骨髓内皮细胞增殖研究论文

骨髓内皮细胞增殖研究论文（精选8篇）

骨髓内皮细胞增殖研究论文篇1

【摘要】本研究以内皮细胞培养液（EndoM）培养小鼠骨髓内皮细胞，探讨粒巨噬系集落刺激因子（rmGMCSF）对骨髓内皮细胞增殖的影响。用EndoM培养小鼠骨髓内皮细胞，通过WrightGiemsa染色计数内皮细胞集落、应用免疫荧光法观察内皮细胞表型；加入不同浓度的GMCSF，通过集落形成率、MTT法和流式细胞术检测内皮细胞生长周期，观察GMCSF对内皮细胞体外扩增的影响。结果表明： EndoM诱导的骨髓细胞可以生成内皮细胞集落，vWF检测呈阳性；集落形成率检测及MTT法测定均证实GMCSF对内皮细胞的增殖具有明显的促进作用；生长周期检测结果显示，GMCSF处理组的细胞进入S期的比率为9.3%，而对照组为2.1%，说明GMCSF可以通过促使内皮细胞进入S期而加快细胞的分裂，促进细胞增殖；比较第1代和第4次传代后细胞的生长曲线，两者无明显差别，说明多次传代后的细胞仍保持传代早期的增殖潜能。结论： GMCSF对内皮细胞的增殖具有促进作用，经多次扩增传代后内皮细胞的增殖潜能无明显改变。

【关键词】骨髓内皮细胞　GMCSF　细胞增殖

Effects of GranulocyteMacrophage Colony Stimulating Factor on Growth of Murine Bone Marrow Endothelial Cells

Abstract The purpose of this study was to investigate the effects of granulocytemacrophage colony stimulating factor(GMCSF)on the growth of mouse bone marrow endothelial cells.Endothelial cell culture medium（EndoM）was used to culture murine bone marrow endothelial cells.Endothelial cell colonies were counted under microscope by WrightGiemsa staining.The effect of different concentriation of GMCSF on the proliferation of bone marrow endothelial cells was observed by the formation of endothelial cell colonies, MTT and flow cytometry.The results indicated that the endothelial specific marker vWF was expressed by the colony cells ,GMCSF promoted the proliferation of bone marrow endothelial cell colonies and MTT confirmed the effect of GMCSF on promoting the proliferation of bone marrow endothelial cells.The result of detecting cell cycle showed that the rate of cells entering into S phase was 9.3% in GMCSF added group and the rate of cells entering into S phase was 2.1% in control.There was no significant difference in cell growth curve between the first passage and fourth passage.It is concluded that GMCSF can promote the proliferation of bone marrow endothelial cells, the proliferation potential of bone marrow endothelial cells between the first and fourth passage no significantly changes.Key words bone marrow endothelial cells;GMCSF;proliferation

J Exp Hematol 2007;15(3):622-62

5目前，已有许多报道证明内皮细胞（endothelial cells, EC）、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EpC）可以用来治疗缺血性心脏病以及各种疾病引起的肢体缺血［1,2］也可以用于组织工程的血管构建［3］，并取得了一定的成果。Kawamoto等［4］报道，EpC对缺血心脏病进行治疗具有良好的效果，一方面减少了缺血组织的面积，同时改善了心脏的功能。Kalka等［5］则报道了利用EpC对肢体缺血的小鼠模型进行治疗，实验结果表明了EpC能显著增加缺血肢体的灌流，而且组织学检查发现缺血部位毛细血管的数目也大大增加。内皮细胞的来源有多种，可以从外周血、脐血及骨髓中获得［6］，而外周血中的内皮祖细胞来源于骨髓。从病人自体的骨髓中获得内皮细胞，一方面来源比较方便，而且也可以避免GVHD的发生。但是由于骨髓基质细胞种类多，难以分离纯化骨髓内皮细胞或内皮祖细胞。本研究用本实验室配制的内皮细胞培养液（EndoM）体外培养小鼠骨髓细胞，分离纯化骨髓内皮细胞及内皮祖细胞，并观察粒巨噬系集落刺激因子（rmGMCSF）对小鼠骨髓内皮细胞体外增殖的影响以及体外增殖后内皮细胞增殖机能的改变，这对临床运用内皮细胞或内皮祖细胞治疗疾病有一定的指导意义。

动物

昆明小鼠，由中南大学湘雅医学院动物学部提供，雌雄不限，普通饮食。

主要试剂和仪器

IMDM为Gibco公司产品；新生牛血清购自杭州四季清生物制品研究所；重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子（rmGMCSF）为R&D公司产品；vWF抗体、CY3标记的羊抗兔IgG为Sigma公司产品；MTT、二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品；酶标仪为Awarens公司产品；CO2 培养箱购自美国Forma。

小鼠骨髓内皮细胞及内皮细胞集落的培养

用颈椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下取出股骨，用IMDM冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，取1×106个小鼠骨髓单个核细胞种入1 ml含有15%新生牛血清的EndoM 培养体系，置于24孔板中，于37℃、5% CO2、饱和湿度下培养5天后,用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按每孔1×104个细胞种入24孔板，每组3孔。于二氧化碳培养箱内培养15天后计数内皮细胞集落数，以≥50个细胞的聚合计为1个集落。

内皮细胞的形态观察及vWF的检测

培养的骨髓内皮细胞集落经WrightGiemsa染色后，显微镜下观察内皮细胞形态。用间接免疫荧光法检测骨髓内皮细胞vWF。将内皮细胞培养于24孔板内放置的盖玻片上，当细胞间没有明显的间隙时，取出盖玻片，用pBS清洗，用4%的多聚甲醛固定30分钟，用pBS洗3次：2%的正常羊血清封闭4小时，加入v WF抗体，4℃过夜，用pBS洗3次，加入二抗CY3IgG，37℃孵育60分钟,pBS洗3次：置于荧光显微镜下观察。以本室建的小鼠骨髓内皮细胞株［7］为阳性对照，骨髓成纤维细胞为阴性对照。

不同浓度的GMCSF对小鼠骨髓内皮细胞形成集落的影响

取纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于24孔板中，每孔5 000个细胞，在基本培养体系（含1%浓度EndoM）的基础上分别加入5、10、25 ng/ml的 rmGMCSF，对照组不加入GMCSF，每组3孔。置于CO2培养箱培养15天，于倒置显微镜下记数集落数，≥50个细胞的聚合计为1个内皮细胞集落。

GMCSF对内皮细胞增殖影响的MTT法测定

将纯化的小鼠骨髓内皮细胞按5 000个/孔培养于96孔板，每孔0.2 ml，每组3孔。实验组培养体系中分别加入5、25、100 ng/ml的rmGMCSF，对照组内不加。在37℃、5% CO2、饱和湿度下分别培养5天和10天，取出培养板吸去培养液，然后加入无血清的IMDM 180 μl和20 μl MTT溶液，放入培养箱孵育4小时，吸去液体，各孔加入DMSO 150 μl，振荡10分钟，使结晶充分溶解。选择492 nm波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值（OD492）。

