体外增殖（精选7篇）
体外增殖 篇1
摘要：为了筛选并验证蛹虫草中具有免疫活性的多糖,试验采用MTT法,在小鼠脾脏淋巴细胞培养体系中加入刀豆蛋白A(ConA)及终浓度为1,0.5,0.25 mg/L蛹虫草多糖培养48 h,观察其对小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖的影响。结果表明:蛹虫草多糖可显著促进体外培养的小鼠脾脏淋巴细胞增殖。说明蛹虫草多糖具有免疫增强活性。
关键词：蛹虫草多糖,小鼠,淋巴细胞,增殖
现代免疫药理学研究表明,虫草多糖能引起T淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞和巨噬细胞的活化及增殖,并分泌各种淋巴因子。虫草多糖主要是通过活化免疫因子和促进细胞因子生成等途径对免疫系统发挥双向调节作用。
蛹虫草,又名北冬虫夏草,属子囊菌亚门(Asco mycotina) 核菌纲(Pyreno-mycetes) 球壳目(Sphaerinles) 麦角菌科(Claviticpitaceae) 虫草属(Cordyceps) ,与冬虫夏草同属异种。现代药理学研究表明:蛹虫草多糖可以提高巨噬细胞NO、IL-1β和TNF-α产量;增强细胞因子的合成、CD11b表达及吞噬作用;抑制炎症反应及癌细胞的增殖;清除羟基自由基活性[1,2,3,4]。近年来,随着人们对蛹虫草多糖药用价值的认识,其开发、利用研究备受关注。由于虫草多糖的分子质量分布范围宽,而多糖分子质量过大或空间结构过于繁杂,都会影响其与特异性受体的结合,降低药理活性,只有在一定分子质量范围内,多糖才能更好地发挥免疫调节作用[5]。因此,试验对蛹虫草多糖进行分离和纯化,为进一步分离、提取到具有更高免疫活性的多糖提供试验基础。
1 材料
1.1 药品与主要试剂
蛹虫草子实体,购自上海某食用菌有限公司;刀豆蛋白A (ConA),Sigma公司产品;RPMI-1640培养基,Gibco公司产品;四氮唑盐(MTT),Fluka AG 公司产品;二甲基亚砜(DMSO,分析纯),中国医药集团上海化学试剂公司产品。
1.2 主要仪器
CO2恒温培养箱,西德Haraneus公司生产;ESCO生物安全柜,新加坡Esco科技有限公司生产;酶标仪Multiskan Mk3,Thermo公司产品;96孔细胞培养板,丹麦Nune公司产品。
1.3 试验动物
昆明小鼠,体重为(20±2)g,雄性,购自复旦大学实验动物中心。
2 方法
2.1 蛹虫草多糖的制备和分离
用10倍水于100 ℃提取蛹虫草2 h,过滤;药渣再用5倍水提取2次,每次2 h,过滤;合并滤液,将其浓缩至固形物的25%,然后加入3倍体积的95%乙醇,静置24 h;倾去上层液体,收集下层沉淀;流水透析3 d,再用纯化水透析3 d;然后冻干制备冻干粉(蛹虫草多糖,CMP);采用Sevage法去除蛋白,制得多糖(除蛋白多糖,CMP1),用苯酚-硫酸测定多糖含量[6]。将蛹虫草冻干粉过DEAE52柱进行分离,收集含糖峰,获得2个含糖峰组分,即CMPF1和CMPF2。
2.2 小鼠脾脏细胞悬液的制备
参照参考文献[7],小鼠颈椎脱臼处死,75%乙醇浸泡5 min,取出后右侧卧位放在超净工作台内的解剖板上;消毒左侧背腹交界处皮肤,无菌取脾脏,置于盛有5 mL预冷Hank’s液的平皿中;于200目不锈钢丝网上轻辗,使单个细胞滤过筛网进入平皿;吸取冷Hank’s液冲洗筛网,收集网下的细胞悬液注入无菌的10 mL离心管中;4 ℃、1 500 r/min离心10 min,弃上清液;加入适量Tris-NH4Cl溶解红细胞,吹打均匀,冰浴3 min;再次离心并用Hank’s液洗涤细胞3次,离心,弃上清液,用完全RPMI-1640培养基重悬细胞;0.2%台盼蓝染色,显微镜下细胞计数,当细胞存活率大于95%时,用完全RPMI-1640培养基调整细胞浓度至6×106/mL。
2.3 细胞培养及增殖作用的检测
将调整好的浓度为6×106/mL细胞悬液加入96孔细胞培养板中,每孔100 μL,每孔加入ConA 50 μL(终浓度5 mg/L),同时加入不同稀释度的蛹虫草多糖50 μL(终浓度为1,0.5,0.25 mg/L);在37 ℃、5%CO2培养箱中培养44 h,每孔加入MTT 20 μL;培养4 h后取出培养板,1 500 r/min离心5 min;每孔吸出上清液100 μL,再加入DMSO 100 μL,30 min内于波长570 nm处测定吸光度。
2.4 统计学分析
采用SPSS15.0统计软件对试验数据进行分析。
3 结果
3.1 蛹虫草多糖的分离
在蛹虫草多糖分离的过程中,20～29管收集的糖液为CMPF1,50～60管收集的糖液为CMPF2,见图1。
3.2 蛹虫草多糖体外对淋巴细胞增殖作用的影响(结果见表1和表2)
注:同列数据肩标字母相同表示差异不显著 (P>0.05),不同表示差异显著(P<0.05)。
由表1可知,CMP和CMP1均可显著提高淋巴细胞活性(P<0.05),相同浓度时CMP1的活性高于CMP(P<0.05),表明去蛋白后可以提高蛹虫草多糖的活性。
注:同列数据肩标字母相同表示差异不显著 (P>0.05),不同表示差异显著(P<0.05)。
由表2可知,蛹虫草多糖过DEAE52柱后,分段收集的多糖CMPF1和CMPF2活性均显著高于对照组(P<0.05),且CMPF1的活性比CMPF2活性更高(P<0.05)。
4 讨论
T淋巴细胞在体外培养时,受特异性抗原或非特异性抗原(如ConA)刺激后,可出现细胞体积增大、细胞代谢旺盛、蛋白与核酸合成增加等现象,并进行分裂增殖。根据T淋巴细胞转化增殖程度,可反映药物对细胞免疫功能的影响。 本试验从来自上海的蛹虫草中获得了具有体外提高淋巴细胞活性的CMP,去蛋白后可提高其活性;过DEAE52柱分离,分段收集含糖峰,得到具有活性的CMPF1和CMPF2,提示蛹虫草多糖具有免疫增强作用。
参考文献
[1]JONG S L,JEONG S K,DONG P W,et al.Study on macrophage ac-tivation and structural characteristics of purified polysaccharide fromthe liquid culture broth of Cordyceps militaris[J].Carbohydrate Pol-ymers,2010(82):982-988.
[2]MEI C K,CHIEN Y C,TSO L C,et al.Immunomodulatory effect ofexo-polysaccharides from submerged cultured Cordyceps sinensis:enhancement of cytokine synthesis,CD11b expression,and phagocy-tosis[J].Appl Microbiol Biotechnol,2007(75):769-775.
[3]YERRA K R,SHIH H F,WEN S W,et al.Constituents isolatedfrom Cordyceps militaris suppress enhanced inflammatory mediator’sproduction and human cancer cell proliferation[J].J Ethnopharma-col,2010,131:363-367.
[4]RONG M Y,WEI Y,LI Y S,et al.Structural characterization andantioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies ofcultured Cordyceps militaris[J].Carbohydrate Polymers,2007(70):430-436.
[5]王普,郑明,何军邀,等.虫草多糖的化学结构及药理活性研究进展[J].浙江工业大学学报,2010,38(2):129-133.
