骨髓培养

骨髓培养（共12篇）

骨髓培养 篇1

摘要：目的 对比、探求分离培养人骨髓间充质干细胞 (human mesenchymal stem cells, hMSCs) 的方法, 探讨hMSCs鉴定和标记的方法, 为进一步的实验研究打下基础。方法 采集成人健康志愿者骨髓5mL, 全骨髓贴壁法、全骨髓贴壁改良法、密度梯度离心法分离纯化、培养和扩增, 获得hMSCs, 对比三种方法。“慢冻速融”的原则进行细胞冻存、复苏。流式细胞术检测hMSCs的表面标志。hMSCs经5-溴脱氧尿嘧啶核苷 (Brdu) 标记, 免疫细胞化学法测定并评估。结果 hMSCs运用三种方法均可获得, 比较全骨髓贴壁改良培养法最为方便高效分离获取hMSC、体外扩增迅速。流式细胞仪检测结果显示:CD44阳性及CD71弱阳性, 表达率分别为95.05%, 78.86%;CD34、CD45阴性, 表达率分别为3.40%, 2.88%。Brdu最佳标记浓度和时间分别为10μmol/L和72 h。结论 hMSCs采取全骨髓贴壁改良法进行较好的纯化和扩增, Brdu标记可用于hMSCs的生长和分化的动态示踪观察。有望建立hMSCs库, 为组织工程、细胞移植研究打好基础。

关键词：人骨髓间充质干细胞,分离培养,流式细胞术鉴定,Brdu

骨髓间充质干细胞 (human mesenchymal stem cells, hMSCs) 具多向分化的潜能, 在一定条件下可向骨、脂肪、肌肉等中胚层来源的组织分化[1], 参与这些组织的损伤修复。分离、培养和扩增后仍保留分化潜能, 且具有低免疫原性和免疫调节功能, 稳定表达外源基因和易于转染[2,3], 成为组织工程较为理想的种子细胞, 也为利用骨髓间充质干细胞进行细胞及基因治疗提供了靶向载体。本实验将利用全骨髓贴壁法、全骨髓贴壁改良法和密度梯度离心法分离培养和纯化hMSCs, 并探寻冻存和复苏的条件, 流式细胞术进行鉴定, Brdu标记测定, 为研究hMSCs提供实验细胞来源。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

成人骨髓来自健康志愿者;低糖DMEM (美国Hyclone公司) ;胎牛血清 (FBS, 杭州四季青生物材料有限公司) ;胰蛋白酶 (北京中山生物技术公司) ;红细胞裂解液 (美国Sigma公司) ;Percoll淋巴细胞分离液 (美国Sigma公司) ;荧光标记鼠抗人抗体CD34-ECD、CD44-PE、CD45-FITC、CD71-FITC (美国Pharmingen公司) ;Brdu (美国Sigma公司) ;倒置相差显微镜 ( CK40-32PH , 日本Olympus 公司) ;超净工作台 (苏净集团公司) ;超速低温离心机 (美国Sigma公司) ;自动控温二氧化碳细胞培养箱 (美国Forma公司) ;恒温水浴箱 (上海医用恒温设备厂) ;流式细胞仪 (美国BD 公司) 。

1.2 hMSCs的获取和原代培养

选取20-30岁的健康男性志愿者, 告知志愿者并取得同意, 签订知情同意书后, 于髂后上嵴抽取骨髓5mL置于抗凝管中。

全骨髓贴壁培养法: 75 mL培养瓶中加入1000单位的肝素抗凝, 将上述骨髓对半加入两个培养瓶, 加入含20% FBS 的L-DMEM - F12 培养基 4 -5mL混匀 , 置于37℃、5% CO2 培养箱中恒温培养。48h后全量换液, 弃去红细胞等未贴壁细胞, 以后每3天进行换液。

全骨髓贴壁改良法: 5mL骨髓置于离心管中, 加入15mL红细胞裂解液, 轻轻吹打混匀, 作用10min, 1000rpm离心5min, 离心弃去上层红色清液, 收集沉淀部分, 加入无血清培养液离心洗2-3次, 重悬细胞, 培养液调整细胞浓度为2×105/mL接种于培养瓶中, 置于CO2培养箱中, 48h后换液, 弃去未贴壁细胞。此后每3天换液。

密度梯度离心法: 5mL骨髓转入无菌试管, 与等量无血清L-DMEM培养基混合, 1000r/min离心10min, 弃去脂肪和上清液, 重新垂悬, 另一离心管注入等体积Percoll分离液 (1.082g/mL) , 将骨髓缓缓加入上层, 注意勿混合, 2000r/min离心20min, 取中间单个核细胞层, 以培养液调整细胞浓度为2×105/mL接种于培养瓶中, 置于CO2培养箱, 48h后换液, 弃去未贴壁细胞。此后每3天换液一次。

1.3 hMSCs的纯化和扩增

原代培养10-15d hMSCs融合达到80-90%时进行首次传代。首先弃去原培养液, PBS缓冲液洗涤3遍, 去除残余培养液, 加入0.25%胰酶1mL进行消化, 放入培养箱作用30s到2min, 在相差显微镜下观察细胞解离程度, 低倍下见细胞突起缩回、间隙增大为宜, 立即加入培养液终止消化, 弯头吸管有序吹打瓶底, 以1:2比例将细胞悬液转入传代培养瓶, 加20%FBS 的L-DMEM - F12 培养基 4-5mL放入培养箱中继续培养。观察3-4d后贴壁生长达80-90%时, 再次进行传代, 传代2到3次后即可达到hMSCs的纯化和扩增。

1.4 hMSCs的冻存和复苏

传至第3代的hMSCs消化成悬浮细胞, 加入培养液吹打混匀, 移入离心管中, 以1000r/min离心4min, 见管底细胞沉淀, 弃去上清, 再加入细胞冻存液 (DMSO:FBS 1:9) 重悬细胞, 调整细胞浓度为1-5×106/mL, 移入低温冻存管中, 依次放入4℃冰箱30min、-20℃冰箱30min、-70℃气氮过夜, 最后置于液氮中长期冻存。复苏时将细胞冻存管从液氮中迅速取出, 立即置于37℃水浴箱中快速解冻, 要求30s内融化后转入培养瓶加上5mL培养基置培养箱中, 6h后观察换液去除未贴壁细胞。

1.5 hMSCs的表型鉴定

取第3代hMSCs, 0.25%胰酶消化贴壁细胞, 离心、垂悬, 制成密度为1×108 L-1的细胞悬液。各取悬液100μL, 分别加入MouseIgG-1、IgG-2, CD34、CD44、CD45、CD71各表型抗体10μL, 避光孵育15 min, PBS洗涤后滴入多聚甲醛固定液重悬, 流式细胞仪检测细胞CD34、CD44、CD45、CD71各表面抗原的表达。Cell-Quest软件分析数据。

1.6 Brdu标记及免疫细胞化学染色检测

传代24h内的细胞约50%融合时, 弃去原培养基, 换用Brdu终浓度为10 μmol/L的培养基, 相差显微镜下观察细胞的形态、生长及增殖, 分别于24h、48h、72h消化下细胞, 转入6孔板中爬片。细胞贴壁后用PBS冲洗, 10%多聚甲醛固定15 min, 进行Brdu的免疫细胞化学检测。具体步骤:Triton-X100破膜, 过氧化氢处理, 血清封闭, 滴入Brdu一抗, 37 ℃孵育2 h, 滴加生物素化二抗, 加入显色剂SABC, DAB, 显色5min终止, 中性树脂胶封片, 显微镜下观察。设PBS作一抗进行阴性对照。选取10个视野进行观察计数。

2 结果

2.1 原代培养

原代培养48h换液后, 在倒置相差显微镜下, 全骨髓贴壁法仍见大量未贴壁的红细胞、脂肪细胞等;密度梯度离心法未见其他杂质细胞, 贴壁细胞也较少;改良法可见贴壁的细胞形成了数个细胞的克隆细胞, 也可见较少的漂浮红细胞 (见图1) 。培养3-4d后, 细胞贴壁呈长梭形、类圆形, 细胞壁上少量突起, 细胞核较大, 呈扁圆形。改良法培养10d左右见细胞长满瓶底, 细胞间单层融合, 放射状、漩涡状整齐排列生长 (见图2) 。全骨髓贴壁和密度梯度离心法15d左右贴壁的hMSCs仍较少, 生长缓慢, 不能传代, 仍可见少量杂质细胞。

2.2 传代培养

传代细胞6-8h可贴壁, 形态与原代类似 (见图3) 。传代细胞生长周期约为3-4d, 80-90%融合后再次传代扩增。随着每次的传代和洗涤, 不贴壁的杂质细胞被逐渐弃去, 使hMSCs得以纯化。传至第3代时, 细胞形态仍与原代细胞相似, 呈成纤维细胞样生长, 镜下看不到其他的杂质细胞 (见图4) 。

2.3 细胞的冻存和复苏

大部分冻存细胞在6h内可贴壁生长, 少数细胞死亡, 无法贴壁。贴壁细胞形态及生长速度与冻存前无显著差异, 这一点对于hMSCs的研究及体内移植具有重要意义。

2.4 hMSCs表型鉴定

流式细胞仪检测第3代hMSCsCD44阳性细胞比率为95.05%, CD71阳性细胞为78.86% (见图5) , CD45为2.88%, CD34为3.40% (见图6) 。

2.5 Brdu标记及免疫细胞化学染色

IHC见Brdu阳性细胞, 阳性反应物位于细胞核, 呈棕色, 颗粒状或弥漫性分布 (见图7) , 数据统计分析标记率达80%。对比24h、48h、72h发现Brdu 最佳标记浓度和时间分别为10 μmol/L和72 h。对照组未见阳性细胞 (见图8) 。

3 讨论

目前hMSCs分离培养的方法主要有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法[4]、免疫学方法[5]等。免疫学法利用hMSCs的表面抗原采用流式细胞分离法或免疫磁性分离法对其分离, 有较高的特异性, 但影响细胞活性[6], 且仪器成本较高, 因此较少应用。密度梯度离心法采用Percoll或Ficon分离液将红细胞、白细胞和单核细胞层有效地分离, 操作步骤较复杂, 所得细胞数量较少, 再通过密度梯度离心获得的hMSCs大大减少, 离心后也影响细胞活性。由于骨髓中含大量红细胞、脂肪细胞等影响间充质干细胞的贴壁, 故全骨髓法分离培养所得细胞杂质较多, 目的细胞较少, 不利后期实验。本实验运用改良贴壁培养法对hMSCs进行分离, 使用红细胞裂解液去除红细胞, 离心去除脂肪细胞。因此改良贴壁培养不影响间充质干细胞的贴壁可用于hMSCs的分离, 方法简便易行。

体外分离培养人骨髓间充质干细胞易受培基血清浓度、种植密度、培养环境等条件的影响[7]。培养基血清浓度以10-20%左右为宜, 浓度过高由于血清中含有大量促进细胞分化的因子, 可引起细胞分化, 不利于目的细胞生长。传代培养时以1:2比例传代为宜, 胰酶消化时间把握适当, 不宜过长, 本实验通常消化30s左右, 镜下见细胞突起缩回、细胞间隙增大即可终止。冻存细胞时要注意冻存液的配比浓度, 另外冻存时应逐步降温, 复苏时快速复温, 这样才利于细胞最大可能的存活。由于间充质干细胞缺乏特异性的干细胞标志, 目前, 体外间充质干细胞是通过一系列的表型和形态结构功能特性来综合鉴定的[8]。研究表明, 间充质干细胞表面抗原表型并不是单一的, 而是兼有间充质、内皮和肌肉细胞的特征[9]。间充质干细胞表达一系列的细胞表面抗原如Stro-1、SSEA-4、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90等, 不表达造血细胞表面抗原如CD34、CD45、CD38、CD14。实验选取CD34、CD44、CD45、CD71四种代表性的抗原标记物, 流式细胞仪分析显示, CD44阳性细胞比率为95.05%, CD71阳性细胞为78.86%, CD45为2.88%, CD34为3.40%。说明分离的细胞群纯度较高。

实验采用Brdu标记hMSCs, 并进行免疫细胞化学染色, 其阳性标记率> 80%, 不影响细胞生长、形态、增殖, 结果显示Brdu标记hMSCs可用于活体内移植的干细胞的检测示踪。

综上所述, 本实验所采用的全骨髓贴壁改良法分离培养间充质干细胞和BrdU标记示踪方法操作简单, 不影响细胞增殖能力, 实验结果稳定, 使用流式细胞术选取细胞表面抗原监测的hMSCs具有代表性, 为今后进一步研究hMSCs的生物特性及其在组织工程方面的应用奠定了基础。

参考文献

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骨髓培养 篇2

成人骨髓间充质干细胞体外培养及诱导分化的研究进展

目的. 探讨成人骨髓间充质干细胞体外培养及诱导分化的研究现状及发展前景.方法 查阅国内外公开发表的相关文献,进行分析、归纳、总结.结果 成人骨髓间充质干细胞可在体外大量扩增,并诱导分化为骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多种组织细胞.结论 成人骨髓间充质干细胞具有成为种子细胞的潜力,在细胞移植方面有广阔前景.