生长曲线

纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于96孔板中，每孔5 000个细胞，加0.2 ml含15%新生牛血清的基本培养液，并加入25 ng/ml的rmGMCSF。共种6组，每组3孔，培养5天后，分别于第7、9、11、13、15天用胰酶消化后计数细胞，每次3孔，求平均值，做出生长曲线。按公式 DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第1代内皮细胞生长的倍增时间。

细胞周期的流式细胞术检测

无菌条件下取小鼠骨髓单个核细胞，按2×106个细胞种于6孔培养板中（2 ml培养体系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5% CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入两种不同培养体系，对照组加含15%新生牛血清的IMDM，实验组加15%新生牛血清的IMDM和100 ng/ml的rmGMCSF，每组各10孔，置于CO2培养箱培养3天后，用胰酶消化细胞，200×g, 离心5分钟，用pBS洗涤细胞2次之后，用300 μl pBS重悬细胞，加入冰冷的乙醇（-20℃）约700 μl（终浓度为70%），将细胞放于-20℃过夜处理后，用流式细胞仪检测细胞周期。

细胞传代培养

取小鼠骨髓单个核细胞，按2×106个细胞种于6孔培养板中（2 ml体系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5% CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入15%新生牛血清的IMDM培养液和100 ng/ml的rmGMCSF，促使细胞融合，再按1∶4传代于6孔板中，同样加入15%新生牛血清的IMDM和100 ng/ml的rmGMCSF，等细胞生长至融合，按1∶4传代，加入相同培养体系。按上述方法传4代后，绘制生长曲线，方法同前。公式 DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第4代内皮细胞生长的倍增时间，并与第1代的倍增时间进行比较。

统计学处理

实验数据为3次结果，以mean±SD表示。不同处理组两组间比较采用t检验，应用SpSS软件分析，p<0.05表示有统计学意义。

结果

细胞形态每孔种入小鼠骨髓内皮细胞5 000个，对照组加基础培养液,实验组在基础培养液的基础上分别加入rmGMCSF 5、10、25 ng/ml。与对照组相比，实验组集落数均明显增多（图3），说明rmGMCSF对小鼠骨髓内皮细胞的增殖有明显刺激作用。

rmGMCSF对内皮细胞增殖的影响

小鼠骨髓内皮细胞培养5、10天，分别进行MTT的检测，结果表明rmGMCSF对小鼠骨髓内皮细胞生长促进作用明显，各组与对照组相比差异显著（p<0.01）（图4）。

GMCSF对EC细胞周期的影响

运用流式细胞仪检测细胞周期，观察GMCSF对EC细胞周期的影响。结果显示GMCSF使细胞进入S期的比例为9.3%，与对照组2.1%相比有明显差别。此结果说明GMCSF能够促使细胞进入S期，加快细胞的分裂，从而促进了细胞的增殖（图5）。Figure 5.Effect of GMCSF on cell cycle of endothelial cells.A: group treated by GMCSF.B: control group.体外扩增传代对内皮细胞增殖的影响

图6为小鼠骨髓第1代和第4代内皮细胞的生长曲线。利用计算公式［DT=t×1g2/(1gN-1gN0)］计算出第1、4代细胞生长的倍增时间分别为30.25±0.55小时、31.67±0.26小时。第1代与第4代的细胞倍增时间相比，无明显差异，表明经体外扩增传代4次，仍能保持传代早期的增殖潜能。

Figure 6.Growth curve of the first and fourth passage generations of murine bone endothelial cells.讨论

国内外对于骨髓内皮细胞的纯化报道较少，但已经进行了一些关于细胞因子对内皮细胞增殖影响的研究，如Yonekura等［8］报道VEGF可以促进内皮细胞的增殖，Rieck等［9］则报道bFGF可促进角膜内皮细胞的生长。我们此前曾报道了VEGF、bFGF、SCF、IL

6、GMCSF等对内皮细胞株的增殖有促进作用［10］。GMCSF对未经转化的骨髓内皮细胞增殖的作用尚未见报道。本研究中，我们用本室配制的培养基在较短的时间内纯化了小鼠的骨髓内皮细胞，vWF为阳性，并在此基础上观察了GMCSF对骨髓内皮细胞增殖的影响。应用基本培养基培养内皮细胞集落时，形成的集落数较少，加入rmGMCSF后，集落生成明显增多。MTT的结果亦支持GMCSF对小鼠骨髓内皮细胞生长的刺激作用。细胞生长曲线的结果表明，在含GMCSF培养的条件下，内皮细胞生长的倍增时间为30.25±0.55小时，经4次传代后细胞倍增时间无明显延长，表明体外培养扩增4代后，细胞仍能保持早期的增殖能力，GMCSF对骨髓内皮细胞的体外增殖有明显刺激作用。文献报道内皮细胞表面有 GMCSFR的存在，而内皮细胞本身也可以分泌GMCSF［11］。结合细胞周期测定的结果，可以认为，GMCSF促内皮细胞增殖的机制可能是GMCSF与GMCSFR结合，通过细胞内信号传递使更多的细胞进入S期来实现的。

【参考文献】

1Luttun A, Carmeliet G, Carmeliet p.Vascular progenitors :from biology to treatment.Trends Cardiovasc Med, 2002;12: 88-96

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5Kawamoto A, Tkebuchava T, Yamaguchi J, et al.Intramyocardial transplantation of autologous endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization of myocardial ischemia.Circulation, 2003;107:461-468

6Hristov M, Erl W, Weber pC.Endothelial progenitor Cells: isolation and characterization.Trends Cardiovasc Med, 2003;13:201-206

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骨髓内皮细胞增殖研究论文篇2

1 EPCs的概况

1.1 EPCs的来源

自1997年Asahara等[2]首次将EPCs从成人外周血中分离出来, 并证实其能表达内皮细胞标记物, 分化成为成熟血管内皮细胞。有些文献[2-3]认为EPCs与造血干细胞同起源于胚外中胚层卵黄囊的血岛, 由血液/血管母细胞发育而来。目前有研究证实, EPCs在成人体中主要分布于外周血、骨髓和脾等。机体在需要时能在血管内皮生长因子 (VEGF) 、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-csf) 等细胞因子的作用下从骨髓增殖、迁移、归巢到血管受损部位参与修复活动。

1.2 EPCs的特性与表面标记

血管内皮祖细胞作为内皮细胞的前体, 两者的特性既有相似的地方又有所区别。EPCs既表达内皮系特异抗原v WF、CD31、CD34等, 又表达特殊的CD133表面标记, 同时EPCs具有高增殖和归巢特性。目前比较公认的血管内皮祖细胞表面标志物为CD34、CD133、VEGFR-2。

