骨髓炎动物模型研究

骨髓炎动物模型研究（精选5篇）

骨髓炎动物模型研究 篇1

骨髓炎是由感染引起的骨及其相关组织的急性或慢性炎症过程[1]。根据病程, 骨髓炎可分为急性、亚急性和慢性3种类型。根据感染机制, 骨髓炎可分为外源性和血源性两类。外源性骨髓炎是由开放骨折、手术 (医源性) 或邻近组织感染漫延引起的, 而血源性骨髓炎则源自菌血症。此外, 依据宿主对感染的反应还可将骨髓炎分为化脓性和非化脓性 (肉芽肿性) 两类。由于骨髓炎的发病过程非常复杂, 且变异度高, 以上分类方法往往不能在临床上得到很好的应用。以往有多种动物模型曾被用来进行骨髓炎的研究, 基于这些早期的探索, 可以研究骨髓炎的不同类型和阶段, 然而目前能够全面评价治疗、病原菌、疾病阶段和分类的单一动物模型尚未报道。本研究通过检索关于骨髓炎动物模型的国内外文献并进行综述, 以期寻求最佳的动物模型建立方法。

1 骨髓炎动物模型的历史回顾

最早的骨髓炎动物模型是1885年Rodet[2]通过直接将葡萄球菌静脉注射到兔的体内的方法建立, 但并不能模拟人类疾病过程。1941年Scheman等[3]直接注射鱼肝油酸钠和葡萄球菌到兔胫骨干骺端, 建立了一种可重复的慢性骨髓炎模型, 鱼肝油酸钠造成了骨的无菌坏死, 这是能够引起骨髓炎进展的基础。这一方法被国内外多位研究者进一步验证和发展, 成为常用的建模方法。此后, 多种小型动物, 如大鼠、小鼠和大型动物如狗、猪、山羊等开始被使用, 越来越多的新方法在临床工作和研究中被应用。

2 骨髓炎动物模型的进展

2.1 静脉注射模型

Rodet[2]通过直接静脉注射葡萄球菌到兔体内建立模型, 但是实验发现该方法具有较高的动物致死率和较低的骨髓炎成功率。Emslie等[4]通过鸡翅静脉直接注射金黄色葡萄球菌的方法首次成功建立急性血源性骨髓炎动物模型, 研究证实了血流缓慢是引起细菌沉积的原因, 骨骺血管出现的内皮细胞间隙也是造成葡萄球菌骨髓炎的原因。Poultsides等[5]通过将葡萄球菌直接注射到股动脉来建立新的植入物相关的骨髓炎模型, 但结果发现高浓度 (5×108个菌落数) 会导致100%的病死率, 而浓度降低也不能得到稳定的感染结果。进一步说明了该模型建立的困难:即便注入确保造成感染的最低浓度细菌, 也会导致实验动物由于全身炎性反应而大量死亡。

2.2 局部注射或接种模型

1941年Scheman等[3]报道了第一个可以重复的慢性兔骨髓炎模型。实验组动物局部应用5%鱼肝油酸钠和金黄色葡萄球菌悬液, 发现骨和软组织脓性组织形成、新骨形成、骨膜下出现脓肿、骨骺和骺板破坏, 并将这种模型的成功归于硬化剂鱼肝油酸钠, 因为其可以引起骨的无菌性坏死。

1970年Norden[6]通过研究菌落接种验证了Scheman等[3]的模型, 发现单独应用鱼肝油酸钠或葡萄球菌在14 d或60 d时无明显骨髓炎症状, 而同时应用鱼肝油酸钠和葡萄球菌在60 d和180 d时90%的感染胫骨培养出细菌;影像学结果显示脓肿形成、骨膜破坏、骨正常结构被破坏和新骨形成。卢旻鹏等[7]在探讨骨髓炎模型与菌液浓度的关系中重复了该方法, 并通过大体标本观察和放射学检测标准反映骨髓炎严重程度分级。闻一新等[8]制备兔胫骨金黄色葡萄球菌慢性骨髓炎模型, 在兔胫骨近端钻孔, 髓腔注射鱼肝油酸钠和2×106个菌落数的金黄色葡萄球菌并且骨蜡封闭, 30例患者中有3例死亡, 27例通过大体观察、放射学、细菌学及组织病理学等方法评价, 显示造模成功。

Schulz等[9]将一枚活检针头植入股骨近段髓腔, 通过活检针取出1 m L骨髓, 然后将0.1 m L 5%鱼肝油酸钠和0.1 m L葡萄球菌悬液注入髓腔, 并且将活检针头留在髓腔内, 研究发现所有实验动物均发生骨髓炎, 认为抽出骨髓破坏了髓腔内血运, 同时硬化剂的应用是模型成功的关键。