作 者：李亚 赵勇刚 梁萍 LI Ya ZHAO Yong-gang LIANG Ping 作者单位：河南科技大学第一附属医院,河南洛阳,471003刊 名：河南科技大学学报(医学版)英文刊名：JOURNAL OF HENAN UNIVERSITY OF SCIENCE & TECHNOLOGY (MEDICAL SCIENCE)年，卷(期)：27(2)分类号：Q813.1+1关键词：成人骨髓间充质干细胞 细胞培养 诱导分化

骨髓穿刺不可怕　　 篇3

为什么要做骨穿

明确诊断 白血病包括十几种类型，预后差别很大，治疗也有所不同。仅靠外周静脉血检查无法准确分型，骨穿检查是最佳手段。对于多发性骨髓瘤等疾病的诊断，骨穿也是必不可少的。对于不明原因的骨转移癌，骨穿可能获得肿瘤细胞，从而明确诊断。

疾病分期恶性淋巴瘤常侵犯骨髓，甚至并发白血病，提示肿瘤已进入晚期。为了准确确定其临床分期和治疗方案，应该在首次治疗前常规行骨穿检查。

疗效判断在白血病、多发性骨髓瘤和恶性淋巴瘤的治疗过程中，需要多部位、多次进行骨穿检查。通过动态观察骨髓状况，可以及时判断疗效和调整治疗方案。

确保治疗安全在肿瘤放化疗的过程中，骨穿能帮助医生了解病人的骨髓功能。化疗时，要依据骨髓增生程度酌情给药，以把握最佳时机和确保用药安全。放疗时，如果病人白细胞等指标持续低下，要根据骨髓状态调整剂量。

骨穿非常方便安全

很多病人觉得骨穿是件很恐怖的事情，其实不然。骨穿的方法很简单，一般是在髂骨前(或后)上嵴或胸骨部位，局部注射少量麻药，用骨穿针抽取一小滴骨髓组织就可以了。一个熟练的医生操作骨穿的全部过程，也不过几分钟。抽出骨髓后，病人可以马上起床活动。

有的病人觉得骨穿会损伤“元气”，这也是一种误解。正常人的骨髓造血组织平均有2600克，每次骨髓穿刺抽取的量仅0.2-0.3克，加之骨髓是人体再生能力很强的组织，抽了以后会很快生成，所以对病人健康没有任何损伤，也不会引起远期损伤。

骨髓间充质干细胞的三维培养 篇4

关节部位的损伤或关节疾病如骨关节炎、关节退行性病变严重影响人类健康,而究其原因主要是关节部位软骨不同程度的缺损或病变。组织工程技术是目前修复关节软骨损伤研究领域的热点,其中种子细胞、组织工程支架、生长因子的选择是当前研究的核心,其主旨是利用支架为种子细胞提供三维培养环境,从而促进细胞的渗入、黏附和组织的形成。

2 材料和仪器

2.1 实验动物

日本大耳白兔(武警医学院动物实验中心)。

2.2 实验材料

壳聚糖粉末(医用,山东奥康生物科技有限公司)。

2.3 主要试剂

聚乙二醇(Sigma公司);CD44、CD45试剂盒(Sigma公司);冰醋酸、速眠新、肝素钠等(华北制药厂)。

2.4 主要实验仪器

冻干机(北京博医康);超纯水系统(英国Millipore公司);台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂);FEI Quanta 200扫描电镜(荷兰FEI公司)。

3 实验方法

3.1 壳聚糖支架制作

将3%壳聚糖醋酸混合溶液100 mL,加入相对分子质量为1 000的聚乙二醇1 g,放入37℃水浴箱内以溶解腊状聚乙二醇,以1 500 r/mim转速离心10 min去除气泡。将壳聚糖醋酸溶液缓慢倒入72孔板内,放入冰箱-20℃预冷冻10 h,再放入冷冻抽干机中冻干24 h,制备壳聚糖支架。将支架从72孔板内取出,放入0.1mol/L NaOH中,中和支架内的残余醋酸,以PBS液反复冲洗至pH值中性备用。

3.2 扫描电镜观察支架超微结构

将制备好的壳聚糖支架用锐刀切开放入3%戊二醛固定4 h,磷酸盐缓冲液漂洗10 min×3次,1%四氧化锇固定2 h,磷酸盐缓冲液漂洗10 min×3次,梯度乙醇(30%~100%)脱水,乙酸异戊酯置换,冻干法干燥,金离子溅射法镀膜(SCD-005),FEI Quanta 200扫描电镜观察该支架的孔径大小及支架的超微结构。

3.3 骨髓间充质干细胞的提取及鉴定

无菌胸骨穿刺针从日本大耳白兔胫骨近端采取骨髓约5 mL,全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞,10%胎牛血清的LG-DMEM作为细胞培养基,在37℃、体积分数为5%的CO2及饱和湿度条件下培养,取第3代BMSCs,免疫细胞化学测定其细胞表面抗原CD44、CD45,对BMSCs进行鉴定。

3.4 骨髓间充质干细胞-壳聚糖支架的三维培养

将壳聚糖支架浸泡在装有75%酒精的6孔板内,放入超净台内紫外线照射30 min,无菌条件下以PBS缓冲液反复清洗3次,再用LG-DMEM反复清洗2次,吸去培养液后,重新加入LG-DMEM液浸泡24 h备用。将支架从培养液中取出,置入24孔培养板内,取第3代BMSCs以1×106/mL密度接种于支架内(各孔加入3 mL培养基将支架完全浸没),放入37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养。分别在培养24、48 h后取出细胞/支架复合体进行电镜检测,观察细胞在支架上的黏附生长情况。

4 结果

4.1 细胞培养及鉴定结果

细胞培养2周后长满培养板底壁,细胞形态多呈梭形(如图1所示)。CD44免疫细胞化学检测可见阳性细胞主要集中在细胞密度高的区域,胞浆内可见棕黄色颗粒,细胞周围也出现黄染区(如图2所示);CD45检测结果为阴性(如图3所示),符合骨髓间充质干细胞的生物学特性。

4.2 扫描电镜观察壳聚糖支架的超微结构

电镜下壳聚糖支架在横断面上可见内部密布大小均一的孔洞,孔径为150~360μm,平均为255μm左右(如图4所示)。

4.3 骨髓间充质干细胞与支架的三维培养

BMSCs与支架共培养24 h后,多孔支架表面密布细胞,部分细胞已渗入支架孔内生长(如图5~6所示),分泌少量细胞外基质,并与支架建立连接;48 h后,部分孔内可见细胞呈簇生长,底层细胞已呈现梭形黏附在支架上,部分细胞分泌大量细胞外基质,与支架黏附较好,细胞在三维培养环境下生长较好(如图7~8所示)。

5 讨论

5.1 骨髓间充质干细胞作为种子细胞的可行性

骨髓腔内含有造血和基质两大系统。前者由造血干细胞及其分化的细胞组成,后者是富含骨髓基质的异质细胞群体,BMSCs是存在于骨髓基质中的非造血干细胞。20世纪70年代,Friedenstein等[1]在骨髓标本中首次发现骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)。它具有自我复制能力及多向分化潜能。在体内和体外通过外界干预及环境的变化,可以分化成具有多种功能的细胞,干细胞可分为成体干细胞和胚胎干细胞,BMSCs是成体干细胞的一种。现阶段,BMSCs已广泛应用于组织工程、基因治疗等方面。其中在神经系统、心肌组织、骨组织、软骨组织的组织工程应用尤为广泛[2,3,4]。BMSCs不仅存在于骨髓,在软骨膜、骨膜及肌肉中也有间充质干细胞的分布,但骨髓中的含量相对较多,BMSCs可以来源于机体各部位的骨髓,不同来源的BMSCs的功能状态不一。Minguell等发现同等条件下,椎骨来源的BMSCs其碱性磷酸酶活性低于胫骨来源的细胞[5],故我们选取胫骨取材,另外,有研究发现BMSCs的数量随年龄增加而逐渐减少[6]。D’Avis等观察到随供体年龄增长BMSCs数目下降并对生长因子的反应性降低[7]。而成年后长骨骨髓腔内以黄骨髓为主,若以此作为BMSCs的来源,则分离出的脂肪细胞较多,BMSCs少,而幼年动物骨髓腔内以具有多向分化潜能的各种未分化幼稚细胞为主。因此,我们选取2.5月龄的日本大耳白兔作为实验动物,用以分离到数目相对较多且功能良好的BMSCs。

5.2 利用壳聚糖制备组织工程支架的可行性

组织工程支架从取材方面看分为天然材料、人工合成材料和天然与人工合成复合材料。天然材料主要有几丁质类(壳聚糖,Chitosan,CS)、胶原(Collagen,COL)、纤维蛋白(Fibrin,FIB)、藻酸盐(Alginate,ALG)、蚕丝蛋白等;人工合成材料主要有聚乳酸(Polylactide,PLA)、聚羟基乙酸(Polyglycolide,PGA)、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(Polylactic-co-glycolic acid,PLGA)、羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)、磷酸三钙(Tricalcium phosphate,TCP)等;天然与人工合成复合材料支架,如CS/HA支架、COL/TCP支架、COL/PLGA支架等。

其中壳聚糖支架的优点有:(1)良好的生物相容性和组织相容性[8,9]。壳聚糖是自然界广泛存在的一种天然多糖类有机聚合物,它的分子结构和软骨基质糖氨多糖(GAG)结构相似,具有良好的生物相容性和组织相容性,对软骨细胞有较好的吸附作用,能促进细胞在材料上的增殖与分化[10]。(2)多孔结构特性[11]。通过冻干法将混合溶液中的聚乙二醇去除,从而形成多孔结构,诸多多孔结构利于细胞的渗透,增大细胞在支架上的黏附生长面积,为组织的重建奠定基础。(3)良好的加工性能。由于实验中以72孔板为磨具,制备的材料以圆柱形为主。实际上我们可以根据临床需要,设计并制备大小、形状、厚度相匹配的支架,从而构建出适合需要的细胞/支架修复体。(4)支架易于消毒、保存,消毒后支架材料不降解[12]。壳聚糖支架的消毒可应用酒精浸泡方式消毒,并通过缓冲液及培养液的反复洗涤去除酒精,实验证实该种消毒方式下细胞在支架上能够较好生长,并未见明显其他细菌滋生。不足之处:力学特性和耐磨损性能相对差,关节部位由于其解剖特点特殊,其受力因素较为复杂,在机体运动过程中,关节部位的受力不但有纵向和横向受力,而且存在切面方向的滚压式受力,因此支架材料的选择应适合力学环境下的需要,保持一定的力学性能和耐磨性适应临床治疗的需要。

5.3 骨髓间充质干细胞三维培养的必要性和可行性

实验表明[13],细胞在单层培养时,细胞在增殖、生长一段时间后常会发生细胞之间的接触性抑制,从而抑制了细胞生长和增殖。利用三维培养,为细胞提供三维立体的生长环境,从而更加利于细胞的生长、黏附,减少细胞间的接触性抑制。同时,我们知道,软骨组织的缺损其结构亦为立体结构,单层细胞无法对软骨缺损进行修复。三维培养就是为种子细胞提供三维立体结构,按照支架结构的形状、大小形成组织,以适应临床需要,并且三维多孔结构,孔与孔之间相通,在培养液中添加药物或生长因子,可通过孔道相互传递,达到浓度均一,从而利于外界因素对组织工程化软骨形成的干扰,对组织的构建提供更好的平台。

6 结语

骨髓穿刺定位研究 篇5

（黎凤萍 李彩霞 佛山科学技术学院医学院2009医学检验2班；指导老师： 刘文国）

[摘要] 目的探讨骨髓穿刺术的形态学定位方法。方法

在人体标本或活体上进行观测以探寻较为准确及简便的骨髓穿刺定位方法。结果

对临床上常用的五个穿刺部位进行形态学的观察与测量获得相关数据。结论

骨髓穿刺术的关键在于如何快而准地进行定位，若定位能够快而准地选好，将为诊断、治疗带来莫大的帮助。

[关键词]

骨髓；穿刺术；定位

骨髓是各类免疫细胞和血细胞发生及成熟的场所，是机体重要的中枢免疫器官。骨髓穿刺术是采集骨髓的一种常用诊断技术。其适应证为各种血液病的诊断，鉴别诊断不明原因的血细胞数量增多或减少及形态学异常；也可进行血液形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学的分析和干细胞功能、病原生物学的检查等，从而了解骨髓的造血功能诊断疾病。骨髓穿刺术是获取骨髓的一种关键性的诊疗技术，骨髓穿刺点定位的准确与否直接关系到穿刺的成败，故穿刺点的形态学定位研究具有临床意义。材料和方法