CD34是我们熟知的造血干细胞标记物之一, 是白细胞分化抗原的一种, 其广泛表达于内皮干细胞。早期试验中常用CD34+来富集EPCs, 富集出的细胞能够分化为成熟内皮细胞, 推测大多数为EPCs。但最近有研究证实CD34-细胞群中也有EPCs的存在[4]。使得此种富集细胞的方法受到挑战。

VEGFR-2 (即人的KDR, 鼠的Flk-1) 也是EPCs高度富集的标志之一。作为从干细胞转换为成熟内皮细胞最早表达的分子标记, 其配体对EPC有阳性趋化的作用。

CD133是近年来新发现的, 具有5个跨膜结构域的糖基化多肽。它的分子质量为1 200 000, 选择性表达于造血干/祖细胞。体外研究发现, CD133仅表达于血管内皮祖细胞, 而在分化过程中其逐渐消失, 不表达于成熟内皮细胞。因此, 它为目前用于分离、富集EPCs最重要的分子标志。

在EPCs转化为成熟细胞的过程中, 经过各种细胞因子诱导分化, 能够吸收乙酰化低密度脂蛋白 (ac LDL) 并与荆豆凝集素-1 (UEA-1) 结合, 然后其表面标志CD133+的表达逐渐减弱至2周后完全消失而成熟内皮细胞表面标志如CD31+、E-钙粘附素、v WF等的表达增多[5]。而到底是哪些基因在调控此过程还属未知。

2 EPCs的分离

EPCs存在于外周血 (如脐带血) 、骨髓和脾中, 故各研究多取这些组织做试验。在早期对EPCs的分离中多采用免疫磁珠法, 原理即血管内皮祖细胞表面抗原与磁珠表面包被的抗体反应, 再将其置于磁场之中, 被结合的细胞就会在磁场力的作用下与其余细胞分群, 如此就可以筛选出特定的细胞来。此种方法虽然能获得较纯的EPCs, 但是数量过于稀少, 不能满足科学研究的需要。近年来, 试验多使用密度梯度离心法来筛选EPC。此种方法通过离心机的离心力达到沉降平衡, 使细胞处于一种梯度的分布, 然后可以直接收获位于界面层的单个核细胞, 如此可大量筛选出试验用细胞。筛选出可用细胞后需要用倒置相差显微镜观察获得细胞形态并用流式细胞仪检测分子表面特征如CD34、CD14、CD31, 尤其是CD133的阳性百分率来鉴定EPCs

3 EPCs的增殖和迁移

3.1 TRPC-1

TRPC-1 (Transient Receptor Potential Cannonical-1) 是瞬时受体电位家族的一员, 人体中的TRPC通道很类似于果蝇的TRP通道。TRPC-1也是被首先在果蝇身上发现, 被认为是负责响应苍蝇的视觉[6]。结构上看, 这一家族的成员之间很类似, 都可以非选择性的透过阳离子, 不同成员间Ca2+和Na+的选择性不同。TRPC-1主要定位于EPCs的质膜, 已有研究试验发现, Ca2+含量的减少可触发SOCE (Store-operated Ca2+entry) 的传感器STIM1, TRPC-1可以与STIM1和ORAI结合形成一个三原复合物[7], 通过调节SOCE来调控EPCs的增殖和迁移[8]。在早期的研究中已经有报道指出TRPC1是广泛参与血管系统的发展和功能的维护, 如抑制TRPC的特殊位点来抑制血管损伤后的平滑肌细胞增生。而对于血管内皮祖细胞来说, Kuang等[9]发现可以通过两种RNA沉默的方法下调TRPC-1来抑制血管内皮祖细胞的增殖和迁移, 他们在试验中通过RNA转染的方法敲除TRPC-1基因, 结果SOCE被抑制, 细胞周期停滞于G1期。从目前细胞基因表达的结果来看, 循环PCR基因芯片显示, 9个基因 (AK1, BRCA2, camk2b, p21, DDIT3, INHA, slfn1, MDM2, 和Prm1) 可以上调, 4个基因 (BCL2, mki67, PMP22, 和ppp2r3a) 表达下调, 并且Kuang等[9]发现一个Schlafen1-blocking peptide可以部分逆转非正常细胞的周期分布并诱导EPCs增殖和迁移。由此推断出TRPC1可能是诱导内皮祖细胞修复血管的新靶点, 是一种调节EPCs生物学特性的新机制。

3.2 ID1

ID1 (inhibitor of DNA binding 1, DNA结合抑制因子) 是HLH (helix-loop-helix, 螺旋-环-螺旋) 转录因子家族的成员之一, 因为其缺乏HLH二聚体功能区外碱性DNA结合域, 所以可以形成无功能异二聚体, 对转录起负调节的作用。ID1在人体很多系统都可以参与增殖分化, 而近年来, 人们渐渐把目光投入到ID1与EPCs的关系中来。2007年Jankovic等[10]的试验就提示了ID1可能参与调控EPCs增殖形成新的血管, IDl缺失还可导致生成血管前基因, 如整合素Q6的下调, 由此抑制血管发生[11]。ID1已被证明可以增殖骨髓和脾源性的EPCs[12]。为了阐述清楚ID1是否是调控EPCs增殖的关键因子, 它又是通过什么机制来调控的, 国内外进行了大量的试验研究。

3.2.1 ID1-E2-2途径

现有研究已揭示ID1主要通过两种途径参与细胞增殖调控。其一, ID1可与b HLH转录因子相结合, 形成无功能的异二聚体阻断p53、p21基因的表达;或者与启动子区域的位点如E-box (CANNTG) 、N-box (CACNAG) 等结合, 通过调节各种被激活的蛋白来调控。通过酵母双杂交技术, 筛选小鼠文库, 最终获得一个目的基因编码E2-2蛋白。早先Einarson等[13]的研究认为转录因子E2-2在神经系统的发育中起到促进神经增长的关键作用, 2010年Ghosh等[14]的研究也证实E2-2可以促进成熟淋巴细胞增殖。之后的试验提示此蛋白属于E蛋白家族, 可以与ID1结合形成二聚体来抑制b HLH, 可能在血管内皮祖细胞的增殖与迁移中也起到重要作用。在内皮细胞的增长中有一种十分特殊的细胞因子 (scular endothelial growth factor, VEGF) VEGF-2, 它的缺乏可导致明显的血管生成障碍, 提示其在传输细胞信号及促进内皮细胞的增殖、迁移等过程中是一个关键的受体。现有证据已经可以证明E2-2可以通过与VEGFR-2启动子特异性结合抑制成熟内皮细胞的增殖, 将其敲除后内皮细胞增殖明显增强。

