骨髓增殖性疾病

骨髓增殖性疾病（精选6篇）

骨髓增殖性疾病 篇1

骨髓增殖性疾病是一种获得性克隆性多能干细胞的疾病, 临床上往往出现有异常增高的血细胞干扰血糖的检测。我院, 住院骨髓增殖性疾病患者出现静脉血糖持续假性偏低病例。

1 临床资料

(1) 例1:患者女性, 64岁, 以“头痛, 口角歪斜、右侧肢体麻木3个月, 加重1周”入院, 入院时血常规:血红蛋白273g/L, 红细胞压积0.78, 经相关检查及骨髓穿刺, 骨髓活检明确诊断为“真性红细胞增多症”。

(2) 例2:患者女性, 21岁, 以“头痛、头晕、乏力半年加重1个月”为入院, 入院时血常规:血小板2110×109/L, 经骨髓穿刺、活检同时相关检查诊断明确为“原发性血小板增多症”。

(3) 例3:患者男性, 47岁, 以“腹胀、腹痛、头晕1年加重半个月”为入院。血常规发现白细胞336×109/L, 经骨髓穿刺、活检、染色体检查, 诊断为“慢性粒细胞性白血病”。

(4) 例4:患者男性, 77岁, 从头晕、乏力、腹胀2年, 左下肢肿一周为入院, 检查发现白细胞65×109/L, 经骨髓及相关检查明确诊断“慢性中性粒细胞性白血病”。

(5) 例5:患者男性, 18岁, 以“反复鼻出血2个月, 发热2周”为入院, 检查发现白细胞747.54×10 9/L, 骨髓检查确认“ALL”。

2 供5例患者检测空腹静脉血糖和手指空腹血糖结果如下

(1) 第1例诊断:真性红细胞增多症, 静脉空腹血糖2.4mmol/L, 手指空腹血糖3.7 m m o l/L。无低血糖表现, 治疗原发病血糖升高。

(2) 第2例诊断:原发性血小板增多症, 静脉空腹血糖0.8mmol/L, 手指空腹血糖2.8mmol/L。有乏力, 无低血糖表现经静脉及口服高淀糖, 后治疗原发病血糖正常。

(3) 第3例诊断:慢性粒细胞性白血病, 静脉空腹血糖1.3mmol/L, 手指空腹血糖3.1mmol/L。无低血糖表现, 治疗原发病, 血糖升为正常。

(4) 第4例诊断:慢性中性粒细胞性白血病, 静脉空腹血糖0.6mmol/L手指空腹血糖2.4mmol/L。无低血糖表现, 治疗原发病后血糖恢复正常。

(5) 第5例诊断:急性淋巴细胞性白血病, 静脉空腹血糖2.1mmol/L手指空腹血糖3.3mmol/L。无特殊不适, 无低血糖表现经过治疗原发病后血糖降为正常。

3 讨论

我科每年收住院骨髓增殖性疾病较多, 出现低血糖假像也可见, 我院近几年来收住院的骨髓增殖性疾病统计来看, 有5例出现低血糖假像, 骨髓增殖性疾病是多能干细胞异常增生的一种血液病, 一般血细胞中含有葡萄糖酵解酶, 使血中的葡萄糖随效量时间的延长而降低, 从而对糖测定产生较大的影响, 从结果来分析:同1天查空腹静脉血和空腹手指血测血糖, 都低, 但相差比较大, 但患者并无嗜睡、乏力等低血糖症状, 对于低血糖方面无特殊治疗, 治疗原发病后血细胞下降, 血糖渐渐升为正常范围。说明葡萄糖酵解酶的作用下, 空腹静脉血抽后放时间越长测出血糖越低。其实患者本身血糖不低, 这种患者血糖低, 无任何低血糖的临床表情况下, 不必急着处理。治疗原发病血细胞正常后血糖恢复正常。

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摘要：骨髓增殖性疾病是一种获得性克隆性多能干细胞的疾病, 临床上往往出现有异常增高的血细胞干扰血糖的检测。我院, 住院骨髓增殖性疾病患者出现静脉血糖持续假性偏低病例。

关键词：骨髓增殖性疾病,葡萄糖酵解酶,低血糖

骨髓增殖性疾病 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

该组12例MPNs患者, 男3例, 女9例, 年龄56~78岁, 平均68岁。其中PV7例、ET4例、PMF1例, 所有病例诊断均符合WHO (2008) Ph阴性经典MPNs诊断标准。根据血栓发生部位, 下肢深静脉血栓 (DVT) 5例、肺栓塞 (PTE) 2例、脑梗死3例、周围血管栓塞 (红斑性肢痛病) 2例。

1.2 临床表现

12例患者分别以下肢肿胀、咳嗽、胸闷、神经系统症状及行走时足底疼痛为首发症状就诊, 所有病例最终因血细胞增多经血液科专科检查后确诊为MPNs。

伴发危险因素:12例患者中伴常见血管危险因素有吸烟3例、高血压4例、糖尿病2例、高脂血症或血脂代谢异常6例。

1.3 治疗方法

3例脑梗死患者服用阿司匹林抗血小板治疗;2例PTE患者使用尿激酶溶栓后继以低分子肝素抗凝治疗;5例DVT及2例周围小血管栓塞患者接受低分子肝素抗凝治疗。其中11例患者同时使用羟基脲降细胞治疗。

1.4 统计方法

所有数据均采用SPSS 10.0统计软件进行分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验, 计数资料采用x2检验。

2 结果

对在该院接受治疗的12例骨髓增殖性肿瘤患者资料进行分析, 根据检查结果:包括病史、年龄、白细胞数及骨髓等指标见表1。

该次实验中, 血常规:白细胞计数>10×109/L者8例;男性血红蛋白>185 g/L者2例、女性血红蛋白>165 g/L者5例;血小板计数>450×109/L者6例。凝血指标:所有患者PT、APTT时间正常。基因检查:12例患者BCR/ABL融合基因定性检测全部为阴性, JAK2V617F基因突变阳性10例, 阳性率为83.3%。