材料：人体骨骼标本20副，人体标本6具，人体活体10人，手术器械若干，游标卡尺；方法：选定穿刺部位，通过观察定位及距离测量以获得穿刺点的准确定位方法。结果

我们就临床上常用的骨髓穿刺部位，通过对标本、活体进行观察和测量，进行了较为全面的观测比较、测量和分析，获得了相关数据和结论。

临床上，常选用以下5个部位进行骨髓穿刺：髂后上棘，髂前上棘，胸骨，腰椎棘突，胫骨上端内则。其中髂后上棘是最常用的穿刺位点，我们根据现时的医学发展情况及医生诊断的需要，重点对髂后上棘进行了研究。

2.1 髂后上棘 取标本侧卧位，在标本剖开前使之双腿向胸部弯曲，使其腰骶部位向后突出，髂后上棘充分显露。用游标卡尺量得髂后上棘到骶骨中线的距离为30mm；然后把标本的臀部、腰部后背下方的皮肤，肌肉剖开找到髂骨的精确位点，作上标记，同时找到椎骨棘突，用卡尺量得到在骶骨正中脊至髂后上棘处水平距离为44.82mm。由于在活体上有皮肤和肌肉，所以有时难以确定骶骨正中棘的部位，也可以触摸腰椎，用卡尺量度第五腰椎垂直向下34.18mm处也就是骶骨正中棘与髂后上棘连线的交点。

对于肥胖者，可用手指循髂脊轮廓在骶椎两侧触知或从患者头部10°角水下方向观察，髂后上棘是最低的一个区域，在该区找最低点，可触摸髂后上棘[1]。

[2][1]髂后上棘骨质较薄，骨髓腔大，髓液较丰富，比较容易刺入，安全性大，而且在患者背部进行取样，患者不易恐慌。

2.2 髂前上棘

取仰卧位（如有腹水或异常肿大脏器可以半侧仰卧[3]），双手指交叉放于头部枕骨下，暴露脐下至骶骨联合上段皮肤，操作时医生应双手夹住髂骨[4]，穿刺位点在髂前上棘顶端后约10mm较平坦处[1]，或者脐与髂前上棘连线中外1/3处。

另外，有的患者有大量腹腔积液，肝脾极度肿大，这类患者不应选用该部位，明显腹胀者会因穿刺针内滑在穿入腹腔的危险[5]。

该位点较硬，细胞增生度低，医生穿刺时稍为费力[1]，而髂前上棘后10-20mm处的骨面较为平坦，易于固定，操作方便。所以临床上常在髂前上棘后10-20mm进行穿刺，从而降低了手术的危险性。

2.3 胸骨

取仰卧位并将胸部用枕头稍垫高10°—15°，患者头稍后仰，充分暴露胸骨[3]。快速查找胸骨穿刺点有以下三种方法：

1、胸骨角正中部位上15mm处；

2、第二或第三肋骨间水平面上5mm~10mm处（或胸骨凹下10mm处）[6]；

3、胸骨柄

[6]与胸骨体相接处稍下方正中线上。

选择此部位胸骨较薄，骨髓细胞增生旺盛[7]，骨髓丰富，易于固定[3]，皮下组织少，压迫容易止血，但该部位距心脏和大血管较近，具有一定的危险性[7]。当其他部位穿刺结果不理想时，仍可考虑胸骨穿刺。

2.4 腰椎棘突

患者反坐于背靠椅上，双臂交叉放在椅背上，把枕头放在双臂上，使上身向前弯曲，背部尽量向后突，使棘突暴露得更加清楚。另外一种方法是使患者左侧卧，右臂抱着双腿，使腰椎明显暴露[1]。可选择第三、四腰椎棘突进行穿刺，选用棘突体而不用棘突尖。

选择这个部位的优点在于患者能够感觉的疼痛较少，但是有很大的局限性。大多数小孩的脊突端小而不要容易固定，部分成年人脊突尖硬不易刺入。

2.5 胫骨

取仰卧位并固定下肢，选定胫骨粗隆水平向下10mm稍内侧垂直刺入。因为胫骨骨质会随年龄增长变得坚厚，而且红骨髓逐渐被脂肪组织所代替变成黄骨髓，从而失去造血功能[1]，其中造血组织亦趋减少。所以胫骨穿刺只适用于2岁以下的儿童[2]。讨论

骨髓穿刺技术以及骨髓标本的采取正确与否，直接关系到骨髓细胞学诊断的结论和效果。这点对血液病及其他病理改变诊断至关重要。在穿刺实际操作过程中常因患者的个体差异、年龄、胖瘦、心理耐受性配合程度、患者扁骨的厚薄及三维立体角度、患者的疾病性质、施术者的经验等因素而有所不同。医生只有术前对患者本身所带有的疾病进行综合的考虑，研究才能选取最恰当的定位位点。对解剖结构的掌握熟练是每一们穿刺医生的基本要求，人体的骨质硬度会随着年龄的增长而增加，不同的个体相同的骨构大小不尽相同，每一个穿刺点的骨髓腔大小也有很大差别。

很多时候，患者的心理因素更是影响手术进行、效果的另一重要因素。因此，术前医生可对患者做适量的心理辅导，说明其必要性和安全性，解除顾虑和不必要的紧张心理。选择棘突和髂后上棘的穿刺点，患者不能看到穿刺所用的医疗器械及穿刺操作过程，可减少其心理恐慌，此处是临床上较为常用的穿刺部位。

骨髓穿刺术是临床上一项既常用又十分重要的技术，也是作为一名医务工作者所必须具备的技术。骨髓穿刺术定位的技巧性很高。经过这次学术基金的研究，我们深刻地认识到在骨髓穿刺的整个过程中，骨髓穿刺的具体定位是最为关键的。作为一名合格的医务工作者，只有清楚认识人体的解剖位置，加之不断在临床上进行反复骨髓穿刺术的练习，才能取得骨髓穿刺的成功。

参考文献：

[1] 钟振宇 骨髓穿刺序程解析 淮海医药 2003年6月第21卷第3期 P197； [2] 唐宏 如何提高骨髓穿刺成功率 实用医技杂志 2007年1月第14卷第1期

（旬刊）P120；

[3] 窦洪渠 雷霆 骨髓穿刺方法改进56例报告 川北医学院学报 2001年9月第 16卷第3期 P106；

[4] 郑潇潇 郑维扬 江千里 徐波儿 何美蓉 孟卫东 “五字诀”优化骨髓穿刺

培训体系 南京医科大学学报 2010年3月 第1期 P81；

[5] 张军 骨髓穿刺200例临床分析 实用医技杂志 2009年6月第16卷 第6期

P479；

[6] 徐强 王丽红 5ml注射器行小儿胸骨骨髓穿刺40例 中国煤炭工业医学杂志

2009年1月第12卷第1期 P17；

[7] 彭楚明 肖灿辉 肖琴 苏咏泉 一次性注射针头在老年人胸骨骨髓穿刺中的

应用 中国医学工程 2006年6月第14卷第3期 P303；

[8] 李有国 艾玲 采用一次性注射器做婴幼儿胸骨骨髓穿刺50例 新乡医学院

让服务深入骨髓 篇6

原本是个卧底

郭敏的早期经历很丰富，在餐厅做过服务员，当过领班，卖过图书，也在电视台当过记者。有一天，他去洗车，猛然发现“洗车这个生意还不错，一辆车的费用是5-10元不等，那是2003年”。

于是，他心生念头，打算进入洗车行业。他在报纸上寻找商铺转让的广告，发现了一个规律：几乎距离每个转让的洗车铺子一公里范围内，必有一家精典汽车美容连锁。“虽然我当时不知道这是一家怎样的企业，但是我想一定很强大，是它逼死了那些转让的铺子。”

郭敏语言幽默，并且语速也较快，是一个头脑非常灵活的人。“先找机会应聘到精典汽车，看看他们是怎样运营的，为以后自己的铺子讨点经验。”就这样，经过6轮面试，郭敏进入精典汽车连锁，成为一名“卧底”。郭敏当时的身份是“实习销售代表”。上班第一天，就成功销售了6瓶发动机抗磨剂。该产品当时的售价是200多元，相当于一款车一次保养的全部费用。20天以后，他又卖掉了70多瓶。正是这些良好的工作表现，让郭敏得到了提拔，成为罗家碾店店长助理。随后，又以优秀的业绩成为新鸿店店长。而从他进入这一行到升任店长，只用了70天时间。

据了解，新鸿店的前两任店长都是因为连续两个月没完成任务而“阵亡”了。郭敏履新，虽然压力山大，但是凭借满腔热情和科学的方法，连续五个月超额完成任务。不久，他升任绵阳区域主管，统管3家店。因为出色的表现，一年后，郭敏再次被提拔，负责管理精典汽车美容连锁，直至调任精典上海大众4S店总经理。

先把服务做好

“只要你有能力，你就有平台。”郭敏认为，精典集团的文化就是如此。“我的每一步，都是集团给安排的，虽然我内心有过斗争，但是想到我是来学东西的，所以都接受了命运的安排。”接管上海大众4S店之后，郭敏继续奉行精典的企业文化，讲诚信、讲亲情，将服务做到极致。

早在1997年，精典集团就前瞻性地提出了服务制胜的企业理念。“这就像苹果，它可以领行业之先，让消费者享受到先进的技术，站在行业的前沿高地。”在精典上海大众4S店购车的消费者，可以享受到让您出乎意料的服务——对于那些刚刚拿到驾照的消费者来说，停车入库是最难的，也最容易产生心理恐慌。针对这部分群体，精典上海大众可以派专人上门指导，在2个小时时间内教会车主如何倒车入库。

而如此细致贴心的服务，源自郭敏对于家人的关心。据透露，他的老婆和父亲也曾经是新手司机，对于停车非常恐惧，郭敏帮助他们逐渐学会了停车入库。家人都有如此需求，客户当然也有，郭敏所说的服务，就是这样一个从亲情出发，反哺客户的理念。

“我们追求服务的过程，而不是结果。而当我们的过程做到极致的时候，结果往往比我们预想的要好很多。”郭敏说，精典汽车十几年来的高速发展也印证了它的服务理念是非常正确的，迎合了消费者的需求，才会取得长足进步。

我不是总经理

据了解，精典上海大众的销量全部来自展厅销售，因为它没有二级网络。然而，就是这样一个销售模式，精典上海大众的展厅销量一直保持了第一名的成绩。在今年成都国际车展现场，精典上海大众仅用十天时间，就取得了777辆的订单成绩，在成都地区再次夺冠，这不能不说是一个奇迹。

那十天，郭敏每天镇守车展现场，从早到晚，从未含糊。他取掉了胸牌，也不让员工暴露他的总经理身份，像普通员工一样，奋战在车展现场。当有客户需要回店开票提车，销售又抽不出人手的时候，郭敏就代劳；当现场销售顾问都忙于接待客户时，他就变成了销售顾问，帮忙接待更多的客户；总之，他是一个“机动”员工，而不是那种高高在上的总经理。

Q&A（Q=张欣男 A=郭敏）

Q：你最喜欢什么动物？

A：狗。我家里养了一条金毛。

Q：你怎么看待“财富”二字？

A：好东西。可以回报家人，有助于改善他们的生活品质，有助于我孝顺父母。

Q：你理想当中的精典上海大众是一个什么样的公司？

A：比现在更有勇气去挑战，更具竞争意识。

Q：最内疚的事儿？

A：对一线员工关心和了解不够。

Q：当老板有什么经验？

A：创业是为自己做，打工也是为自己做，做任何事都是为自己而不是为别人而做。

Q：你最钦佩的人是谁？

A：邓小平。

Q：你最讨厌的几件事是什么？

A：形式主义；浪费资源。

Q：来自他人的建议里，最有价值的一个是什么？

A：工作中给我提相反意见的。这说明他尊重我。

Q：谁是对你影响最大的人？

A：父母。

骨髓培养 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

成年Wistar大鼠, 雄性, 体重 (200±50) g, 购于兰州大学实验动物中心, 动物合格证号:SCXK (甘) 2013-0002。

1.1.2 主要试剂

DMEM/F12培养基及0.25%胰蛋白酶 (购自Gibco公司) 。胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) 购自Hyclone公司。B27添加剂购自Invitrogen公司。表皮生长因子 (EGF) 、碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF) 购自Peprotech公司, 小鼠抗Nestin抗体、兔抗GFAP抗体、小鼠抗Galc抗体购自Chemicon公司, 小鼠抗MAP2抗体、兔抗β-tubulinⅢ抗体购自Abcam公司, 兔抗CD133抗体购自Santa Cruz公司。Alexa Fluor 488山羊抗小鼠Ig G、Alexa Fluor 594标记羊抗兔Ig G和Alexa Fluor 488山羊抗兔Ig G购自Molecular Probes公司。DAPI封片剂购自Vector Laboratories公司。

