细胞增殖实验方法（精选9篇）
细胞增殖实验方法 篇1
一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物
细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结-CCK-8 法
实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
一、用途：
药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。
二、优点：
1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； 2.CCK-8法能快速检测；
3.CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度； 4.CCK-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；
5.而本方法产生的formazan是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；
6.CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；
7.CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
三、所需设备及仪器：
1.10ul，100-200ul及多通道移液器 2.酶标仪（带有450nm滤光片）3.96孔培养板
4.二氧化碳培养箱
一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物
四、方法及步骤：
实验一：细胞增殖分析
1、制备细胞悬液：细胞计数。
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基（现用现配），以换液的形式加入。
5、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件（建议预实验先摸清楚时间点）。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
实验二：细胞毒性分析
1、制备细胞悬液：细胞计数
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约≥5×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入不同浓度的毒性物质。5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间（例如：6、12、24、48、60、72小时）。
6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
7、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
五、实验注意事项：
·若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
·如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
·当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔(100 μl 培养基)。检 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物
测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔(100 μl 培养基)。
·酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
· CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。
· CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。
·当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔加培养基或者PBS，不作为测定孔用。
·在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
·金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。
·悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。
·加入CCK-8 时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或pH 值已变化，建议换用新鲜的培养基。
·用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定，且要擦拭干净样品板了。
六、经验总结及分享：
CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。但无论如何，做这个试验一定要摸条件。你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。以下言论全部以细胞毒性试验为前提，如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。
摸条件包括
1、种板数；
2、种板后细胞的贴壁生长时间；
3、加药后的孵育时间；
4、cck8试剂加入量；
5、cck8试剂加入后细胞孵育时间。看起来很多，其实这就是一个实验。而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和CCK8。
1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人有无做过，把范围大致找出。记住还要参考说明书，这个很重要。然后稀释一系列浓度种板。首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全，一般贴壁生长24小时。然后还有在你的实验时间内，不同细胞数下孔内生长情况。比如我拟定考察4天的时间，那么在4天内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？因为每块板都会设置对照孔，也就是含有细胞的培养基+CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物
值在1.0附近，所以这个最大数值最好能控制在1.0左右。我的实验经验是不要让细胞长满，一旦长满了很难去判断是否堆积生长了，对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一，其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大，而且OD值也很大。
2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了，这个时间细胞已经贴壁完全，而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便。没人愿意大半夜爬起来做实验吧。
3、加药后的孵育时间，我的实验摸了3个时间，24h，48h，72h。然后根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了，细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。
4、CCK8试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10%。这里有一个问题：假设我要孔内是200微升的体系，即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢，还是细胞悬液+药液=200微升，cck8不算在体系内呢。关于这一点文献报道不一致。本人最终采用的是后者。
5、cck8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。
再说一下关于种板设置问题。众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。一般每组样品我会设置6个复孔，得到的OD值去掉最大值与最小值，其余取平均值。我用的是排枪，会省很多力气，但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液枪和选用最适枪头了。
做这个实验我想大家遇到的最大问题应该是数据不稳定，组内数据偏差大。讲了很多怎样摸条件，其实就一个原则，把OD值控制在1.0左右。数据不稳定也只能通过增大样品数，借助数据处理来弥补。还有实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。
补充
突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题。比如孔里不能有气泡，如果有气泡，就用吸耳球吹掉，气泡会很影响检测结果。样品板要擦拭干净，当然了，盖子一定要记得拿掉啊Big Smile补充说明：这几天有同学提出了一个问题，这个问题非常好也非常关键：将OD值控制在1.0这个说法是否有依据？
这里我还是想提醒大家一定要认真阅读试剂盒的说明书，试想一个试剂盒的上市并且作为技术手段得到认可需要经过多少试验反复验证。我购买的是同仁化学研究所的CCK8试剂盒，说明书的P7Q23：OD值在什么范围比较合适？答：一般情况下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比较好。
再说到自己的实验设计，酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一样的，所以UV上很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用。这就能够理解为什么不能有气泡，为什么要擦拭干净样品板了。再者熟悉UV原理的同学会了解利用紫外检测有一个最佳检测范围，超过了这个范围，数值就会呈现出不稳定，无规律。（大家可以把自己的数据统计分析看看是不是数值控制在1.0附近更稳定。）而更有甚者就是超出了仪器的检测范围，仪器读数为—。一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物
我在摸条件的时候，cck8加入2.0h后检测就出现过酶标仪读不出数据的情况。