Salgado等[10]在羊的胫骨钻直径为3 mm的孔, 注射金黄色葡萄球菌后10 min注射5%鱼肝油酸钠1 m L, 术后1 h注射头孢唑林预防致死性脓毒血症, 在术后12~16周处死动物并进行临床和影像学检查。27只实验动物在影像学和组织学发现骨髓炎形成, 并且没有动物出现致死性脓毒血症。11例在引流部位形成伤口, 23例的细菌培养发现金黄色葡萄球菌。章相锋等[11]用兔重复和验证了该方法, 成功率为100%。

2.3 生物膜及载药系统研究模型

治疗骨髓炎时, 植入的生物材料可能形成细菌生物膜, 这是骨髓炎的治疗中面临的仅次于产生细菌耐药性的第二个复杂问题。Gracia等[12]通过建立模型来研究抗生素对生物膜内细菌的作用, 将表面覆盖生物膜细菌的不锈钢棒植入大鼠并且在手术部位接种细菌悬液。随后用妥布霉素、万古霉素或头孢呋辛进行治疗, 头孢呋辛治疗后发现抑制了细菌群落在骨髓中的聚集, 减少但并没有消除来自植入物的细菌;妥布霉素治疗无效;万古霉素虽然无法消除生物膜但部分动物的感染治疗有效。另一项类似的实验仅植入预处理过的植入物而不接种细菌, 所有实验动物均出现骨髓炎, 证明在手术部位同时应用细菌悬液并不是必须的, 还证明了头孢呋辛在消除细菌生物膜的有效性。

Lucke等[13]通过模拟髓内针来建立一种大鼠模型。为了与人类疾病过程类似, 并未使用其他能够引起骨髓炎的促进剂。实验发现100个菌落数就可以发生急性破坏性骨髓炎, 同时, 无菌克氏针可以模拟体内异物植入和生物膜形成。该模型被后来其他一些研究者所验证和重复[14,15], 此外还有植入细菌和髓内固定后使用骨水泥和骨蜡封闭钉孔来建立模型[16,17]。

Garvin等[18]建立一种犬慢性骨髓炎模型来探讨多乳酸化合物/聚乙醇酸交酯共聚物作为局部载药系统, 感染四周后行伤口清创并开始治疗。利用庆大霉素骨水泥或庆大霉素多乳酸化合物/聚乙醇酸交酯共聚物。6周后提取组织, 取出内植物, 发现骨水泥可以完整取出, 而共聚物因为大部分已经被吸收而无法完整取出。实验发现局部治疗效果比全身用药效果要好, 并且使用可吸收材料作为载药系统不需要进行植入物取出手术。

李云飞等[19]采用植入载药纳米仿生骨的方法治疗兔骨髓炎, 取得良好疗效。吴伟等[20]通过建立兔慢性股骨骨髓炎模型研究可降解缓释抗生素载体对慢性骨髓炎的治疗效果, 发现硫酸钙、纳米羟基磷灰石两种载体效果更好, 有良好的应用价值。

2.4 其他模型

1988年Worlock等[21]最早利用兔研究开放性骨髓炎, 通过造成开放骨折并进行髓内固定建立模型。最近Williams等[22]利用模拟羊胫骨近端的GustiloⅢB型开放骨折, 同时使用涂有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜钢板作为内固定建立模型。褚立涛等[23]在研究兔胫骨创伤后骨髓炎时, 通过造成兔胫骨开放骨折、断端菌液注射和小夹板外固定也成功建立模型。

Lindsey等[24]和Aslani等[25]通过模拟大鼠股骨开放骨折、克氏针髓内固定和髓腔接种金黄色葡萄球菌建立模型, 研究免疫调节对于预防和治疗骨髓炎的作用, 认为其可在治疗骨科相关的感染中发挥作用, 提供了一种通过免疫调节来治疗骨髓炎的新思路。

Funao等[26]建立了一个实时、定量、可重复的小鼠骨髓炎模型, 切开膝关节, 在股骨远端钻孔, 向髓腔注射金黄色葡萄球菌后用骨蜡封闭钻孔, 利用生物发光体内成像检测技术连续监测感染的过程和骨髓炎的建立。

黄金亮等[27]建立动物模型模拟临床难治性慢性骨髓炎, 在应用鱼肝油酸钠和金黄色葡萄球菌建立慢性骨髓炎模型的基础上, 经清创、万古霉素治疗后依然有56.8%未治愈, 认为成功建立难治性慢性骨髓炎动物模型。

3 骨髓炎动物模型常用的实验动物

在以往的研究中有多种动物模型曾被用来进行骨髓炎的研究, 常用的动物有兔、大鼠和小鼠, 狗、猪、山羊等较少使用。

兔早在1885年被Rodet[2]作为模型动物进行骨髓炎的研究, 并且回顾已有文献被使用次数最多。其大小较合适, 相对容易饲养和维持, 此外骨的尺寸也足够大, 可以支持钢板螺钉内固定的安放。包括兔胫骨模型[5,6,7,8,21,28,29,30]、兔股骨模型[9,20]、兔血源性骨髓炎模型[2]、兔下颌骨模型[31]等。

