慢性骨髓增殖性疾病

慢性骨髓增殖性疾病（精选4篇）

慢性骨髓增殖性疾病 篇1

氨茶碱(Aminophyllin,AP)治疗哮喘、慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)等已一个多世纪之久,过去使用AP是基于其对支气管平滑肌有直接舒张作用,近年来[1]发现氨茶碱还具有抗炎、免疫调节、增强呼吸肌收缩力等作用。本文通过对1252例COPD患者及25只实验羊长期应用小剂量AP后,观察其对骨髓及外周血粒细胞增殖的影响,探讨AP在临床的抗炎、调节免疫价值,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 资料来自2004年1月-2009年12月就诊我院门诊及社区筛查的COPD患者,符合纳入标准共1500例;排除人数220例,失访人数28例;完成试验人数1252例,男1046例,女206例;平均年龄69±11.2岁,体重70.1±5.2kg。

1.2 诊断标准 符合2002年中华结核和呼吸杂志慢性阻塞性肺疾病诊治指南[2]。

1.3 纳入标准 入选的病例为确诊COPD且肺功能分级为Ⅱ-Ⅲ级的患者,即肺功能:FEV1/FVC<70%,30% ≤FEV1<80%预计值。

1.4 排除标准 ①对氨茶碱等药物过敏者;②患者肺功能分级在Ⅲ级以上者(不含Ⅲ级);③存在心、肝、肾功能损害者;④合并肺部肿瘤、血液系统、风湿免疫系统等基础疾病或受试过程中出现骨折、急性心脑血管病等其他系统疾病而无法继续参加研究者;⑤合并支气管哮喘等其他肺部疾病;⑥患有可能影响肺功能结果的疾病者,如近2个月内做过胸腹部手术;⑦不愿意或无法配合者不列为调查对象。

1.5 25只实验羊产地新疆,属绵羊科系,由新疆生产建设兵团绵羊繁育重点实验室提供,月龄5个月,15雄10雌,平均体重24±5.0kg,其实验标准符合《医学实验动物学》标准[3]。每只实验羊在实验过程中均用麦草微贮饲料喂养。

1.6 实验方法

1.6.1 稳定期COPD患者的试验方法

1.6.1.1 分组及比较方法 本研究对符合试验标准的患者采用双盲、随机分组,在进行研究之前均有2周的洗脱期,具体洗脱方案如下:①既往未治疗的COPD患者不经洗脱随机分为治疗组和对照组;②将既往曾应用氨茶碱、沙美特罗替卡松、异丙托溴铵等药物治疗的COPD患者需要停用原用药物的5个半衰期后随机分入治疗组(小剂量茶碱+常规治疗)和对照组(常规治疗)。③在洗脱期内如患者出现喘息及气短加重等急性发作情况,经过系统治疗好转后,按照原洗脱方案进行洗脱后再重新纳入实验。本次调查通过研究中心伦理委员会批准,入选对象均签署知情同意书。

1.6.1.2 给药方法 小剂量氨茶碱:“茶碱缓释片”0.4 g/d口服(平均每公斤体重2.5 mg～4 mg)共75d;常规治疗:异丙托溴铵2.5mL/d 1次雾化吸入+舒利迭50/250μg/d 2次吸入。

1.6.1.3 监测方法 治疗组及对照组患者在试验开始前3d禁用一切影响AP代谢的药物、茶叶、咖啡、可可、烟、酒等。实验开始后第四日晨起8:00取患者上肢外周静脉血查血常规。治疗开始后每间隔15d复查一次外周静脉血血常规。

1.6.2 受试实验羊均于检测前描记心电图一份,测量体重;在给药前取羊耳静脉血0.5 mL做瑞士染色后血常规检查;取髂后上棘处穿刺,抽取骨髓液0.5 mL涂片瑞士染色后20 min,油镜下计数250个有核细胞,在低倍镜下观察骨髓增生程度。此后予氨茶碱注射液3 mg/(kg·d)+5%葡萄糖注射液250 mL以30～40滴/min速度静滴,每隔15d重复上述检测一次,共5次;每周均测量体重,及时调整给药剂量。