1.2 方法

1.2.1 Wistar大鼠骨髓基质细胞的分离、培养和鉴定

将所选大鼠无菌条件下取双侧股骨和肱骨, 取5 m L无菌注射器, 用10 m L DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔, 用吸管将骨髓组织悬液反复吹打均匀, 1000 r/min, 离心5 min后, 以含10%FBS的DMEM/F12含血清培养基重悬, 接种于25 cm2培养瓶, 37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。骨髓细胞通过直接贴壁法培养, 根据大鼠骨髓基质细胞贴壁生长的特征, 采用差异贴壁法, 定期更换掉不贴壁的细胞, 得到贴壁生长的骨髓基质干细胞, 48 h后更换培养基, 培养条件同前, 去除未贴壁细胞, 并以PBS缓冲液轻轻冲洗2遍。以后每隔72小时换液1次, 待原代细胞达到90%融合后, 用0.25%胰酶消化进行传代, 通过传代培养进行纯化及扩增。。

1.2.2 Wistar大鼠骨髓源性神经球的诱导培养及鉴定

大鼠骨髓源性神经干细胞的培养方法采用无血清悬浮培养法, 选择第四代在含血清培养基中培养呈对数生长期的贴壁骨髓基质细胞, 用0.25%胰酶消化, 吸管反复吹打制成单细胞悬液, 以含20 ng/m L b FGF、20 ng/m L EGF及使用浓度为1∶50的B27添加剂的DMEM/F12培养基重悬, 调整活细胞密度为2×105/m L, 接种于25 cm2培养瓶中, 置37℃, 5%CO2、饱和湿度培养箱中培养, 约2~3 d换半液1次, 并添加半量b FGF、EGF、B27等生长因子。

1.2.3 Wistar大鼠骨髓源性神经球的CD133和Nestin检测

(1) 选取在无血清培养基中呈悬浮生长的状态良好的大鼠骨髓源神经球, 去除培养基, 0.01 mol/L PBS冲洗3次, 用4%多聚甲醛固定30 min;0.01 mol/L PBS冲洗3次; (2) 0.3%Triton X-100破膜, 室温10 min;0.01 mol/L PBS冲洗3次; (3) 10%正常山羊血清封闭60 min; (4) 滴加一抗:兔抗CD133 (1∶200) 和小鼠抗Nestin (1∶100) 置湿盒中4℃孵育过夜, 去除一抗, 0.01 mol/L PBS冲洗3次; (5) 滴加二抗:Alexa Fluor 594标记羊抗兔Ig G (1∶200) 和Alexa Fluor 488标记羊抗小鼠Ig G (1∶200) , 37℃孵育1 h, 去除二抗后, 0.01 mol/L PBS冲洗3次; (6) 用含DAPI的封片剂 (H-1200, Vector Laboratories) 对细胞核进行复染, 并封片, 荧光显微镜下观察。 (7) 同时设阴性对照实验, 以抗体稀释液代替一抗, 结果镜下不显色, 为阴性结果。

1.2.4 Wistar大鼠骨髓源性神经球的分化

Wistar大鼠骨髓基质细胞在无血清培养条件下, 呈球状聚集生长, 选择生长状态良好的大鼠骨髓源神经球, 经0.01%胰酶消化制成单细胞悬液或直接将神经球用PBS液清洗, 按2×105个活细胞/m L的密度, 接种于含血清培养基 (DMEM/F12+10%FBS) , 置37℃, 5%CO2、饱和湿度恒温培养箱培养。分化7 d后, 行免疫细胞荧光检测, 具体操作步骤如下: (1) 去除培养基, 0.01 mol/L PBS冲洗2次, 用4%多聚甲醛固定30 min;0.01 mol/L PBS冲洗3次, 5 min/次; (2) 10%正常山羊血清封闭60 min; (3) 滴加一抗:小鼠抗GFAP (1∶500) , 小鼠抗MAP-2 (1∶100) , 小鼠抗β-tubulinⅢ (1∶100) , 小鼠抗Galc (1∶100) 置湿盒中4℃孵育过夜, 去除一抗, 0.01 mol/L PBS冲洗3次; (4) 滴加二抗:Alexa Fluor 488标记羊抗小鼠Ig G (1∶200) 、Alexa Fluor 488山羊抗兔Ig G (1∶200) , 37℃孵育1 h, 去除二抗后, 0.01 mol/L PBS冲洗3次; (5) 用含DAPI的封片剂 (H-1200, Vector Laboratories) 对细胞核进行复染, 并封片, 荧光显微镜下观察。 (6) 同时设阴性对照实验, 以抗体稀释液代替一抗, 结果镜下不显色, 为阴性结果。

2 结果

2.1 Wistar大鼠骨髓基质细胞的形态学观察

通过倒置相差光学显微镜观察发现, 至第三代时骨髓基质细胞形态较为均一, 已经得到纯化, 细胞形态以长梭形为主, 体积较小、大小基本一致, 增殖速度较快, 经多次传代其细胞形态、大小及增殖方式不会发生改变 (图1) 。

注:细胞呈贴壁生长, 梭形, 交织成网, 放大倍数:×200

2.2 大鼠骨髓源性神经球的诱导培养、鉴定及CD133和Nestin检测结果

DMEM/F12培养基中, 大部分细胞呈悬浮生长, 形成细胞球, 细胞球由几个到几十个细胞组成, 大部分细胞球呈圆形, 随着培养时间的延长, 球体内细胞数量增多, 球体增大, 但球体内细胞增殖速度较慢, 约7~9 d传代1次。经免疫组织化学检测, 所形成的细胞球呈CD133和Nesitn阳性 (图2) 。

注:大鼠骨髓源神经干细胞呈Nestin (绿色、图2A) 、CD133 (红色、图2B) 阳性, 细胞核以DAPI复染 (蓝色、图2C) , 荧光显微镜, 标尺为50μm

2.3 大鼠骨髓源神经干细胞的分化

将大鼠骨髓源神经干细胞去除生长因子, 并转入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养后, 其生长方式再次发生改变, 不再呈悬浮生长, 而是再次转为贴壁生长, 单细胞及神经球很快发生贴壁, 贴壁后细胞不再呈圆形, 而是伸出突起, 呈梭形、多角形及不规则形等, 且其增殖速度较在无血清培养基中为快。分化7 d后, 行免疫荧光细胞化学检测, 可表达星形胶质细胞表面标志物GFAP、神经元标志物MAP-2和β-tubulinⅢ, 少突胶质细胞表面标志物Galc。其中大部分细胞均呈GFAP阳性, 少部分细胞呈MAP-2、β-tubulinⅢ及Galc阳性 (图3) 。

注:大部分细胞均呈GFAP阳性 (图3A) , 少部分细胞呈MAP-2 (图3B) 、Galc (图3C) 及β-tubulinⅢ阳性 (图3D) , 荧光显微镜放大倍数:×200

3 讨论

神经干细胞 (neural stem cells, NSCs) 是指分布于神经系统的, 具有无限增殖、自我更新及多向分化潜能的细胞[1], 最早由Reynolds等[4]分离得到并提出这一概念, 以后的研究发现在中枢神经系统的多个部位存在神经干细胞, 如脑室、脑室下区、中脑导水管周围等[1,5], 它具备无限增殖、自我更新及多向分化潜能, 其增殖方式包括对称分裂和不对称分裂两种分裂方式, 通过对称分裂进行自我更新与增殖, 产生两个子代神经干细胞;而通过不对称分裂产生一个神经干细胞, 另一个为相对成熟的已分化细胞, 通过不对称的分裂方式产生神经组织的各类细胞, 如神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。神经干细胞不仅存在于动物胚胎时期发育的脑组织中, 在成年动物脑中也存在。神经干细胞的主要功能是作为一种后备储备, 它在一定条件下可以进行增殖、迁移和分化并参与神经系统损伤修复或细胞正常死亡的更新[6,7]。但是成体中枢神经损伤后其自我再生能力有限, 远远不能完成神经功能的再生修复的功能, 特别是大面积受损的中枢神经组织, 仅靠自身的神经干细胞修复是无法实现的。因此, 采用外源性干细胞移植治疗中枢神经系统损伤成为目前治疗的主要策略之一[8,9,10,11]。

目前干细胞移植修复中枢神经系统损伤的细胞包括胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓基质细胞、脂肪源神经干细胞、骨髓源神经干细胞等[12,13]。其中, 胚胎干细胞及中枢来源的神经干细胞虽在理论上有较高的评价, 但用于异体移植时有较大的免疫排斥反应, 并且存在伦理上的限制, 故其不适宜用于临床。脑源性神经干细胞直接从中枢神经组织取材, 其来源受限, 扩增培养困难;胚胎干细胞来源于发育早期阶段的胚胎, 能分化成全身的所有组织细胞, 是全能干细胞, 但是由于伦理的限制和具有诱发同种异体免疫以及有致瘤性的可能性, 目前尚无法临床推广应用。相比而言, 骨髓基质细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 作为移植修复治疗用细胞则具显著优势[12]。

骨髓基质细胞是一种增殖能力较强的、存在于骨髓非造血组织中的多能干细胞, 它来源丰富, 取材简单, 培养增殖容易, 并且自体移植没有伦理争议和免疫排斥的问题。在中枢神经系统损伤的细胞移植治疗研究中, 骨髓基质细胞已成为较理想的种子细胞来源之一[14]。目前分离纯化骨髓基质细胞的方法主要有以下四种:全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、荧光激活细胞分选 (fluorescence-activated cell sorting, FACS) 和磁珠分离法 (magnetic-activated cell sorting, MACS) [15]。由于目前尚无BMSCs的特异性表面标志物, FACS及MACS方法的应用十分局限。袁斌等[16]研究发现, 采用密度梯度离心法分离出的BMSCs增殖速度显著慢于全骨髓贴壁培养法。在本实验的预实验中, 采用梯度离心法进行细胞, 亦发现骨髓细胞的增殖显著慢于全骨髓贴壁法, 且采用梯度离心法分离出的骨髓细胞在培养过程中其形态不规则, 细胞内易出现空泡, 分析原因, 可能系梯度离心分离液对骨髓细胞的生物学活性有一定的抑制作用, 故在本实验中, 采用了全骨髓贴壁培养法。实验发现, 若接种后24 h进行换液, 部分骨髓基质细胞贴壁不牢, 经换液时细胞量损失较大;若延期至72 h进行换液, 培养基内营养成分减少, 细胞培养基的酸度增大, 细胞的活性会受到一定程度的抑制, 因此, 本实验采用首次接种后48 h换液, 换液时轻轻晃动培养瓶, 并采用PBS缓冲液将未贴壁的杂细胞去除, 然后多次传代处理, 骨髓基质细胞形态逐渐变得均一, 细胞形态以长梭形为主, 体积较小、大小一致、增殖速度较快, 经多次传代其细胞形态及增殖方式不会发生改变。

近年来研究表明, 骨髓基质细胞于体外通过诱导分化可获得骨髓源性神经干细胞[2]。无限增殖和自我更新能力是神经干细胞的主要特征之一。本实验发现, 将Wistar大鼠骨髓基质细胞转入含b FGF、EGF的无血清培养基中后, 其生长方式发生改变, 呈悬浮或半悬浮状态, 呈球状聚集生长, 从生长速度来看, 其增殖速度相对较慢, 呈现未分化的幼稚状态。CD133和Nestin为目前公认的神经干细胞特异性标志物, 通过免疫荧光检测, 发现呈球状聚集生长的细胞球呈CD133和Nestin阳性。多向分化潜能是神经干细胞的另一主要特征, 其可分化为中枢神经系统内神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等细胞。在本实验中, 将Wistar大鼠骨髓源细胞球转入含血清培养基中后, 其生长方式再次发生改变, 不再呈悬浮生长, 而是再次转为贴壁生长, 单细胞及神经球很快发生贴壁, 贴壁后细胞不再呈圆形, 而是伸出突起, 呈梭形、多角形及不规则形等。分化7 d后, 行免疫荧光细胞化学检测, 大部分细胞表达星形胶质细胞表面标志物GFAP, 表达星形质细胞表面标志物GFAP、神经元标志物MAP-2和β-tubulinⅢ, 少突胶质细胞表面标志物Galc。由此可见, 成年Wistar大鼠骨髓源神经细胞球具多向分化能力, 具备类似神经干细胞的多向分化能力, 可分化为星形胶质细胞、神经元及少突胶质细胞样细胞。

综上所述, 采用含b FGF和EGF的无血清培养法, 可成功将成年Wistar大鼠骨髓基质细胞诱导为骨髓源神经干细胞, 这为大鼠骨髓源神经干细胞的进一步研究提供了实验基础。