3.2.2 ID1-P13K/Akt/NFk B途径

之前就有报道称ID1可能通过P13K/Akt/NFk B对肿瘤细胞的增殖起着重要的调控作用[15]。他们使用si RNA转染来抑制ID1的表达, 显著降低PI3K/Akt和NFk B信号通路的表达。Li等[16]在体外试验中通过重组腺病毒载体表达ID1, 同时使用小分子干扰RNA沉默ID1表达来做对照, 并使用anti-P13K, anti-Akt, antiNFk B抗体等对试验进行控制。结果显示使用Id1体外转染的内皮祖细胞诱导Akt通过PI3K的磷酸化, ID1刺激细胞增殖, 上调p-PI3K, p-Akt蛋白, p-IJB, 并可以通过NFk B通道增加凋亡抑制基因的表达, 证实了ID1通过活化PI3K/Akt/NFk B/survivin通路来促进EPCs的增殖。Id1/PI3K/Akt/NFj B/survivin信号转导通路在EPC和肿瘤系统中的作用有许多相似之处, 但是不像肿瘤细胞或组织, ID1, PI3K/Akt, NFk B, 和Survivin在静态内皮祖细胞的基础表达几乎检测不到, 在内皮祖细胞的生物学功能中ID1与PI3K/Akt/NFk B/survivin之间的关系在很大程度上是未知的, 这也是以后的研究方向。

3.3 b FGF和PDGF-BB近年来的研究发现b FGF (碱性成纤维细胞生长因子) 和PDGF-BB (血小板源性生长因子) 具有协同作用, 可以促进血管内皮祖细胞的增殖和迁移。b FGF是成纤维细胞生长因子 (fibroblast growth factor, FGF) 家族的一员, 由于其等电点呈碱性且对酸和热敏感, 故命名为碱性成纤维细胞生长因子。血小板衍生因子 (PDGF) 具有3种二聚体结构, PDGF-BB是其中之一, 具有促进细胞群分裂与增殖的能力。两者基本原理都是依靠其受体激活下游的分子来起到调控作用。通常, 人们认为PLC-C是与细胞增殖和分化等有关的关键分子[17], Guo等[18]使用了PDGF受体激酶拮抗剂 (AG1296) 和选择性PLC抑制剂 (U73122) 作对照, 评估了b FGF和/或PDGF-BB处理过的内皮祖细胞在缺少和有b FGF抗体存在的情况下PDGFRBm RNA的表达。结果有力地表明, 碱性成纤维细胞生长因子可以触发PDGFRB m RNA的转录活性, b FGF和PDGF-BB可促进内皮祖细胞的增殖和迁移, 特别是b FGF和PDGF-BB的协同作用影响更为显著。

4 讨论

由于篇幅所限, 载脂蛋白A-I模拟肽D-4F通过e NOS/NO途径、雌激素通过雌激素受体和P13K途径、肝细胞生长因子的过表达等等促进血管内皮祖细胞增殖和迁移的方法不再一一赘述[19,20,21]。随着近年来研究的深入, 人们对血管内皮祖细胞在各领域所能发挥的作用表现出了极大的关注。EPCs在血管损伤修复, 靶向治疗, 血管新生及生物学特性等都有着无可估量的使用前景。但是由于现有技术层面的局限, EPCs有限的增殖能力已是制约EPCs研究进展的一大瓶颈, 其有没有更加特异性的表面标记, 如何分离、纯化单个的EPC, 提取出来的EPC又如何保持体外增殖、迁移, 这其中的机制又是如何还有待解答, 所以未来的研究任务依然艰巨。

摘要：血管内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞, 亦称为成血管细胞。随着近年来血管性疾病的增多, 血管内皮祖细胞在动脉硬化性狭窄及闭塞性病变方面的作用越来越受到人们重视。但内皮祖细胞的增殖能力成为制约其运用的一大障碍。笔者通过大量阅读文献, 就血管内皮祖细胞的增殖与迁移方面作一综述。

骨髓内皮细胞增殖研究论文篇3

【摘要】血管内皮细胞生长因子(VEGF)是机体内促进血管生长最主要的生长因子,VEGF特异性地作用于内皮细胞,促进其增殖和血管生成。因此,以VEGF为基础的治疗性血管生成的研究备受关注。

【关键词】血管内皮细胞；生长因子；干细胞移植

【中图分类号】R318.06【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)08-0032-02

1骨髓间充质干细胞

1.1BMSC的生物学特性间充质干细胞是中胚层发育的早期细胞,为多能干细胞,主要存在于全身结缔组织器官间质中,其中以骨髓组织中含量最为丰富,称为骨髓间充质干细胞。其具有自我更新和多向分化的潜能,在不同的微环境中能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、纤维细胞、内皮细胞等,特别是能够横向分化为神经细胞。其具有取材方便、扩增迅速、可自体移植等特点。BMSC没有特异性的表面标志，在其表面存在一些与造血干细胞不同的表面抗原，目前一致认为BMSC对于CD29，CD44，CD90，CD105，CD71，SH-2,SH-3等呈阳性反应，同时对于造血干细胞的表面标志CD11b、CD45、CD34等呈阴性反应^[1,2]。形态上多呈扁平梭形或星形细胞，因此BMSC可通过细胞的表面标志和细胞形态进行初步鉴定。目前常用的BMSC分离的方法主要有三种：贴壁筛选法、密度梯度离心法和流式细胞仪分离法。

1.2BMSC作为种子细胞治疗疾病的优越性BMSC具有很多其他干细胞没有的特性,使其成为很多治疗疾病的种子细胞:①可来源于自体,取材方便,分离获取容易,没有伦理学争议。②在体外培养能快速扩增,且能永久分化,可诱导分化为各种细胞。免疫原性弱,安全性好。④能在组织中成活、迁移和分化。⑤可分泌多种细胞因子、集落刺激因子、干细胞生长因子、多种黏附分子等 ,在组织发育及分化过程中发挥重要作用。因其有以上优越性,表明BMSC是疾病治疗的理想种子细胞之一。

1.3BMSC作为外源性基因细胞载体的优越性①转染后骨髓间充质干细胞仍可以保持其干细胞的多向分化潜能。②外源性基因的产物可随骨髓间充质干细胞迁移至缺血损伤区,充分发挥其作用,改善组织修复的微环境。③骨髓间充质干细胞可转染外源性营养因子促进自身和神经干细胞存活、增殖、分化,同时亦可转染凋亡基因如 bcl-2等抑制脑细胞凋亡,减轻神经组织的进一步缺血损伤。因此,通过导入目的基因,将细胞治疗与基因治疗相结合,对脑梗死的治疗将具有更广泛的前景。