[6]许晓炜.蛹虫草固体培养基中虫草多糖、虫草素提取分离工艺研究[D].天津:天津大学,2006.
[7]陈子,李云森,周吉燕,等.香茶菜免疫活性成分的筛选研究[J].中药材,2005(11):1015-1017.
体外增殖 篇2
1 材料
1.1 玉屏风散的制备
由黄芪、白术、防风按3∶1∶1比例构成,即取黄芪90 g,白术、防风各30 g,采用煎煮法制备,第1次煎煮放入8倍体积的蒸馏水,浸泡30 min,然后用文火煎制1 h,双层纱布过滤去渣;再往滤渣中加入6倍体积的蒸馏水,煎制1 h,双层纱布过滤除渣。收集2次滤液,加热浓缩至每毫升含生药1 g,再将玉屏风散稀释成不同浓度,即1 000、500、250、125、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90和1.95 mg/m L,用0.22μm滤膜过滤除菌,分装于已灭菌的小试剂瓶中,于4℃保存备用。
1.2 试验动物
7日龄健康雏鸡由福建森宝有限公司提供。
1.3 主要仪器
美国Thermo(Forma)CO2培养箱(型号3111),超净工作台(苏州净化设备有限公司SW-CJ-1F型),酶标仪(Bio-rad公司,型号680),倒置生物显微镜(尼康Nikon TE2000型),96孔一次性细胞培养板(美国Costar公司),离心机(上海安亭科学仪器厂,型号80-2B),高压灭菌锅(ZDX-35BI型),一次性0.22μm微孔滤器(爱尔兰Millex公司),电热恒温鼓风干燥箱(上海-恒科技有限公司,DHG-9240A型)。
1.4 主要试剂[4]
Hanks液,RPMI1640培养基(GIBCO公司),刀豆蛋白A(Con A)(Sigma公司,5 mg),四甲基偶氮唑盐(MTT)(Amresco公司,250 mg),小牛血清(GIBCO公司),二甲亚砜,红细胞裂解液(Tris-NH4Cl)。
2 方法
2.1 鸡脾脏淋巴细胞悬液的制备
7日龄小鸡,正常放血处死。放入75%乙醇中浸泡3~5 min,移入超净工作台,在无菌条件下取出脾脏,置于盛有5~10 m L Hanks液的平皿中。剥膜后用注射器内芯轻轻碾碎,经100目铜网滤过。移入10 m L离心管,1 000 r/min离心10 min,吸弃上清液,加适量TrisNH4Cl,弯头吸管吹打,除去红细胞。静置3 min,1 000 r/min离心10 min,吸弃上清液,沉淀用RP-MI1640培养液清洗3次,最后用RPMI1640培养液重悬,弯头吸管吹打,调整细胞浓度为5×106个/m L[5,6]。2.2鸡脾脏淋巴细胞的培养和测定(MTT法)在96孔细胞培养板中分别加入细胞悬液100μL,10μg/m L的Con A 100μL及不同浓度的玉屏风散100μL,每个浓度重复4孔,同时设对照孔和无细胞的调零孔。置CO2培养箱(37.0℃、5%CO2)分别培养24、48、72 h,终止培养4 h前置于超净工作台内,各孔加浓度为5 mg/m L的MTT 10μL,继续培养4 h后取出,置于超净工作台内,每孔去上清100μL,加二甲亚砜100μL,室温放置20 min,用伯乐680型酶标仪于570 nm测其吸光值(OD值),作为淋巴细胞增殖的指标。试验重复3次,取其具有代表性的结果[7,8]。
2.3 数据处理
采用SPSS11.5统计软件,对所有试验数据进行单因素方差分析。
3 结果及分析
由表1可知,在不同培养时间(24、48、72 h),随着浓度的增加,玉屏风散能协同Con A对鸡脾脏淋巴细胞增殖的影响越来越大,在1.95~1 000 mg/m L范围内基本呈钟罩形(先升后降)。500 mg/m L的玉屏风散对鸡脾脏淋巴细胞增殖作用最强,与对照组相比,差异极显著(P<0.01)。以培养48 h的OD值最好,24 h与72 h的OD值相对会低一些。
注:同一列内肩标不同字母者表示平均数差异显著(P<0.05)。
4 讨论
1)脾脏是机体内最大的外周免疫器官,也是T淋巴细胞、B淋巴细胞定居和接受抗原刺激产生免疫应答的重要场所,以Con A为代表的有丝分裂原非特异性地诱导T细胞活化,导致细胞因子合成,细胞因子受体表达及最终活化的增殖。淋巴细胞转化率的高低可以直接反映淋巴细胞活力的高低,是测定T淋巴细胞免疫功能的重要指标之一[9]。因此,以一定浓度的玉屏风散在Con A的协同作用与鸡脾脏淋巴细胞作用下,用MTT比色法测定的结果显示,1.95~500 mg/m L的玉屏风散对鸡脾脏淋巴细胞的增殖影响越来越大,且以浓度为500 mg/m L的玉屏风散作用最强,玉屏风散浓度大于500 mg/m L时对脾淋巴细胞的增殖作用出现逐渐下降的趋势,并且以培养48 h为宜,培养时间太长会影响其增殖作用。表明玉屏风散在适宜的浓度下能增强淋巴细胞的活性。
2)该试验所用玉屏风散为粗提物,成分较复杂,至于何种成分能发挥免疫调节作用及其作用机制尚有待进一步探讨;该试验研究的是玉屏风散对体外培养的鸡脾淋巴细胞的影响,在鸡体内是否也具有促进淋巴细胞增殖的作用,有待进一步研究。
参考文献
[1]毕玉霞,周德忠,许剑琴."玉屏风散"对机体免疫功能的影响[J].中兽医医药杂志,2006(1):38-40.
[2]陈向涛,李俊.玉屏风散的药理学研究进展[J].安徽医药,2003,7(4):241-242.
[3]张红军,张晓莉,宋宝辉,等.玉屏风散对免疫抑制小鼠免疫功能的调节作用[J].细胞与分子免疫学杂志,2001,17(4):398.
[4]程宝鸾.动物细胞培养技术[M].广州:华南理工大学出版社,1999:151.
[5]杨发龙,岳华,罗薇,等.MTT法检测鸡外周血淋巴细胞增殖性反应的最佳条件探讨[J].西南民族学院学报,2002,28(2):214-215.
[6]聂小华,史宝军,敖宗华,等.黄芪活性成分的提取及其对淋巴细胞增殖的影响[J].无锡轻工大学学报,2003,22(4):49-51.
[7]郭丽丽,周勇,王旭丹,等.山茱萸分离提取物对脾淋巴细胞增殖的影响[J].北京中医药大学学报,2001,24(3):38-40.
[8]王德云,胡元亮,孔祥峰,等.中药成分对培养的鸡脾脏淋巴细胞增殖的影响[J].畜牧兽医学报,2005,36(11):1210-1214.