摘要：目的:对Wistar大鼠骨髓源神经干细胞进行分离、培养和鉴定, 观察其生长方式和分化特征。方法:运用无血清培养基对Wistar大鼠骨髓基质细胞进行培养, 对分离获得的悬浮生长的神经球采用免疫组织化学法检测CD133和Nestin表达情况。用血清诱导其分化, 分化7 d后, 采用免疫荧光细胞化学染色方法检测分化后GFAP、Map2、β-tubulinⅢ、Galc的表达情况。结果:大鼠骨髓基质细胞在无血清培养基中, 呈悬浮状态生长, 形成细胞球, 经免疫荧光检测, 细胞球呈CD133和Nestin阳性。将细胞球转入含血清培养基后, 转为贴壁生长, 经免疫荧光检测大部分已分化细胞呈GFAP阳性, 少部分细胞呈MAP-2、β-tubulinⅢ及Galc阳性。结论:采用含bFGF、EGF的无血清培养基可培养出呈球状聚集生长、具多向分化潜能的大鼠骨髓源神经干细胞。

骨髓培养 篇8

1 材料和方法

1.1 主要材料

SD大鼠由第四军医大学动物中心提供。胎牛血清,α- MEM培养液,CD29、CD90、CD34、CD45抗体,β- 磷酸甘油钠,维生素C,地塞米松,均购自美国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 BMSCs分离培养

2周龄雄性SD大鼠1 只,体重120 g,断颈处死,分离出四肢,用含有10%胎牛血清的α- MEM培养液冲洗骨髓腔收集骨髓细胞,在37 ℃、 5% CO2孵箱内培养,3 d后首次换液,7 d后细胞贴满培养瓶底部,倒置显微镜下观察细胞形态。

1.2.2 骨髓间充质干细胞鉴定

传代后,取第2 代生长良好的细胞,制备细胞悬液后,分别加入CD34、CD45、CD90、CD29大鼠抗体,FITC、PE标记,用流式细胞仪检测标记抗体阳性的细胞百分比。

1.2.3 成骨诱导分化及鉴定

将第2 代BMSCs接种于6 孔板,密度为2×104/孔。细胞贴壁后加入成骨诱导液(地塞米松10-8 mol/L + β-甘油磷酸钠10 mmol/L+抗坏血酸50 mg/L),在37 ℃、5% CO2孵箱内培养,每3 天换液1 次,于第21 天弃培养基,用茜素红进行矿化结节染色。

1.2.4 成脂诱导分化及鉴定

将第2 代BMSCs接种于6 孔板,密度为2×104/孔。待细胞贴壁后,加入成脂诱导液(1 μmol/L地塞米松+10 μmol/L胰岛素+200 μmol/L吲哚美辛+0.5 mmol/L 3- 异丁基- 1- 甲基黄嘌呤)继续培养,每2 d换液1 次,培养至14 d,弃培养液,在倒置相差显微镜下观察细胞质中脂滴状态并用油红O染色,检测细胞成脂情况。

1.2.5 MTT法细胞增殖活性的测定

将第2 代BMSCs接种于96 孔培养板,密度1×104/孔,每孔α- MEM培养基0.2 ml。于培养后第1、 3、 5、 7、 9 天,弃去上清液后,每孔加入200 μl浓度为0.2 mg/ml的MTT溶液(用α- MEM培养基配制),震荡混匀后继续培养4 h。再弃去上清液,每孔加入200 μl DMSO溶液,酶标仪上振荡10 min,用仅加培养基的空白孔调零,以560 nm为检测波长,检测每个孔的吸光度值(A)。

2 结 果

2.1 BMSC形态观察

刚分离出的原代细胞较小,呈圆形,不能与血细胞区分,3 d后首次换液,观察此时细胞明显变大并已贴壁生长。1 周后细胞已长满,呈梭形。经传代后细胞状态逐渐稳定(图 1)。

2.2 细胞增殖活性检测

MTT检测结果显示,所培养BMSCs在培养第3天起显示出很强的增殖活性,在培养1、3、5、7、9 d时的OD值分别为0.29±0.024、0.27±0.043、0.495±0.057、0.945±0.144、1.092±0.278。细胞倍增时间为36 h。

2.3 CD34、CD45、CD90、CD29表达检测

流式细胞仪检测P2代BMSCs CD90细胞计数阳性率为88.2%,CD29阳性率为98%,CD34细胞计数阴性率为2.8%,CD45细胞计数阴性率为2.7%(图 2)。

a: CD90细胞计数阳性率为88.2%; b:CD29阳性率为98%; c: CD34细胞计数阴性率为2.8%; d: CD45细胞计数阴性率为2.7%

a: Expression of CD90(88.2%); b: Expression of CD29 (98%); c: Expression of CD34(2.8%); d: Expression of CD45(2.7%)

2.4 成骨诱导分化鉴定

P2代BMSCs成骨诱导21 d后,茜素红染色,显微镜下可明显观察到矿化结节形成(图 3a、b)。

2.5 成脂诱导分化鉴定

取P2代BMSCs加成脂诱导液诱导后,14 d弃培养液,油红O染色,显微镜下可见红色脂滴形成(图 3c)。

a、b: BMSCs成骨诱导21 d后矿化结节染色; c: BMSCs成脂诱导14 d油红O染色

a, b:Osteogenic induction for 21 d (Alizarin red staining); c:Adipogenic induction for 14 d (Oil red O staining)

3 讨 论

近年来,因牙周病引起的牙槽骨丧失在临床中越来越常见,修复阶段性骨缺损已成为临床中的难点,骨组织工程为这一难题的解决带来了新的希望。种子细胞、生长因子和生物支架是影响骨组织工程质量的三要素。在众多的种子细胞中,BMSCs以取材方便、免疫排斥反应低[3]、扩增能力强[4]、成骨潜能高等特点而成为研究的热点。Morishita[5]曾将骨髓基质干细胞接种于羟基磷灰石支架上,植入骨肿瘤切除后的缺损区,6 个月后使之得以修复。但需要注意的是:组织中的干细胞只有在特定的培养环境中才能转化为成骨细胞,且不同体外诱导条件、不同年龄来源的骨髓基质细胞在其成骨分化方面也存在差异[6]。本实验对大鼠BMSCs进行了体外培养及表面标志物与多向分化潜能的鉴定,为其进一步用于成骨实验研究乃至以后在动物体内的研究打下基础。

参考文献

[1]Jayadev S,Nochlin D,Poorkaj P,et al.Familial prion disease with alzheimer disease-like tau pathology and clinical phenotype[J].Ann Neurol,2011,69(4):712-720.

[2]Wirz S,Dietrich M,Flanagan TC,et al.Influence of PDGF-AB on tissue development in autologous platelet-rich plasma gels[J].Tissue Eng Part A,2011,17(13-14):1891-1899.

[3]Barry FP,Boynton BE,Haynesworth S,et al.The mono-clonal antibody SH-2,raised against human mesenchymal stem cells,recognizes an epitope on endoglin(CD105)[J].Biochem Biophys Res Commun,1999,265(1):134-139.

[4]王荣,刘华松,孙正.BMSC-HA/TCP修复羟基磷灰石种植体周围骨缺损的实验研究[J].口腔医学研究,2007,23(6):620-623.

[5]Morishita Honoki K,Ohgushi H,et al.Tissue engineering approach to the treatment of bone tumors:Three cases of cul-tured bone g rafts derived from patients'mesenchymal stem cells[J].Artif Organs,2006,30(21):115-118.

骨髓培养 篇9

由于人骨髓间充质干细胞 (hBMMSCs) 在骨髓血中含量较低, 能否在相对短的时间内获得数量充分、性状满意的种子细胞, 成为阻碍其尽早在临床得到广泛应用的一个障碍。既往文献中记述的分离、传代、增殖培养方法各异, 所检测的表面标记物也不统一, 后续的深入研究就没有一个规范的研究基准。本实验所关注的, 正是心血管外科领域中组织工程学的基本问题-对人骨髓间充质干细胞来源的种子细胞的获取、分离、培养、基本生物学特性, 流式细胞术对hBMMSCs表面标记物的测定, 以及大量增殖的研究。

1 资料与方法

1.1 hBMMS Cs的分离、提取及原代培养

健康人骨髓血10~20 m L, 肝素锂抗凝采血管 (Becton Dickinson) 采集备用。术中采集的新鲜骨髓血, 加入等量的PBS溶液, 于室温下400 g离心10 min。PBS重悬后, 取细胞悬液, 加入1.073 g/m L的Percoll淋巴细胞分离液 (Parmacia) , 于900 g离心30 min。收集分层后白膜层的单个核细胞。PBS溶液洗2次, 加入10%的FBS溶液 (FBS, Hyclone) , 于DMEM-LG培养基 (Invitrogen) 中重新悬浮。于25 cm2Nunclon塑料培养瓶 (Denmark) 中接种5.0×106个细胞, 置于37℃, 5%二氧化碳孵育温箱 (Thermo 3110, US) 中。24 h后, 更换培养液, 弃除未贴壁细胞。以后每3~4天换液一次, 此为原代MSCs。

1.2 hBMMS Cs的传代培养

当培养瓶底的细胞培养物接近90%融合时, 以0.25%胰酶, EDTA消化。每25 cm2Nunclon塑料培养瓶中接种2.5×105个细胞, 此为第一代传代细胞。以后依次传代培养, 并在相差显微镜下观察计数细胞。每天取6孔计数细胞数目, 取均值绘制细胞生长曲线。

1.3 流式细胞仪鉴定hBMMS Cs

用0.25%胰酶消化培养的P4代细胞, 成单细胞悬液, 进行CD14, CD34, CD38, CD44, CD45, CD71, CD73, CD90, CD105, CD117, CD147相应的单克隆抗体 (PharMingen) 孵育。

4℃暗室染色30 min, 用PBS洗涤2次后, 用流式固定液固定待测。同时进行同型对照染色。流式细胞仪为BD公司的FACS Vantage。

消化细胞, 计数, 每BD管加入细胞2×105, 溶于200μL, 加入抗体, 4℃、30 min或者室温20 min, 加入3 m L PBS, 1 200 rpm×6 min。离心, 洗2次, 溶于200μL流式细胞固定液中, 4℃保存待检。

用流式细胞仪 (FACS Vantage, Becton Dickinson) 进行细胞表面抗原检测。

1.4 MS Cs在Cytode x3微载体上的生长

取0.5g Cytodex3 (Pharmacia) 加入0.1 mol/m L的PBS 50mL中, 并加入吐温-80 2滴, 浸泡过夜。PBS溶液冲洗2次, 高压灭菌30min。以DMEM培养基 (Invitrogen) 冲洗2次, 并将Cytodex3浸泡在DMEM培养基中, 置于4℃冰箱中备用。Poly-HEMA (Sigma) 以无水乙醇配制成2.5%的溶液, 预处理反应器瓶壁, 超净工作台上吹干备用。实验时将Cytodex3用DMEM洗3次。取消化好的传代P4代MSCs, 共5.0×105/2.5 m L备用。

实验组:1.5 m L Cytodex3 (约0.015 g) 与1.25m L的MSCs (约2.5×105个) , 混合后, 置于24孔培养板内并放在自制的搅拌反应器上, 置于37℃, 5%二氧化碳孵育温箱中。开始时每半小时转动1min。6小时后持续转动。共11 d。在本次培养开始后的第2、4、6、8和11天, 从24孔板中取与Cytodex3共同生长的细胞悬液200μL, 离心后弃去上清, 加胰酶至500μL, 20 min后开始计数。一次计数6孔。

对照组:24孔板中加入0.1 m L/孔的MSCs (约2.0×104个) , 补充DMEM培养基并调整细胞浓度为0.9×105/m L, 也放在同一孵育温箱中的反应器上。共11d。在与实验组相同的时间点, 对对照组细胞弃去上清后, 加入胰酶400μL, 20 min后开始计数。一次计数6孔。

相差显微镜下观察、照相, 并以血球计数仪计数绘制在Cytodex3上生长的MSCs和普通培养 (为对照组) 的生长曲线。

1.5 统计学处理

应用SPSS11.0统计软件, 对同一时间点 (天) 的细胞数目 (在Cytodex3上生长的MSCs和普通培养作为对照) 等数据进行独立样本的t检验。P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 hBMMS Cs的原代和传代培养

原代培养接种3~4 h后细胞开始贴壁, 24 h后贴壁细胞数量明显增多。3 d后贴壁细胞聚集, 有时克隆呈漩涡状, 而细胞为多角形、长梭形或纺锤形, 见图1。

传代培养的BMMSCs开始呈圆形, 2~3 h开始贴壁, 12 h内贴壁率为90%左右。传代培养后的细胞不再以呈集落方式生长, 而是均匀分布生长, 24 h后细胞完全伸展并变为梭形、多角形, 折光性好。圆形细胞明显减少。随后传代的细胞增值生长迅速, 见图2。

2.2 hBMMS Cs传代细胞计数结果, 见表1

2.3 流式细胞仪细胞亚群鉴定结果

表2显示的是hBMMSCs不同的表面标记物在进行流式细胞术检测时, 所呈现的阳性表达率或阴性表达率。

可以看到, CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、CD105和CD147均呈阳性表达。CD71和CD90的阳性率分别为86.74%和71.01%, 其他标记物的阳性率都在96%以上;CD14、CD34、CD38、CD45和HLA-DR呈阴性表达, 除CD45外, 阳性率都在2%以下。