细胞增殖实验方法 篇2
1 材料与方法
1.1 试剂与细胞株
子宫内膜癌细胞株HEC- 2B购自中科院细胞库,RNase、胰蛋白酶、DMEM 培养基、Trizol、逆转录酶Superscript Ⅲ为Invitrogen公司产品,优质胎牛血清购自Gibco公司,HGF购自R&D,ATRA、Agarose 、G418 由Sigma公司提供。PCR用酶购自ABI公司。7300 Real Time PCR System 由美国应用生物系统公司提供。
1.2 HEC- 2B细胞的体外培养与诱导
将细胞以1×105 cm-2接种于细胞培养瓶中,每瓶加入5ml含10%FBS(胎牛血清)的DMEM;培养24h后,换5%FBS的DMEM饥饿培养12h,加入ATRA和(或)HGF进行处理,分组情况见表1。设置空白组不进行诱导,培养基中FBS的浓度改成5%。其中第6组分别于培养0.5、1、6、12、24、48、72h时收集细胞用RT- PCR方法检测作用时间对c-met受体表达的影响。1～7组于培养48h收集细胞检测细胞的增殖力及c-met受体表达情况。
1.3 RT- PCR
用PBS清洗细胞,用Trizol法抽提RNA,并常规检测RNA的纯度及完整性。Superscript Ⅲ进行逆转录,反应液30℃保温10min,42℃保温60min,72℃保温30min,逆转录引物采用Oligo dT与Random Hexamer,并常规用人的β- actin基因检测逆转录是否成功。Realtime定量PCR条件为:95℃ 5min 激活聚合酶,95℃变性15s,57℃退火5s,72℃ 25s,共45个循环。采用ABI7300系统进行检测,每个循环结束检测荧光强度。融解曲线检测条件为0.1℃·min-1,检测范围为55℃到95℃。荧光强度检测采用动态跟踪的方法,自动测出Ct值(每个反应管内的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数),用2-△△Ct 表示实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,并采用琼脂糖凝胶检测的方法进一步验证。β- actin引物序列:上游引物 5′- GCTCTTTTCCAGCCTTCCTT- 3′,下游引物 5′- TGATCCACATCTGCTGGAAG- 3′。c-met检测引物序列:上游引物5′- TTCAAGTAGCCAAAGCGATG- 3′,下游引物5′- GCGTTTACGTCAGGATAAG- 3′,产物大小300bp。维甲酸受体(RAR)检测引物序列:RARα上游引物5′- GCTTCTTCCGCCTCAGCATC- 3′,下游引物5′- GCGAAGGCAAAGACCAGGCT- 3′,产物大小约 600 bp;RARβ上游引物5′- AAATCACAGATCTCCGTAGC- 3′,下游引物5′- CATTGATCCAGGAATTTCCA- 3′,产物大小约80bp;RARγ上游引物5′- CCTGCCTAGATATCCT GATG- 3′,下游引物5′- GCTGAGCATCCCTGTCTCGG- 3′,产物大小约200bp。
1.4 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法分析细胞的增殖力
取对数生长期的细胞,用含0.25%胰酶消化,悬浮于适量培养基中,通过细胞计数将其浓度调整到4×104ml-1。将此细胞悬液以每孔100μl均匀接种到细胞培养板上,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养24h。培养24h后换成稀释液,继续培养24h,使细胞饥饿。用稀释液溶解待测上清,按1∶2剂距进行系列稀释。将稀释后的待测上清分别按100μl·孔-1额量逐一加入靶细胞培养孔中,每个稀释度做4个复孔。加样后置于37℃、5%CO2的培养箱中继续培养22h。终止培养前4h,每孔加入20μl染色液,继续培养4h;弃去培养液,加入抽提液150μl·孔-1,置于微量振荡器充分振匀以抽取染料,振动15min。以570nm为检测波长,630nm为参考波长,用酶标仪测定各孔的光密度(OD)值。
1.5 统计学处理
组间比较采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 c-met在HEC- 2B细胞中的表达情况
在HEC- 2B细胞中具有c-met基因的转录,见图1。
M.相对分子质量标志;1.阴性对照;2.c-met的PCR产物
2.2 ATRA对 HEC- 2B细胞的作用
2.2.1 ATRA受体在HEC-
2B细胞中的表达 3种亚型的受体在HEC- 2B细胞中均有表达,见图2。
M.100 bp lader;1.RARα;2.RARβ;3.RARγ
2.2.2 ATRA对HEC-
2B细胞增殖能力的影响 单独使用HGF(60ng·ml-1)能够明显促进HEC- 2B的增殖,增殖水平较空白对照上调约1.9倍。单独使用ATRA(10-6 mol·L-1)处理HEC- 2B,并不能够影响细胞的增殖能力。但是,如果与60ng·ml-1HGF共处理,10-7 mol·L-1的ATRA即能够明显抑制前者的促增殖作用(P<0.01),而且表现出一定的量效关系,过低的处理浓度(10-8 mol·L-1)效果不明显(P>0.05),10-5 mol·L-1的ATRA抑制作用最为突出(P<0.01)。见图3。
2.2.3 ATRA对c-met表达水平的影响
用RT- PCR检测不同剂量ATRA处理24h对c-met转录水平的影响。结果表明,ATRA能够有效抑制HEC-2B细胞中c-met的转录水平,10-7mol·L-1的ATRA即有明显作用(P<0.01),10-6mol·L-1作用最为显著(P<0.01),10-5mol·L-1的作用有所减弱,表明ATRA的作用呈现一定的量效关系。见图4。
2.2.4 ATRA对c-met抑制作用与处理时间的关系
10-6mol·L-1的ATRA处理0.5h后,c-met的转录水平即开始下降,作用1h后ATRA对c-met的抑制作用有显著意义(P<0.01)。随着处理时间的延长,ATRA的抑制作用也逐渐增强,24h时下调c-met的转录水平至对照的32%,72h时略有回升,说明ATRA的抑制作用具有明显的时间依赖特征。见图5。
3 讨论
子宫内膜癌的病因不十分清有楚。多数学者认为内膜癌有两种类型:一类与无孕酮拮抗的雌激素长期作用有关,组织学类型为子宫内膜样腺癌;另一类发病机制不清楚,与基因变异有关,组织学类型为浆液性腺癌、透明细胞癌等。
HGF是一个多功能生长因子。HGF的单一受体c-met是一跨膜蛋白,由原癌基因Cmet编码[3]。近年研究表明,c-met表达的水平与子宫内膜癌外科分级、组织学分级及短生存率有关[1]。我们检测了HEC- 2B细胞中c-met的表达情况,发现c-met的mRNA存在于HEC- 2B细胞中。单独使用HGF( 60ng·ml-1)能够明显促进HEC- 2B的增殖,增殖水平较空白对照上调约1.9倍,与Yoshida等[4]报道相符。子宫内膜癌中c-met的表达为我们以后的临床应用提供了理论基础。
维甲酸(retinoic acid,RA)类药物包括维生素A的天然及人工合成的衍生物,又称视黄酸或维生素A 酸。维甲酸包括多种同分异构体,其中ATRA最为稳定及常见。大量报道证实ATRA能够抑制肿瘤增殖、诱导肿瘤分化,但是对于子宫内膜癌的作用却至今尚无报道,我们首先检测了HEC- 2B细胞中是否有功能性ATRA信号通路的存在,结果发现3种RAR(RARα、RARβ、RARγ)在HEC- 2B细胞中均有表达。接下来发现ATRA能够在较短的时间内抑制c-met的有效转录,并且表现出一定的量效关系与时间依赖特点。处理后0.5h,c-met的转录水平即开始下降,这与ATRA特殊的作用途径有关。ATRA脂溶性高,能够直接穿过细胞膜,与RAR结合并进入细胞核,变成转录因子,直接作用于靶基因;ATRA对HEC- 2B细胞的作用是通过受体来完成的,在与受体的结合未达到饱和时,作用与时间及剂量相关,与受体结和饱和时,ATRA对细胞的作用便不随时间与剂量的增加而增加。ATRA单独作用并不能够改变细胞周期与增殖效率,但是能够明显抑制HGF的促增殖作用,说明其对细胞周期的影响不是直接而是间接的作用。10-6 mol·L-1ATRA对c-met表达的下调作用最明显,而10-5 mol·L-1ATRA对HGF促增殖作用的抑制最明显,再次说明了ATRA对细胞的作用是通过与HGF的协同来完成的。因此我们认为,通过抑制c-met的表达调控细胞的增殖可能是ATRA作用于子宫内膜癌细胞的通路之一。
HGF/c-met不仅在肿瘤的增殖而且在肿瘤的浸润、转移中起关键作用[5]。ATRA能通过抑制c-met的表达抑制HGF对子宫内膜癌细胞的促增殖作用。所以,ATRA也可能通过抑制c-met的表达抑制HGF/c-met介导的子宫内膜癌的浸润和转移,改善预后。ATRA 有希望成为治疗子宫内膜癌的药物之一。
摘要：目的通过观察全反式维甲酸(ATRA)、肝细胞生长因子(HGF)对子宫内膜癌细胞HEC-2B增殖的影响及检测子宫内膜癌细胞HEC-2B中HGF受体c-met的表达,了解ATRA对子宫内膜癌细胞的作用及其可能机制。方法体外培养人子宫内膜癌细胞HEC-2B,用60 ng.ml-1HGF及10-5、10-6、10-7、10-8mol.L-1的ATRA作用于HEC-2B,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法分析细胞的增殖力,实时定量PCR检测ATRA作用前后细胞中HGF受体c-met的表达。结果单独使用ATRA(10-6mo.lL-1)处理HEC-2B,并不能够影响细胞的增殖能力。如果与具有明显促细胞增殖作用的60 ng.ml-1HGF共处理,10-7mol.L-1的ATRA即能够明显抑制前者的促增殖作用(P<0.01),而且表现出一定的量效关系。ATRA能够有效抑制HEC-2B细胞中c-met的转录水平,10-7mol.L-1的ATRA即有明显作用(P<0.01),10-6mol.L-1的作用最为显著(P<0.01),呈现一定的量效关系。经ATRA处理0.5 h后,c-met的转录水平即开始下降,随着处理时间的延长,ATRA的抑制作用趋于明显(P<0.01),有明显的时间依赖性。结论通过抑制c-met的表达调控细胞的增殖可能是ATRA对子宫内膜癌细胞作用的通路之一。
关键词：子宫内膜癌细胞HEC-2B,全反式维甲酸,肝细胞生长因子,肝细胞生长因子受体
参考文献
[1]Wagatsuma S,Konno R,Sato S,et al.Tumor angiogenesis,hep-atocyte growth factor,and c-met expression in endometrial car-cinoma[J].Cancer,1998,82(3):520-530.