体外增殖 篇3
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器
低糖DMEM培养液(Hyclone公司,美国);胎牛血清、Ⅰ型胶原酶、0.25%胰蛋白酶、双抗(Gibco,美国);地塞米松(Sigma,美国);还原型谷胱甘肽(GSH)(Amersco,美国);中性蛋白酶Ⅱ(Roche,瑞士);MTS细胞增殖测定试剂盒(Promega,美国);HC- A离体肾保存液(上海长征医院);HBSS液(杭州吉诺公司);CO2恒温培养箱(Thermo,美国);酶标仪(Biocell,美国)。
1.2 人PDLCs的体外培养及鉴定
选取11～18岁因正畸拔除的前磨牙根中1/3的牙周膜组织,采用酶消化加组织块法消化进行人PDLCs原代培养[4]。使用含200 ml/L胎牛血清以及青霉素、链霉素各100 U/ml的DMEM培养液,在37 ℃、50 ml/L CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养。当原代人PDLCs长至约80%汇合时进行传代培养,培养的第4代细胞用于实验,并用ABC法行抗角蛋白、波形丝蛋白免疫组织化学染色鉴定人PDLCs的组织来源。
1.3 改良HBSS液(Hank's液)的配制
在HBSS液中添加青霉素、链霉素各100 U/ml,无水酒精溶解地塞米松后加入HBSS液中使其终浓度为8 mg/L。将上述HBSS液充分混匀后分成3 等份,分别添加GSH使其终浓度分别为1、3和5 mmol/L,然后用NaOH调节pH值在7.2～7.4之间,最后过滤消毒待用。
1.4 MTS增殖试验
取生长良好的第4代人PDLCs,消化,计数,用含100 ml/L胎牛血清的DMEM培养液制成细胞浓度为5×104/ml的悬液,以100 μl/孔铺于96 孔板,置于培养箱内培养24 h,细胞贴壁后换用含20 ml/L胎牛血清的DMEM培养24 h使细胞同步化。弃去原培养液,分别加入上述3 种改良HBSS液、HBSS液、HC- A液及蒸馏水各100 μl/孔,每种保存液设5 个复孔,同时设空白对照孔。96 孔板在室温(25 ℃)下置放0.5、1、2、6、12、24、48 h,达到上述时间后每孔加入20 μl MTS试剂,于37 ℃、50 ml/L CO2培养箱内孵育1 h,然后在酶标仪上于490 nm测量A值,实验重复3 次。
1.5 统计学分析
实验结果数据均以undefined表示,用SPSS 13.0软件采用单因素方差分析法,组间比较采用LSD法,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞原代培养情况
人PDLCs原代培养第5天可见细胞从组织块游出,细胞呈长梭形或星形(图 1)。原代培养12 d细胞达到80%汇合,可传代,细胞传代5 d后长满瓶底。因传至第7代时细胞生长明显减慢,故将第4代PDLCs用于实验。
2.2 细胞鉴定结果及生长曲线
第4代人PDLCs抗波形丝蛋白染色阳性(图 2A),胞质内有褐色阳性颗粒均匀分布;而抗角蛋白染色阴性(图 2B),胞质内未见阳性颗粒,符合间叶来源细胞特征,且无上皮细胞污染。MTS法测得的人PDLCs生长曲线(图 3)显示接种第3天细胞进入对数生长期,第7天进入平台期。
2.3 MTS增殖试验结果
从人PDLCs增殖活性测定结果看,HBSS液组和改良HBSS液组在0.5～48 h内显著高于HC- A液组和蒸馏水组(P<0.05)(后两者之间没有显著差异,P>0.05);含3 mmol/L和5 mmol/L GSH的改良HBSS液组在2～12 h显著高于HBSS液组(P<0.05);含1 mmol/L GSH的改良HBSS液组在2～6 h显著高于HBSS液组(P<0.05),其中,含5 mmol/L GSH改良HBSS液组在2～12 h显著高于含GSH的其它浓度组(P<0.05)。但含1 mmol/L GSH的改良HBSS液组在12 h时与HBSS液组无显著差异(P>0.05);另外,改良HBSS液组与HBSS组在24～48 h均无显著差异(P>0.05),但显著高于HC- A液组和蒸馏水组(P<0.05)(图 4)。
3 讨论
牙齿完全脱位时牙周膜受伤撕裂,残留在牙根面上的PDLCs就会失去原有的生理环境并很快发生坏死而不利于再植后的愈合。Cvek等[5]的调查研究显示牙脱位后干燥放置15 min、20～40 min和超过60 min的牙齿再植后分别有13%、40%和100%发生了置换性吸收。因此牙脱位后因多种原因不能即刻再植时,选择合适的介质进行保存就显得尤为重要。
HBSS液含有细胞生存必需的营养物质,且pH为7.2±0.2,渗透压320 mOsm/kg,是美国牙髓医师学会推荐的最佳牙齿保存液,其中美国市场上出售的一种名为Save- A- Tooth®牙齿保存液就是HBSS液[6]。关于HBSS液的研究报道,有的结果显示它是最合适的脱位牙保存液,也有研究认为它的效果没有牛奶好[2,3],这些不同的结果可能与实验方法、实验条件等不同有关。器官保存液研究的“金标准” UW液(university of Wisconsin solution,商品名ViaSpan®)是目前应用最广泛、效果明确的多器官保存液。Trope等[7,8,9]报道在ViaSpan®中保存过的犬牙再植后炎症性吸收发生率低;唇成纤维细胞在ViaSpan®中保存168 h仍有37.6%细胞存活,在HBSS中保存120 h已无活细胞存留;UW液中除了含维持渗透压的非渗透性物质、细胞供能物质外,还有一种重要的添加物—GSH[10](表 1)。还原型GSH是一种广泛存在于正常细胞中的生理活性物质,是细胞内氧化还原状态的一个主要决定因子。此外,有的器官保存液中还添加了少量的地塞米松,据报道地塞米松能保护细胞膜的完整性,还有辅助清除氧自由基的作用[11]。
本实验在HBSS液(存放6 个月)中添加了双抗、地塞米松与不同浓度的GSH配成改良HBSS液,结果发现改良HBSS液在2～12 h内保存人PDLCs增殖活性的效果明显好于HBSS液,而且这种效果随GSH浓度(在1～5 mmol/L 范围内)的升高而显著增强,提示在HBSS液中添加一定浓度的GSH会在短时间内(12 h)提高其保存PDLCs增殖活性的效果。但是,当保存时间超过24 h,改良HBSS液组与HBSS液组之间的效果差异则不太明显(图 4)。作者分析这可能与保存液中的代谢物质累积、营养物质消耗殆尽,进而影响到细胞线粒体酶的活性有关,此时已添加的GSH也很难发挥其抗氧化物破坏作用的效果。Buttke等[1]研究也证实犬脱位牙在添加了100 U/ml过氧化氢酶的HBSS液中保存45 min,其再植后的根面吸收率显著低于未添加过氧化氢酶组,但当保存时间延长到5 h时其根面吸收率显著增高。Souza等[12]的研究发现新鲜配制的HBSS液保存人PDLCs的效果显著高于存放6 个月和12 个月的HBSS液。本实验选择使用存放6 个月的HBSS液,主要是考虑到将来研究开发的脱位牙保存液应该是保存待用的液体,放置一定时间(保质期内)使用比较符合脱位牙保存的实际情况。
此外,本实验还发现国产肾保存液—HC- A与蒸馏水的作用相似,不适合保存人PDLC的增殖活性,这可能与HC- A液成分较UW液简单,不含谷胱甘肽、地塞米松等,且渗透压为380 mOsm/kg(这种高渗环境不利于人PDLC的存活)等[13]有关。