实验中12例患者在经过医护人员综合治疗后, 患者血液学达完全或部分缓解, 症状不同程度改善。

该次实验中, 7例符合PV骨髓象, 4例符合ET骨髓象, 1例经骨髓活检提示巨核细胞增生、网状纤维增生, 并排除炎症或其他肿瘤性疾病导致骨髓纤维化可能, 符合PMF诊断。影像学检查:3例脑梗死患者行头核磁检查, 双侧基底节多发腔梗1例、脑干腔梗1例、左额叶梗死1例;2例PTE患者行肺动脉造影检查, 1例见左肺动脉及下叶肺动脉部分充盈缺损, 1例左右肺动脉分叉处及右下肺动脉见充盈缺损;5例DVT患者血管彩超分别提示股静脉、腘静脉、胫后静脉、小腿肌间静脉血栓形成;2例周围小血管栓塞者血管彩超提示踝下动脉血流信号消失。

3 讨论

根据国内外大量实验研究结果显示:MPNs患者血栓栓塞发病机制与患者体内血细胞增多、白细胞活化、内皮细胞损伤、血小板功能异常、JAK2V617F基因突变等有关。此外, 血栓形成还与其他因素有关如:糖尿病、高血压、高脂血症、吸烟等。根据PV低剂量阿司匹林治疗方案欧洲协作组 (ECLAP) 研究显示, 在PV以及ET患者中血栓形成死亡患者占41%, 且PV以及ET患者在初诊时已有血栓形成的概率为34%~39%和10%~29%, 此后8%~19%和8%~31%还会有血栓形成[1,2]。

而对于一些临床症状不明显的MPNs患者, 由于患者早期时会表现为不明原因血栓形成, 在检查过程中无明显血液学改变[3]。再加上不同患者血栓发生的部位也可能不相同, 该次实验中, 部分患者以下肢深静脉血栓、肺栓塞、脑梗死、周围小血管栓塞为首发症状。此外, 脾静脉、肝静脉、肠系膜静脉等内脏静脉也是容易发生栓塞的部位。在PV患者中, 约有1/3的患者发生深静脉栓塞, 大动脉栓塞在脑血管和冠状动脉比较常见[4]。

此外, JAK2V617F在MPNs患者中存在较高表达, 尤其在PV患者中。2008年WHO已将JAK2基因突变作为Ph阴性经典骨髓增殖性肿瘤的诊断指标之一。邹煦等[5]通过对MPNs患者临床资料的多因素统计分析结果显示高白细胞血症、JAK2V617F阳性和年龄>60岁为发生血栓性卒中的独立危险因素。故对JAK2检测阳性的MPNs患者, 尤其是老年患者, 临床上应密切随诊, 警惕血栓形成。对于不明原因的血栓患者, 可以进行JAK2V617F检测, 以明确是否存在潜在MPNs。临床上, 对于这种疾病采用单纯的溶栓、抗凝、抗血小板聚集治疗临床治疗效果不理想。因此, 患者在进行治疗时, 可采用羟基脲等化疗药、干扰素及血细胞单采等降细胞方法进行综合治疗。

综上, 血栓性疾病患者应仔细阅读血常规, 重视排查MPNs, JAK2基因突变有助于MPNs早期诊断。该类患者抗栓治疗联合羟基脲降细胞治疗有效。

参考文献

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骨髓增殖性疾病 篇3

1 资料与方法

1.1 研究对象 资料来自2004年1月-2009年12月就诊我院门诊及社区筛查的COPD患者,符合纳入标准共1500例;排除人数220例,失访人数28例;完成试验人数1252例,男1046例,女206例;平均年龄69±11.2岁,体重70.1±5.2kg。

1.2 诊断标准 符合2002年中华结核和呼吸杂志慢性阻塞性肺疾病诊治指南[2]。

1.3 纳入标准 入选的病例为确诊COPD且肺功能分级为Ⅱ-Ⅲ级的患者,即肺功能:FEV1/FVC<70%,30% ≤FEV1<80%预计值。

1.4 排除标准 ①对氨茶碱等药物过敏者;②患者肺功能分级在Ⅲ级以上者(不含Ⅲ级);③存在心、肝、肾功能损害者;④合并肺部肿瘤、血液系统、风湿免疫系统等基础疾病或受试过程中出现骨折、急性心脑血管病等其他系统疾病而无法继续参加研究者;⑤合并支气管哮喘等其他肺部疾病;⑥患有可能影响肺功能结果的疾病者,如近2个月内做过胸腹部手术;⑦不愿意或无法配合者不列为调查对象。

1.5 25只实验羊产地新疆,属绵羊科系,由新疆生产建设兵团绵羊繁育重点实验室提供,月龄5个月,15雄10雌,平均体重24±5.0kg,其实验标准符合《医学实验动物学》标准[3]。每只实验羊在实验过程中均用麦草微贮饲料喂养。

1.6 实验方法

1.6.1 稳定期COPD患者的试验方法

1.6.1.1 分组及比较方法 本研究对符合试验标准的患者采用双盲、随机分组,在进行研究之前均有2周的洗脱期,具体洗脱方案如下:①既往未治疗的COPD患者不经洗脱随机分为治疗组和对照组;②将既往曾应用氨茶碱、沙美特罗替卡松、异丙托溴铵等药物治疗的COPD患者需要停用原用药物的5个半衰期后随机分入治疗组(小剂量茶碱+常规治疗)和对照组(常规治疗)。③在洗脱期内如患者出现喘息及气短加重等急性发作情况,经过系统治疗好转后,按照原洗脱方案进行洗脱后再重新纳入实验。本次调查通过研究中心伦理委员会批准,入选对象均签署知情同意书。

1.6.1.2 给药方法 小剂量氨茶碱:“茶碱缓释片”0.4 g/d口服(平均每公斤体重2.5 mg～4 mg)共75d;常规治疗:异丙托溴铵2.5mL/d 1次雾化吸入+舒利迭50/250μg/d 2次吸入。

1.6.1.3 监测方法 治疗组及对照组患者在试验开始前3d禁用一切影响AP代谢的药物、茶叶、咖啡、可可、烟、酒等。实验开始后第四日晨起8:00取患者上肢外周静脉血查血常规。治疗开始后每间隔15d复查一次外周静脉血血常规。