[2]Wang R,Ferell L D,Faouzi S,et al.Activation of the Met re-ceptor by cell attachment induces and sustains hepatocellularcarcinomas in transgenic mice[J].J Cell Biol,2001,53(5):1023-1034.
[3]di Renzo M F,Olivero M,Katsaros D,et al.Over expression of the MET/HGF receptor in ovarian cancer[J].Int J Cancer,1994,58 (5):658- 662.
[4]Yoshida S,Harada T,Iwabe T,et al.Induction of hepatocyte growth factor in stromal cells by tumor-derived basic fibroblast growth factor enhances growth and invasion of endometrial cancer[J].J Cli Endocrinol Metab,2002,87(5):2376- 2383.
《细胞的增殖》教案 篇3
细胞的分裂
●教学过程
[课前准备]
教师准备一对染色体在有丝分裂过程中变化的模型剪贴图。如图6—1—2。
图6—1—1染色体的复制图6—1—2着丝点分裂，姐妹染色单体分开成两条染色体
学生用橡皮泥制作染色体的模型，以供上课用。
[情境创设]
教师：上节课我们观察植物细胞的有丝分裂，观察到的细胞是死的还是活的?为什么?
学生：是死的，解离的时候已经把细胞杀死了。
教师：为什么要对视野中的细胞进行计数?
学生：因为细胞已经被杀死，我们不能观察到细胞分裂的动态过程，只能用看到的视野中细胞的多少来说明细胞分裂的某个时期的长短。
教师：同学们回答得很精彩(掌声鼓励)。下面我们就一起来认识有丝分裂的过程。
[师生互动]
教师演示有丝分裂细胞周期的动画课件。
学生观察。
教师引导学生总结：
有丝分裂是真核生物进行细胞分裂的主要方式。细胞进行有丝分裂具有周期性。即连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。一个细胞周期包括两个阶段：分裂间期和分裂期。
教师：同学们上节课的实验结果怎样呢?
学生：根据实验的计数，我们发现：细胞分裂间期的细胞最多，大约是其他各期细胞的8倍。
教师：非常好!引导学生观察课本p112表6—1不同细胞的细胞周期持续的时间(t/h)。在细胞周期里，哪一个时期长?
学生：细胞分裂间期。
教师：细胞分裂间期有什么特点呢?
教师和学生一起总结：从细胞在一次分裂结束之后到下一次分裂之前，是分裂间期。细胞周期的大部分时间处于分裂间期，大约占细胞周期的90%～95%。分裂间期为分裂期进行活跃的物质准备，完成dna分子的复制和有关蛋白质的合成，同时细胞有适度的生长。
教师：dna分子和蛋白质实际上是什么?
学生：染色质，也是染色体。
学生：用橡皮泥操作染色体的复制。
教师：用先剪好的剪贴图在黑板上贴出染色体复制图。如课前准备的图(一)。细胞分裂间期的活动是非常活跃的，它为细胞的分裂提供了物质的准备。这时候细胞核内染色体数目和状态如何?
学生：(1)染色体经复制成两条染色单体连于一个着丝点，形态为丝状，为染色质。见课本p113图6—4。
(2)染色体数目→与分裂前比较数目不变，但dna数目加倍。
教师：下面我们一起结合同学们上一节课的实验来分析细胞的分裂期。人们为了研究的方便，把分裂期分为四个时期：前期、中期、后期、末期。下面以高等植物为例，认识有丝分裂的过程。
学生：观察课本p112图6—2，课本p113图6—3。
教师：用flash动画演示细胞分裂的前期。这是什么时期?染色体有哪些变化?
学生：(1)细丝状的染色质高度螺旋化，形成染色体。(2)核仁、核膜解体、消失。(3)出现纺锤丝，构成纺锤体。
学生用橡皮泥操作染色质染色体，教师引导学生总结：
细胞分裂前期的特征：
(1)核膜、核仁解体消失。
(2)纺锤体和染色体形成。(两消失，两出现)
(3)每条染色体会分开成为两条姐妹染色单体，染色体排列无序。
教师：用flash动画演示细胞分裂的中期。这是什么时期?这个时期的明显标志是什么?(引导学生根据染色体形状、数目、位置归纳特点)共3页，当前第1页123
学生：(1)染色体形态固定，数目清晰，着丝点与纺锤丝相连。
(2)染色体数目→与前期、间期相同。
(3)染色体位置→染色体的着丝点排列在细胞中央的赤道板上。
教师引导学生总结：
细胞分裂中期的特征：
(1)染色体缩得最短、最粗。
(2)染色体有规律地排列在赤道板上。
教师：用flash动画演示细胞分裂的后期。这个时期又有什么特点呢?用剪贴图操作。
学生：用橡皮泥操作着丝点分裂，一条染色体中的两条姐妹染色单体分开成为两条染色体。
教师：要求学生数一数这时细胞核中有多少染色体，并与间期、前期、中期作比较。
学生：(1)染色体形态→每条染色体分开，无姐妹染色单体。
(2)染色体位置→移至细胞的两极。
(3)染色体数目→比间、中、前期加倍(因着丝点分裂加倍)。
教师引导学生总结：
细胞分裂后期的特征：
(1)着丝点分裂为二，姐妹染色单体分开成为染色体。
(2)染色体移至细胞的两极。
(3)染色体数目加倍，dna数目不变。
教师：用flash动画演示细胞分裂的末期。最后指导学生概括末期的特点，注意与前面各期对比。
学生：(1)染色体形态→染色质呈丝状。
(2)染色体数目→与间期、前期、中期细胞中相同。
(3)染色体位置→散乱分布在细胞核中。
教师引导学生总结：
细胞分裂末期的特征：
(1)染色体成为丝状染色质。
(2)核仁、核膜出现。(两出现，两消失)
(3)细胞板形成，将一个细胞分裂成两个子细胞。
(4)染色体数目和dna数目都恢复原样。
(5)大多数子细胞进入下一个细胞周期的分裂间期状态。
[课堂反馈]
教师：下面我们一起来探讨动物细胞的有丝分裂，其实动物细胞的有丝分裂与植物细胞的分裂是有很多相似之处的，现在我们一起来观察它们的异同。用多媒体课件演示动物细胞有丝分裂和植物细胞有丝分裂的过程，提醒学生对照观察、分析比较。
学生：通过对比图中各时期变化特征，找出动植物细胞有丝分裂过程的异同点;学习通过观察分析得出结论，由推荐生回答教师问题。
教师和学生：
(1)相同点：
a、动植物细胞分裂过程染色体变化规律，即各时期特征相同。
b、动植物细胞有丝分裂过程经染色体复制，然后平均分配到两个子细胞的结果是相同的。
(2)不同点：主要有两点。
银幕显示：
动植物细胞有丝分裂过程不同点
植物细胞的有丝分裂
动物细胞的有丝分裂分裂
分裂前期(纺锤体的形成)
由细胞两极发出许多纺锤丝，纵行排列在细胞中央，形成梭形的纺锤体
中心体复制形成两组中心粒，分别移向细胞两极，两个中心粒发出星射线，在两组之间的星射线形成纺锤体
分裂末期
在细胞赤道板位置形成细胞板，并向周围扩展形成细胞壁，将细胞质分成两部分——两个子细胞
不形成细胞板，细胞膜从细胞中部向内凹陷，最后将细胞质缢裂成两部分，其结果形成两个子细胞
学生：阅读教材p113最后一自然段。
教师：要求学生理解有丝分裂的特征、意义，并能回答问题。
银幕显示检测题：
细胞有丝分裂的重要特征是：亲代细胞的染色体_______后，________到两个子细胞中去。由于染色体上有________，因而在生物的__________之间保持了__________的稳定性。可见，
细胞的`有丝分裂对于生物的遗传有重要意义。
答案：经过复制平均分配遗传物质亲代和子代遗传性状共3页，当前第2页123
教师：除了细胞的有丝分裂，还有其他的分裂方式吗?