1.6.3 仪器、试剂、试药 采用日本OLYMPUS公司BX51T-32F01型显微镜;氨茶碱注射液(广州白云山明兴制药有限公司,批号080901);茶碱缓释片(山西新华制药股份有限公司,0.1g/片,批号1002002),瑞士染色试剂(沈阳市试剂三厂生产)。

1.7 数据处理 外周血及骨髓片为瑞士染色,油镜计数,细胞之比以百分数计算。用SPSS11.5统计软件进行统计分析,采用重复测量资料的方差分析,全部资料采用undefined表示,给药前后资料采用配对数据t检验进行统计学分析,P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 人和动物的外周血白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞 粒细胞增殖在用药前和用药后15d、30d、45d、60d及75d增殖与减少不明显,t值分别是1.298、1.292、1.297、0.845、0.627、0.924和0.920、0.1476、1.20、0.727、0.792、0.923,即人和动物外周血粒细胞增殖在用药前后无显著性差异(P>0.05,表1、2)。

2.2 在长期应用小剂量AP后,动物骨髓中嗜酸粒细胞的比率逐渐增多,但在用药的第15天、30天和45天与用药前比无差异,而在用药后第60天开始骨髓的嗜酸粒细胞的比率较用药前有显著增高,并有统计学意义,第60天和第75天的P值分别为P<0.05和P<0.025(表3)。

2.3 长期应用小剂量AP后,动物骨髓的红系呈增生改变,各阶段比例正常,用药前后比较无统计学差异(P>0.05);而粒:红比值明显增大,用药前后有统计学意义(P<0.05),其中嗜酸粒细胞增生活跃,研究结果也显示用药前后其它粒细胞增生无显著性影响(P>0.05);血红系统增生无变化(P>0.05)。

3 讨论

AP是磷酸二酯酶(PD)抑制剂,同时也是腺苷受体的阻断剂,能对抗内源性腺苷诱发的气道收缩。近年来有些学者还发现,AP还有调节免疫和抗炎的作用。本文通过1252名患者和25只实验羊进行长期应用小剂量AP观察发现:AP可通过调节骨髓嗜酸性粒细胞增殖而引起抗炎调节免疫的作用。

嗜酸性粒细胞是血液粒细胞中的一个重要组成部分,是由骨髓干细胞产生,不产生于粒-单细胞(CFU-GM),它与红细胞及巨核细胞一样,有独立的前体细胞;CFU-E,嗜酸性粒细胞集落形成因子主要受抗原刺激淋巴细胞产生。骨髓中嗜酸早幼粒细胞及中性粒细胞构成了嗜酸性细胞分裂,其分裂、增殖及成熟方式与中性粒细胞相似。成熟的嗜酸性粒细胞在进入外周血液前数天储存于骨髓内,平均渡过时间为9d。分裂后的过渡时间约为2.5d。本组资料发现:长期应用小剂量AP,骨髓红系增生无显著性变化(P>0.05),粒细胞增生呈递增性活跃(P<0.05),粒:红比值明显增大(P<0.05),而外周血嗜酸细胞比值无明显变化(P>0.05)。提示:AP可能通过调节淋巴细胞功能,而产生趋化因子和促嗜酸性粒细胞生成因子,以促进骨髓嗜酸性粒细胞生成。因嗜酸性粒细胞的循环半衰期(T1/2约30min)明显短于中性粒细胞半衰期,并于骨髓释放以后进入循环最初期间一小时,嗜酸粒细胞约有50%离开血液并大部分进入组织中,若一旦离开循环和进入组织就不能再进入循环中[4]。因此,用药后骨髓嗜酸粒细胞比值较外周血中嗜酸性粒细胞比

值明显增大(P<0.05)。

bcl - 2 (b-cell lymphoma/Leukemia-2,B细胞淋巴瘤/白血病-2)蛋白质家族是控制线粒体致凋亡因子释放的主要调节因子,作为细胞内蛋白,可以抑制众多因素诱导的细胞凋亡,在调节嗜酸性粒细胞细胞凋亡过程中也起重要作用[5]。茶碱可以抑制免疫机制等刺激反应从而使哮喘患者的祖细胞表达Bcl-2蛋白,茶碱可以减少嗜酸性粒细胞系统的移植和增加嗜酸性粒细胞的凋亡,而这个过程是通过cAMP系统抑制bcl-2的表达来实现的。而茶碱的抗炎的作用抑制了祖细胞的循环[6]。