2血管内皮细胞生长因子

2.1VEGF的生物学特性VEGF特异性促使血管内皮增殖的有丝分裂原，是机体内促使血管生成的最主要生长因子，其功能是刺激血管内皮细胞生长，启动血管形成和增加血管通透性，并能与内皮细胞表面的特异性受体结合，强烈的促进血管内皮细胞增殖，诱导血管生成，在胚胎发育、创伤修复、侧枝循环建立等病理生理过程中发挥重要作用。VEGF165在组织和细胞中的含量最丰富，而且它是一种分泌性生长因子，广泛地在多种组织细胞中表达，不仅具有促进血管生成活性，而且其表达产物是可溶性的。从细胞中分泌出来，扩散性强，易到达靶细胞，能很好的发挥生物学活性。

2.2VEGF基因转染BMSC移植治疗疾病的优势对于移植的BMSC进行VEGF基因修饰后，就会从几个方面加强疾病的治疗作用。㈠大量的血管新生可以改善梗死边缘区休眠细胞的血供，改善和恢复其功能；㈡血管内皮细胞生长因子在促进血管新生的同时，还可以直接刺激血管扩张，血供的改善可以提高移植细胞的成活率并为其以后的长期增殖分化提供一个良好的生存环境；㈢移植细胞存活数量可能增多，因为通过对移植细胞的基因修饰可提高其移植后的存活率。因此，将细胞治疗和基因治疗结合起来将是一种新的较好的方法。

3VEGF基因转染入BMSC的方法

3.1重组载体导入真核细胞的方法将重组载体导入真核细胞的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀法，电穿孔法，DEAE-葡聚糖法，脂质体介导法，原生质融合法；病毒载体转染法，细胞核直接注射法。其中阳离子脂质体介导基因转染是近年来外源性基因导入宿主细胞的常用方法之一。

脂质体是由生物可降解成分组成，以其靶细胞范围宽、转化效率高、应用简便、毒性小、对包裹的基因没有限制，又没有病毒做载体引发生物变异和癌变的可能性等优点正受到越来越多的重视。因此在实验室研究和临床基因治疗中得到了广泛的应用。

脂质体转染基因的作用方式主要是通过脂质体与细胞膜相结合，由于其与细胞膜有相似的结构产生了脂质体与细胞膜融合，或者通过内吞的形式使得外源基因进入胞内，但是阳离子脂质体介导的外源基因主要是通过内吞的形式进入胞内，在胞内释放外源基因或者进一步与核摸结合使得外源基因直接进入细胞核，减少了外源基因被溶酶体降解，同时由于阳离子脂质体带有正电荷而核酸分子及细胞膜的电荷都是负电荷，所以阳离子脂质体与核酸和细胞膜的结合力都大大增加，从而增强了脂质体介导的转染效率。

3.2影响脂质体介导VEGF基因转染入BMSC的因素①阳离子脂质体的组成；②脂质体与DNA的比率；③脂质体的总量；④细胞密度以及脂质体/DNA复合物与细胞作用的时间；⑤转染时所用的培养液是否含有血清等。由于脂质体具有细胞毒性作用是影响基因转染效率的重要因素,因此适时终止其胞毒作用是很关键的。

4BMSC修复组织损伤的机制

大量研究表明BMSC能有效修复组织损伤, 使其功能和结构缺损得到恢复, BMSC的组织修复机制有以下几方面:①BMSC能直接分化为相应的组织细胞；②分泌营养因子促进修复；③促进内源性干细胞迁移与分化；④促进新生血管形成；⑤BMSC对损伤部位靶点的归巢；⑥抑制炎症因子的表达。

5影响BMSC移植治疗效果的因素

5.1移植BMSC的时机移植时机的选择需要考虑两个方面的影响:一是在缺血的早期,毒性物质、促炎递质和氧自由基的释放等微环境的改变对移植细胞的影响。同时,组织损伤亦释放趋化因子等使干细胞迁移至损伤部位参与修复,即缺血后组织的自身修复过程有利于细胞的存活、分化。二是在缺血的慢性期,纤维组织的形成阻碍了移植细胞的迁移、生长、整合。

5.2移植BMSC的途径脑局部立体定向注射细胞移植是一种创伤性手术,有可能会损伤正常脑组织,不易为患者接受,而经静脉或动脉注射较脑局部注射优越,因移植细胞分布更广,每次可移植的细胞数更多,操作更为方便,不需特殊装置,将来临床应用中患者更容易接受。

5.3移植BMSC的浓度BMSC的浓度影响着移植治疗的效果,研究表明,MAPCs浓度为3～6×106时,神经功能缺失症状均有恢复,而MAPCs浓度为1×106时,神经功能恢复不明显。MAPCs浓度太低,达不到治疗效果,浓度太高又易致静脉栓塞。

6VEGF基因转染BMSC的治疗应用

6.1缺血性心肌病周文武等心肌缺血动物模型中，移植后4周用Buxco系统于Wistar大鼠心尖置测压管进行有创动态心功能测定。结果表明：冠状动脉结扎后各组的大鼠收缩功能及舒张功能均受损，导致了心功能不全；在治疗后，联合组、细胞组及基因组动物均显示有不同程度的心功能改善，以联合组最明显，且心肌梗死面积明显小于对照组、细胞组、基因组，同时，细胞组、基因组动物又明显小于对照组。这说明联合治疗在抑制心室扩张、限制心室重构及促进心肌细胞修复，缓解心功能进行性下降等方面要优于单纯的细胞治疗或基因治疗；即认为血管内皮细胞生长因子基因转染BMSC移植于心肌缺血区，其疗效可能优于细胞治疗与基因治疗的单独应用。因此采用基因转染的方法将VEGF导入 MSC中就有可能使BMSC在发挥心肌修复作用的同时表达分泌 VEGF,从而促进血管的生成,有利于血管化心肌组织的新生,提高组织工程心肌组织修复缺血心肌的效果。

6.2骨缺损对骨发生，骨修复的研究证实，血管入侵是骨形成的关键环节，血管内皮细胞生长因子是其中的关键生长因子，不仅可促使血管内皮细胞的募集，迁移，增殖，协调着血管生成，并且介导成骨细胞，软骨细胞，破骨细胞等的分化及功能。骨内血管生成是骨形成早期的关键环节，骨生发中心即位于血管化的环境中，无论膜内成骨，软骨内成骨都与血管生成密切相关。禹志宏等在腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染促进人骨髓间充质干细胞的成骨特点的研究中证实人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力具有促进作用，验证了转染人血管内皮生长因子165的人骨髓间充质干细胞移植治疗骨疾病的可行性。 Zelzar等表明血管内皮细胞生长通过增加格根包尔氏细胞在骨膜内和软骨内的活性来促使骨的形成。J.Wang 等表明Ad-VEGF165组诱导骨形成的时间比阳性对照组早2周，这说明Ad-VEGF165能缩短骨形成的时间。在临床上，我们可以发现它能缩短治疗周期和降低细胞污染的危险性。