学生：减数分裂和无丝分裂。
教师：无丝分裂是最简单的分裂方式。进行无丝分裂的生物是不多的，通常是单细胞生物，特别是原生动物的生殖方式，例如草履虫、变形虫主要靠这种方式进行。无丝分裂在高等生物中也较普遍存在，而且是一种分裂方式。主要是高度分化的细胞，例如肝细胞，肾小管上皮细胞等。无丝分裂的过程如何，有什么特点呢?请同学们回答。要求学生阅读教材p114第二自然段。
教师：银幕显示：草履虫的无丝分裂图、蛙的红细胞的无丝分裂图。
学生：分裂过程中没有纺锤丝和染色体出现。
[教师精讲]
通过今天的学习，同学们深刻认识到每种植物细胞和每种动物细胞，在有丝分裂过程中，都有这样的共同特征：染色体经过自我复制，然后平均分配到两个子细胞中去，使每个子细胞核中都含有与上代细胞数目相同、种类相同的染色体。例如高等动物体组织中，已分化组织在不断丧失的情况下，不断地进行有丝分裂，就角化的皮肤而言，不断地发生上皮细胞的有丝分裂，以提供恒定的细胞供应，因此它的意义就在于保证了动物染色体上遗传物质的相对稳定，从而对保持生物体前后代遗传性状的稳定性起了很大作用。另外，细胞有丝分裂的知识也是研究生物遗传规律的必要基础。
[课堂小结]
本节课主要认识真核细胞有丝分裂的过程，落实有丝分裂过程中dna和染色体的规律性变化。如下：
含四条染色体细胞为例
细胞周期
比较项目
间期
分裂期
前期
中期
后期
末期
dna含量(个)
4→8(逐步复制)
8
8
8
8→4
染色体数(条)
4
4
4
4→8
8→4
染色单体数(条)
0→8
8
8
0
0
纺锤体
无
出现
最清
较清
消失
[布置作业]
1、p114的练习一基础题1～5。
2、以体细胞里含有4条染色体为例，画一个处于有丝分裂中期的植物细胞。
高中生物细胞的增殖教案 篇4
建构主义强调学习者的主动性，认为知识不是通过教师传授得到，而是学习者在一定的情境下，借助教师的帮助，利用必要的学习资料，通过意义建构的方式获得的。同时，建构主义的教学观也强调教学应从学习者的经验出发，进行角色的调整，通过布置良好的学习情境，让学习者反省和思考。基于建构主义这一理念，本节课将利用多媒体、视频等直观教具，并以问题为载体，引导学生结合之前学习到的内容以及自身在生活中的了解思考、探究细胞周期、真核细胞有丝分裂过程等内容，提升学生解决分析问题的意识和能力，提高生物科学素养。
教材分析
从教材内容上看，本节课主要介绍了细胞周期及真核细胞有丝分裂的过程，是在学生学习了“细胞的结构”、“细胞的代谢”等相关内容的基础上展开的，同时也为后续对细胞的分化以及细胞的衰老和凋亡的学习作铺垫。因此，在整个章节中，本节课居于承上启下的重要地位。其次，从教材内容的组织形式上看，本节课从细胞分裂引出细胞周期，进一步介绍了细胞有丝分裂周期的过程和特点，层层递进，符合学生的认知发展规律。并且，在教材以及多媒体教具中引入的一些图片以及图表，不仅加深了学生的感性认识，而且便于激发学生学习的积极性和主动性。
学情分析
从学生的知识起点看，通过前面的学习，学生已经大致了解细胞基本的结构特点及其代谢，为本节课的学习打下了基础。教师可以通过创设一定的学习情境，回顾之前学习的内容，并导入本节课要学习的主要内容，以讲解介绍和问题的形式引导学生思考、分析和总结，并借助视觉媒体和相关图表以及探究活动和小组合作学习，让学生达成新旧知识体系的建构。这不仅有利于学生较快地进入学习状态，而且可以引导学生对DNA的分子组成和结构特征进行有目的的学习。
从认知技能上看，高中生的思维虽然大部分已经完成从形象思维向抽象思维的转变，但动手操作能力还处于一般水平。因此，教师可以在教学中创设各种情境，开展生生之间、师生之间的交流、讨论、分析，进一步锻炼他们听取他人的意见、自主合作、获取信息、以及建构知识体系的能力。
教学目标
知识与技能：
了解细胞生长和增殖的周期性，简述细胞周期;
观察细胞的有丝分裂，概述细胞有丝分裂的过程，包括各个时期的名称和主要变化特点，区别各时期细胞分裂图;
清楚真核细胞在有丝分裂过程中染色体行为和数目的变化、DNA数量的变化规律。
过程与方法：
尝试识图和绘图，培养画图分析的能力，总结、归纳各时期细胞分裂图的异同;
学会使用探究的方法把握细胞分裂的原因;
懂得运用之前学习的知识解决现在的问题，达到新旧知识的重新建构。
情感与态度：
认同细胞增殖只是因为细胞数目的增多，有丝分裂是细胞增殖的主要形式;
通过对细胞分裂的原因的寻找，养成学会探究的好习惯，同时认同多学科合作研究的重要性;
通过比较各时期细胞分裂图的异同，认同生命的运动性，形成事物发展过程中从量变到质变的辩证唯物主义观点。
教学重难点
重点：
细胞生长和增殖的周期性;
有丝分裂的过程。
难点：
有丝分裂过程中各个时期染色体行为和数目的变化;
有丝分裂过程中各个时期DNA数量的变化。
教学方法与学法指导
采用多媒体展示法辅之以探究研讨法开展教学活动
课时安排
1课时
教学准备
多媒体课件、有关有丝分裂的视频
教学过程
教学环节及时间预设 教学活动及组织 学生活动 教学意图 激趣导入
(3分钟)
【创设情境】回顾之前学习的知识;
【提问】一个细胞的体积大概是多少?
【观察】举例原核细胞、真核细胞、支原体、鸵鸟卵细胞的直径大小;
【提问】生物体是如何由细胞组成的?
从而导入本节课的主要内容——细胞的增殖。 观察、回答问题。 让学生回顾之前的知识，有益于巩固之前的知识，同时接连提出问题，引发学生的思考，活跃学生的大脑，使学生能够更容易地进行本节课的学习。 探究活动：细胞不能无限长大的原因 【问题】为什么细胞的体积不能无限增大?