嗜酸性粒细胞是人体内一种重要的白细胞,正常情况下,其在人体内所占白细胞的百分比相对稳定。当人体因寄生虫感染而导致过敏反应或患有哮喘、SLE、类风湿关节炎、湿疹等变态反应性疾病时,嗜酸性粒细胞会增多,并参与非特异性免疫反应[7,8]。巩惠芸等[9]对100例嗜酸性粒细胞增高的患者以及100名正常人进行了外周血T淋巴细胞的细胞核仁银染面积与细胞核面积比值(I.S%值)进行检测,发现嗜酸性粒细胞增高者的I.S%值明显高于正常人(P<0.01),说明嗜酸性粒细胞增高者的T淋巴细胞增殖活跃,机体细胞免疫功能增高,帮助机体对抗异物,参与机体的免疫应答。AP可能通过调节骨髓粒细胞增殖而参与调节免疫,以提高机体抗炎、调节免疫作用。由于本研究资料欠缺,AP导致骨髓嗜酸性粒细胞增生活跃的原理还有待进一步研究。

摘要：目的 探讨长期应用小剂量氨茶碱(Aminophyllin,AP)对稳定期慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)患者、动物骨髓、外周血粒细胞增殖的影响。方法 (1)应用前瞻、随机分组、对照及自身对照的方法,将1252例稳定期COPD患者(Ⅱ～Ⅲ级)分为治疗组(常规治疗+茶碱缓释片0.4g/d)和对照组(常规治疗)。治疗开始后每间隔15d复查1次血常规,对治疗前后的指标进行自身前后比较。(2)25只实验用羊采用自身对照法,在应用AP 3mg/(kg.d)后,对治疗前后的各项指标进行自身前后比较。结果 (1)长期应用小剂量AP,对稳定期COPD患者的外周血粒细胞增殖无影响(P>0.05);(2)长期应用小剂量AP可使动物的骨髓嗜酸性粒细胞增生活跃(P<0.05);(3)长期应用小剂量AP对动物的骨髓、外周血粒细胞增生无影响(P<0.05)。结论 长期应用小剂量AP可使骨髓嗜酸性粒细胞增生活跃以提高机体抗炎及调节免疫能力,而对骨髓血红系统及外周血粒细胞增殖无影响。

关键词：氨茶碱,慢性阻塞性肺疾病,外周血/骨髓,调节免疫,人/动物

参考文献

[1]黎友伦,罗永艾.氨茶碱的药理作用[J].医药导报,2005,24(9):807-809.

[2]中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南[J].中华结核和呼吸杂志,2002,25(8):453-460.

[3]秦川.医学实验动物学[M].人民卫生出版社,2008,1.

[4]邓家栋.临床血液学[M].上海科技出版社出版,2001,6:555-557.

[5]吴昌归,史皆然,张新海,等.茶碱对嗜酸性粒细胞凋亡的影响[J].中国医师杂志,2005年增刊:43-46.

[6]Chun-Hua Wang,Horng-Chyuan Lin,Chien-Huang Lin,et al.Effect of theophylline and specific phosphodiesterase IV inhibitionon proliferation and apoptosis of progenitor cells in bronchial asth-ma[J].British Journal of Pharmacology,2003,138,1147-1155.

[7]Bochner BS.Verdict in the case of therapies versus eosinophils:thejury is still out[J].J Allergy Clin Immunol,2004,113(1):3-9.

[8]Klion AD,Nutman TB.The role of eosinophils in host defense a-gainst helminth parasites[J].J Allergy Clin Immunol,2004,113(1):30-37.

[9]巩惠芸,夏文权,石厚荣,等.嗜酸性粒细胞增高患者的细胞免疫改变[J].诊断学理论与实践,2004,3(6):442-443.