7小结与展望

血管内皮细胞生长因子(VEGF)是机体内促进血管生长最主要的生长因子,VEGF特异性地作用于内皮细胞,促进其增殖和血管生成。因此,以VEGF为基础的治疗性血管生成的研究备受关注。VEGF在很多正常及病理的人或动物组织中的表达水平较低无法形成有效浓度，并且VEGF蛋白的生物半衰期非常短，仅为6分钟，即使直接将VEGF应用于损伤处也会被周围组织中的酶类很快降解，不能持续发挥作用，为了解决这个问题，许多学者采取了基因治疗的手段通过许多实验也都证实了通过转基因技术可以使VEGF蛋白在机体局部持续、高效表达，为治疗各种缺血性疾病、骨折、骨缺损、骨坏死等提供了一种有效的途径。骨髓间充质干细胞（BMSC）由于具有多向分化潜能，取材方便安全、来源丰富、损伤小，易于体外培养扩增，在体外可长时间保持未分化状态，体外基因转染率高，并能稳定高效表达多种治疗性外源基因，而且自体获取的BMSC回植后不会发生免疫排斥反应等优点，BMSC已经成为重要的组织工程种子细胞，因此随着组织细胞工程学和基因工程学的兴起，若与其多向分化潜能相结合，通过导入目的基因，将细胞治疗和基因治疗结合在一起，这在临床应用中将会有广阔的前景。如将二者结合起来治疗神经系统方面的疾病，这将为神经临床科医生开拓新的思路和方法。

虽然对BMSC的研究已经取得了惊人的成果，但是也还有许多问题没有解决。目前BMSC的鉴定、分离纯化等还未形成成熟的技术体系,BMSC在体外诱导和体内移植的生物学机制还未阐明，以及通过病毒载体如腺病毒将VEGF转染到BMSC中，虽然效率高，但存在着免疫反应的危险，何适时调控VEGF表达等问题还需要深入研究。

骨髓内皮细胞增殖研究论文篇4

核受体介导细胞增殖分化与凋亡的作用机制研究进展

核受体是配体依赖性的`转录因子,广泛存在于细胞内,主要分为激素类核受体与孤儿核受体.它们与机体的生长发育,细胞的增殖、分化与凋亡,以及体内众多生理、物质代谢及肿瘤形成过程中基因表达的调控有很大关系.现就核受体介导细胞增殖、分化与凋亡的作用机制研究进展做一综述.

作者：金丹婷刘北忠 JIN Dan-ting LIU Bei-zhong 作者单位：重庆医科大学临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室,重庆,400016 刊名：医学综述 ISTIC英文刊名：MEDICAL RECAPITULATE 年，卷(期)：2008 14(4) 分类号：Q7 Q344 关键词：核受体增殖分化凋亡

骨髓内皮细胞增殖研究论文篇5

目的分析表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在绿茶提取物中的含量,探讨EGCG对人胃癌细胞BGC823增殖和凋亡的影响,为阐明EGCG抗肿瘤作用机制提供实验基础.方法反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定绿茶提取物中EGCG的含量.MTT法检测EGCG对体外培养的人胃癌细胞BGC823增殖的影响;DNA ladder法检测EGCG处理各组DNA梯度的变化.所有数据均采用SPSS12.0进行统计分析,均数比较采用t-test.结果通过绘制标准曲线确定绿茶提取物中EGCG 的`含量为9%.MTT法检测结果显示EGCG能够呈现剂量(5×10~(-3),1×10~(-2),2×10~(-2),4×10~(-2))g/L依赖性地抑制人胃癌细胞BGC823的增殖;DNA ladder法显示EGCG处理组细胞DNA呈现梯状条带,而对照组则没有这种带纹.结论绿茶提取物中EGCG的含量为9%;EGCG能够通过诱导细胞凋亡而抑制人胃癌细胞BGC823的生长和增殖.

作者：张凤安利国李福荣赵晓民文今福杨桂文 ZHANG Feng AN Li-guo LI Fu-rong ZHAO Xiao-min WEN Jin-fu YANG Gui-wen 作者单位：张凤,ZHANG Feng(泰山医学院生命科学研究所,山东,泰安,271000;山东师范大学动物抗性重点实验室,山东,济南,250014)

安利国,杨桂文,AN Li-guo,YANG Gui-wen(山东师范大学动物抗性重点实验室,山东,济南,250014)

李福荣,LI Fu-rong(泰山医学院,山东,泰安,271000)

《细胞增殖》教案篇6

【知识】：简述细胞的生长和增殖的周期性(了解)

概述细胞有丝分裂的过程(理解)

描述细胞的无丝分裂(了解)

【技能】：模拟探究细胞大小与物质运输的关系，探讨细胞不能无限长大的原因。

二、教学重难点：

细胞生长和增殖的周期性;真核细胞有丝分裂的过程(重点)。真核细胞有丝分裂过程中，各个时期染色体行为和数目的变化，以及DNA数量的变化(难点)。

三、教学用具：

PPT幻灯片、探究活动的VCD或者实验材料

四、课前准备：

五、教学过程

教学内容

教师活动

学生活动

(一)引入：问题探讨

问题探讨：展示图片，提出问题，不同生物体体积的差异主要是由于细胞数量造成的，还是细胞体积造成的呢?引导：如果大象的体积是老鼠的1万倍，大象的细胞也是老鼠的一万或者几千倍吗?引导学生得出结论(例外：人的神经系统的发育，主要是由于细胞体积的变化)

进行思考和讨论，发表观点。在教师引导下，得出结论，多细胞生物个体的差异，主要是由于细胞数量的差异。

(二)探究活动：细胞不能无限长大的原因

提出问题：为什么细胞的体积不能无限增大?先从两方面引导，如果细胞体积过大，细胞内的物质运输速度会减慢;细胞体积过大，细胞核的调控能力会减弱

进行探究活动。设定情景，设细胞为正方体，边长本别是3微米、2微米、1微米，引导学生计算3种情况中，细胞的表面积和体积之比。进一步以实验的方式进行探究。以问题引导学生进行探究：氢氧化钠溶液和含有酚酞的琼脂块之间的有什么关系，作用是什么?实验现象说明了什么?