1.6.2 受试实验羊均于检测前描记心电图一份,测量体重;在给药前取羊耳静脉血0.5 mL做瑞士染色后血常规检查;取髂后上棘处穿刺,抽取骨髓液0.5 mL涂片瑞士染色后20 min,油镜下计数250个有核细胞,在低倍镜下观察骨髓增生程度。此后予氨茶碱注射液3 mg/(kg·d)+5%葡萄糖注射液250 mL以30～40滴/min速度静滴,每隔15d重复上述检测一次,共5次;每周均测量体重,及时调整给药剂量。

1.6.3 仪器、试剂、试药 采用日本OLYMPUS公司BX51T-32F01型显微镜;氨茶碱注射液(广州白云山明兴制药有限公司,批号080901);茶碱缓释片(山西新华制药股份有限公司,0.1g/片,批号1002002),瑞士染色试剂(沈阳市试剂三厂生产)。

1.7 数据处理 外周血及骨髓片为瑞士染色,油镜计数,细胞之比以百分数计算。用SPSS11.5统计软件进行统计分析,采用重复测量资料的方差分析,全部资料采用undefined表示,给药前后资料采用配对数据t检验进行统计学分析,P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 人和动物的外周血白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞 粒细胞增殖在用药前和用药后15d、30d、45d、60d及75d增殖与减少不明显,t值分别是1.298、1.292、1.297、0.845、0.627、0.924和0.920、0.1476、1.20、0.727、0.792、0.923,即人和动物外周血粒细胞增殖在用药前后无显著性差异(P>0.05,表1、2)。

2.2 在长期应用小剂量AP后,动物骨髓中嗜酸粒细胞的比率逐渐增多,但在用药的第15天、30天和45天与用药前比无差异,而在用药后第60天开始骨髓的嗜酸粒细胞的比率较用药前有显著增高,并有统计学意义,第60天和第75天的P值分别为P<0.05和P<0.025(表3)。

2.3 长期应用小剂量AP后,动物骨髓的红系呈增生改变,各阶段比例正常,用药前后比较无统计学差异(P>0.05);而粒:红比值明显增大,用药前后有统计学意义(P<0.05),其中嗜酸粒细胞增生活跃,研究结果也显示用药前后其它粒细胞增生无显著性影响(P>0.05);血红系统增生无变化(P>0.05)。

3 讨论

AP是磷酸二酯酶(PD)抑制剂,同时也是腺苷受体的阻断剂,能对抗内源性腺苷诱发的气道收缩。近年来有些学者还发现,AP还有调节免疫和抗炎的作用。本文通过1252名患者和25只实验羊进行长期应用小剂量AP观察发现:AP可通过调节骨髓嗜酸性粒细胞增殖而引起抗炎调节免疫的作用。

嗜酸性粒细胞是血液粒细胞中的一个重要组成部分,是由骨髓干细胞产生,不产生于粒-单细胞(CFU-GM),它与红细胞及巨核细胞一样,有独立的前体细胞;CFU-E,嗜酸性粒细胞集落形成因子主要受抗原刺激淋巴细胞产生。骨髓中嗜酸早幼粒细胞及中性粒细胞构成了嗜酸性细胞分裂,其分裂、增殖及成熟方式与中性粒细胞相似。成熟的嗜酸性粒细胞在进入外周血液前数天储存于骨髓内,平均渡过时间为9d。分裂后的过渡时间约为2.5d。本组资料发现:长期应用小剂量AP,骨髓红系增生无显著性变化(P>0.05),粒细胞增生呈递增性活跃(P<0.05),粒:红比值明显增大(P<0.05),而外周血嗜酸细胞比值无明显变化(P>0.05)。提示:AP可能通过调节淋巴细胞功能,而产生趋化因子和促嗜酸性粒细胞生成因子,以促进骨髓嗜酸性粒细胞生成。因嗜酸性粒细胞的循环半衰期(T1/2约30min)明显短于中性粒细胞半衰期,并于骨髓释放以后进入循环最初期间一小时,嗜酸粒细胞约有50%离开血液并大部分进入组织中,若一旦离开循环和进入组织就不能再进入循环中[4]。因此,用药后骨髓嗜酸粒细胞比值较外周血中嗜酸性粒细胞比

值明显增大(P<0.05)。

bcl - 2 (b-cell lymphoma/Leukemia-2,B细胞淋巴瘤/白血病-2)蛋白质家族是控制线粒体致凋亡因子释放的主要调节因子,作为细胞内蛋白,可以抑制众多因素诱导的细胞凋亡,在调节嗜酸性粒细胞细胞凋亡过程中也起重要作用[5]。茶碱可以抑制免疫机制等刺激反应从而使哮喘患者的祖细胞表达Bcl-2蛋白,茶碱可以减少嗜酸性粒细胞系统的移植和增加嗜酸性粒细胞的凋亡,而这个过程是通过cAMP系统抑制bcl-2的表达来实现的。而茶碱的抗炎的作用抑制了祖细胞的循环[6]。

嗜酸性粒细胞是人体内一种重要的白细胞,正常情况下,其在人体内所占白细胞的百分比相对稳定。当人体因寄生虫感染而导致过敏反应或患有哮喘、SLE、类风湿关节炎、湿疹等变态反应性疾病时,嗜酸性粒细胞会增多,并参与非特异性免疫反应[7,8]。巩惠芸等[9]对100例嗜酸性粒细胞增高的患者以及100名正常人进行了外周血T淋巴细胞的细胞核仁银染面积与细胞核面积比值(I.S%值)进行检测,发现嗜酸性粒细胞增高者的I.S%值明显高于正常人(P<0.01),说明嗜酸性粒细胞增高者的T淋巴细胞增殖活跃,机体细胞免疫功能增高,帮助机体对抗异物,参与机体的免疫应答。AP可能通过调节骨髓粒细胞增殖而参与调节免疫,以提高机体抗炎、调节免疫作用。由于本研究资料欠缺,AP导致骨髓嗜酸性粒细胞增生活跃的原理还有待进一步研究。