骨髓增殖性疾病导致低血糖假象 篇2

1 临床资料

(1) 例1:患者女性, 64岁, 以“头痛, 口角歪斜、右侧肢体麻木3个月, 加重1周”入院, 入院时血常规:血红蛋白273g/L, 红细胞压积0.78, 经相关检查及骨髓穿刺, 骨髓活检明确诊断为“真性红细胞增多症”。

(2) 例2:患者女性, 21岁, 以“头痛、头晕、乏力半年加重1个月”为入院, 入院时血常规:血小板2110×109/L, 经骨髓穿刺、活检同时相关检查诊断明确为“原发性血小板增多症”。

(3) 例3:患者男性, 47岁, 以“腹胀、腹痛、头晕1年加重半个月”为入院。血常规发现白细胞336×109/L, 经骨髓穿刺、活检、染色体检查, 诊断为“慢性粒细胞性白血病”。

(4) 例4:患者男性, 77岁, 从头晕、乏力、腹胀2年, 左下肢肿一周为入院, 检查发现白细胞65×109/L, 经骨髓及相关检查明确诊断“慢性中性粒细胞性白血病”。

(5) 例5:患者男性, 18岁, 以“反复鼻出血2个月, 发热2周”为入院, 检查发现白细胞747.54×10 9/L, 骨髓检查确认“ALL”。

2 供5例患者检测空腹静脉血糖和手指空腹血糖结果如下

(1) 第1例诊断:真性红细胞增多症, 静脉空腹血糖2.4mmol/L, 手指空腹血糖3.7 m m o l/L。无低血糖表现, 治疗原发病血糖升高。

(2) 第2例诊断:原发性血小板增多症, 静脉空腹血糖0.8mmol/L, 手指空腹血糖2.8mmol/L。有乏力, 无低血糖表现经静脉及口服高淀糖, 后治疗原发病血糖正常。

(3) 第3例诊断:慢性粒细胞性白血病, 静脉空腹血糖1.3mmol/L, 手指空腹血糖3.1mmol/L。无低血糖表现, 治疗原发病, 血糖升为正常。

(4) 第4例诊断:慢性中性粒细胞性白血病, 静脉空腹血糖0.6mmol/L手指空腹血糖2.4mmol/L。无低血糖表现, 治疗原发病后血糖恢复正常。

(5) 第5例诊断:急性淋巴细胞性白血病, 静脉空腹血糖2.1mmol/L手指空腹血糖3.3mmol/L。无特殊不适, 无低血糖表现经过治疗原发病后血糖降为正常。

3 讨论

我科每年收住院骨髓增殖性疾病较多, 出现低血糖假像也可见, 我院近几年来收住院的骨髓增殖性疾病统计来看, 有5例出现低血糖假像, 骨髓增殖性疾病是多能干细胞异常增生的一种血液病, 一般血细胞中含有葡萄糖酵解酶, 使血中的葡萄糖随效量时间的延长而降低, 从而对糖测定产生较大的影响, 从结果来分析:同1天查空腹静脉血和空腹手指血测血糖, 都低, 但相差比较大, 但患者并无嗜睡、乏力等低血糖症状, 对于低血糖方面无特殊治疗, 治疗原发病后血细胞下降, 血糖渐渐升为正常范围。说明葡萄糖酵解酶的作用下, 空腹静脉血抽后放时间越长测出血糖越低。其实患者本身血糖不低, 这种患者血糖低, 无任何低血糖的临床表情况下, 不必急着处理。治疗原发病血细胞正常后血糖恢复正常。

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摘要：骨髓增殖性疾病是一种获得性克隆性多能干细胞的疾病, 临床上往往出现有异常增高的血细胞干扰血糖的检测。我院, 住院骨髓增殖性疾病患者出现静脉血糖持续假性偏低病例。