分析细胞为什么不会无限变小的原因。培养学生批判性思维。

思考问题，师生进行谈论

学生进行计算，初步得出结论，体积越大，相对表面积越小。

学生进行实验，并得出结论

(三)细胞增殖：间期

细胞周期概念：细胞分裂活动具有周期性，什么是周期性?提出问题，细胞分裂后会造成细胞内物质，特别是细胞核内遗传物质的减少吗?说明细胞周期分为物质准备和细胞分裂两个阶段。过渡到分裂间期。

间期和分裂期经历时间的比较，得出结论：间期的时间远远长于分裂期。分裂间期的概念;细胞间期细胞的生命活动：强调DNA的合成和相关蛋白质的合成(染色体的复制)——回顾染色质的组成(DNA和蛋白质)，用板画形式描述染色质丝的复制。

引导学生思考：分裂间期的生理意义是什么(遗传物质的复制)、分裂期的生理意义是什么(遗传物质的平均等分)

思考问题，作出反应。

观察分裂间期和分裂期时间比例图，得出结论。

教学项目

教师活动

学生活动

(四)细胞增值：分裂期

播放动画，让学生对细胞分裂的动态过程有感性的认识。

前期：展示图片，比较间期和前期的变化：染色质螺旋，染色体出现，纺锤体出现，核仁、核膜消失。归纳为“两出现两消失”展示图片，明确姐妹染色单体、染色单体、染色质、DNA、着丝点等名词的概念和之间的关系。

中期：展示图片和引导性填空题，指导学生观察和阅读，说出中期细胞所进行的生理活动，强调染色体的运动

后期：展示图片和引导性填空题，指导学生观察和阅读，说出后期细胞所进行的生理活动，强调染色体数目的变化。

末期：展示图片和引导性填空题，指导学生观察和阅读，说出末期细胞所进行的生理活动，归纳为两消失三出现。

再次播放植物细胞有丝分裂动画，进行巩固。

展示动物细胞和植物有丝分裂图片，以问题引导学生观察两种细胞有丝分裂的差异：动物细胞纺锤体的形成以及细胞质分裂的方式。

完成引导性的填空题。

阅读课文，完成填空，并对中期的特征进行表达。

阅读课文，完成填空，并对后期的特征进行表达。

阅读课文，完成填空，并对末期的特征进行表达。

观察图片，进行讨论和阅读。回答问题。

以表格形式，对有丝分裂过程中，染色体形态、染色体数目、着丝点数目、染色单体数目、DNA分子数目等进行对比。并对染色体数目、DNA分子数目，染色单体数目作出变化曲线。

有丝分裂的意义。(把概念拆开，细化，联系有丝分裂的间期和分裂期，帮助学生记忆和理解。

在老师的引导下，完成表格。

(五)无丝分裂

无丝分裂的实例、过程。强调没有出现染色体(不等于没有染色体)和纺锤体。

(六)相关练习

骨髓内皮细胞增殖研究论文篇7

关键词：内皮祖细胞,骨髓,超顺磁性氧化铁颗粒,标记

EPCS是一类能分化成为血管内皮细胞的干细胞。1997年Asahara等[1]报道EPCS分离成功,并在体内证明其血管生成的能力。随后的研究显示这些细胞来源于骨髓,可特异性地向血管形成的部位(包括缺血组织及肿瘤微环境)归巢[2,3,4],参与受损部位的血管发生和血管生成,而且很少整合至正常血管组织内。越来越多的研究认为,EPCS可能会成为新一代理想的再生医学工具或者基因治疗肿瘤的载体,为靶向性治疗提供可能性。SPIO作为MR阴性标记物标记移植细胞,可以为EPCS移植的MRI示踪奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂、仪器

SD大鼠,体重120~150 g,雌雄不拘,清洁级,由山西医科大学实验动物中心提供。

超顺磁性氧化铁纳米颗粒(Schering公司,德国),淋巴细胞分离液、台盼蓝、胰蛋白酶(Sigma公司,美国),DMEM/L(Hyclone公司,美国),FBS(杭州四季青生物工程材料有限公司),VEGF,b FGF(Peprotech公司,英国),多聚甲醛(天津傲然精细化工研究所),钙黄绿素(Calcein-AM)、碘化丙啶(PI)(日本同仁化学研究所),倒置显微镜(Leica公司,德国),激光共聚焦显微镜(OLYMPUS,日本),CO2培养箱(SIM公司,美国)。

1.2 细胞的提取、分离与培养

大鼠断颈处死后,置于75%酒精浸泡灭菌5 min。无菌条件下分离肱骨、股骨和胫骨,去除肌肉组织,用注射器吸取PBS缓冲液反复冲洗骨髓腔,充分冲出骨髓组织后收集至离心管中。将冲洗液沿管壁缓缓加入盛有分离液的离心管内(两者体积比为1∶1),动作宜轻柔,勿使其与分离液混合,水平离心,2 000 r/min离心30 min,将离心后的白雾状细胞层小心吸出来,用PBS液洗涤3次,应用DMEM/L培养基[含体积分数15%胎牛血清,b FGF和VEGF终浓度均为10 ng/ml,青霉素(100 U/ml),链霉素(0.1 g/L)],接种于预铺有纤连蛋白3.5 cm培养皿中,置入在10%CO2、37℃、饱和湿度的培养箱中。72 h后进行第1次半量换液,洗去未贴壁细胞,于倒置显微镜下观察细胞形态变化,以后根据培养基变化情况每2~3天全量换液。

1.3 EPCS的磁标及观察

SPIO标记细胞,细胞培养8天,加入终浓度25μg/ml的SPIO,置于培养箱内孵育24 h,用PBS洗涤3次,去除未进入细胞的铁离子。

1.3.1 标记率测定

普鲁士蓝铁染色,细胞爬片后用4%多聚甲醛固定30 min,倒掉后PBS冲洗3次,晾干后加入新鲜Perls溶液(A液:2%亚铁氰化钾;B液:2%盐酸;临用前A、B液等量混合,静置3 min),置培养箱孵育30 min,PBS冲洗3次,加入0.5%中性红水溶液对比染色10 min,PBS洗涤3次。光镜下观察核呈红色,Fe3+呈蓝色,表明标记成功并计算胞浆内存在蓝色颗粒的细胞数量和比例。

1.3.2 台盼蓝染色检测细胞活力

标记细胞消化离心后制成细胞悬液,取90μl悬液和10μl台盼蓝染液混匀,细胞计数板与盖玻片上、下两侧各加10μl混匀液,镜下观察,计数100个细胞,细胞活力=染色阴性细胞数/100个细胞×100%。未标记组方法同上,倒置显微镜下分别于细胞标记后7 d行细胞活性检测。

1.3.3 MTT法检测细胞增殖力

消化EPCS后接种于96孔板中,每孔体积200μl,细胞数为1×106个/ml。标记组和未标记组每组24孔细胞,以纯培养基空白对照,培养1、3、5、7 d后相同时间每组各取6孔细胞,加入20μl MTT液(5 g/L)孵育4 h后,吸弃孔内培养基,向每孔加入200μl二甲基亚砜,轻轻振荡10 min充分溶解细胞代谢产物,以空白孔调零后求出各孔吸光度值,用酶标仪检测590 nm吸光度值A 590。