摘要：目的 探讨长期应用小剂量氨茶碱(Aminophyllin,AP)对稳定期慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)患者、动物骨髓、外周血粒细胞增殖的影响。方法 (1)应用前瞻、随机分组、对照及自身对照的方法,将1252例稳定期COPD患者(Ⅱ～Ⅲ级)分为治疗组(常规治疗+茶碱缓释片0.4g/d)和对照组(常规治疗)。治疗开始后每间隔15d复查1次血常规,对治疗前后的指标进行自身前后比较。(2)25只实验用羊采用自身对照法,在应用AP 3mg/(kg.d)后,对治疗前后的各项指标进行自身前后比较。结果 (1)长期应用小剂量AP,对稳定期COPD患者的外周血粒细胞增殖无影响(P>0.05);(2)长期应用小剂量AP可使动物的骨髓嗜酸性粒细胞增生活跃(P<0.05);(3)长期应用小剂量AP对动物的骨髓、外周血粒细胞增生无影响(P<0.05)。结论 长期应用小剂量AP可使骨髓嗜酸性粒细胞增生活跃以提高机体抗炎及调节免疫能力,而对骨髓血红系统及外周血粒细胞增殖无影响。

关键词：氨茶碱,慢性阻塞性肺疾病,外周血/骨髓,调节免疫,人/动物

参考文献

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[5]吴昌归,史皆然,张新海,等.茶碱对嗜酸性粒细胞凋亡的影响[J].中国医师杂志,2005年增刊:43-46.

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骨髓增殖性疾病 篇4

1 材料和方法

1.1 主要试剂、仪器

EMPs 从猪的牙胚中提取[4],并制成冻干粉备用;DMEM细胞培养基(Gibco,美国),胎牛血清(Hyclone, 加拿大),MTT(Amersco, 美国), CO2培养箱(Thermo Life sciences, 美国),倒置相差显微镜(Leica,德国),DMSO(宜兴市达华化工有限公司,江苏),流式细胞仪(FACSalibur, Becton Dickinsan),碱性磷酸酶试剂盒(上海仁宝医用试剂研究有限公司)。

1.2 人BMSCs的培养

采用全骨髓法培养人BMSCs。无菌条件下,用肝素化骨髓穿刺针于健康成年志愿者髂后上棘抽取骨髓,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液(含10%胎牛血清, L-谷氨酰胺 0.3 g/L, 100 U /ml青霉素及100 U /ml 链霉素),接种于培养皿中培养。3 d后半量换液,1 周后全量换液,去除悬浮红细胞及未贴壁细胞。此后每周换液2 次,倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。至细胞达到80%～90%左右的汇合后,进行传代培养。取第3代细胞用于实验研究。

1.3 细胞周期分析

选择增殖实验[5]中的EMPs作用人骨髓基质细胞最佳浓度200 μg/ml进行分析,以不加EMPs为空白对照。用流式细胞仪检测EMPs 对人BMSCs细胞周期的影响。

1.4 碱性磷酸酶染色

以矿化诱导液培养细胞(DMEM培养液加地塞米松10-8 mol/L,维生素C 50 mg/L,β-甘油磷酸钠10 mmol/L)。以200 μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。培养2、5 d后,取细胞爬片按照试剂盒说明进行碱性磷酸酶染色。用图像分析系统测量平均灰度值。

1.5 统计学分析

采用SAS6.12软件对所得数据行统计学分析,检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1 人骨髓基质细胞的体外培养

接种后最初3 d内,培养皿中含有大量造血干细胞及悬浮细胞(包括血细胞及未贴壁单核细胞),无法观察到细胞贴壁情况。7 d时全量换液后,造血细胞成分基本消失,可见贴壁细胞呈细胞集落,其形态、大小和密度各不相同,大部分细胞呈梭形或三角形,少数呈多角形,细胞体积较大,细胞核较大,呈扁圆形。随着不断培养、换液,集落中的细胞逐渐扩增,呈放射状,细胞呈片状汇合。12～14 d后,细胞基本汇合成单层,长满整个培养皿底可进行传代(图 1)。传代后的细胞生长明显加快,4～6 h大部分细胞贴壁,细胞逐渐伸展为梭形、三角形或多角形,表面颗粒少;48 h后,可见细胞开始分裂增殖、聚集。5～6 d后即可见细胞汇合,长满培养皿底。

2.2 细胞周期分析

流式细胞仪测得细胞周期的分布情况见图 2及表 1。细胞周期的分布情况表现为EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%;对照组G1期细胞数目比例为89.46%,高于EMPs组的77.59%;说明 EMPs作用下的骨髓基质细胞具有较强的增殖能力。

2.3 碱性磷酸酶(ALP)染色

矿化诱导液培养2 d时,对照组和实验组均有少量阳性细胞,无明显区别(图 3);培养5 d时,可见实验组阳性细胞数明显增多,呈条索状、片状,而对照组阳性细胞数较少,稀疏(图 4)。经图像分析系统测定平均灰度值,2 d时,实验组0.18±0.02与对照组0.16±0.01无显著性差异(P>0.05);5 d时,实验组0.25±0.02与对照组0.21±0.03有显著性差异(P<0.05)。

3 讨 论

随着组织工程技术的发展,牙周组织再生的理论不断丰富,利用组织工程技术重建牙周组织成为可能。骨髓基质细胞是牙周组织工程中极有潜力的种子细胞。EMPs可以促进牙周组织再生已得到证实,而关于釉基质蛋白对骨髓基质细胞生物学作用的国内外报道甚少,并多为鼠、兔、猪等动物细胞的研究,因此该组织工程技术距临床应用尚有很大距离。本研究观察釉基质蛋白对人BMSCs生物学特性的影响,试图进一步了解EMPs促进牙周组织再生的机制。