【创设情境】设细胞为正方体，边长本别是3微米、2微米、1微米，引导学生计算3种情况中，细胞的表面积和体积之比(即相对表面积);
让学生自行计算并得出相应的结论;
细胞增殖实验方法 篇5
诺斯卡品多年来一直作为镇咳药物使用, 近年来抗肿瘤药物实验研究发现诺斯卡品及其衍生物具有抗癌活性, 通过作用于微管, 使肿瘤细胞长期处于静止期, 从而影响有丝分裂达到抑制增殖的目的。
体外及体内实验均表明诺斯卡品能够明显抑制乳腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤细胞的增殖和周围血管生成, 并诱导其凋亡。更为重要的是, 在多种小鼠肿瘤模型中, 它对心、肾和肝脏等重要脏器无毒性或仅有轻微毒性。目前研究发现诺斯卡品诱导凋亡的机制主要与caspase家族级联反应、线粒体途径、以及Bcl-2家族成员相关。
本研究拟通过诺斯卡品作用于人胶质瘤细胞U87-MG, 观察其增殖抑制和诱导凋亡的作用, 并探讨其可能的机制。
1 方法
用诺斯卡品 (50, 100μmol/L) 作用于人脑胶质瘤细胞系U87-MG 24, .48小时, 显微镜下观察细胞形态及生物学特性的改变。利用细胞增殖抑制试验 (MTT方法) 观察不同浓度诺斯卡品对细胞活性的影响;流式细胞仪检测细胞生长周期变化;蛋白免疫印迹法 (Western Blotting) 检测经诺斯卡品处理后Bcl-2, 及Bax, 等相关凋亡因子蛋白表达水平的变化。
所有数据用均数±标准差 (mean±S.D.) 表示。所有数据在SPSS13.0软件包上处理。采用非独立样本t检验, Spearman等级相关分析。P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 实验选择合适的诺斯卡品作用浓度
我们选择了5个浓度梯度的诺斯卡品 (25, 50, 100, 200, 400μmol/L) 作用于U87-MG细胞24h, 48h, 72h。结果发现诺斯卡品对U87-MG细胞具有明显的抑制作用。浓度为50μmol/L的诺斯卡品24, 48, 72h后抑制率相近, 在20%左右。浓度为400μmol/L的诺斯卡品24h., 48h, 72h后, 细胞的增殖抑制率相近, 在85%左右。浓度为100μmol/L的诺斯卡品24h., 48h, 72h后, 抑制率在50%左右。
2.2 倒置显微镜观察诺斯卡品对细胞形态的影响
用浓度为100μmol/L诺斯卡品作用于U87-MG细胞48h后, 可见到培养基内部分细胞呈不完全贴壁生长状态, 贴壁的细胞间连接减少、存在细胞碎片。对照组的细胞则贴壁生长, 连接紧密, 突触多, 核分裂象多见。
2.3 流式细胞仪检测细胞周期变化
U87-MG细胞经过诺斯卡品100μmol/L处理24h, 48h后, 收集所有漂浮和贴壁的细胞, 用流式细胞仪检测, 诺斯卡品抑制U87-MG细胞于M期, 表明诺斯卡品诱导的增殖抑制作用和细胞周期阻滞相关。
2.4 诺斯卡品通过caspase家族级联反应诱导U87-MG细胞凋亡
Caspase家族在细胞凋亡过程中是执行凋亡的主要酶类, 实验结果发现, 诺斯卡品作用于U87-MG细胞24, 48h后, 可检测到Caspase-3的激活以及PARP的裂解。
众所周知, 抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax通过线粒体介导的凋亡途中在多种人类肿瘤的形成及发展中起重要作用。诺斯卡品作用于U87-MG后可以检测到Bcl-2蛋白的表达下降, 但本实验未检测到Bax蛋白的表达有明显变化 (P<0.05) 。
3 讨论
诺斯卡品作为围观抑制剂可以使微管长时间的处于静止期, 但细胞内微管蛋白的总量保持不变。这可能是动物模型实验中诺斯卡品对重要脏器无明显毒副作用的原因。诺斯卡品对肿瘤细胞的选择性杀伤作用可能是由于肿瘤细胞存在纺锤体作用点机制的缺陷。
MTT结果表明诺斯卡品作用后, 胶质瘤细胞U87-MG生长受到了明显的抑制, 且药物浓度、作用时间与细胞活性呈较好的线性关系。
大量研究表明, caspase家族级联反应参与了细胞凋亡的作用机制。活化的Caspase通过特异性裂解底物导致细胞凋亡, 分为凋亡起始因子Caspase-2, 8, 9和凋亡执行因子Caspase-3, 6, 7 (15) 。细胞凋亡开始后, 起始因子激活执行因子, 最终激活Caspase-3, 导致PARP蛋白的剪切。诺斯卡品作用于人脑胶质瘤U87-MG细胞后, 实验检测到了Caspase-3的激活和PARP的剪切。
Bcl-2作为重要的抗凋亡基因, 在诺斯卡品作用组和对照组中表达量的明显差异说明可能是通过控制抗凋亡因子Bcl-2的表达来调控细胞的增殖和存活。使用诺斯卡品作用后Bcl-2蛋白的表达明显下调, 而Bax蛋白的表达基本无变化。说明诺斯卡品是通过通过作用于Bcl-2因子使其蛋白水平得以相应降低并促进了肿瘤细胞的凋亡。
4 结论
本实验研究结果表明在体外实验中诺斯卡品可以明显抑胶质瘤细胞U87-MG的增殖并促进其凋亡, 其过程可能有多条信号通路共同调控, 有待进一步的研究证实。
参考文献
[1]Key, Yek, Grossniklaus HE, et al.Noscapine inhibits tu mor growth with little toxicity to normal tissues or inhibition of immune responses[J].Cancer Imnunol Immunother, 2000, 49 (4-5) :217-225.
细胞的增殖 评课案例评析 篇6
长春市第二十九中学生物组 李燕华
具体内容标准：
简述细胞的生长和增殖的周期性。描述细胞的无丝分裂。
观察细胞的有丝分裂并概述其过程。活动建议：
模拟探究细胞表面积与体积的关系。
一、从教学目标上分析
通过问题探讨和探究实验对细胞分裂的意义进行明确。在细胞周期上，课标要求是简述细胞的生长和增值的周期性。从知识目标上，教师能够通过分析图、表的方式突出知识目标。在能力方面，通过实验操作训练学生动手操作的能力。从情感方面，让学生通过操作体验细胞的增殖过程。
二、从处理教材上做出分析
通过一张图片，将教材中问题探讨中的象与鼠的资料来分析生物个体细胞大小的问题。再通过个体生长发育的过程研究生物体的长大与细胞数量、体积的关系。并不是单纯的利用教材上的材料。实验：细胞大小与物质运输的关系。指导学生进行实验操作。充分利用实验解决问题。同时通过与细胞直径的类比，不仅利用了原有教材的探究，同时结合事实进行了比较，让学生体会到了细胞大小与物质运输的关系。
在有丝分裂的讲解过程中，分解各时期的图像，结合教材明确各时期分裂细胞的特点，突出教学重点，同时也能够解决难点。
三、从教学程序上分析
（一）、教学思路上
从教学内容上看，通过实验让学生体会到细胞大小与物质运输的关系；对于教学重点以及难点细胞的增殖过程，从细胞形态、染色体变化、相关结构的数量变化等方面，全面分析此过程。