综上所述,本实验与HBSS液等比较观察了改良HBSS液对人PDLC增殖活性的影响,结果发现添加一定浓度GSH和地塞米松的改良HBSS液具有较好的保存人PDLC增殖活性的作用,但是,人PDLC在该改良液保存后细胞存活情况如何、能否增殖形成正常的细胞克隆,以及脱位牙在此液内保存后再植能否形成牙周膜愈合等问题目前还不清楚,今后作者将针对上述问题展开进一步的研究。
摘要：目的:观察改良HBSS液对体外培养人牙周膜细胞(PDLCs)增殖活性的影响。方法:在添加青霉素、链霉素各100U/ml、地塞米松8 mg/L的HBSS液中分别加入1、3和5 mmol/L的还原型谷胱甘肽(GSH)制成改良HBSS液,并与HBSS液、HC-A离体肾保存液及蒸馏水比较,用MTS法测定培养第4代PDLCs在上述溶液中保存不同时间后的增殖活性。结果:HBSS液组和改良HBSS液组在0.5～48h的PDLCs增殖活性显著高于HC-A液组和蒸馏水组(后两者之间没有显著差异),而改良HBSS液含3 mmol/L GSH组和5 mmol/L GSH组在2～12 h显著高于HBSS液组,1 mmol/L GSH组在2～6 h显著高于HBSS液组,5 mmol/L GSH组在2～12 h显著高于含GSH的其它浓度组。结论:改良HBSS液保存人PDLCs增殖活性的效果好于HBSS液,其中含5 mmol/L GSH的改良液在12 h内的效果最好。
体外增殖 篇4
关键词：猪伪狂犬病毒,纳米元素硒,体外增殖
硒是动物体内必需的微量元素，也是常用的饲料添加剂，具有多种生物活性。研究发现硒的缺乏与一些病毒感染的发生及病程有关，甚至还可能引起病毒毒力发生改变。缺硒可使无致病力病毒变为强致病力病毒。许多研究表明，硒对柯萨奇病毒、人类免疫缺陷病毒、鼠乳腺肿瘤病毒、流感病毒及甲型肝炎病毒等的感染有不同程度的抑制作用，与这些病毒引起的疾病的发生，发展及防治等都有密切的联系。伪狂犬病病毒可危害猪的呼吸系统、繁殖系统或中枢神经系统。猪群感染了伪狂犬病病毒后，流产率、死产率和断奶前死亡率常会增高。研究证实，当微小粒子进入纳米量级时，其光、热、电、磁等物理性质出现许多新的特性。对硒进行纳米化处理后，因纳米体系的庞大比表面，使键态严重失配，出现许多活性中心，表面台阶和粗糙度增加，表面出现非化学平衡，可以导致硒的性质特异性变化，从而展现出许多特有的变化。由于硒尺度的变化，这就使纳米元素硒与其他形式的硒相比具有较强的低毒高效优势。在急性毒性方面，无机硒为15mg/kg，钠米硒则为113mg/kg;在亚慢性毒性方面，饲料中无机硒或有机硒含量在4～5mg/kg时即可使大鼠体重下降和肝硬化，而纳米元素硒含量在6mg/kg时不会发生上述现象。纳米元素硒是已发现的急性毒性最低的补硒制剂。本研究的目的是从纳米元素硒对体外感染的影响入手，探讨猪伪狂犬病毒病的发病机制。
1 材料与方法
1.1 材料
伪狂犬病毒由中国兽医药品监察所提供，已经适应IBRS2细胞，并且通过PCR检测确认。IBRS2细胞购自中国兽药药品监测所;胎牛血清购自杭州四季青公司;PRIM1640培养基 (p H712) ，胰蛋白酶购自Gibco公司。
纳米元素硒：广州博仕奥生化技术研究有限公司提供，使用前配制成1mmol L-1贮备液，用0.22μm纤维素酯微孔滤膜除菌，分装后于4℃保存备用。将四唑盐 (MTT) (Sigma) 用pH7.4的0.01mol L-1PBS液配制成5mg m L-1溶液，用0.22μm混合纤维素酯微孔滤膜除菌，分装。
1.2 试验方法
1.2.1 细胞的培养与传代
按常规方法进行，将IBRS2细胞用0125%的胰酶消化后，吹打，使细胞分散，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基稀释成105～106m L-1，分装后置37℃5%CO2培养箱中培养。
1.2.2 MTT法测定纳米元素硒对细胞的毒性
将纳米元素硒设终浓度为0、1、2、5、10、15和20μmol L-1，分别添加到细胞的分散液中，然后添加到96孔板中，每孔012ml，每个处理4孔，48h后测定吸光值 (D) ;测定前4h在96孔培养板的每孔中加入30μl MTT溶液，测定时快速翻转培养板，甩去孔内培养液，每孔加入150μl裂解液DMSO，室温震荡10min使结晶物溶解，然后用酶联免疫检测仪测定D570值，作为细胞生长的指标。用SPSS统计软件求得x±SD，并进行差异显著性检验。
1.2.3 纳米元素硒对病毒体外感染的影响
将IBRS2细胞的分散液接种到24孔培养板上，每孔约1×105个细胞，添加0、1、2、5、10、15和20μmol L-17个浓度的纳米元素硒，各浓度中均加入100病毒蚀斑形成单位 (PFU) 的伪狂犬病毒，每个处理做3个样，另设3个空白细胞对照，37℃培养48h，收取上清液，测定PFU，将含有伪狂犬病毒的上清液用分散后的IBRS2细胞做10倍系列稀释，按105～106ml-1细胞浓度接种于24孔培养板各孔中，每孔1m1，置37℃培养，48h后移去培养液，添加含有1%琼脂糖的RPMI1640培养液于各孔中，每孔1ml，添加时的温度控制在42℃左右，然后置37℃继续培养，60h后观察并记录蚀斑形成情况。用SPSS统计软件求得x±SD，并做显著性检验。
2 结果与分析
2.1 纳米元素硒对细胞生长的影响
从表1可知，纳米元素硒在0、1、2、5、10、15、20μmol L-1时的D值差异不显著，说明纳米元素硒在1-20μmol L-1时不影响IBRS2细胞的生长，表明纳米元素硒的毒性非常低。
P<0.05
2.2 纳米元素硒对病毒体外感染的影响
由图1可知，不同浓度的纳米元素硒对伪狂犬病毒的增殖有不同程度的抑制作用，并随着浓度的增高其抑制作用增强。在纳米元素硒为2μmol L-1时，可抑制病毒的复制;在10和15μmol L-1时，对病毒的抑制作用最强。
3 讨论
本试验发现纳米元素硒在较低浓度 (0、1、2、5、10、15、20μmol L-1) 时，对细胞不产生毒性作用。这一结果与Huang等报道的在使用9μmol L-1亚硒酸钠时会对牛输卵管上皮细胞产生毒性作用有一定的差异，据此推测有机硒比无机硒对细胞的毒性低。本研究首次证实，纳米元素硒对伪狂犬病毒具有明显的抑制作用，且随着浓度的增加逐渐增强。
纳米元素硒与其他硒源相比有如下特点：(1)高生物活性。研究表明，与标准参照物比，纳米元素硒具有高效的生物功效。(2)高安全性。纳米元素硒为国内外有资料报道的安全性最高的晒制剂，它对小鼠的毒性为硒标准参照物的1/7～l/10，是已知的急性毒性最低的硒制剂。(3)纳米元素硒能显著刺激生物体的细胞、体液、非特异免疫功能，从而提高机体的防病、抗病能力(张劲松等，2001)。试验证明，纳米元素硒能灵敏提高小鼠的免疫功能。(4)高抗氧化纳米元素硒是由几万个硒化合物形成的一个微小单位，它的抗氧化、清除自由基能力更强，能很好地抑制自由基，保护细胞免受损害.已有试验表明，纳米元素硒体外清除羟自由基效率为无机硒的5倍，为有机硒的2.5倍。(5)高吸收率。由于纳米元素硒的粒度极细，易被动物胃肠道直接吸收充分利用，能更大限度地发挥其功能(夏枚生等，2006)。
纳米元素硒的众多特性和优点将使它在动物生产中的应用有广阔的发展前景。
参考文献
[1]Huang K H, Yang S G.Inhibitory effect of selenium on Cryptosporidi-um parvum infection in vitro and in vivo[J].Biol Trace Elem Res, 2002, 90 (13) :261-272.
[2]张劲松, 高学云, 张立德等.纳米红色元素硒的护肝、抑瘤和免疫调节作用[J].营养学报, 2001, 23 (1) :32-35.
