敏感型水稻而言, 一定浓度的Fe2+ (100~200μmol/L) 有利于铁耐型品种RBCs的产生;Fe2+对RBCs有致死效应, 随Fe2+浓度的提升, RBCs的存活率呈下降趋势, 根尖外围细胞壁增厚, 并出现细胞程序性死亡特征 (铁敏感型) ;Fe2+对根尖保护酶活性有一定的影响, 200~400μmol/L Fe2+处理下, 铁耐型品种过氧化物酶 (POD) 、过氧化氢酶 (CAT) 、超氧化物岐化酶 (SOD) 活性都超过对照, 铁敏感型水稻只有SOD活性超过对照, 这说明Fe2+胁迫下, 水稻根尖可通过增加RBCs数目、提高细胞拒Fe作用, 维持较高水平的POD、CAT和SOD活性来缓解铁毒害。铁对于植物生长也存在低促高抑的现象。

3.3 Cu元素

Cu是植物必需的营养元素, 但过量的Cu对植物有明显的毒害作用。刘婷婷[10]等人采用悬空培养及离体培养的方式, 观察玉米的RBCs在铜离子胁迫下发生的形态、数量及存活率变化情况。结果表明:在玉米根长为32mm的时, RBCs的数量达到最大, 但其存活率此时最低;玉米的RBCs随着铜离子浓度的增加发生变化。当处理浓度为50μmol·L-1时, 存活率为24.80%, 铜离子处理浓度增加到100μmol·L-1时, 存活率降低为17.54%;玉米RBCs的数量随着铜离子浓度的增加逐渐减少, 存活率逐渐降低, 说明过量重金属铜离子胁迫对RBCs有明显的毒害作用。

3.4 Cd元素

Cd是危害植物生长发育的有害物质。梁剑[11]等人以麻疯树离体RBCs为材料, 探究其RBCs的生物学特性及Cd对其活性的影响。麻疯树RBCs大多数呈椭圆型, 少数成弯曲的长条型;根长为15mm时, RBCs存活率达到最大值;根冠果胶甲基脂酶 (PME) 酶活性随根的伸长有所降低;Cd对麻疯树RBCs产生明显毒害, 随着镉浓度和处理时间的增加, RBCs的活性都呈现下降的趋势。梁剑[12]以油橄榄根系为材料, 探讨Cd胁迫下对油橄榄RBCs的影响, 发现镉对油橄榄RBCs产生明显毒害, 当镉浓度逐渐增加时, PME酶活性和RBCs存活率呈下降趋势。王亚男[13]等人以绿豆为材料, 采用琼脂悬空培养法和培养皿滤纸培养法, 以不同浓度的Cd2+处理洗脱RBCs和未洗脱RBCs的绿豆根尖, 研究了离体状态和活体状态绿豆RBCs对镉毒的响应。在Cd2+的诱导下, 离体状态的绿豆RBCs凋亡和分泌黏液, 同时随着Cd2+浓度的升高, 其存活率逐渐递减;Cd2+具有诱导根尖产生RBCs的作用, 根尖释放的RBCs数量随着Cd2+浓度的增加先增多后减少;其中50μmol L-1 Cd2+处理在洗脱组和未洗脱组均呈现最大诱导效应;Cd2+对RBCs的活性具有影响, 随着Cd2+浓度的增加, RBCs的存活率在未洗脱组逐渐降低, 而洗脱组则先升高后降低。受到Cd2+胁迫时, 绿豆根尖可释放更多RBCs, 并通过离体RBCs形成黏液层、凋亡等来抵御Cd2+对根尖的毒害作用。

4 研究展望