从学生水平上看，学生能够跟随老师的引导进行知识的学习，首先从身边的现象入手，让学生接受新知识；将探究实验的难度降低，使学生能够通过实验，体会实验的目的认识细胞的大小与物质运输的关系。
从教学思路上看，教学设计符合教学内容，紧贴课标与学生的程度；教学设计有独创的方面，并不是单纯的实验，结合细胞的相关知识将实验与事实相结合；教学思路的层次清晰从实验入手引入有丝分裂的过程；教学思路实际运作有效性。
（二）、课堂结构安排
教学内容的时间分配：教学实践的分配合理，大致分成两阶段，第一阶段在细胞大小的探究上占用十五分钟左右，第二阶段放在重点内容细胞的有丝分裂过程的分析。
教师授课与学生活动的配比：学生实验在十二分钟左右，其余时间 都是 老师讲解结合设问以及学生回答，因为本节课重点是知识的讲解，所以讲授的比例加大比较合理。
四、教学方法和手段 教学方法能够实验与讲解相结合，图解与板书相结合，能够看出教师在教学方法上下了一番功夫。
五、从教师教学基本功上分析
（一）、板书：设计比较合理，条理性强，字迹工整美观。
（二）、教态：教态明朗、快活、庄重，富有感染力。仪表端庄，举止从容，态度热情，热爱学生，师生情感交融。
（三）、语言：准确清楚，说普通话，生动形象有启发性。教学语调高低适宜，快慢适度。
六、从教学效果上分析
通过学生提问，能够反映出学生对知识的理解程度都比较好，能够准确的回答问题，说明对难点的讲解比较深入，将难点分解成一个个的小知识点，分别进行解决，这样在突破难点的过程中就能够步步击破，理解知识，并能够运用起来。
高中生物细胞的增殖知识点 篇7
意义：细胞以分裂的方式进行增殖，细胞增殖是生活细胞的重要生理功能之一，是生物体的重要生命特征。细胞的增殖是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。
方式：真核生物的分裂依据过程不同有三种方式，有有丝分裂，无丝分裂，减数分裂。其中有丝分裂是人、动物、植物、真菌等一切真核生物中的一种最为普遍的分裂方式，是真核细胞增殖的主要方式。减数分裂是生殖细胞形成时的一种特殊的有丝分裂。
2.生物细胞增殖分类
(1)有丝分裂
有丝分裂是真核生物进行细胞分裂的主要方式。(右上角图就是常见有丝分裂的开始和结果)多细胞生物体以有丝分裂的方式增加体细胞的数量。体细胞进行有丝分裂是有周期性的，也就是具有细胞周期。
细胞周期 细胞周期是指连续分裂的细胞，从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，这是一个细胞周期。
一个细胞周期包括两个阶段：分裂间期和分裂期。从细胞在一次分裂结束之后到下一次分裂之前，是分裂间期。在分裂间期结束之后，就进入分裂期。
在一个细胞周期内，这两个阶段所占的时间相差较大，一般分裂间期大约占细胞周期的90%到95%;分裂期大约占细胞周期的5%到10%。细胞的种类不同，一个细胞周期的时间也不相同。
(2)无丝分裂
细胞无丝分裂的过程比较简单，一般是细胞核先延长，从核的中部向内凹进，缢裂成为两个细胞核;接着，整个细胞从中部缢裂成两部分，形成两个子细胞。因为分裂过程中没有出现纺锤丝和染色体，所以叫做无丝分裂。
(3)减数分裂
细胞的减数分裂是一种特殊方式有丝分裂，它与有性生殖细胞的形成有关。它是进行有性生殖的生物，在原始的生殖细胞(如动物的精原细胞或卵原细胞)发展为成熟的生殖细胞(或卵细胞)的过程中，要经过减数分裂。在整个减数分裂过程中，染色体只复制一次，而细胞连续分裂两次。减数分裂的结果是，新产生的生殖细胞中的染色体数目，比新原始的生殖细胞的减少一半。例如，人的精原细胞和卵原细胞中各有46条染色体，而经过减数分裂形成的和卵细胞中，只含有23条染色体。
(4)二分裂
细菌可以以无性或者遗传重组二种方式繁殖，最主要的方式是以二分裂这种无性繁殖的方式：一个细菌细胞壁横向分裂，形成两个子代细胞。
细胞增殖实验方法 篇8
1 材料
1.1 主要试剂
胎牛血清 (FBS) :武汉三利生物工程材料研究所;四甲基偶氮唑蓝 (MTT) :Sigma公司;Rabbit Anti-ACTIN:武汉博士德生物工程有限公司;胰蛋白酶:Sigma公司;二甲基亚枫 (DMSO) :Sigma公司;碘化丙啶 (PI) :Sigma公司;Rnase酶:美国进口分装;其余试剂均为国产分析纯。
1.2 主要仪器
CK-TKc-3倒置相差显微镜:日本OLYMPUS;酶联免疫检测仪:芬兰Thermol Labsystems;FACSC Libur流式细胞仪:美国BD亚洲有限公司。
1.3 实验动物
健康Wistar清洁级大鼠, 体重约180g, 由湖北省预防医学院实验动物中心提供。
1.4 实验药物
补肾化痰降浊方:由魔芋精粉、枸杞、茯苓、山楂、决明子、山药、制首乌、陈皮、制半夏、山茱萸组成, 经水煎浓缩成1g生药/ml。
2 方法
2.1 大鼠主动脉VSMC的分离培养及传代鉴定 参照文献方法[1]。取大鼠胸主动脉小心剥去外膜, 刮下内膜, 贴块法培养VSMC, 制备细胞悬液, 在血细胞计数板计数;进行传代。待VSMC在培养瓶内铺满单层后, 弃原培养基, 用PBS液轻轻荡洗1次, 加入1ml的0.25%胰蛋白酶, 37℃条件下消化2～3分钟, 待单层细胞松动浮起时, 加入完全培养液终止消化, 用吸管轻轻吹打数次, 使细胞完全分散。在倒置显微镜下观察细胞计数, 用完全培养液稀释为1×106·ml-1的细胞悬液, 接种于培养瓶和培养板中, 37℃, 5%CO2下培养, 2～3天细胞贴壁生长, 即可用于实验。第二代的VSMC长满培养瓶约80%时, 用PBS清洗, 再用1ml 0.25%胰蛋白酶37℃条件下消化2～3分钟, 用吸管轻柔反复吹打, 将细胞吹散, 接种于6孔培养板中经多聚赖氨酸预处理的盖玻片上, 静置4小时后加入培养液, 镜下观察。当细胞铺满盖玻片后, 4%多聚甲醛固定, 进行抗α-actin细胞免疫组化染色, 倒置相差显微镜观察VSMC的阳性表达。
2.2 VSMC增殖的测定 将细胞稀释为1×103·ml-1, 接种于96孔培养板, 培养24小时, 换成无血清的DMEM培养液继续培养24小时, 使细胞静止于G0/G1期。分为对照组和不同浓度加药组。各组所用培养液均为含20%胎牛血清的DMEM培养液, 补肾化痰降浊方的浓度分别为0、10、20、40mg/ml, 每组设8个复孔, 继续培养48小时。MTT法检测。
2.3 VSMC细胞周期的检测 流式细胞仪检测。
2.4 统计分析 所有检测数据以均数±标准差undefined表示, 采用SPSS10.0统计软件包统计分析, 以单因素方差分析和组间t检验进行统计学处理。
3 实验结果
3.1 原代VSMC生长的形态学观察及鉴定