体外增殖 篇5
关键词：肝细胞,内毒素,山羊,氨基胍,左旋硝基精氨酸,NG-硝基-L-精氨酸甲酯
内毒素血症是引起人、畜各种器官功能障碍,最终导致死亡的临床危症之一。尤其是反刍兽内毒素血症,更是给国家和人民造成了巨大的损失,严重影响了畜牧业的发展。因此,许多国家的研究人员都致力于内毒素血症致病机理的研究,以期最终根治此病。
肝脏损伤是内毒素血症病理发生过程中的关键机制。随着对内毒素血症研究的不断深入,人们发现内源性一氧化氮( NO) 在此病中起着十分重要的作用。研究表明,发生内毒素血症时过量的NO可引起微循环障碍,首先是激活内皮素,使得细胞聚集,中性粒细胞和血小板黏附,释放出细胞因子,产生活性氧自由基[1,2,3]。同时,NO的释放可致P450活性降低[4,5],这可能是由于NO与P450活性位点结合,使线粒体酶变性或失活,对肝脏造成损伤[6]。NO对血液动力学影响的最新研究表明,NO可降低血压,使血管平滑肌收缩性降低,血管阻力下降[7]。NO还可负调节心肌氧耗量,当抑制NO的形成时,就会提高心肌的氧消耗量,这是通过抑制线粒体肌酸激酶实现的[8]。
NO是诱导不同类型细胞产生许多病理代谢变化的介质分子,为了观察肝脏细胞功能障碍的发生是否与NO有关,试验通过体外培养肝细胞,应用不同的NO酶抑制剂( NOSI) 研究其对肝细胞增殖的影响。
1 材料
30日龄内海南东山羊,购自批发市场; 内毒素脂多糖( LPS) 、氨基胍( AG) 、NG - 硝基 - L - 精氨酸甲酯( L - NAME) 、左旋硝基精氨酸( L - NNA) ,均购自Sigma公司; 1640培养液,购自Gibco公司。
2 方法
应用肝脏原位两步胶原酶灌流法分离山羊肝细胞,将新分离的山羊肝细胞密度调节至( 1 ~ 5) ×105/ mL ,接种于96孔培养板上,孵育48 h; 去除培养液,按下述设计加入LPS、AG、L - NAME或L - NNA的条件培养液( CM) 1 mL ,每个浓度作3 ~ 5个复孔,孵育48 h; 去除上清液,每孔加5 mg /mL的MTT溶液20μL,7 h后每孔加DMSO 20μL,半小时后在酶标仪上测定OD490值。
试验分下列处理: 1) LPS组。每孔分别加入含LPS浓度为0,0. 1,0. 5,1,10μg / mL的CM 1 mL ,分别命名为空白对照组、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组。2) LPS + AG组。每孔加入的1 mL CM培养液中除含1μg /mL LPS外,还分别含0,0. 1,0. 5,1 mmol / L AG,分别命名为LPS对照组、B、C、D组,空白对照组同上。3)LPS + L - NAME组。加入的1 mL CM培养基中除含1μg /mL LPS外,还分别含0,0. 1,0. 5,1 mmol/LL - NAME,分别命名为LPS对照组a、b、c、d组,空白对照组同上。4) LPS + L - NNA组。加入的1 mL CM培养基中除含1μg / mL LPS外,还分别含0,0. 1,0. 5,1 mmol / L L - NNA,分别命名为LPS对照组α、β、γ、δ组,空白对照组同上。
试验结果以“平均值±标准误”表示,应用SPSS统计软件进行数据处理,Ducan’s法比较组间差异显著性。
3 结果
3. 1 LPS 对肝细胞增殖的影响( 见图 1)
由图1可以看出: 随着LPS浓度的增加OD490值是降低的,由于OD490值与肝细胞的增殖成正比,因此肝细胞的活细胞数是降低的。Ⅰ组、Ⅱ组与空白对照组相比差异不显著( P > 0. 05) ; Ⅰ组与Ⅲ组、Ⅳ组相比差异显著( P < 0. 05) ; Ⅲ组、Ⅳ组与空白对照组相比显著降低( P < 0. 05) 。说明LPS的浓度高会抑制肝细胞的增殖。
3. 2 LPS + AG 对肝细胞增殖的影响( 见图 2)
由图2可以看出: LPS + AG处理的肝细胞D组与B组、C组、LPS对照A组相比差异显著 ( P <0. 05) ,这说明随着AG浓度的增加,AG可以颉颃LPS对肝细胞增殖的抑制,使肝细胞的增殖水平在一定程度上恢复到正常。
3. 3 LPS + L - NAME 对肝细胞增殖的影响( 见图 3)
由图3可以看出: LPS + L - NAME处理的肝细胞c组显著高 于LPS对照a组,差异显著 ( P <0. 05) ,使吸光度达到最高水平,说明L - NAME可以显著抑制LPS对肝细胞的损伤作用。但d组显著低于c组( P < 0. 05) ,说明大剂量的L - NAME对LPS处理的肝细胞的增殖没有明显作用。
3. 4 LPS + L - NNA 对肝细胞增殖的影响( 见图 4
由图4可以看出,β组、γ组、δ组与空白对照组相比差异不显著( P > 0. 05) ,γ组、δ组与LPS对照α组相比差异显著( P < 0. 05) 。说明L - NNA可以逆转LPS的作用,使肝细胞的增殖维持正常水平。
4 讨论
内毒素是由革兰阴性菌产生的大分子质量的具多种生物活性的脂多糖物质。类脂A是内毒素分子中最重要的部分,对人体健康的危害最大,它可以启动与内毒素血症有关的宿主反应[9]。本试验用MTT法研究LPS对山羊肝细胞增殖的影响,结果表明,低剂量的外 源LPS对肝细胞 增殖影响 不大,而1μg / mL和10μg / mL的LPS显著抑制肝细胞的增殖,表现在其OD490值比空白对照组显著降低。由于OD490值与肝细胞的成活率是呈正相关的,说明LPS能剂量依赖性地抑制肝细胞的增殖,也说明内毒素对山羊肝细胞具有毒性作用。据报道,LPS可直接或间接引起肝细胞的损伤。R. Pagani等[10]认为,肝细胞上具有LPS受体,LPS通过与LPS受体结合被肝细胞摄取,经溶酶体降解后类脂A被转运至线粒体内膜,抑制了ATP合成酶和NADH脱氢酶的活性,使呼吸链终末氧化酶反应中氧分子接受的电子不是形成水而是形成过氧化氢,对生物膜造成直接损伤,从而导致肝细胞坏死; 而W. Schumer等[11]和R. Utili等[12]则观察到内毒素可以通过解偶联过程影响ATP生成,从而间接造成肝细胞的损害和坏死。A. Bast等[13]的研究发现,用LPS处理RAW 264. 7细胞可引起Prx基因表达的增加,则可能是细胞对氧化应激损伤的保护性反应。
体外增殖 篇6
1 材料与方法
1.1 材料
足细胞 MPC5为美国Mundel教授授权,北京大学第一医院儿科丁洁教授转赠。RPMI 1640培养基、胰蛋白酶-EDTA购自美国Gibco公司,胎牛血清购自美国Hyclone公司,Ⅰ型胶原购自美国BD Biosciences公司,重组小鼠γ-干扰素购自美国PEPRO Tech公司,DEX购自美国Sigma公司,GL(商品名美能,日本米诺发源制药株式会社产品)由深圳健安医药有限公司提供。四甲基偶氮唑蓝(MTT)及二甲基亚枫(DMSO)购自美国Sigma公司;倒置显微镜(德国Zeiss公司);酶标仪分析系统(Bio-Rad公司)。
1.2 方法
1.2.1 足细胞培养
自液氮罐取出足细胞,立即投入37℃温水中摇动1～2min使其融化,用吸管吸出细胞悬液,注入已加入新鲜培养液5ml的离心管,转速为1000r/min,离心4min,弃上清液,加入新鲜培养液吹散细胞,继而接种至涂有Ⅰ型胶原的25cm2培养瓶,于33℃、10 U/ml的重组小鼠γ-干扰素诱导下增生,待细胞融合至约85%,使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞后传代;继而接种到涂有Ⅰ型胶原的25cm2培养瓶或带盖玻片的24孔板,于37℃无γ-干扰素条件下培养10d使其分化,每2d换液一次。
1.2.2 建立PAN致足细胞损伤模型
参照文献[5]及既往实验,选用终浓度50mg/L PAN诱导足细胞损伤。
1.2.3 实验分组