2.4 相差显微镜下在Cytode x3上生长的hBMM-S Cs

每个微载体上大约能附着3~5个hBMMSCs。此时的hBMMSCs形态不再是长梭形或多角形, 可能是由于表面张力的缘故而呈圆形生长, 胞浆和核仁丰富, 见图3。

对照组的MSCs尽管也同时是在动态培养条件下生长, 但形态与静态培养时并无两样, 仍为多角形或梭形, 折光性好, 胞浆和核仁丰富, 生长活性好, 见图4。

2.5 在Cytode x3上生长的P 4代hBMMS Cs与普通培养 (control) 的hBMMSCs计数结果比较

MSCs能够在微载体上迅速贴附、铺展并生长。当MSCs在微载体表面生长时, 细胞密度和培养速度至少是普通培养方法的4.5~9.6倍, 差异有显著性 (P<0.01) 。

在Cytodex3上培养的前8 d, 不同时间点之间的细胞数目增长迅速;而第8天到第11天, 细胞数目增长不明显, 进入平台期, 见表3。

3 讨论

人骨髓间充质干细胞 (human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMMSCs) 是一群存在于骨髓基质中的非造血细胞, 仅占骨髓有核细胞的1/20 000~1/30 000, 具有多向分化潜能。由于将可能成为新型理想的种子细胞而引起了人们的广泛关注。自FRIEDENSTEIN[1]首次通过骨髓培养贴壁生长获得BMMSCs, 并发现这种细胞具有多向分化潜能。与其他种子细胞相比, BMMSCs具有诸多优点, 并将在组织工程学中占据不可替代的作用。但作为组织工程的一个新的自体种子细胞, 欲在临床实践中得到有效应用, 还需对其进行合理地选择, 充分地了解其生物学特性。

hBMMSCs的分离与基本培养:骨髓MSCs的分离, 最早的方法是细胞贴附分离法, 但所得细胞的成分复杂, 骨髓MSCs的纯度不足[1]。而应用单克隆抗体磁珠分离系统或流式细胞仪技术, 对细胞的活性影响较大, 甚至导致细胞完全失去活性[2]。

采用梯度分离是较简便而实用的分离骨髓中MSCs的方法, 它能有效地将红细胞、白细胞和间充质细胞分离开来。目前常用的梯度分离液有Percoll和Ficoll两种。此两种梯度分离液在分离骨髓中的MSCs中均具有操作简便、快速、对细胞的活性影响较小的优点。然而, 这两种梯度分离液对骨髓的MSCs的分离效果有所不同, 有实验证实[3]:用Percoll梯度分离液对骨髓的MSCs分离的纯度高于Ficoll梯度分离液。其原因可能是由于Percoll和Ficoll两种梯度分离液在密度上的微小差别而分离不同的细胞群, 由于Ficoll的密度较高, 因而保留了部分存在于Percoll液面下的细胞。用Percoll液梯度离心法加贴壁培养方法提取MSCs能够在梯度离心时利用MSCs与成纤维细胞比重不同, 将MSCs与成纤维细胞分离开[4,5];单层贴壁培养法又将不能贴壁的造血细胞分离开。

本实验显示, 应用Percoll密度梯度分离液能方便快捷地将人BMMSCs分离提取出来, 对细胞活性影响小, 便于后续的其他实验研究。

h BMMSCs原代培养时种植细胞密度为1×105~3×105/cm2, 48 h后换液的方法较合理[6]。密度超过3×105/cm2并不能缩短MSCs原代培养时间;而接种密度过低时, MSCs及其他贴壁细胞的含量将明显减少, 从而大大延长原代培养时间。体外培养细胞还受培养血清的浓度、种植细胞的密度、培养的温度、培养基的pH值等影响。并非血清浓度越高就能促进细胞生长;细胞生长也受细胞与细胞之间相互作用的影响, 细胞种植密度的多少将影响细胞生长, 以 (4~8) ×104/m L的细胞数进行种植最利于细胞生长。

本实验采用的方法就是在25 cm2Nunclon塑料培养瓶中接种5.0×106个细胞, 相当于2.0×105/cm2的密度。这是很传统、经典的原代培养方案。事实证明在本实验的培养方式中, 细胞种植密度、FBS浓度、换液时间等都是合理、有效, 而且经济的, 与大多数文献报道推荐的方案相一致。

流式细胞术 (flow cytometry, FCM) 对人骨髓MSCs的表面标记物的测定:MSCs是混合细胞群, 不具备典型的形态特征, 通过光学显微镜形态学及流式细胞仪研究其细胞大小和颗粒的有无, 均无从判断MSCs。目前对MSC并没有找到理想的特异标记分子, 它既有间质细胞的表面抗原特征, 又有内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞的表面抗原, 但不表达造血细胞的表面标志, 如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等, 也不表达与人白细胞抗原 (HLA) 识别有关的的共刺激分子B7-1、B7-2及主要组织相容性复合物II类分子, 如HLA-DR抗原等。同样从蛋白表达水平上MSCs也没有一个独特的已知表面标志物。而分离获得的细胞是否为MSCs, 对结果的可信度具有很重要的意义。目前比较公认的鉴定MSCs标志是缺乏CD34、CD45和CD11b等造血干细胞标志, 而表达CD90、CD71及CD44等标志的细胞群。CD44、CD54属于细胞黏附分子[7], 在造血干细胞并不表达。而CD105和CD166更是已倾向于作为MSC的特征性标志的一部分。

有实验应用流式细胞术检测了传代培养的MSCs表面标志[8,9], 结果CD166、CD29、CD44、CD105表达呈强阳性, 阳性率高达96.7%以上;HLA-DR和CD34呈阴性表达。在本实验中, CD29、CD44、CD73、CD105都在96%以上, 而呈阴性表达的CD14、CD34和HLA-DR的阳性率都在2%以下, 说明分离的MSCs的纯度较高, 而且表型也较均一, 这与文献报道相一致[10]。只有CD71、CD90、的阳性率分别为86.74%和71.01%, 阴性表达的CD45的阳性率为2.94%。但这些并不影响流式细胞术对MSCs的检测结果是确实可靠的。实际上, 有人认为阳性率只要超过门控的50%即为有效。

由于每个实验的方案不尽相同, 所得到的细胞纯度可能不同, 而在骨髓来源的贴壁细胞中除骨髓间充质干细胞外, 最常见的为成纤维细胞。只有最大限度地减少成纤维细胞才能提高培养效率。因此, MSCs的体外分离培养中的一个关键问题就是去除成纤维细胞。流式细胞术结果提示MSCs呈CD44+和HLA-DR-表达, 而成纤维细胞呈CD44-和HLA-DR+表达[9]。

本实验结果也证实了所提取的细胞符合鉴别MSCs所需的几项基本标准[11], 即在塑料培养瓶壁上贴壁生长;表达CD105、CD73、CD90, 阳性率≥95%;不表达CD45、CD34、CD14, 或CD11b、CD79α, 或CD19, 和HLA-DR表面分子, 阳性率≤2%。以上实验结果表明所分离的细胞就是MSCs, 而非造血干细胞或成纤维细胞。流式细胞术可快速有效地鉴定hBMMSCs表面标记物。

利用Cytodex3微载体对人骨髓MSCs进行大量扩增培养:由于骨髓间充质干细胞的含量极低, 需要在体外进行大量扩增。如果采用平皿培养法, 操作繁杂且耗时长, 既容易污染又需要占用巨大的培养空间, 难以满足临床实践的需要。

VAN WEZEL于1967年最先使用微载体系统进行细胞大规模培养, 该技术目前已渐趋完善和成熟。由于微载体具有极大的比表面积, 很小的空间可以培养出大量的细胞, 有报告微载体培养细胞密度最高可达1×1011/L[12], 因而可以满足骨组织工程对细胞数量的要求。近年来利用微载体系统进行组织工程细胞的大规模培养, 已成功培养了软骨细胞、成骨细胞、肝细胞等多种细胞[11], 在组织工程领域展示出良好的应用前景。

从理论上讲, 100 m L的搅拌生物反应器加入0.5 g的Cytodex3型微载体, 由于培养面积可达100m L普通培养瓶培养面积的60倍, 微载体法培养细胞的数量也应达到普通培养的60倍。利用微载体培养MSCs, 由于有更大的可贴壁表面, 解决了传统培养中接触抑制的问题, 从而可获得更多细胞。同时, 微载体培养是一种悬浮状态培养, 细胞培养混合更均匀, 细胞生长状况均一, 不会产生局部的副产物积累, 因而细胞生长速率快。但由于搅拌生物反应器产生的剪应力对细胞的不利影响、细胞达到高密度后营养不足, 代谢产物的累积限制了细胞的密度[13]。通过减小生物反应器的剪应力、改善营养供给有望提高微载体培养的细胞密度。

在本实验中也能看到并证实, BMMSCs能够在微载体上迅速贴附、铺展, 当BMMSCs在微载体表面长满时, 其细胞密度和培养速度至少是普通培养法的4.5~9.6倍, 而且表型得以很好地保持。在Cytodex3上培养的前8 d, 细胞增殖迅速;而第8天到第11天, 细胞增殖进入平台期, 数目增长不明显, 提示在相同的细胞传代培养过程中, 尽量选取适宜的时间点进行大量的细胞收集, 以便进一步研究利用。

本实验性研究可以看到, 应用Percoll淋巴细胞分离液能方便快捷地将hBMMSCs以密度梯度法从人骨髓血中分离提取出来, 对细胞活性影响小, 便于后续的其他实验研究。

流式细胞术可快速有效地鉴定MSCs表面标记物。本实验所采集、分离、培养的细胞就是hBMM-SCs, 且纯度较高, 表型也较均一, 而非造血干细胞或成纤维细胞。

骨髓培养 篇10

关键词：M-CSF,L929细胞上清,骨髓巨噬细胞,腹腔巨噬细胞

0引言

巨噬细胞具有非常重要的生物学功能。当病原体进入机体时,巨噬细胞能够迅速清除病原微生物发挥非特异性免疫防御作用[1]; 其次,巨噬细胞还能通过释放多种细胞因子广泛参与炎症、肿瘤免疫、止血、 组织修复等过程,与此同时其自身的功能状态也受到局部微环境的影响。巨噬细胞是实验室最常用的细胞种类之一。

实验室常用的巨噬细胞有两类,细胞株和原代巨噬细胞。细胞株有THP - 1 ( the human macrophage cell line ) 、Raw264. 7 ( murine peritoneal macrophage cell line) 、MHS ( murine alveolar macrophage cell line) 等,原代巨噬细胞有腹腔巨噬细胞( peritoneal macrophage,PM) 、肺泡巨噬细胞( alveolar macrophage,AM) 和骨髓诱导分化的巨噬细胞( bone marrow - derived macrophages,BMDM) 等。由于原代细胞的生物学特征比细胞株更加稳定,而且原代巨噬细胞直接来源于机体组织,生物性状较好而被应用较多。在原代细胞中,由于获取PM和AM的数量有限,例如,在无诱导时只能获取( 1. 5 ~ 3) × 106个腹腔巨噬细胞/只小鼠[2],不能满足某些实验需求,所以实验室常采用相对比较容易获取的BMDM。目前实验室获取BMDM的方式有两种,一种是利用重组M - CSF诱导小鼠骨髓分化[3],另一种则是利用L929细胞培养上清诱导分化获得巨噬细胞[4]。由于L929细胞培养上清的成份比较复杂,除了M - CSF外还有其他多种可能影响巨噬细胞活性状态的因子,这些因子对诱导分化的BMDM与单纯用M - CSF诱导分化的巨噬细胞是否相同,体外诱导的BMDM与体内分化成熟的腹腔巨噬细胞之间有无差异目前报道较少,至今无文献报道对二者的基本功能比较详细的研究。因此,本研究比较重组M - CSF诱导的BMDM与L929细胞培养上清诱导分化的BMDM二者之间的形态、纯度以及功能的差异具有重要意义,为后续研究采用何种方法诱导获取BMDM提供实验依据。

1材料和方法

1.1材料

1. 1. 1实验材料: 8 ~ 10w的、动物等级SPF的级C57BL /6小鼠购于南方医科大学实验动物中心,合格证号为SCXK( 粤) 2011 - 0015; L929小鼠表皮成纤维细胞( NCTC clone 929) 购于中国科学院细胞库; 大肠杆菌( E. coli) 菌株DH5α 由作者实验室保存。

1. 1. 2试剂: 细胞裂解液RIPA购自美国GST公司; M - CSF购于美国R&D公司; 细胞因子检测试剂盒 ( MILLIPLEX- MAP) 购自美国EMD Millipore公司; 羊抗小鼠Ig G - HRP荧光抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司; Anti - F4 /80( BM8) 抗体购于美国Santa Cruz公司; 荧光标记抗体驴抗大鼠Ig G( A - 21209) ,E. coli( #E - 2861) 购自美国Molecular Probe公司。