倒置相差显微镜下观察, 在贴壁5天后均可见细胞从不同的组织块边缘爬出, 细胞多呈梭形或长梭形, VSMC胞核多为卵圆形, 有一个或多个核仁, 胞浆丰富, 有时有暗色颗粒, 细胞间常有突起相连。原代培养VSMC胞体较小, 胞质折光性强, 7～10天后细胞已爬满瓶底, 即可进行消化传代。传代后VSMC突起增多, 胞质伸展, 较多分支状突起, 部分区域细胞重叠堆积生长形成典型的“峰”与“谷”的特点。通过抗α-actin免疫组织化学染色镜下观察细胞爬片, 可见细胞浆中大量平行丝条状阳性染色, 胞核不着色, 所有细胞染色结果均为阳性, 细胞纯度达95%以上。
3.2 补肾化痰降浊方对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响 结果见表1。
与空白组比较*P<0.05, **P<0.01
3.3 补肾化痰降浊方对VSMC细胞增殖周期的影响 见表2。
与空白组比较*P<0.05, **P<0.01
4 讨论
血管平滑肌细胞是AS斑块中的主要细胞, 其增殖在AS形成中具有十分重要的意义[1], 寻找有效的药物以抑制VSMC增殖具有重要意义。本实验结果显示20%FBS刺激VSMC增殖, MTT法检测细胞增殖明显升高, 而加入不同浓度的补肾化痰降浊方作用24小时后, 细胞增殖明显下降, 并呈一定程度的剂量依赖关系, 表明补肾化痰降浊方有明显抑制VSMC增殖作用。
细胞的增殖主要取决于DNA的合成, 对于同一细胞群来说, G0/G1期细胞所占比例越低, S期细胞所占比例越高, 表示该群细胞增殖越活跃。流式细胞仪检测结果显示补肾化痰降浊方对20%FBS刺激的VSMC增殖而发生的细胞周期改变有显著抑制作用, 使G0 /G1期细胞比例增加, S期细胞比例减少, 说明补肾化痰降浊方可使VSMC增殖周期停滞于G0 /G1期, 从而抑制VSMC增殖。
参考文献
细胞增殖实验方法 篇9
1.教学目标
1.简述细胞的生长和增殖的周期性。2.描述细胞的无丝分裂。3.概述细胞的有丝分裂过程。
2.教学重点/难点
教学重点：
真核细胞有丝分裂的细胞周期和有丝分裂的过程。教学难点：
真核细胞有丝分裂的细胞的染色体形态、数目、位置和运动的变化是一个动态而又微观的过程。
3.教学用具
教学课件
4.标签
教学过程
教学过程设计
（一）、导入新课
[师]从细胞水平来看，一个蛙的受精卵需要怎样的途径才能成为一只成蛙呢？ 学生小组讨论、代表回答：需要不断进行细胞体积的扩大与细胞分裂，还要细胞的分化等。
[师]细胞生物学的研究也证明了以上观点，生物体的体积增大，即生物体的生长，既靠细胞生长增大细胞的体积，还要靠细胞分裂增加细胞的数量。事实上，不同生物同类器官或组织的细胞大小一般无明显差异，器官大小主要决定于细胞数量的多少。
（二）、细胞不能无限长大
[师]细胞为什么不能无限长大？什么因素限制了细胞的长大？
[生]细胞体积越大，需要的营养物质越多，需要排出的代谢废物也越多，物质的输入和输出也会遇到困难。
[师]随着细胞的长大，细胞膜的面积不是也在扩大吗？下面通过模拟实验来探讨这个问题。
学生分组实验：①将实验桌上准备好的琼脂块（内含酚酞）切成边长分别为25px、2 cm、3 cm的立方体；②将以上三种琼脂块样品，同时置于盛有适量0.1%的NaOH溶液的烧杯中，处理10 min；③取出琼脂块样品，吸干浮液后，分别将每一样品切成两半，观察切面，测量每一切面上NaOH扩散的深度并记录数据。
学生活动：各小组对实验采集的数据进行讨论分析，小组代表陈述观点。分析：
（1）琼脂块的边长越长，NaOH在琼脂块中的扩散效率越差。
（2）边长为3 cm、2 cm、1 cm的琼脂块分别看作三个植物细胞的话，那么细胞表面积与体积的比值是依次增大的。
（3）因而，我们有理由相信，生物的异常旺盛的代谢与其细胞的S/V相对直接有关。细胞体积越大，其相对表面积越小，细胞的物质运输的效率就越低。[师]细胞表面积与体积的关系限制了细胞的长大。可见，生物体的长大主要靠细胞的数量增多，即细胞的增殖来实现。
（三）、细胞周期
[师]细胞以分裂的方式进行增殖。
[师]像草履虫、变形虫这些单细胞生物，细胞分裂有什么作用呢？ [生]通过细胞分裂可以产生后代，起到生殖和繁衍种族的作用。[师]对多细胞生物来讲，细胞分裂又有什么作用呢？
[生]细胞分裂可以增加体细胞的数目，是细胞分化、组织与器官形成的基础。[师]细胞的增殖是生物体生长、发育、生殖和遗传的基础。[师]下面我们就来探讨细胞增殖的问题。我们先以动物细胞为例，看看细胞是如何增殖的。
呈示多媒体信息：播放一段草履虫有丝分裂的视频。
[师]大家看到了一个动物细胞经过一系列复杂的变化，最后形成两个完全一样的子细胞，也就是说它完成了一次细胞增殖。并且这样的增殖具有周期性。科学家采用放射性同位素标记法，用32P标记蚕豆根尖细胞并观察它的有丝分裂过程，揭示了细胞周期的基本规律。
那么，什么是一个细胞周期呢？教师呈现细胞周期示意图。
一个细胞周期是指从一次细胞分裂结束开始，直到下一次细胞分裂结束为止的过程。这一周期实质上包括了细胞分裂的准备阶段——分裂间期和细胞分裂的实施阶段——分裂期。
[师]从图上我们可以看出，一个细胞周期可以用一个圆来表示，那么是不是圆上的任何一点都可以作为细胞周期的起点呢？ 学生活动：学生小组讨论并提出自己的见解。
[师]细胞周期对于不同类型的细胞持续的时间是不同的，请看屏幕。课件展示：
不同类型细胞的细胞周期持续时间比较表。
[师]从图中我们不难看出，不同类型细胞的细胞周期持续时间有长有短。大家仔细看一看，细胞周期在分裂间期和分裂期的时间分配是否平均？有什么规律？
学生活动:学生就提问进行思考，并提出自己的见解。
[师]不平均，分裂间期占用的时间远远多于分裂期所占用的时间，分裂间期占用了整个细胞周期的90%～95%，而分裂期只占用了5%～ 10%，这就是细胞周期的特点。细胞周期的这一特点充分说明了分裂间期这一准备阶段的重要性，下面我们来看一看分裂间期为分裂期的进行作了哪些准备？请看屏幕。教师演示分裂间期的动态画面，并提示大家注意观察细胞核内染色质的变化。教师出示间期结束时与开始时的比较画面，并提示学生观察。
目前同学们还没能看出它有什么变化。难道分裂间期就真的没有什么变化吗？下面我们把细胞内的一条染色质长丝单独放大，看前后发生了什么变化？ 教师演示放大的一条染色质长丝在间期开始时和结束时的比较画面。
[师]现在我们再看一看，细胞核内的一条染色质长丝经过间期发生了什么变化？ 学生观察、比较后回答提出的问题。
[师]间期开始时的一条染色质长丝变成了连在一起的两条染色质长丝。图像上的这种变化我们可以用染色体复制来加以描述。当然，此时的染色体还以染色质的形式存在。
（四）、有丝分裂
[师]染色体由哪几个部分构成？ [生]DNA和蛋白质。
[师]染色质的成分为DNA和蛋白质，分裂间期的染色体复制也就包含了DNA分子的复制和有关的蛋白质的合成。从图像上看，原来的每条染色质长丝都形成了两条一样的染色质长丝，并且这两条长丝是连在一起的。这说明原来每条染色质长丝中含有的一个DNA分子复制成了两个DNA分子。因此可以说，分裂间期为细胞分裂期准备好了双份的DNA分子。我们已经知道DNA是细胞内的遗传物质，那么，这双份的DNA分子是怎样平均分配到两个子细胞中去的呢？下面我们就来看看细胞分裂期是怎样进行的。分裂期是一个连续的过程，为了便于学习，人为地把它分为四个时期：前期、中期、后期和末期。下面我们就先来看前期是怎么进行的。