慢性骨髓增殖性疾病 篇3

1 MPD发病机理

酪氨酸激酶异常、信号转导激酶活化与血液病的关系已被普遍了解, 蛋白质酪氨酸激酶磷酸化是生长刺激因子信号转导中的关键步骤, EPO、GM-CSF和TPO等受体缺乏胞质酸的酪氨酸激酶结核域, 它们信号转导需要通过JAK/STAT信号转导系统, JAK2作为胞质酪氨酸激酶, 在多种造血生长因子受体信号转导过程中发挥关键作用。受体信号转导起始于JAK, 受体结合后JAK活化进一步激活STAT, 促进生长增殖相关基因转录和翻译, 促进基因表达[1]。

2 MPD中JAK2 V617F突变

JAK2在多种造血生长因子受体信号转导中发挥关键作用, 值得注意的是, JAK2参与MPD中造血祖细胞高度敏感的生长因子包括EPO、GM-CSF、IL-3、GCF、ICF-1和TPO的信号转导过程, 激酶抑制剂包括JAK2抑制剂和JAK2的siRNA可阻断EEC的形成。

3 JAK2 V617F突变在MPD中的作用

JAK2 V617F对MPD的发病起作用, 不是在同一细胞中存在的偶发突变, JAK2 V617F突变对MPD尤其是对PV密切相关: (1) 该突变发生对激酶 (JH1) 结构域起负调控作用的JAK2激酶样区 (JH2) 结构域模型提示缬氨酸617和半胱氨酸618在保持JAK2激酶结构域非活化构象中起重要作用。 (2) 动物实验表明, 给小鼠转入突变的JAK2基因后出现明显的红细胞增多和脾肥大, 而野生型不具有该作用[2]。

4 KLF4与MPD的关系

KLF4是一种新发现的真核锌指转录因子。通过调节其下游目标基因转录表达而在细胞周期调控、细胞增生分化中担任重要角色。转录因子是一类具有重要功能的序列特异性DNA结合蛋白, 它们通过激活或抑制其目标基因的转录来调控基因的时相性及细胞的组织特异性表达, 而在细胞生长、分化、凋零等生理过程起重要作用[3]。

4.1 KLF4表达

KLF4在多种组织中存在, 最近Andrew认为人和鼠的KLF4有差别。KLF4在表皮细胞中上层分化成熟的细胞表达高。在体外试验中, DNA损伤能使KLF4的表达上调, 缺失KLF4小鼠出生后1d, 结肠上皮细胞将无增生变化而死亡。多个研究组发现它在消化道、口腔、食管上皮及皮肤表皮都有表达。最近发现它在造血细胞和胚胎细胞中存在, 促进细胞分化。

4.2 KLF4与细胞增生的关系

Andrew等[4]也认为人或鼠的KLF家族中KLF2或KLF4在原始红系造血组或胚胎珠蛋白的生成起重要作用。干细胞高表达基因有KLF4, 一个转录因子家族成员, 研究当DNA损害后, 还发现KLF4是一个重要的调停者, 在P21生长抑制G1/S细胞抑制周期上, 研究发现KLF4能成功抑制HPC分化抗原和产生诱导作用, P21样通路在细胞周期抑制和增加编程细胞死亡, 进一步研究KLF4细胞组和分子活度不能了解干祖细胞休眠分子基础, 但可以了解正常干祖细胞扩充的方法。

5 JAK2 V617F与KLF4之间的关系

JAK2是广泛表达的胞质酪基酸激酶, 在多种生长因子受体信号转导中发挥核心作用。JAK2 V617F突变发生在对激酶 (JH1) 结构起负性调控作用的JH2结构域, 617位缬氨酸被大量苯丙氨酸替代, 将引起交互抑制作用的不稳定, 从而使MPD某一系列的细胞呈增长优势。

6 问题与展望

MPD患者中JAK2 V617F突变的发现, 扩展了对PV、ET、IMF的分子病因学和生物学特征的认识, 以下问题有待于进一步解决: (1) JAK2 V617F突变对疾病的发生、转归、治疗及预后有无影响; (2) 单一突变如何在3种以上的不同的MPD间起作用; (3) 能否找到抑制该突变的靶向药物, 从而有效控制疾病发展; (4) JAK2 V617F和KLF4在细胞增殖分化方面是因果关系还是协同关系。目前医学界靶向治疗越来越受到重视, JAK2 V617F为我们找到了MPD的治疗策略的新思路。

参考文献

[1] Thle JN.Cytokine receptor signaling[J].Nature, 1995, 377:591-594.