1.3.4 AO/PI染色检测细胞凋亡率

用10 ml PBS溶解AO原粉100 mg制备成1%的AO母液;1 ml dd H2O溶解1 mg PI,制备成1.5 mmol/L的PI储备液(1 mg PI/1 ml H2O)(-20℃下避光冷冻保存)。细胞染色前加1ml AO母液和1 ml PI储备液至8 ml PBS中配制成染色溶液。取未标记细胞及标记细胞,各培养皿中加入100μl染液,37℃温孵10 min后,用PBS洗3次。在激光共聚焦显微镜下观察,每皿随机取至少3个无重叠视野拍照计数。试验重复3次。AO能透过细胞膜而嵌入双链DNA使之呈现绿色,PI仅能透过破损的细胞膜嵌入DNA使之呈现红色。在激光共聚焦显微镜下观察,细胞凋亡率计算公式:细胞凋亡率=凋亡细胞/(活细胞+凋亡细胞+膜破损细胞)×100%。

1.3.5 Calcein-AM/PI染色检测细胞存活率

用1 ml无水DMSO溶解1 mg Calcein-AM制备成1 mmol/L的Calcein-AM储备液;1 ml dd H2O溶解1 mg PI,制备成1.5 mmol/L的PI储备液(1 mg PI/1 ml H2O)。细胞染色前加10μl Calcein-AM储备液和15μl PI储备液至5 ml PBS中配制成染色溶液。取未标记细胞及标记细胞,用PBS洗涤数次,每皿加入100μ染色溶液,在37℃下孵育15 min。在激光共聚焦显微镜下观察,先用(490±10)nm波长激发,观察黄绿色的活细胞,还可以观察到红色的死细胞,然后用545 nm波长激发,能够看到红色的死细胞。每皿随机取至少3个无重叠视野拍照计数,试验重复3次。

1.4 统计学方法

全部数据采用SPSS 13.0统计软件进行处理。检测数据以均数±标准差表示,两组间均数比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EPCS形态学观察

接种初期的EPCS为圆形,体积较小,生长速度较慢。4 d后细胞生长明显加速,大多数细胞呈短梭形,并可见细胞形成集落,7 d后大多数混杂细胞脱落,梭形细胞呈优势生长(图1)。至第10天,梭形细胞继续增多,可见特异性索条状结构或铺路石样排列。

2.2 SPIO标记率测定

标记的EPCS光镜下观察,胞浆内可见棕色铁颗粒浓聚,经普鲁士蓝染色后在光镜下观察,细胞内可见大量蓝染的铁颗粒,在铁浓度为25μg/ml条件下,细胞形态同未标记细胞无明显差别,大部分细胞的胞浆内可见蓝染颗粒,标记的效率接近94%(图2)。当浓度>75μg/ml的条件时,大部分细胞皱缩、漂浮于培养基中,细胞胞浆内充满高浓度深染颗粒。胞活力分别为(94.34±0.25)%和(95.33±0.31)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05),可见25μg/ml超顺磁性氧化铁颗粒标记细胞后不会影响细胞的活力。

2.3 标记细胞台盼蓝染色

倒置显微镜下细胞计数,SPIO标记及未标记的EPCS细胞活力分别为(94.34±0.25)%和(95.33±0.31)%,两组间比较差异无统计学意义(P>0.05),可见25μg/ml超顺磁性氧化铁颗粒标记细胞后不会影响细胞的活力。

2.4 MTT法检测细胞增殖活力

MTT法检测标记的细胞与未标记细胞分别在1、3、5、7 d测得的OD值比较,两组之间差异无统计学意义[(0.231 5±0.046 2),(0.243 8±0.041 5);(0.379 0±0.030 1),(0.358 9±0.0302);(0.394 2±0.047 2),(0.403 4±0.030 9);(0.462 6±0.032 7),(0.453 1±0.026 8);P>0.05],这表明超顺磁性氧化铁标记细胞对其增殖活力无影响,无毒性作用。

2.5 AO/PI染色检测细胞的凋亡率

AO/PI染色后凋亡细胞核染色质显现绿色并呈固缩状或片段状;活细胞核染色质着绿色并呈正常结构;膜破损细胞,核染色质着红色。标记细胞组(图3)与未标记细胞组每组细胞取3个视野计数,重复3次,两组凋亡率均为5%,说明细胞标记后对其凋亡能力无影响。

2.6 Calcein-AM/PI染色检测细胞存活率

Calcein-AM/PI染色后存活细胞胞浆呈现绿色,死细胞胞核呈现红色,标记细胞组(图4)与未标记细胞组细胞存活率均值分别为96%和97%,说明细胞标记后对其存活率无影响。

3 讨论

EPCS是能增殖并分化为血管内皮细胞,但尚未表达成熟的血管内皮细胞表型的前体细胞。在胚胎第15天左右,卵黄囊胚外中胚层的细胞聚集成细胞团形成血岛。多个血岛融合形成原始的血管,这些血管建立了最初的毛细血管网结构。血岛中央的细胞为造血干细胞,周边的细胞为EPCS[5]。研究证实,在成年动物的骨髓、脐血、外周血中都存在有EPCS,作为实验研究,大鼠骨髓容易获得,无需特殊处理,操作简单且EPCS含量丰富。原代EPCS培养过程中要注意以下两点:①无菌操作是关键;②操作过程动作宜轻柔,细胞贴壁前避免剧烈移动培养皿。

磁共振细胞成像可以被简单的定义为活体组织内靶向细胞和细胞行为的非侵入性和可重复性成像,是分子影像学在细胞水平的拓展和延伸,它的出现为示踪移植细胞提供了新的途径[6]。高分辨MRI是干细胞检测和示踪的理想手段[7,8],外源性移植细胞必须标记磁共振对比剂,这样才能将细胞从其周围的组织中分辨出来。SPIO是目前MRI成像应用较广泛的对比剂,SPIO用于干细胞标记剂量越大,孵育的时间越长,标记水平越高,但是过多的铁会影响细胞的生物学活性及其增殖能力[9]。因此,选择适宜浓度的SPIO标记意义重大。Arbab等[10]研究表明,25μg/ml SPIO标记不影响细胞的生物活性,且可获得较好的标记效果,而50μg/ml SPIO标记影响细胞生物活性。因此,本研究采用25μg/ml SPIO标记,结果表明:该标记方法可达到94%的标记率,且细胞的活力及增殖能力均不受影响,进一步说明了适量SPIO标记不影响EPCS的生物学特性。

干细胞移植治疗疾病已成为临床研究的热点。本实验采用了简单实用的方法从大鼠骨髓中分离、诱导,并在体外成功培养出EPCS,采用多种手段、多个方面地观察标记后细胞的生物学特性,并证明了该标记不影响其活性、增殖以及凋亡等,为今后EPCS的下一步进行活体示踪实验奠定了重要实验基础。

参考文献

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