目前常用的骨髓基质细胞的分离培养方法有2 种[6]:全骨髓培养法和密度梯度离心法。全骨髓培养法是一种保留造血干细胞和其他各种细胞混合培养的方法,将骨髓稀释后反复抽吸制成单细胞基液,利用BMSCs贴壁生长的特性将其分离纯化,由于维持了BMSCs原始的生活环境,有利于BMSCs的分化。本实验选择无血液疾病的健康成年人,利用全骨髓培养法成功培养了人骨髓基质细胞,体外培养的成人BMSCs 适应能力较强,接种成活率高,增殖速度较快,这可能是保留的血细胞成分中含有部分生长因子或促进贴壁的物质有关,而且全骨髓培养法维持了BMSCs原始的生活环境,更接近将来体内移植研究的要求。因此,利用BMSCs进行骨组织工程学的研究具有良好的应用前景。

目前评估细胞生长和增殖状况的方法主要有3 种: 3H-TDR 掺入法、MTT 比色法和流式细胞仪细胞周期检测法[7]。MTT 法检测细胞增殖结果显示,EMPs作用于人BMSCs 3 d时,200 μg/ml EMPs组与对照组相比差异即有显著性,说明该浓度有促增殖作用[5]。这与EMPs对兔BMSCs和鼠BMSCs增殖的结果不尽相同,虽然EMPs均能促进鼠[8]、兔BMSCs的增殖,但作用的浓度不同。结果不同的原因可能是由于细胞培养过程中,不同种属细胞分裂增殖活动恢复的快慢不同;其次可能与提取获得的EMPs的纯度和效价不同有关,当然也可能与不同实验室所用培养液的成分不完全相同有关。我们在用MTT法检测细胞增殖的基础上,进一步采用流式细胞仪检测EMPs对人BMSCs细胞周期的影响。结果显示,加入EMPs培养5 d的人BMSCs,G1期DNA含量减少,而S期DNA含量增高,表明EMPs可以增加人骨髓基质细胞DNA含量,具有促进BMSCs早期DNA合成,使细胞从G0/G1期进入S期的作用,从而促进细胞增殖。

碱性磷酸酶(ALP)的表达是成骨细胞分化的主要特征之一。我们观察了EMPs对人BMSCs的ALP活性的影响,发现5 d时,在EMPs条件下,ALP阳性细胞数明显增多,呈条索状、片状。表明BMSCs可在矿化诱导液培养下,向成骨细胞方向分化,并可被EMPs所增强。诱导的细胞能够产生ALP, 也表明BMSCs具有矿化能力,已具备成骨细胞的生物学特性,而且应用矿化诱导液联合EMPs诱导5 d后即明显表达成骨细胞表型,说明联合应用矿化液和EMPs能在较短时间内有效诱导BMSCs分化为成骨细胞。

本实验以成人骨髓为培养材料建立的成人BMSCs的培养方法和成骨诱导途径,为该组织工程技术的临床应用打下了基础,但组织工程技术应用于牙周病学临床还需更多的深入研究。

摘要：目的:观察釉基质蛋白(enamelmatrix proteins,EMPs)对人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)细胞周期和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。方法:体外培养人骨髓基质细胞,以200μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。流式细胞仪检测EMPs对BMSCs细胞周期的影响,碱性磷酸酶试剂盒检测ALP的活性。结果:体外培养的人BMSCs生长良好,200μg/ml浓度的EMPs能提高细胞的ALP活性;影响细胞周期变化,EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%。结论:釉基质蛋白可促进人骨髓基质细胞的分化,影响细胞周期变化。

关键词：釉基质蛋白,骨髓基质细胞,增殖,矿化,细胞周期

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骨髓增殖性疾病 篇5

1 材料

1.1 实验动物

4周龄清洁级SD大鼠,雌雄不限,由南京中医药大学实验动物中心提供(SCXK(浙)20080033)。

1.2 实验药物

六味地黄丸水提液(LWW)。组成:熟地、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、牡丹皮。制备:以上中药加入10倍量的水煎煮两次,每次1.5h。过滤,滤液旋转蒸发浓缩,按照生药剂量使终浓度为1g/ml,调整pH=7.2,过0.22μm滤膜除菌,4℃保存,用时用含10%FBS的完全培养液稀释到所需浓度。

1.3 实验试剂

DMEM/F12(1:1)培养基(hyclone公司);胎牛血清(FBS,杭州四季青公司),PBS平衡盐溶液、胰蛋白酶(sigma公司),兔抗鼠单克隆抗体CD29、CD34、CD44(武汉博士德生物公司)。

1.4 仪器

高速冷冻离心机,SIGMA3K-15,德国。超净工作台,苏州净化设备厂。CO2恒温培养箱(SANYOMCO-15AC型),CK-40型倒置相差显微镜(OLYMPUS,日本)。Model 680型酶标仪,Thermo,美国。

2 方法

2.1 SD大鼠BMSCs分离、培养及生长形态观察

选用4周龄健康SD大鼠(雌雄不限),颈椎脱臼法处死。在尽量保持大鼠双侧股骨和胫骨的完整性的条件下,将大鼠双下肢剪下,取两侧股骨和胫骨,去除骨表面附着组织。75%乙醇浸泡5～10min,转移置于超净工作台上。暴露骨髓腔,用5ml注射器吸取无血清的DMEM/F12冲出骨髓,用吸管将平皿中的细胞悬液吹打混匀,形成单细胞悬液。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液洗涤2次,反复吹悬细胞,计数后以2×106密度接种于培养瓶(25com2),标记为P0,置于37℃、体积分数为0.05,C02饱和温度孵箱内,24h后进行半量换液,以后每2～3d全量换液1次,弃去非贴壁细胞以达到纯化,贴蹙细胞生长到80%以上融合时结束原代培养进传代。加入0.25%胰蛋白酶消化液消化3～5min,细胞突起缩回、细胞之间间隙增大时终止消化,制成细胞悬液,以1:2转入培养瓶中,接种密度为2×104/ml,放入培养箱继续培养。分别标记P1～3。倒置显微镜密切观察BMSCs生长情况及形态观察。

2.2 SD大鼠BMSCs的表型鉴定

取P3生长状态良好的细胞,制成细胞爬片,40g/L多聚甲醛固定,PBS冲洗,0.1%Triton-100通透,过氧化氢消除内源性过氧化物酶,加5%BSA,加一抗(兔抗大鼠CD44、CD34、CD29),同时用PBS作为一抗设置阴性对照,37℃孵育lh,加生物素化二抗,加SABC,DAB显色,苏木素染色,脱水、封片、显微镜下观察。