1. 2. 3仪器设备: 二氧化碳细胞培养孵箱购自德国Heraeus公司; 多光谱微孔板阅读器M5购自美国GE公司; Zeiss荧光显微镜购自德国Zeiss公司; IS4000R图像工作站购自美国Kodak公司。

1. 2. 4培养基: 胎牛血清( fetal bovine serum,FBS) ; DMEM培养基; L929细胞上清; 2% LB细菌培养基: 100ml超纯水加入2g LB粉末后高压。

1.2方法

1. 2. 1骨髓诱导分化巨噬细胞和腹腔巨噬细胞的分离和培养

1. 2. 1. 1收集L929细胞培养上清的方法: 用DMEM完全培养基( 含10% FBS) 于37℃、5% 的CO2孵箱中培养L929细胞3 ~ 5d,然后收集细胞上清,最后利用滤器( 0. 22 μm) 过滤后备用。

1. 2. 1. 2分离小鼠骨髓: 首先将周龄8 ~ 10w动物等级SPF级的C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死,放置在75% 的乙醇消毒2 ~ 3 min,然后暴露和分离小鼠股骨及胫骨,并置将其于冰的DPBS离心管中,最后超净台中去净小鼠肌肉组织切除关节面暴露骨髓腔,用注射器吸取DMEM ( 含1‰ P/S) 冲洗骨髓 腔,离心 ( 300g,10 min) 后收集骨髓。

1. 2. 1. 3 L929细胞培养上清诱导分化巨噬细胞: 将L929细胞上清与含20% FBS的DMEM完全培养基按1: 4比例充分混匀,配制成BMDM全培液,然后将BMDM全培液加入离心管吹打收集的小鼠骨髓使其成为单细胞悬液,最后将细胞悬液铺于细胞培养瓶中,放置37℃、5% 的CO2孵箱中按步骤培养,培养过程中的第3 d( 不洗) 、第5 d更换新鲜完全培养基,第7 d获得成熟的BMDM。

1. 2. 1. 4 M - CSF诱导分化BMDM: 用含有10 ng / ml M - CSF及20% FBS的DMEM完全培养基重悬小鼠骨髓并制成细胞悬液,然后将细胞悬液铺于细胞培养瓶中,放置在37℃、5% 的CO2孵箱中步骤培养,培养的第3 d( 不洗) 、第5 d置换新鲜培养基,第7 d获得成熟的BMDM。

1. 2. 1. 5腹腔巨噬细胞的分离、培养: 将8 ~ 10w龄、 SPF级C57BL /6小鼠处死并置于75% 酒精中浸泡3 min后,用冰的5ml DPBS灌洗腹腔; 1 000 r / min离心5 min后收集细胞,用含10% FBS的完全培养基重悬细胞,计数后铺至24孔板或96孔板中,待细胞贴壁后6 h,用DPBS洗2遍,除去其他未贴壁细胞。

1. 2. 2骨髓诱导分化巨噬细胞和腹腔巨噬细胞的鉴定: 将BMDM和PM( 1 × 106/ 管) 利用多聚甲醛( 4% ) 室温固定收取的EP管中细胞30 min,接着用1‰BSA的洗涤细胞2次,用5% BSA封闭细胞表面抗原10 min,再用F4 /80抗体于摇床孵育30 min ( 室温) ,最后洗涤细胞2次与异硫氰酸荧光素( fluorescein iso-thiocyanate,FITC) 标记的巨噬细胞荧光抗体摇床上 ( 室温) 避光孵育30 min,洗涤细胞2次后用PBS重悬震荡成充分混匀的悬液待上机,用流式细胞仪检测F4 /80阳性细胞数。

1. 2. 3骨髓诱导分化巨噬细胞和腹腔巨噬细胞的形态学观察: 将BMDM和PM种在24孔细胞培养板的孔中,2 × 105/ 孔,培养过夜待细胞完全伸展后,利用Zeiss荧光显微镜观察及采集巨噬细胞形态图像。

1. 2. 4巨噬细胞细胞吞噬细菌实验: 将带有FITC标记的大肠杆菌( FITC - E. coli) 与巨噬细胞按1: 30比例 ( cell: E. coli) ( 细胞2 × 105/ 孔) 混匀,然后放置37 ℃ 共孵育30 min,弃去培养上清,DPBS洗涤3次, 然后在Zeiss荧光显微镜下观察和采集图像; 进行荧光读值检测时,用细胞裂解液裂解细胞5 min ( 冰上) ,然后将细胞裂解液转移至黑色96孔板,利用微孔板阅读器( excitation: 494 nm; emission: 520 nm) 读取各组的平均荧光值。

1. 2. 5杀菌实验[5]: 将M - CSF和L929上清诱导的BMDM和腹腔巨噬细胞接种到24孔板中 ( 2 × 105/ 孔) ,加入的大肠杆菌( 活菌) 与细胞比例为1: 30,然后37 ℃培养箱中共孵育30 min,到时间后弃掉细胞上清,且用DPBS充分摇晃洗涤培养孔3次,按杀菌30min和60min组分别在培养箱中继续用新鲜培养基培养30 min和60 min。待杀菌时间完成,细胞培养孔中加入细胞裂解液冰上裂解细胞( 含1‰Triton X - 100的无菌水, 500 μl / 孔) ,裂解10 ~ 15min后,移液器吹吸细胞使充分裂解并将细胞裂解液收集在EP管中待下一步实验 。 取100μl裂解液进行倍比稀释 ( 10- 1、10- 2、10- 3) ,然后各取100μl裂解液和100μl LB分别均匀涂布于细菌培养板上,在37 ℃ 培养培养过夜( 13 h ~ 16 h ) ,最后选取细菌数量合适( 30 ~ 300个) 的细菌培养板计数 。0 min组所得菌落数即为巨噬细胞在30 min吞噬的细菌总数,杀菌30 min组细菌培养板中所得细菌数为胞内杀菌30 min后的细菌数,杀菌60 min组细菌培养板中所得细菌数为胞内杀菌60 min后的细菌数 。 巨噬细胞清除细菌的百分比为杀灭细菌数 / 吞菌总数 % 。

1. 2. 6液相芯片 ( Liqui Chip) 检测培养上清中细胞因子水平: 给予BMDM和PM100 ng /ml LPS刺激0、 6、12、24 h后收集细 胞培养上 清,利用液相 芯片 ( Liqui Chip) 检测炎症因子IL - 6和TNF - α 的水平。 具体检测方法按试剂盒操作说明进行。

1. 2. 7统计学分析: 统计学软件为SPSS 13. 0进行实验数据统计,数据统计都以均数 ± 标准差(  ± s ) 为准,均采用了两个独立样本t检验统计分析,统计结果均P < 0. 05为有统计学差异 。

2结果与分析

2.1BMDM和PM的形态

Zeiss显微镜下观察M - CSF和L929培养上清诱导分化小鼠骨髓巨噬细胞第7 d呈不规则型或梭型,与体内分化成熟的腹腔巨噬细胞大小 、 形态相似 ( 图1 ) 。

2. 2流式细胞仪鉴定BMDM和PM的纯度

取诱导分化第7 d的小鼠骨髓巨噬细胞,流式细胞术鉴定结果表明, M - CSF诱导分化的巨噬细胞中代表巨噬细胞的分子F4 /80阳性细胞数为98. 6% , L929上清诱导分化的巨噬细胞为99. 6% ,腹腔巨噬细胞为98. 8% ,三者之间无显著性差异( 图2 ) 。

2. 3 M - CSF和L929上清诱导的BMDM吞菌功能比较

Zeiss荧光显微镜下可见M - CSF与L929上清诱导成熟的BMDM和PM三者吞噬荧光强度无差异 ( 图3A ) 。 为了更加客观地反映巨噬细胞的吞噬能力,将与FITC - E. coli共孵育30 min的细胞裂解,通过微孔板阅读器( M5 ) 检测细胞裂解液的平均荧光强度,结果M - CSF组的平均荧光强度是21. 31 ± 5. 83 ,L929组是26. 10 ± 6. 11 ,两组之间相比无显著统计学差异( t = - 0. 745 , P = 0. 498 , P > 0. 05 , t test ) ( 图3B ) ; PM组是37. 61 ± 4. 21 ,与M - CSF和L929上清相比P > 0. 05 ( t test ) ,无显著性差异 。

2.4M-CSF和L929上清诱导的BMDM杀菌功能比较

将BMDM与活的E. coli共孵育30 min后洗去细胞外细菌,并将细胞放入培养箱中继续培养30 min或60 min,在30 min和60 min时间点M - CSF诱导的BMDM和L929诱导的BMDM对细菌的杀灭能力无明显差异( P > 0. 05,t test ) ,两种方式诱导的BMDM与PM杀菌功能上无统计学差异 ( P > 0. 05,t test ) 。

2.5M-CSF和L929细胞培养上清诱导的BMDM受到LPS刺激后对细胞因子释放能力的比较

LPS刺激后M - CSF与L929上清诱导分化的巨噬细胞释放的IL - 6在各检测时间点均无显著性差异( P > 0. 05,t test) ,TNF - ( 的释放在LPS刺激后24 h L929组低于M - CSF组( P < 0. 05,t test) ; 与体内分化成熟的腹腔巨噬细胞相比,无论是L929组还是M - CSF组除了在LPS刺激后6 h点释放的IL - 6较低外其它时间点无显著性差异( P > 0. 05,t test) 。 L929组TNF - α 的释放低于M - CSF组的原因尚不清楚,可能与L929细胞培养上清中含有的多种细胞因子有关。据报道,这些因子可能对巨噬细胞分化成熟的影响比较复杂,某些细胞因子还可能通过影响巨噬细胞的表型从而影响细胞功能。我们的结果与Gersuk GM等的报道一致[6]。他们发现,在给予脂胞壁酸质或酵母多糖刺激BMDM 24 h后,L929细胞培养上清诱导的BMDM释放TNF - α 的水平低于M CSF组。

3讨论

目前认为,单核巨噬细胞主要来源于骨髓,骨髓干细胞经过分化最终在多集落刺激因子( multi - colony stimulating factor,M - CSF) 或粒 - 巨噬细胞集落刺激因子( GM - CSF) 的诱导下分化成巨噬细胞,但是不同组织中的巨噬细胞因局部微环境的不同其形态和生物学特征不尽相同。L929细胞是一种小鼠表皮成纤维细胞。早在1984年就有研究报道L929培养上清中存在某些种可溶性分子如M - CSF,可用来诱导分化骨髓巨噬细胞[7]。后来有研究进一步证实L929细胞培养上清中含有高浓度的M - CSF,可用于代替昂贵的 重组M - CSF诱导分化 骨髓巨噬 细胞[8,9]。此后,M - CSF和L929培养上清成为诱导分化骨髓巨噬细胞的主要方法。2008年,Gersuk GM等报道检测了L929细胞培养上清成份,除了M CSF外还含有 其它多种 细胞因子,如高浓度 的VEGF、MCP - 1、KC、MIG和低浓度的FGF - β 、嗜酸细胞活化趋化因子、IL - 9、IL - 10、IL - 12等[6],而这些因子对诱导分化的BMDM与单纯用M - CSF诱导分化的巨噬细胞是否相同,对后续实验是否有影响成为我们在选择获取BMDM诱导方式时关注的问题。

巨噬细胞的功能常受周围微环境的影响,微环境中的多种微生物或细胞因子可以使其发生表型改变, 如LPS、INF - γ 能诱导巨噬细胞发生极化而转变为M1型,IL - 4、IL - 13能诱导巨噬细胞转变为M2型, 不同极化状态下的巨噬细胞表型各异,其功能也各不相同[10]。巨噬细胞M1型主要以促炎为主,M2型主要以促进免疫调节为主,而单纯M - CSF诱导成熟的巨噬细胞为M2型。已有研究报道,M1和M2型巨噬细胞中某些细胞表面分子、受体和分泌的细胞因子含量不同,如CD64、CD163、CD206、CCR7、CXCL10、IL - 12和IL - 10等[11]。本研究虽然未能阐明L929细胞上清中多种细胞因子的复杂作用机制,但是全面比较了M - CSF和L929细胞上清诱导成熟的巨噬细胞的基本生物功能,对指导选择合适的诱导方式提供了更加全面的实验依据。研究还发现,与体内分化成熟的腹腔巨噬细胞相比,体外诱导分化成熟的BMDM在某种程度上可以代替体内分化成熟的巨噬细胞用于相关研究。

捐献骨髓 并不危险 篇11

造血干细胞移植是治疗白血病、再生障碍性贫血等疾病的重要手段，也是目前世界上先进的根治白血病的医疗手段，捐献造血干细胞也被称为“捐献骨髓”。但是出于对捐献骨髓的恐惧，有些捐献者甚至在患者已经准备好了手术之前临时反悔，直接给患者带来生命危险。

2012年7月，小吴被确诊为白血病，此前一年他以610分考取福建医科大学基础医学院临床医学专业。

“嘴唇出血、脸色苍白”、“当时听到这个消息感觉天都要塌下来了！”小吴的家人说，在泉州第一人民医院治疗一段时间之后，带着小吴来到了北京空军总医院。在空军总医院和中华骨髓库的努力下，顺利找到了两个配型成功的骨髓捐献志愿者。