设立对照组、PAN组、GL组、DEX组、PAN+GL组、PAN+DEX组。药物处理前,细胞先予不含血清的RPMI-1640培养液培养24h使细胞同步化。对照组用RPMI-1640培养液培养;PAN组加入终浓度50mg/L PAN;GL组加入不同浓度的GL,终浓度分别为50、100、200、400、600、800mg/L;DEX组加入终浓度1μmol/L DEX;PAN+GL组同时加入PAN(终浓度50mg/L)和GL(终浓度分别为50、100、200、400、600、800mg/L),PAN+DEX组同时加入PAN(终浓度50mg/L)和DEX(终浓度1μmol/L),于培养24、48h检测细胞增殖活性。
1.2.4 MTT检测细胞增殖活性
足细胞分化成熟后,用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞,离心4min,转速为1000r/min。弃上清液,将足细胞制成细胞悬液,以每孔5×103细胞数接种于96孔板中,每孔终体积为200μl。无血清培养液培养24h,更换培养液,按实验分组加入相应干预因素,对照组用RPMI-1640培养液培养,每组设12个复孔。于37℃、5%CO2孵箱内培养24h和48h。在培养结束前4h吸去上清液,每孔加入90μl培养液,再加入MTT溶液(5mg/ml)10μl,继续孵育4h进行显色实验,4 h后可见蓝紫色结晶。4h后终止培养,吸弃孔内培养上清液,每孔加入110μl的DMS0,摇床上振荡10min,使结晶物充分溶解。选择550nm为测量波长,630nm为参考波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(A值)。并根据A值计算细胞生长抑制率(IE)=(A0-Ai)/A0,其中IE表示药物对细胞增生抑制率,Ai表示实验组细胞值,A0表示对照组细胞A值。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件分析处理,计量资料以
2 结果
各实验组足细胞增殖A值和IE的比较 PAN组24h及48h时足细胞增殖A值较对照组均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),IE分别为55.56%、59.10%; GL组中不同浓度组24h时A值较对照组均明显降低,随着GL浓度增加,A值降低越明显,IE呈上升趋势,以高浓度组(800mg/L)降低更明显,IE达18.06%。组间两两比较,GL200、400、600mg/L间差异无统计学意义,其余各组间A值比较差异有统计学意义(P<0.01)。随着作用时间的延长,低浓度GL组(100～400mg/L)足细胞的IE48h时较24h明显降低;高浓度GL组(600～800 mg/L)抑制作用仍明显,较前有升高趋势(见图1)。除GL50mg/L组A值48h时与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),其余浓度GL组A值均较对照组均明显降低(P<0.01),且随GL浓度增加,A值降低越明显。DEX组足细胞增殖A值24、48h均较对照组均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),足细胞IE48h时较24h差异无统计学意义(P>0.05)。PAN组、PAN+GL组、PAN+DEX组24h、48h足细胞增殖A值较对照组均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与相比,PAN+DEX组足细胞增殖A值24h、48h时较PAN组均明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),IE分别为14.17%、16.53%;PAN+GL组中各组足细胞增殖A值24h及48h时均显著升高,且在50～600mg/L范围内呈现剂量依赖关系,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05),PAN+GL低浓度50mg/L组即可发挥保护作用,IE降至34.17%、38.94%,但随着剂量的增加,PAN+GL高浓度800mg/L组足细胞增殖活性不再增加,A值与PAN+GL200mg/L组比较差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。不同浓度GL组IE48h时均较24h时均有升高趋势,其中以PAN+GL400mg/L组上升幅度最不显著(见图2)。
3 讨论
GL又名甘草酸,是甘草中提取的一种三萜皂苷,分为 、 两种构型,美能为含 体甘草素的复方制剂,通用名为复方甘草酸苷,具有抗炎、抗病毒、抗生物氧化、免疫调节、抑制钙内流和保护细胞膜结构等多种作用。其立体构型和皮质醇相似,在体内可与皮质醇竞争结合l1-羟基类固醇脱氢酶,发挥类皮质激素样作用。临床研究及动物整体实验均证实GL对肾脏具有保护作用。宋明爱等[6]报道GL可以减轻慢性肾脏疾病尿蛋白的排泄,改善肾功能。刘长山等[7]报道GL可通过调节Bax、Bcl-2的表达抑制细胞凋亡,延缓糖尿病的发展。Li等[8]报道GL通过降低PAN肾病大鼠24h尿蛋白,减少肾组织LN、FN、COL和CTGF表达从而发挥保护肾功能作用。我们既往的研究表明GL对PAN肾病大鼠肾小球硬化早期有防护作用[9]。但GL在体外培养细胞中是否也能发挥类似保护作用以及对足细胞的直接影响作用究竟如何尚未见报道。本实验旨在观察不同浓度GL对足细胞增殖及受损足细胞增殖的影响作用,并与用于肾小球疾病方面研究的经典药物糖皮质激素进行比较,为GL用于临床治疗及进一步研究GL对足细胞特异性蛋白分子表达奠定实验基础。
足细胞是高度分化的终末细胞,增殖能力有限,正常生理条件下,损伤后不再增殖,但在病理条件下,足细胞可呈现增殖状态。有关对足细胞增殖影响的报道不多 。陈洪宇等[10]报道低密度脂蛋白和氧化低密度脂蛋白可以诱导小鼠肾足细胞增殖,强的松龙、缬沙坦能明显抑制足细胞增殖。王松等[11]报道成纤维细胞生长因子可刺激足细胞增殖,也有报道干预因素对足细胞增殖有双向调节作用,低浓度抑制足细胞增殖,高浓度促进足细胞增殖[12]。戴艳等[13]研究表明高糖抑制小鼠足细胞增殖,不同浓度表没食子儿茶素没食子酸醋(EGCG)干预后,高糖环境下足细胞增殖能力随着EGCG浓度的增高而增强。提示不同干预因素对足细胞增殖影响不同。PAN是诱导足细胞损伤的经典药物,本实验选用了50mg/L浓度的PAN致足细胞损伤,结果显示24h及48h足细胞增殖A值均较对照组明显降低,IE率分别为55.56%、59.10%,提示PAN显著抑制足细胞增殖,这与文献结果一致[5]。
糖皮质激素广泛应用于临床治疗各种以蛋白尿为主要表现、足细胞损伤为特征的肾小球疾病,对足细胞有直接的保护作用,但其确切作用机制和作用靶细胞尚未完全阐明。Ohashi等[14]报道糖皮质激素通过serum/glucocorticoid-induced kinase 1 (SGK1)调节足细胞分子nephrin磷酸化,发挥保护作用;Ransom 等[15]报道糖皮质激素可使足细胞中CNTF、热休克蛋白72和αB-crystallin表达上调,而这些保护性蛋白在细胞损伤中具有促细胞存活功能。体外实验还证实足细胞中存在糖皮质激素的功能受体,糖皮质激素可通过受体和非受体途径,对足细胞损伤具有一定干预作用[16,17] 。本实验观察了DEX对足细胞增殖的影响,结果表明,DEX组足细胞增殖A值24h、48h均较对照组降低,IE率分别为3.61%,3.92%,提示DEX对正常状态足细胞增殖有轻微抑制作用,48h对足细胞的抑制率较24h无明显变化。PAN+DEX组足细胞增殖A值24h及48h时较PAN组均显著升高,抑制率分别降至14.17%、16.53%,提示DEX能显著改善PAN对足细胞增殖的抑制作用。