2.3 SD大鼠BMSCs增殖分析

选取生长状态良好的P3代细胞,0.25%胰酶消化后以1×104/ml密度接种于96孔板培养,每孔体积200μl。将细胞分为空白对照组及不同浓度(相当于生药含量)的六味地黄丸(LWW)干预组,即BMSCs组、Ⅰ组(4mg/mlLWW+BMSCs组)、Ⅱ组(2mg/ml LWW+BMSCs组)、Ⅲ组(lmg/mlLWW+BMSCs组)、Ⅳ组(0.5mg/mlLWW+BMSCs组)及V组(0.25mg/mlLWW+BMSCs组)。分别作用24h后每组加入20μl5mg/mlMTT培养4h后终止培养,每孔加入150μl DMSO振荡10min后用酶标仪在492波长处测吸光度(OD)值。

3 结果

3.1 BMSCs生长形态

骨髓单个核细胞接种于培养瓶后,细胞呈圆型,大小不一,悬浮于培养液中。24h后部分细胞开始贴壁,呈圆形或多角形。第3天换液后,可见少量短梭形、星形细胞分散贴壁生长,伸出伪足呈逗点状或短棒状(图1-A);6天左右可见放射状排列的细胞集落,伸出长短不一、粗细不均的突起、胞核大、核仁清晰(图1-B)。约14天细胞融合80%～90%,呈漩涡状(图1-C)。传代细胞比原代细胞贴壁快,24h内已全部贴壁、伸展,增殖迅速,均匀分布生长,6～7天可见长梭形细胞80%～90%铺满培养瓶形成单层。

3.2 BMSCs细胞表面抗原鉴定

免疫组化染色显示P4代rMSCsCD29、CD44有阳性表达,阳性细胞表现为胞浆呈棕色至棕褐色,细胞核周围最明显(图2-A、B),和CD34检测细胞均未见着色(图2-c),显示CD34呈阴性表达。

3.3 六味地黄丸对BMSCs体外增殖的影响

由表1可知,空白对照组(0.3422±0.03)相比,4、2、1、0.5、0.25mg/ml浓度六味地黄丸干预组吸光度值均增高,其中1mg/ml六味地黄丸干预组(0.4842±0.04)增高明显,差异有统计学意义(P<0.05)。

注:*与空白对照组比较P<0.05;**与空白对照组比较P<0.01

4 讨论

BMSCs是Friedenstein等[4]于1987年首次成功在体外分离培养发现,具有高度的自我更新能力和多向分化潜能。在特定条件下可分化为多种组织谱系的细胞,包括成骨细胞、脂肪细胞、成肌纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、心肌细胞[5,6,7,8]。BMSCs表面标示并非单一,一般认为整合素家族成员CD29、黏附分子CD44、CD166及CD105等是MSCs的重要标志物,而且MSCs不是造血类细胞,不表达造血细胞表面抗原,如造血前体细胞标志抗原CD34[9]。

本研究采用全骨髓贴壁法分离纯化的SD大鼠BMSCs呈长梭形,呈集落样生长,均匀的表达BMSCs标志抗原CD29、CD44,而不表达造血干细胞标志抗原CD34。符合BMSCs的生物特性,可以用以BMSCs相关的基础研究。六味地黄丸是中药滋补肾阴的经典代表名方,临床疗效确切,组方严谨合理。近年来,有关六味地黄丸的药效学研究主要集中在增强免疫功能、抗衰老、抗肿瘤及抗化疗药物毒副作用、降血糖、调节血脂、降血压等方面,但是对骨髓间充质干细胞的影响尚未见报道。基于“肾主骨”理论,本试验仅就六味地黄丸对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖进行了观察,提示其增加了BMSCs的体外增殖能力。但药物如何在体内对细胞产生作用尚需进一步全面、深入地研究。

参考文献

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骨髓增殖性疾病 篇6

胰岛素样生长因子-1 (IGF-1) 是一种作用于多种组织和器官的强效生长因子, 可不依赖其他因素独立影响骨基质的形成和细胞增殖, 在骨组织修复再生中起重要作用[2]。由于该蛋白半衰期短、局部使用易被稀释, 需反复给药, 价格昂贵, 限制了其在临床中的应用。故借助生长因子缓释系统实现活性药物的缓慢释放, 将是解决问题的关键。本实验通过构建IGF-I-GMs, 持续释放生长因子, 促进BMSCs的增殖, 为颌骨骨缺损修复的组织工程提供理想的种子细胞和生长因子提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

IGF-I冻干粉 (PeproTech公司, USA) ;固体明胶 (国药集团化学试剂有限公司) 及Span-80 (Sigma公司, USA) , 25%戊二醛、甲醛、丙酮、无水乙醇、液体石蜡均为分析纯, IGF-IELISA检测试剂盒 (Rapidbio公司, USA) , DMEM复合培养液 (Sigma公司, USA) , 兔淋巴细胞分离液 (天津市灏洋生物制品科技有限责任公司) , MTT (Sigma公司, USA) , Axiovert200倒置相差显微镜和照相系统 (Carl-Zeiss公司, Japan) , MIAS-2000图像分析仪 (四川川大智胜软件股份有限公司) , SME (Hitach公司, Japan) , FD-1冷冻干燥机 (北京博医康技术公司) 。

1.2 IGF-I-GMs的制备、粒径观察及性质检测

采用乳化交联法制备空白明胶微球。将空白明胶微球加入三蒸水充分浸润溶胀, 离心 (2500r/min, 15min) , 吸除上清液, 置于冻干机冷冻干燥, 1KGy 60Coγ射线照射30min消毒备用。

将500μL浓度为200μg/L的IGF-I溶液滴加在50mg经γ射线消毒后的冻干明胶微球上, p H=7.4、4℃充分浸润、膨胀24h后离心 (1500r/min, 15min) , 收集微球后在无菌状态下冻干, 封存。图像分析仪观察空白微球和冻干IGF-I-GMs的分散度及外形, 同时测量500个冻干IGF-I-GMs的直径, 计算其平均粒径, 以算术平均径为微球的平均粒径。