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[3] Bieker JJ.Kruppel-like factors:three Fingers in manypies[J].Bi-ol Chen, 2001, 276:34 355-34 358.

慢性骨髓增殖性疾病 篇4

1 材料和方法

1.1 主要试剂、仪器

EMPs 从猪的牙胚中提取[4],并制成冻干粉备用;DMEM细胞培养基(Gibco,美国),胎牛血清(Hyclone, 加拿大),MTT(Amersco, 美国), CO2培养箱(Thermo Life sciences, 美国),倒置相差显微镜(Leica,德国),DMSO(宜兴市达华化工有限公司,江苏),流式细胞仪(FACSalibur, Becton Dickinsan),碱性磷酸酶试剂盒(上海仁宝医用试剂研究有限公司)。

1.2 人BMSCs的培养

采用全骨髓法培养人BMSCs。无菌条件下,用肝素化骨髓穿刺针于健康成年志愿者髂后上棘抽取骨髓,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液(含10%胎牛血清, L-谷氨酰胺 0.3 g/L, 100 U /ml青霉素及100 U /ml 链霉素),接种于培养皿中培养。3 d后半量换液,1 周后全量换液,去除悬浮红细胞及未贴壁细胞。此后每周换液2 次,倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。至细胞达到80%～90%左右的汇合后,进行传代培养。取第3代细胞用于实验研究。

1.3 细胞周期分析

选择增殖实验[5]中的EMPs作用人骨髓基质细胞最佳浓度200 μg/ml进行分析,以不加EMPs为空白对照。用流式细胞仪检测EMPs 对人BMSCs细胞周期的影响。

1.4 碱性磷酸酶染色

以矿化诱导液培养细胞(DMEM培养液加地塞米松10-8 mol/L,维生素C 50 mg/L,β-甘油磷酸钠10 mmol/L)。以200 μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。培养2、5 d后,取细胞爬片按照试剂盒说明进行碱性磷酸酶染色。用图像分析系统测量平均灰度值。

1.5 统计学分析

采用SAS6.12软件对所得数据行统计学分析,检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1 人骨髓基质细胞的体外培养

接种后最初3 d内,培养皿中含有大量造血干细胞及悬浮细胞(包括血细胞及未贴壁单核细胞),无法观察到细胞贴壁情况。7 d时全量换液后,造血细胞成分基本消失,可见贴壁细胞呈细胞集落,其形态、大小和密度各不相同,大部分细胞呈梭形或三角形,少数呈多角形,细胞体积较大,细胞核较大,呈扁圆形。随着不断培养、换液,集落中的细胞逐渐扩增,呈放射状,细胞呈片状汇合。12～14 d后,细胞基本汇合成单层,长满整个培养皿底可进行传代(图 1)。传代后的细胞生长明显加快,4～6 h大部分细胞贴壁,细胞逐渐伸展为梭形、三角形或多角形,表面颗粒少;48 h后,可见细胞开始分裂增殖、聚集。5～6 d后即可见细胞汇合,长满培养皿底。

2.2 细胞周期分析

流式细胞仪测得细胞周期的分布情况见图 2及表 1。细胞周期的分布情况表现为EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%;对照组G1期细胞数目比例为89.46%,高于EMPs组的77.59%;说明 EMPs作用下的骨髓基质细胞具有较强的增殖能力。

2.3 碱性磷酸酶(ALP)染色

矿化诱导液培养2 d时,对照组和实验组均有少量阳性细胞,无明显区别(图 3);培养5 d时,可见实验组阳性细胞数明显增多,呈条索状、片状,而对照组阳性细胞数较少,稀疏(图 4)。经图像分析系统测定平均灰度值,2 d时,实验组0.18±0.02与对照组0.16±0.01无显著性差异(P>0.05);5 d时,实验组0.25±0.02与对照组0.21±0.03有显著性差异(P<0.05)。