目前从细胞水平研究GL报道较少见,Li 等[18]报道了甘草提取物对高糖诱导的系膜细胞的影响,可抑制IV型胶原分泌及CTGF表达,从而治疗防治糖尿病肾病。本研究观察了GL对足细胞增殖的影响,结果显示,除50mg/L组48h A值与正常对照组无差异外,其余各组A值均降低,提示不同浓度GL组24h及48h均对正常足细胞增殖抑制作用,随着浓度增加,抑制作用越明显,以800mg/L抑制最显著,IE分别为18.06%、19.89%。但24h时各组间比较,GL200、400、600mg/L间差异无统计学意义,48h时各组间比较,GL200、400mg/L组间无明显差异,提示GL抑制作用在24h、48h均呈现一定程度的剂量依赖关系。与PAN组相比,GL各组对足细胞增殖抑制作用轻微。不同时间点IE比较,低浓度GL组(100～400mg/L)48h对足细胞抑制作用较24h减弱,高浓度GL组(600～800mg/L)随着时间延长抑制作用仍明显,并有增强趋势,提示不同浓度GL作用时间不同,抑制程度不同。本研究还观察了GL对损伤足细胞增殖的影响,结果显示PAN+GL组中各组A值24h及48h时均较PAN组显著升高,组间比较,PAN+GL200、800mg/L组间无显著差异,其余组间差异明显,提示在50～600mg/L范围内,GL呈剂量依赖性降低PAN对足细胞增殖的抑制作用,PAN+GL50mg/L低浓度组即可发挥保护作用,IE 降至34.17%、38.94%,但PAN+GL800mg/L高浓度组足细胞增殖活性不再增加,与PAN+GL200mg/L组作用相当,差异无统计学意义。PAN+不同浓度GL组48hIE均较24h升高,提示随着时间延长,GL保护作用下降。其中PAN+GL400mg/L组下降幅度最小,提示GL发挥对足细胞损伤的保护作用与其浓度及作用时间有关。1μmol/L地塞米松为保护足细胞损伤的适宜浓度,本实验结果显示GL400～600mg/L组对足细胞的保护作用与浓度1μmol/L DEX作用相当,提示GL对受损足细胞在体外亦能发挥类似DEX的保护作用。
综上所述,PAN能显著抑制足细胞增殖;GL及DEX对体外培养的正常足细胞增殖有轻微抑制作用,其抑制程度与剂量及作用时间相关;二者均能显著降低PAN对足细胞增殖的抑制作用,且GL在一定范围内呈剂量依赖性关系,对PAN诱导体外培养足细胞损伤具有类似DEX的防护作用。但其发挥保护作用的具体作用机制以及是否与DEX作用机制类似将有待于进一步研究。
摘要：目的 通过建立嘌呤霉素(PAN)诱导小鼠足细胞MPC5损伤模型,观察甘草甜素(GL)及地塞米松(DEX)对足细胞及受损足细胞增殖的影响作用,探讨GL在体外培养足细胞损伤中是否具有类似DEX的防护作用。方法 体外培养小鼠足细胞,分为对照组、PAN组、GL组、DEX组、PAN+GL组、PAN+DEX组。对照组采用RPMI-1640培养液培养;PAN组加入终浓度50mg/LPAN;GL组加入不同浓度的GL,终浓度分别为50、100、200、400、600、800mg/L;DEX组加入终浓度1μmol/LDEX;PAN+GL组同时加入PAN(终浓度50mg/L)和GL(终浓度分别为50、100、200、400、600、800mg/L);PAN+DEX组同时加入PAN(终浓度50mg/L)和DEX(终浓度1μmol/L),培养24h及48h,采用MTT检测细胞的增殖活性。结果 与对照组相比,PAN组24h及48h时足细胞增殖的光密度(A)值均明显降低(P<0.01),抑制率(IE)分别为55.56%、59.10%;GL组中不同浓度组24h时A值较对照组均明显降低(P<0.01),48h时GL50mg/L组A值与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),其余各组A值较对照组均明显降低(P<0.01);低浓度GL组(100～400mg/L)对足细胞的IE48h较24h明显下降,高浓度GL组(600～800mg/L)对足细胞的IE48h较24h明显升高。DEX组24、48h足细胞增殖A值较对照组均明显降低(P<0.01),48h时足细胞的IE较24h时差异无统计学意义(P>0.05)。PAN+GL组50～600mg/L浓度范围内,24h、48h时足细胞增殖A值均呈剂量依赖性升高(P<0.01),但PAN+GL组800mg/L浓度时足细胞增殖活性不再增加。PAN+DEX组24、48h时足细胞增殖A值均明显升高(P<0.01)。结论 PAN能显著抑制足细胞增殖,GL及DEX对体外培养的正常足细胞增殖有轻微抑制作用,但二者均能促进受损足细胞的增殖,且GL在一定范围内呈剂量依赖性关系,对PAN诱导足细胞损伤具有类似DEX的防护作用。
体外增殖 篇7
关键词：钛,骨髓间充质干细胞,富血小板纤维蛋白,细胞黏附,细胞增殖
骨结合的形成是口腔种植成功与否的关键。种植体植入牙槽骨后, 未分化的骨祖细胞和多能间充质干细胞迁移至种植体骨界面, 与种植体表面产生早期的粘附, 影响细胞的增殖分化等一系列反应。骨髓间充质干细胞作为一种具有增殖和分化潜能的多能干细胞[1], 其在种植体表面黏附、增殖将直接影响着种植体骨整合的形成。
Choukroun's platelet-rich fibrin (PRF) 是新一代自体血液制品[2]。其降低炎性反应和抗感染作用已经得到认可, 已逐步应用到包括口腔种植等临床实践中。Dohan报道证明PRF可促进多种细胞增殖分化, 特别是其有促进BMSCs增殖并向成骨细胞分化的能力[3]。
本试验通过研究PRF对兔BMSCs在钛板表面黏附和增殖的影响, 模拟种植体表面骨结合初期BMSCs的细胞行为, 为临床种植应用和BMSCs体外增殖提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 兔骨髓MSCs的原代分离培养和传代培养
1月龄日本大耳兔, 10%水合氯醛2mL/kg (30 mg/kg) 于耳缘静脉缓慢注射麻醉, 用含有0.1 mL肝素 (1 250 U/mL) 的16号骨髓穿刺针于双侧股骨大转子后方穿刺吸取骨髓血3mL注入离心管中, 收集界面上黄白色雾状层, 以1500 r/min离心5 min, 弃上清, 加入含PBS培养基使细胞混匀沉淀, 加入25cm2培养瓶中 (含体积分数为1O%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养液) 中, 在37℃, 5%CO2的恒温培养箱内培养。每3d换一次液, 倒置显微镜下观察, 待细胞铺展至培养瓶底约80%后, 以0.25%胰蛋白酶常规消化、传代。
1.2 细胞表面抗原标记
取活力较好的P3细胞, 分别加入CD90, CD34抗体孵育。流式细胞仪检测细胞表面抗原表达情况。
1.3 钛板制备
成品钛板经喷砂处理后, 切割成10mm×10mm大小。经丙酮, 酒精, 蒸馏水分别清洗20min。再依次浸泡在5 mol/L, 60℃恒温的NaOH溶液和80℃的蒸馏水中各2 h。高压蒸汽消毒后备用。
1.4 PRF的制备
从抽取骨髓的同一只家兔的耳中央动脉抽取全血10mL与离心管中。取等量蒸馏水配平后迅速置于离心机中, 3000r/min 10min。将离心产物弃上清, 取出中间的PRF, 用消毒剪剪去下部红细胞凝块, 静置备用。
1.5 细胞黏附增殖的测定
取生长良好的第三代BMSCs, 用DMEM培养液将其浓度调整为1×105/mL, 以1mL/孔接种于24孔板中的钛片上。试验组的盖上静置备用的PRF凝胶。对照组不盖PRF。两组同时进行细胞增殖, 同时进行一式三份的试验。分别在24h、48h、72h进行后续检测试验。
1.6 MTT检测
分别取细胞, PBS漂洗10min去除未粘附细胞, 置于另一块24孔板中, 按试剂盒说明, 每孔加入500μL培养液和50μL MTT底物, 继续培养4 h, 吸除培养液, 每孔加入500μL溶解液, 继续培养20 min, 振荡3 min, 用分光光度计570 nm波长测吸光度值, 结果采用t检验进行统计分析、比较两组之间的差异。
1.7 吖啶橙荧光染色
分别取三个时间点的两组钛板, 经PBS清洗3次, 95%的乙醇固定后, 吖啶橙3, 6- (二甲胺基) 吖啶盐酸盐染色, 于荧光显微镜下观察BMSCs在钛片上的粘附与伸展情况。
2 结果
2.1 细胞表面抗原标记
流式细胞仪结果显示:CD34阳性率为0.8%;CD90为98.7%。
2.2 MTT检测结果