与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01

计算公式为:平均粒径=n1d1+n2d2+…+nndn/n1+n2+n3+…+nn。

(式中n1, n2…nn为粒子数;d1, d2…dn为粒径) 。

酶联免疫仪吸附法 (依据IGF-I ELISA试剂盒说明书) 在450nm处测定吸光度值 (A值) 绘制标准曲线。取微球样品2mg放入PBS (p H=7.4) 缓冲液中, 待完全溶解, 离心后, 上清液用PBS定容至20mL, 取10μL另加90μLPBS缓冲液共100μL作为代测样, 测出A450nm值, 然后在标准曲线上查出相应IGF-I的含量, 并由此计算出微球的载药率以及包封率。

载药率= (IGF-I质量/缓释微球质量) ×100%。

包封率= (IGF-I质量/缓释微球中IGF-I理论质量) ×100%。

动态透析法进行微球体外释药实验, 称取10mg IGF-I-GMs混悬于5mL PBS中, 置于37℃水浴摇床 (135r/min) 上, 分别于各时间点 (1、2、3、4、5、6、7d) 取上清液100μL, 离心 (1500r/min, 15min) 后取上清液100μL, 于450nm处测吸光度值, 结合IGF-I标准曲线, 测定不同时间点的样品上清中IGF-I的含量, 并绘制体外累积释放曲线。

1.3 兔BMSCs的分离与培养

采用全骨髓密度梯度离心法合并贴壁培养法培养BMSCs。取5周龄兔的双侧股骨, 将其两端干骺端切除, 用含低分子肝素钠0.2mL (100μL/mL) 的注射器吸取含10%FBS的DMEM培养液冲洗骨髓腔入培养皿, 并用注射器适当抽吸吹打使骨髓组织分散均匀后入10mL离心管, 室温下, 1000r/min离心10min, 弃上清后加入DMEM培养液至5mL, 再将该细胞悬液加入到装有等体积的Percoll (1.073g/mL) 分离液的10mL离心管中, 室温下2000r/min离心25min。收集中间乳白色有核细胞层加入DMEM低糖培养液至5mL, 室温下1000 r/min离心10min, 弃上清后再加入DMEM培养液至5mL重悬细胞, 按1×104个细胞/cm2接种于50cm2培养瓶中, 置于37℃、50mL/LCO2饱和湿度孵育箱中行原代培养。48h换液, 弃去未贴壁细胞, 此后每3d换液1次。原代培养细胞12d后细胞达80%融合, 用2.5g/L胰酶消化后以1∶3的比例传代培养。取第3代细胞行下游相关实验。

1.4 观察IGF-I-GMs和IGF-I-GMs对BMSCs增殖的影响

取生长良好的第3代BMSCs, 离心收集, 加入含10mL/LFBS的DMEM, 调整细胞密度至3×104/mL, 接种于4块96孔培养板, 分为三组:IGF-I-GMs组 (加入IGF-I-GMs, 依据微球含IGF-I相对于DMEM的终浓度再分为1、5、10、50和100μg/L 5个浓度组) 、IGF-I组 (加入IGF-I, 依据IGF-I相对于DMEM的终浓度再分为1、5、10、50和100μg/L5个浓度组) 和对照组 (不加IGF-I) 。各浓度设立8个复孔进行孵育。

1.5 MTT法检测BMSCs的增殖情况

在孵育第1、3、5、7d时, 每次随机抽取一块96孔板, 吸出各孔内培养液分别保存于EP管, 每孔加入无血清培养基200μL和MTT (5mg/mL) 液20μL, 继续于37℃、5%CO2孵育4h, 吸去上清液。每孔加入150μL DMSO, 室温下于微孔板振荡器上振荡15min, 静置30min, 测定A490nm。重复实验3次。

1.6 统计学处理

实验结果以χ—±s表示, 用SPSS13.0软件包处理, 分别以浓度和时间因素分组, 作单因素多水平两两比较方差分析 (Student-NewmanKeuls, S-N-K) , 检验水准a=0.05, P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 IGF-I明胶微球

扫描电镜显示明胶微球干粉分散度良好, 粒径均匀, 球体表面光滑, 复合IGF-I的明胶微球经图像分析仪检测, 平均粒径为 (19.51±3.53) μm, 冻干粉剂为疏松粉末, 无塌陷及萎缩现象。药物的载药量为890ng/g, 包封率为89.0%, IGF-I-GMs具有良好的缓释性能, 微球在释药初期具有“突释”效应, 释药速度较快, 3d后释放平稳, 7d后大约释放87%。

2.2 BMSCs

兔骨髓组织经PERCOLL分离液梯度离心后可形成明显的分层结构, 吸取单核细胞层细胞洗涤后接种, 倒置显微镜下观察培养液中存在大量大小不一的圆形细胞;2～4h后细胞开始贴壁, 3d后可见多数贴壁的圆形细胞中散在少数多角形或梭形细胞 (图1) , 5～6d后梭形细胞和多角形细胞显著增多, 8～10d后, 形成细胞集落方式生长, 呈放射状向四周扩展, 14d左右, 贴壁细胞生长至瓶壁的80%左右, 将细胞传代, 传代细胞形态逐渐呈均一的纺锤形和长梭形, 核质比大, 细胞分布均匀沿胞体长轴呈有序同向分布 (图2) 。传代细胞增殖速度更快, 一般5～6d可长满培养瓶底, 传代1次。

2.3 IGF-I和IGF-I-GMs对BMSCs增殖的影响

I G F-I组各浓度水平与对照组比较, I G F-I-G M s在梯度含量为1～100μg/L范围内均能促进BMSCs增殖 (P<0.05) , 且与对照组相比, 5、10、50、100μg/L浓度组均有显著性差异 (P<0.01) 。IGF-I浓度均为100μg/L时, IGF-I组和IGF-I-GMs组促进BMSCs增殖作用最强 (表1) 。但是IGF-I组各浓度水平间的比较无显著差异 (P>0.05) , 而IGF-I-GMs组各浓度水平间的比较有统计学意义 (P<0.05) , 提示IGF-I-GMs组对BMSCs增殖的促进作用呈浓度依赖性。