3 讨 论

随着组织工程技术的发展,牙周组织再生的理论不断丰富,利用组织工程技术重建牙周组织成为可能。骨髓基质细胞是牙周组织工程中极有潜力的种子细胞。EMPs可以促进牙周组织再生已得到证实,而关于釉基质蛋白对骨髓基质细胞生物学作用的国内外报道甚少,并多为鼠、兔、猪等动物细胞的研究,因此该组织工程技术距临床应用尚有很大距离。本研究观察釉基质蛋白对人BMSCs生物学特性的影响,试图进一步了解EMPs促进牙周组织再生的机制。

目前常用的骨髓基质细胞的分离培养方法有2 种[6]:全骨髓培养法和密度梯度离心法。全骨髓培养法是一种保留造血干细胞和其他各种细胞混合培养的方法,将骨髓稀释后反复抽吸制成单细胞基液,利用BMSCs贴壁生长的特性将其分离纯化,由于维持了BMSCs原始的生活环境,有利于BMSCs的分化。本实验选择无血液疾病的健康成年人,利用全骨髓培养法成功培养了人骨髓基质细胞,体外培养的成人BMSCs 适应能力较强,接种成活率高,增殖速度较快,这可能是保留的血细胞成分中含有部分生长因子或促进贴壁的物质有关,而且全骨髓培养法维持了BMSCs原始的生活环境,更接近将来体内移植研究的要求。因此,利用BMSCs进行骨组织工程学的研究具有良好的应用前景。

目前评估细胞生长和增殖状况的方法主要有3 种: 3H-TDR 掺入法、MTT 比色法和流式细胞仪细胞周期检测法[7]。MTT 法检测细胞增殖结果显示,EMPs作用于人BMSCs 3 d时,200 μg/ml EMPs组与对照组相比差异即有显著性,说明该浓度有促增殖作用[5]。这与EMPs对兔BMSCs和鼠BMSCs增殖的结果不尽相同,虽然EMPs均能促进鼠[8]、兔BMSCs的增殖,但作用的浓度不同。结果不同的原因可能是由于细胞培养过程中,不同种属细胞分裂增殖活动恢复的快慢不同;其次可能与提取获得的EMPs的纯度和效价不同有关,当然也可能与不同实验室所用培养液的成分不完全相同有关。我们在用MTT法检测细胞增殖的基础上,进一步采用流式细胞仪检测EMPs对人BMSCs细胞周期的影响。结果显示,加入EMPs培养5 d的人BMSCs,G1期DNA含量减少,而S期DNA含量增高,表明EMPs可以增加人骨髓基质细胞DNA含量,具有促进BMSCs早期DNA合成,使细胞从G0/G1期进入S期的作用,从而促进细胞增殖。

碱性磷酸酶(ALP)的表达是成骨细胞分化的主要特征之一。我们观察了EMPs对人BMSCs的ALP活性的影响,发现5 d时,在EMPs条件下,ALP阳性细胞数明显增多,呈条索状、片状。表明BMSCs可在矿化诱导液培养下,向成骨细胞方向分化,并可被EMPs所增强。诱导的细胞能够产生ALP, 也表明BMSCs具有矿化能力,已具备成骨细胞的生物学特性,而且应用矿化诱导液联合EMPs诱导5 d后即明显表达成骨细胞表型,说明联合应用矿化液和EMPs能在较短时间内有效诱导BMSCs分化为成骨细胞。

本实验以成人骨髓为培养材料建立的成人BMSCs的培养方法和成骨诱导途径,为该组织工程技术的临床应用打下了基础,但组织工程技术应用于牙周病学临床还需更多的深入研究。

摘要：目的:观察釉基质蛋白(enamelmatrix proteins,EMPs)对人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)细胞周期和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。方法:体外培养人骨髓基质细胞,以200μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。流式细胞仪检测EMPs对BMSCs细胞周期的影响,碱性磷酸酶试剂盒检测ALP的活性。结果:体外培养的人BMSCs生长良好,200μg/ml浓度的EMPs能提高细胞的ALP活性;影响细胞周期变化,EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%。结论:釉基质蛋白可促进人骨髓基质细胞的分化,影响细胞周期变化。

关键词：釉基质蛋白,骨髓基质细胞,增殖,矿化,细胞周期

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