“一般人能找到一个就不错了，小吴一下找到两个，这是非常幸运的。”空军总医院血液病科主任王恒湘说。手术计划定出来了：今年1月22日在天津的某医院对其中一名志愿者进行骨髓采集，然后再运到北京，植入小吴体内。但志愿者在进入骨髓采集室后突然变卦。事出紧急，骨髓库赶紧联系另一名志愿者，得到的答复也是拒绝捐献。

中华骨髓库工作人员杜世强说，自从为小吴寻找到适宜的捐赠者后，工作人员曾反复就捐赠者可能出现的心理疑问及顾虑给予疏导和释疑，尽最大可能保障受捐者及捐赠者的情绪及心态保持稳定，然而手术开始前两天，为小吴捐赠的志愿者突然改变主意，多次安慰及说服工作无果后，骨髓库只能尊重捐赠者的意愿。

无奈之下的选择

“骨髓移植前期的准备工作就是先把患者自身的免疫系统完全摧毁，然后再将健康的骨髓植入患者体内，重建免疫系统。供体反悔前，小吴的骨髓移植准备工作早已完成，这个‘空髓期’是非常危险的，如果持续下去得不到新骨髓，那这个孩子就完了。”王恒湘说。

紧急关头，医院只能临时决定对小吴进行“半相合”骨髓移植，即让小吴的直系亲属进行捐献。“半相合移植也是在迫不得已的情况下采用的，因为不是百分之百的成功，而且后期的排异反应也比完全配型成功的移植要大。”王恒湘说，小吴的爸爸身体不适合捐献，妈妈也患有贫血，妹妹远在老家上学，无法及时赶到北京，权衡之后，吴妈妈临时顶替。

手术仍然按照原定时间举行，1月22日上午10点20分，在空军总医院住院部15层，医生开始对吴妈妈和小吴进行骨髓移植手术。下午2点左右，从吴妈妈体内抽出的骨髓顺利移植到小吴体内。

王恒湘说，术后两到三周时间，小吴的免疫力还是非常低下。由于是半相合移植，小吴的后期恢复过程比全相合的要长，面临的危险也更大。

一项艰巨的任务

骨髓捐献是“匿名捐献”，也就是说捐献者和被捐献者互相并不知道对方是谁。对于两名志愿者悔捐带来的麻烦，吴妈妈说，不怨他们。

由于中华骨髓库的相关保密规定，我们也无从了解这两位捐献志愿者在做出决定的最后一刻经历了怎样的心理斗争。

一切可能都来自一个可怕的谎言。

据了解，中国人一直不愿意捐献骨髓，因为不少人一想起要在脊椎骨上扎一根很粗的大針头进去，就怕得要命，甚至担心自己有瘫痪的风险。其实这一切都是误解。

目前国际上和中国采集骨髓的方法及过程是：现代造血干细胞移植法采用从外周血中采集造血干细胞。用科学方法将骨髓血中的造血干细胞大量动员到外周血中，从捐献者手臂静脉处采集全血，通过血细胞分离机提取造血干细胞，同时，将其他血液成分回输捐献者体内。由于整个采集过程是在一个封闭和符合医疗安全要求的环境中进行，因此是极为安全的。在采集完成后，一些轻微疼痛感和不适将会很快消失。至今没有因采集外周血造血干细胞引起对捐献者伤害的报道。“不会为了救一个人，而去害了另一个人。”骨髓库工作人员杜世强肯定地对记者说。

阜外医院吕建华大夫也是中华骨髓库的志愿者，他介绍，“采集总共大约10克的造血干细胞。含部分血液成分，一般是50～100毫升。比一次献全血的血量还少。而且人体对造血干细胞具有很强的再生能力。正常情况下，人体各种细胞每天都在不断地新陈代谢，进行着生成衰老、死亡的循环往复。失血或捐献造血干细胞后，可刺激骨髓加速造血，1～2周内，血液中的各种血细胞恢复到原来水平。因此，捐献造血干细胞不会影响健康。”

但是，类似的宣传已经频繁出现在各种媒体上，仍然难以打破沉积在中国人心灵里那种对流血的巨大恐惧感。据统计，中国有400多万血液病患者，以每年4万的速度递增，其中大部分都需要进行造血干细胞移植。我国骨髓库的容量现在为120多万，不到全国人口的千分之一。而中国台湾的慈济骨髓库容量为33万，占总人口的1.5%。只有把中国的库容增加到1000万，才能让每个患者都会找到他（她）合适的配型。

悔捐

中华骨髓库造血干细胞志愿者超过164万人，捐献成功数量呈逐年上升趋势，去年成功捐献650多例，前年是500多例，但是志愿者悔捐现象一直都存在。曾有媒体报道，我国造血干细胞志愿者悔捐率达到20%，有的地区高达1/3。对于这一数字，中华骨髓库有关负责人没有给予证实，但他表示，降低志愿者反悔率、杜绝捐献前的悔捐，始终是中华骨髓库的一项艰巨任务。

按照程序，当志愿者与白血病患者配型成功，并确定其同意捐献，白血病患者要提前10天住进无菌舱化疗做准备，志愿者提前一到两天住进指定移植医院里，注射造血干细胞动员剂，然后接受造血干细胞分离采集，大约需要三四天时间。“在这一过程中，志愿者可以在任何时间段提出反悔，我们会及时做劝说工作，但是如果志愿者不听，我们也只能尊重其选择。”这位负责人说。

按照中华骨髓库工作人员的了解，大多数悔捐者担心注射药物会对自身健康产生不良影响，而且现实中一些捐献者在捐献过程中会出现暂时“感冒”的症状，再加上亲友的一些影响，难免会“临阵脱逃”。

中华骨髓库于2005年制定的“捐献者须知”上写道：“报名登记及捐献都是建立在自愿的基础上，登记后资料库会对您的自愿性进行再确认，此期间您可以提出终止捐献。但在移植前，尤其是签署捐献同意书后就不能改变捐献决定，因为在这个时候，患者为准备移植已经进行大剂量的放疗和化疗，丧失了造血能力，此期间若您终止捐献，再临时寻找配型相合者已来不及，患者将有生命危险。”不过这样的须知并没有什么实质性的约束力。

目前，公益事业法、献血法对骨髓捐献并无明确规定，而人体器官移植条例规定“从事人体细胞和角膜、骨髓等人体组织移植，不适用本条例”。在捐献者须知、同意书上没有关于捐献者反悔行为应当承担什么责任的条款，因而无法追究悔捐者的法律责任。即使受捐者和捐献者签订了明确的合同，但由于人体器官并不被视为财产，因此也可能会因为没有法律上的保障而失效。

事实上，对于悔捐的现象，目前普遍的观点是，这是一个道德而非法律问题，也有很多人认为不能用道德来“绑架”反悔的骨髓捐赠者。

对于中华骨髓库来说，如何降低悔捐率确实是一项艰巨的任务，甚至是很难完成的任务。中华骨髓库负责人说，悔捐的志愿者悔捐后一般需要面临更大的心理压力，有不少甚至会选择关掉手机等通信方式，不与外界发生联系，然而在悔捐的志愿者当中，也有些人曾在事后表达出后悔的情绪。对于骨髓库方来说，只能是在又一次遇到配型成功的患者时，把曾经悔捐的志愿者放进最后才考虑的名单中。

（编辑·宋冰华）

骨髓培养 篇12

1临床资料

我院检验科2001年—2011年骨髓象530例标本中找出恶性血液病93例, 急性淋巴细胞白血病 (ALL) 11例;急性非淋巴细胞白血病 (ANLL) 42例, 其中急性粒细胞白血病部分分化型 (M2) 4例, 急性颗粒增多的早幼粒细胞白血病 (M3) 15例, 急性粒-单核细胞白血病 (M4) 5例, 急性单核细胞白血病 (M5) 14例, 红白血病 (M6) 4例;骨髓增生异常综合征 (MDS) 18例, 慢性粒细胞白血病 (CML) 8例, 慢性淋巴细胞白血病 (CLL) 3例, 多发性骨髓瘤 (MM) 11例。其中多发性骨髓瘤, 占到恶性肿瘤的8.2%, 男5例, 女6例, 年龄50岁～78岁。

2方法

回顾性分析我院10年来经过临床和骨髓象确认的多发性骨髓瘤患者11例, 并对所有病例骨髓象进行分析。

3诊断标准 (国内的诊断标准)

3.1骨髓中浆细胞>15%, 并有原浆或幼浆细胞, 或组织活检证实为浆细胞瘤。

3.2血清单克隆免疫球蛋白 (M蛋白) :Ig G>35 g/L, Ig A>20 g/L, Ig M>15 g/L, Ig D>2 g/L, Ig E>2 g/L;尿中单克隆免疫球蛋白轻链 (本周蛋白) >1 g/24h.

3.3广泛骨质疏松和 (或) 溶骨病变。

符合第1和第2项即可诊断为MM.符合第1和第3项, 而缺少第2项者, 属不分泌型MM;应除外骨髓转移癌。可见骨髓异常浆细胞是诊断MM的首要条件。根据国内专家的经验, 不仅要求骨髓中浆细胞数量, 而且强调浆细胞的质量, 即出现原、幼浆细胞对诊断的重要意义。我院有1例浆细胞仅占1.9%, 但原浆细胞形态异常明显, 结合骨髓瘤骨折及M球蛋白增多等也可诊断。

4结果

4.1骨髓增生程度大多明显活跃, 无1例增生低下, 骨髓瘤细胞经过1～6次穿刺才找到, 一般早期不易找到, 瘤细胞大多成堆存在。

4.2骨髓瘤细胞分型[1]:1957欧洲血液学会将多发性骨髓瘤细胞分为四型: (1) 成熟浆细胞型; (2) 幼稚浆细胞型; (3) 原始浆细胞型; (4) 网状细胞型。11例患者骨髓瘤细胞的分类结果:原浆细胞型最少占0.4%, 最多占18.5%, 中位数为4.0%;幼稚浆细胞型最少占0.9%, 最多占17.6%, 中位数为12.8%;成熟浆细胞型最少占0.4%, 最多占2.8%, 中位数为2.0%;网状细胞型最少占0.6%, 最多占12.5%, 中位数为8.8%.总计:骨髓瘤细胞最少占有核细胞的1.9%, 最多占59%, 中位数为12.8%.

4.3骨髓瘤细胞的特征[2]:我院患者所见的骨髓瘤细胞除了成堆存在、大小不等, 有各阶段的原始、幼稚、网状细胞样的形态外, 还可见双核、母子核, 最多可见4核。有的浆细胞像蝌蚪样, 还有的呈火焰状, 红色突起, 细胞核圆整, 或者扁圆, 有的居中如早幼、中幼红细胞, 染色质呈紫红色, 颗粒粗而深染, 核小体淡染, 边界不清楚, 胞质有的有空泡, 染色不均、颗粒状, 环核淡染区不像正常浆细胞明显。

5讨论

MM临床表现较复杂, 且缺乏特异性, 据张景顺等报道临床误诊率较高, 我们认为当临床出现以下一些症状、体征和检验结果时, 如:中老年患者有腰酸背痛、活动障碍、头晕乏力、红细胞沉降率增快、球蛋白增高、尿蛋白阳性、肾功能异常、骨质疏松、溶骨性破坏、病理性骨折、易感染等表现, 应考虑是否为MM, 有必要做骨髓象检查。骨髓细胞形态学是诊断MM非常重要的方法之一, 诊断标准是骨髓中异常的浆细胞 (骨髓瘤细胞) 比例增高。国内标准是:骨髓中异常浆细胞>15%, 国外标准是:骨髓中异常浆细胞≥10%.正确区分骨髓瘤细胞和正常浆细胞对MM的诊断具有重大意义。区别要点:骨髓瘤细胞大小悬殊, 常成堆出现, 胞质强嗜碱性, 可见细小空泡, 核旁淡染区常消失, 胞核常呈不规则形, 易见双核及多核浆细胞, 核染色质较细致或呈粗网状, 可见核仁。骨髓细胞形态学是非常重要的方法和手段, 同时必须紧密结合临床表现和其他检查才能对MM作出及时明确的诊断。

由于MM[3]细胞局灶性存在, 我们有1例患者经过3个医院6次穿刺, 才找到MM细胞得以确诊, 所以建议怀疑MM的患者要多次多部位的穿刺, 尤其是骨痛的部位骨损害附近穿刺取材。有些良性的感染性疾病, 如结核、布氏杆菌病也可有浆细胞增多, 但一般<10%, 且多为正常成熟浆细胞。

参考文献

[1]王淑娟, 朱立军.多发性骨髓瘤及其实验室诊断[J].中华检验医学杂志, 2004, 27 (4) :255-258.

[2]汪江, 颜维仁.多发性骨髓瘤误诊原因分析[J].临床误诊误治, 2010, 23 (8) :753.