IGF-I浓度为100μg/L时, 作用1d后IGF-I和IGF-I-GMs对BMSCs的增殖影响无明显差异 (P>0.05) , 从第3d起持续到第7d, IGF-I-GMs的细胞增殖的效果较IGF-I均有显著性差异 (P<0.05) (表2) 。且IGF-I-GMs在不同时间点对BMSCs增殖的显著差异 (P<0.01) 具有时间依赖性。

3 讨论

与IGF-I组比较, *P<0.05, **P<0.01

组织工程中种子细胞的选择一直是学者研究的重点, BMSCs具有多分化潜能, 在特定条件下能向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等分化, 增殖能力强, 来源广泛, 取材方便, 供区损伤小, 因而倍受人们关注[3]。BMSCs具有很强的自我复制能力和多向分化潜能两个重要特征, 除此之外还有贴壁性、异质性、快速形成克隆的能力和可移植性等[4]。本实验采用密度梯度离心和贴壁筛选相结合的方法, 取得了理想的分离效果。传代3次后获得了纯度较高的长梭形BMSCs, 可满足下游实验的要求。

胰岛素样生长因子-I (IGF-I) , 是一类天然存在的生物活性介质, 为含有70个氨基酸残基, 与胰岛素有相似结构的生物多肽, 可作用于多种组织和器官, 具有促进细胞增殖和分化功能。LovschallH等[5]证实IGF是有丝分裂原, 是细胞从G1期向S期转变所必需的生长因子。Thomas等[6]使用IGF-I刺激体外培养的人骨髓基质细胞, 发现IGF-I以及它们的受体活性类似物能显著促进hBMSCs的增殖和分化。本实验结果显示:IGF-I对BMSCs有明显的促增殖作用, 最佳效应浓度为100 ng/mL。

由于外源性生长因子半衰期短, 局部使用很快被稀释和代谢, 需反复大剂量使用, 而且价格非常昂贵, 故借助生长因子缓释系统实现活性药物的缓慢释放, 将是解决生长因子稳定性差、体内半衰期短、生物膜通透性差等问题的有效方法[7]。对制作生长因子缓释剂的材料, 国内外均有大量学者在进行这方面的研究, 壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸以及他们的共聚物、聚乙烯醇、明胶、聚氰基丙烯酸正丁酯、多糖基水凝胶, 均有用作生长因子缓释系统的报道[8]。明胶是一种来源丰富的天然高分子材料, 它无毒无刺激可以降解, 降解产物无毒, 是一种包裹生长因子的理想生物材料。明胶分子溶于水后伸展为纤维状, 在冷冻脱水的条件下卷曲, 并由多个分子凝聚成球状微粒;在固化剂的作用下形成三维网状的稳定结构[9], 保证了微球的载药率和包封率;IGF-I与明胶分子之间有一定的亲和力, 从而使其被明胶所吸附并包裹形成缓释微球[10]。在冻干过程中, 明胶可与IGF-I形成氢键稳定IGF-I的天然构象, 从而保护其活性。

本实验结果表明IGF-I-GMs对BMSCs的增殖具有显著促进作用且呈现浓度和时间依赖性, 证实IGF-I-GMs保持了IGF-I的生物活性。用药1 d后IGF-I组促进作用强于IGF-I-GMs组;而用药3 d后IGF-I-GMs组促进作用强于IGF-I组。据此推测, 培养初期, IGF-I组中游离IGF-I的数量多于微球组中缓释的游离IGF-I数量;培养中后期, IGF-I组中大部分游离IGF-I失去活性, 而IGF-I-GMs组持续释放具有生物活性的IGF-I, 因此IGF-I-GMs促进BMSCs分裂增殖的持续效果优于单独应用IGF-I组。

本实验证明, IGF-I缓释微球可以持续释放具有生物活性的IGF-I, 并对BMSCs起到持续的促增殖作用, 细胞增殖作用大小与微球释药的速度和浓度密切相关。骨组织工程学要求种子细胞向单一方向分化, 所以BMSCs的定向诱导具有重要的作用, 有文献报道, IGF-I可诱导BMSCs向成骨细胞分化[11], 其促进BMSCs增殖及向成骨细胞分化的相互影响有待进一步研究。

摘要：目的 制备胰岛素样生长因子-Ⅰ明胶微球 (insulin-like growth factor-Ⅰ gelatin microspheres, IGF-I-GMs) , 观察其一般性质、体外释药特性及其对兔骨髓基质干细胞 (bone marrow stromal cells, BMSCs) 增殖的长期效应。方法 用乳化交联法制备IGF-Ⅰ-GMs, 观察其一般性质;ELISA法测定IGF-Ⅰ的含量, 计算微球包封率和载药率及体外释药特性。体外培养兔BMSCs, 四唑盐比色法 (methyl thiazolyltetrazolium, MTT) 检测IGF-Ⅰ和IGF-Ⅰ-GMs梯度含量分别对BMSCs增殖的长期效应。结果 ①所制备的微球表面光滑圆整, 球体均匀度好, 平均粒径为 (19.51±3.53) μm, 冻干粉剂为黄白色粉末状, 再分散性良好, 微球载药量和包封率分别为890ng/g和89.0%, 体外7d内药物缓释87%;②IGF-Ⅰ和IGF-Ⅰ-GMs均明显促进BMSCs增殖, IGF-Ⅰ-GMs较单独应用IGF-Ⅰ的效果更加显著 (P<0.05) , 呈浓度及时间依赖性。结论 IGF-Ⅰ-GMs冻干粉剂制备良好;IGF-Ⅰ-GMs在7d内对IGF-Ⅰ有良好的缓释作用;BMSCs形态和活性良好可以用于实验研究;IGF-Ⅰ-GMs与BMSCs有良好的生物相容性, 且促进BMSCs增殖效果明显优于单独使用IGF-Ⅰ。