教师播放分裂前期的动态画面并指出观察的重点：细胞核内的染色质的变化以及细胞结构的变化。动态画面停止后，出示前期结束时与间期结束时的比较画面，并组织学生进行观察、比较、讨论。[师]细胞核中的染色质长丝发生了什么变化？ [生]细长的染色质长丝变成了染色体。
[师]从图像上大家已经看出，经过前期的变化，染色质长丝高度螺旋、缩短变粗，形成了染色体，所以细胞分裂前期的细胞核中出现了染色体。此时的每条染色体由两部分构成，每个部分叫一条染色单体。由于两条染色单体完全一样，因此称它们为姐妹染色单体。姐妹染色单体并不完全分离，而是由着丝点把它们连成一体，由于每条染色单体中各含有一个DNA分子，所以此时的每条染色体都含有2个DNA分子。
[师]除了染色质变成了染色体之外，再看看核膜、核仁有什么变化？ [生]核膜、核仁都不见了。[师]在细胞分裂前期，核膜解体了，核仁消失了。除此之外，我们还可以看到：细胞的两组中心粒发出了星射线，并由这些星射线构成了纺锤体。染色体散乱地分布在纺锤体的中央。
下面我们把前期的变化小结一下，教师出示投影片，前期的主要变化表格，并归纳总结。
前期细胞中出现了纺锤体，纺锤体中的纺锤丝又有什么用呢？下面我们就来看看分裂期的第二个阶段，中期是怎么进行的？请看屏幕。
教师播放细胞分裂中期的动态画面，并提示观察的重点：注意染色体是怎样运动的。动态画面停止后，出示中期与前期的对比画面。[师]染色体是怎样运动的？其结果是什么？
染色体是被连接在着丝点上的纺锤丝牵引着运动的。其结果是散乱分布在纺锤体中的染色体的着丝点都有序地排列在了细胞中央的赤道板上，为下一步的染色体分配作好了准备。下面我们来看着分裂期的第三个阶段——后期，染色体是怎样分配的？
教师播放分裂后期的动态画面，并指出观察重点：细胞中的染色体是怎么分配的？动态画面结束后，出示后期与中期静止的比较画面，并组织学生讨论。[师]细胞中的染色体是怎么分配的？ 学生讨论后回答。[师]（1）在细胞分裂的后期，从图像上看，每条染色体的两条姐妹染色单体分开，在纺锤丝的牵引下分别移向细胞的两极，图像上的这种变化我们叫做姐妹染色单体分离。
（2）染色单体是随着着丝点的分开而分离的。染色单体分离的结果是原来的一条染色体形成了两条完全一样的子代染色体，并且被分开的两条子代染色体分到了细胞的两极。这样我们在后期的图像中可以看到，细胞两极各有一套染色体，而且这两套染色体的数量和形态、结构都完全一样。现在可以说，细胞基本完成了染色体的平均分配。但是这时还没有形成两个子代细胞。那么怎样才能形成两个子代细胞呢？ 我们来看看分裂期的末期是怎么进行的。
教师播放分裂末期的动态画面，并指出观察重点：（1）细胞内有哪些主要变化？（2）两个子细胞是怎么分开的？
动态画面结束后，出示末期与后期的比较画面，并指导学生进行对比观察。细胞分裂的末期，细胞内有哪些主要变化？ 学生讨论后回答。
到达细胞两极的染色体逐渐变为染色质，核膜、核仁重新出现。在赤道板处细胞膜向内凹陷，细胞质一分为二，一个细胞缢裂成两个体积基本相等的子细胞。下面我们把末期的变化与前期的变化比较一下。
教师设置情境：出示前期、末期变化的对比表格，并引导学生逐项比较。[师]通过比较可以得出什么结论？
[生]在染色体、纺锤体的行为变化方面与前期存在着的变化逆转的关系。[师]经过一个细胞周期使一个细胞形成了现在的两个完全一样的子代细胞，也就是说它完成了一次有丝分裂。下面我们来回顾一下：在一个细胞周期内染色体是怎么变化的？依据板书进行总结。
请大家在绘图纸上以一对染色体为例，绘出细胞周期的各时期的染色体变化示意图。
绘图时希望大家思考所绘图像表达的含义。学生活动：学生依据板书提供的文字信息绘图。
师生互动：教师指导绘图，纠正错误，了解学生的绘图情况。绘图完毕后请个别同学在实物投影仪上展示自己的图。
刚才我们以一对染色体为例，绘制了细胞周期中各时期的细胞染色体变化示意图。现在我们再看一看各时期的细胞内各有几条染色体？又有几个DNA分子？请大家数一数，并把结果记录在细胞示意图的下方。学生活动：学生相互讨论，并把结果记录在绘图纸上。
教师引导：教师巡视指导。学生活动结束后，教师请个别同学公布结果，并进行点评。
下面我们把得到的结果在下列的坐标中用曲线表示出来。学生活动：学生绘制DNA和染色体的变化曲线图。师生互动：教师巡视指导，纠正错误。学生绘图完毕后，教师请个别同学在实物投影仪中展示自己的绘图，并进行适当点评。这两条曲线有何相同点？
学生活动：学生认真讨论、回答问题。
[师]最大的相同点就是两条曲线在间期和末期的数值都是一样的。间期记录的是亲代细胞的DNA和染色体的数量，而末期记录的是一个子代细胞内的DNA和染色体的数量。它们的数值一样，说明无论是DNA还是染色体，子细胞都与亲代细胞保持了一致。
子代细胞是两个，而亲代细胞只有一个，那么，它们的DNA和染色体为什么能保持一致呢？
学生活动：学生讨论后回答。
[师]DNA在间期由于复制而加倍，在末期再被两个子细胞平分。染色体在后期由于着丝点一分为二，姐妹染色单体分离，使染色体的数目加倍，在末期再被两个子细胞平分。从而使亲代和子代细胞中的DNA和染色体都保持了稳定。这正是有丝分裂的意义所在。
以上我们学习的是动物细胞有丝分裂的过程。那么，植物细胞的有丝分裂过程又是怎样的呢？出示植物细胞有丝分裂挂图。
学生活动：仔细观察、对比，并列表比较它们的异同点。
（五）、无丝分裂
[师]生物体中还有一种分裂过程相对简单的分裂方式就是无丝分裂。学生活动：阅读教材P72。[师]它和有丝分裂有何不同？哪些细胞进行无丝分裂？
[生]在分裂过程中没有出现纺锤体和染色体的变化，所以叫无丝分裂。如：口腔上皮细胞、蛙的红细胞等进行无丝分裂。教师演示“无丝分裂”课件，请学生叙述具体过程。[生]细胞核先延长，核从中部缢裂成两个子细胞。
（六）、有丝分裂的特点和意义
1、特点：在有丝分裂过程中，染色体复制一次，细胞分裂一次，结果是子细胞具有与亲代细胞数目、形态相同的染色体。
2、意义：保证了亲代与子代细胞间遗传性状的稳定性。
课堂小结
细胞分裂是一切具有细胞结构的生物体生长、发育和繁殖的基础，对于生物体维持生命活动具有重要意义。体细胞的分裂可分为有丝分裂和无丝分裂两种方式。有丝分裂包括分裂间期和分裂期。处于细胞分裂间期的细胞，不是静止的，而是在其内部进行着复杂而旺盛的生理、生化活动，因此细胞间期是整个细胞周期中极为关键的准备阶段，主要完成染色体的复制和有关蛋白质的合成，本节内容也是学习第二节、第三节内容的必要准备知识。安排“观察植物细胞的有丝分裂”的实验，就是要让学生通过动手操作，进行科学的观察和积极思维，深入理解有丝分裂的过程。
板书
第五章
第一节 细胞增殖
一、细胞不能无限长大
二、细胞周期
三、有丝分裂
四、无丝分裂