培养24 h、48 h时, PRF组的细胞MTT值高于对照组 (P<0.05) 见图1, 而在培养72 h时, 两组间没有统计学差异 (P>0.05) , 见图1。
2.3 荧光显微镜观察
两组钛板上的BMSCs均随着培养时间延长而增多, 24 h和48h时PRF组的钛片上粘附的BMSCs明显多于对照组, 而且细胞形态伸展好、成梭形, 见图2、图3。在培养72 h后两组钛片上粘附的BMSCs未见明显差异。
3 讨论
目前MSCs表面标记物研究结论还很不一致, 尚无统一标准。Dominici M于2006年发表了关于MSCs鉴定的最低标准中提出MSCs能表达CD105、CD73、CD90, 不表达CD45、CD 34、CD14或CD11b、CD11b、CD19及HLA-DR表面分子[4]。本试验中的细胞高表达CD90, 不表达造血干细胞标记CD34, 可以认定为间充质干细胞。
试验用钛板作为模拟种植体的模型进行细胞培养的载体, 由于钛板本身不透光, 常规光镜下无法直接观察细胞形态。因此用吖啶橙荧光染色作为观察方法。吖啶橙能透过细胞膜使核DNA和RNA染色, 在荧光显微镜下使DNA发绿色荧光, RNA发橙黄色或橘红色荧光。处于增殖状态的干细胞, 胞浆中含大量RNA, 所以可借助荧光描述出细胞的大致形态。
细胞黏附是多细胞机体的重要性状, 是细胞行为的基础。处于不同黏附阶段的细胞呈现不同的细胞形态, 试验中采用荧光免疫荧光法观察发现, 起初附着细胞呈网形、梭形、三角形不等, 而后伸出伪足。24h时PRF组钛表面上黏附的BMSCs多余对照组。并且细胞形态较好, 成梭形。这意味着该组细胞能够较早进入黏附时相。可能是因为PRF中血小板中包括血小板黏表面黏附分子, 纤维结合蛋白等活性成分在PRF中能够缓慢释放的原因。
MTT比色法, 其原理为线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性MTT还原为水不溶性蓝紫色结晶甲瓒, MTT结晶形成量与细胞数成正比。因此可以反映活细胞数量。从而评估细胞的增值能力。本试验中24h及48小时PRF组均大于对照组, 可证明PRF对细胞黏附及增值具有促进作用。PRF对BMSCs的增殖作用的机制可能有如下几个方面: (1) 血小板的颗粒成分和包膜对细胞有丝分裂起着作用[5]; (2) PRF中富含的生长因子[6]可以促进细胞有丝分裂, 特别是血小板衍生生长因子 (PDGF-AB) 具有强大的促细胞增殖能力[7,8]; (3) 除了生长因子外, 促进细胞的有丝分裂要归因于PRF中的白血球、致密的纤维基质和糖蛋白结构。PRF的纤维基质成分可促进干细胞增殖和活化, 有利于细胞迁移[9]。
4 结论
骨损伤的修复过程分为两种形式: (1) 软骨内成骨:由MSCs聚集并分化软骨细胞, 形成软骨组织, 然后由骨组织逐渐取代软骨组织, 最终完成骨化; (2) 膜内成骨:由骨膜内MSCs直接分化成为成骨细胞形成骨组织。因此, 种植体植入后, MSCs迁移至种植体的数量和在种植体表面增殖和粘附的速度将直接影响骨的重建和愈合。
本试验证明PRF能够促进兔骨髓间充质干细胞在钛板上的黏附和增殖。作为体外培养BMSCs的具有可行性[10], 作为组织工程的动物试验和临床应用具有很大的研究价值。但由于PRF自身体积和重力原因, 物理作用是否会对细胞黏附造成影响尚不得而知。并且由于兔BMSCs与人的相比仍有一定差异, 有待于进一步研究。
参考文献
[1]Caplan AI.Mesenchymal stem cells[J].J Orthop Res, 1991, 9 (5) :641-650.
[2]Dohan DM, Choukroun J, Diss A, et al.Platelet-rich fibrin (PRF) :Asecond generation platelet concentrate.Part I.Technological conceptsand evolution[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral RadiolEndod, 2006, 101:37.
[3]Dohan Ehrenfest DM, Doglioli P, de Peppo GM, et al.Choukroun'splatelet-rich fibrin (PRF) stimulates in vitro proliferation anddifferentiation of human oral bone mesenchymal stem cell in a dose-dependent way[J].Arch Oral Biol, 2010, 55 (3) :185-194.
[4]Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al.Minimal criteriafor defining multipotent mesenchymal stromal cells.TheInternational Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy, 2006, 8 (4) :315-317.
[5]Gruber R, Varga F, Fischer MB, et al.Platelets stimulateproliferation of bone cells:involvement of platelet-derived growthfactor, microparticles and membranes[J].Clin Oral ImplantsRes, 2002, 13:529-535.
[6]Kawase T, Okuda K, Saito Y, et al.In vitro evidence that the biologicaleffects of platelet-rich plasma on periodontal ligament cells is notmediated solely by constituent transforming growth factor-beta orplatelet-derived growth factor[J].J Periodontol, 2005, 76:760-767.
[7]Celotti F, Colciago A, Negri-Cesi P, et al.Effect of platelet-richplasma on migration and proliferation of SaOS-2 osteoblasts:roleof platelet-derived growth factor and transforming growth factor-beta[J].Wound Repair Regen, 2006, 14:195-202.
[8]Ogino Y, Ayukawa Y, Kukita T, et al.The contribution of platelet-derived growth factor, transforming growth factor-beta1, and insulin-like growth factor-I in platelet-rich plasma to the proliferation ofosteoblast-like cells[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral RadiolEndod, 2006, 101:724-729.
[9]Bensaid W, Triffitt JT, Blanchat C, et al.A biodegradable fibrinscaffold for mesenchymal stem cell transplantation[J].Biomaterials, 2003, 24:2497-2502.