大鼠具有体积小、经济的特点, 是一种成熟的模型建立对象, 并且支持尺寸较小的髓内固定, 包括大鼠胫骨[12,13,14,15,31]、大鼠股骨模型[16,17]等。

小鼠作为最常用的试验动物也被用来研究骨髓炎的病理过程。Funao等[26]以小鼠为实验动物, 利用生物发光体内成像检测技术实现了对骨髓炎发生与发展的实时动态连续监测。

其他一些实验表明, 大型动物模型可以制作慢性、渐进性和稳定的感染[10,18,22]。

4 小结与展望

一个好的动物模型可以有效地模拟疾病的发生发展过程, 从而来探索新的诊断和治疗原则。多年来, 国内外学者对骨髓炎动物模型的建立方法进行了大量深入研究, 其中包括静脉注射模型, 由于该模型病死率高, 并且与人类疾病过程不同, 故无法用来评价内植物引起的感染。局部注射或接种模型主要依赖于细菌种植和软组织操作来导致感染, 如硬化剂、异物植入、纤维蛋白胶, 认为骨的预处理比细菌植入更加重要[32,33,34]。生物膜及载药系统研究模型, 1978年Costerton等[35]提出生物膜后, 研究者开始围绕其建立新的动物模型, 并且有效的局部治疗使研究者逐渐关注可降解的局部载药系统。

目前已有的模型中有多种动物被应用于研究, 小动物虽然具有很多优势, 但是不能接受临床内植物系统, 且无法进行复杂的操作, 所以也就无法有效评价骨髓炎。狗、猪、山羊等大型动物的骨和关节的尺寸接近于人类, 可以使用临床内植物, 而且这些大型动物能够耐受较大的药物剂量, 承受较复杂手术和更大的失血量。但是大型动物饲养困难、花费高、观察时间长使研究变得困难。

随着分子生物学和组织工程的发展, 越来越多的新方法应用于临床工作和研究中。目前关于骨髓炎的研究主要集中在抗生素以及局部载药系统方面, 包括骨水泥控释系统、载药人工骨以及纳米人工骨的应用, 在控制感染的同时可以作为骨骼重建支架。此外, 骨髓炎的免疫研究也逐渐被大家关注, 如何通过调节细胞免疫和体液免疫来预防治疗骨髓炎发生发展成为一个研究的新方向。

摘要：骨髓炎是由于感染引起的骨及其相关组织的急性或慢性炎症。该病具有治疗困难、花费高、病程迁延不愈、致残率高等特点。由于骨髓炎发病过程非常复杂、变异度高, 目前有多种动物模型应用于骨髓炎的发病机制、诊断和治疗的研究。建立骨髓炎模型的动物常使用兔、大鼠和小鼠, 较少使用狗、猪、山羊等大型动物。然而, 目前研究中尚未发现可以较好控制的动物模型。本研究通过检索目前骨髓炎动物模型的建立方法, 以期寻求一种可以较好控制的用于研究骨髓炎发生、发展的动物模型, 并对目前骨髓炎研究进展进行展望。

关键词：骨髓炎,动物模型,感染,内固定

骨缺损动物模型的研究进展 篇2

【摘要】通过查阅整理近年来有关骨缺损动物模型的研究资料，从动物种类及年龄的选择，实验动物骨缺损部位的选择及缺损长度的选择等方面对骨缺损动物模型进行综述，以期为骨缺损动物模型的制作提供参考。

【关键词】骨缺损；动物模型；研究进展

【中图分类号】R-332【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）16-0035-02

Abstract：

Keywords：

骨缺损是骨科临床工作中较棘手的问题。目前临床修复骨缺损的常规方式为自体骨移植和异体骨移植，但两者均有一定的弊端。自体骨移植造成供区损伤，给患者带来额外的负担；异体骨移植则有传播疾病的风险，且存在排异反应。而且对于大范围骨缺损来说，二者都存在骨量来源有限的问题。近年来，各种骨组织代替材料的研究日益兴起，而骨缺损模型的建立是这些研究的基础。笔者根据近年来国内外对骨缺损动物模型的研究，从动物种类及年龄的选择，实验动物骨缺损部位的选择及缺损长度的选择等方面对骨缺损动物模型选择综述如下。

1动物种类的选择

目前常用于制作骨缺损模型的动物有小鼠，大鼠，兔，犬等。骨缺损动物模型理论上是选择越大型的动物越好，比如犬，猪，羊等。一则越大型的动物骨折愈合机制与人类越相似；再则越大型的动物制作过程中越易于操作。然而大型动物也有实验成本过高，样本数量难以保证的现实缺点，并且动物越高等，自我恢复能力越弱，不利于骨折断端骨痂生长情况的短期观察，极易造成实验周期过长，所以使用大型动物并不常见。小鼠模型价格低廉，来源广泛，小鼠自身具有较强的抗感染及耐受手术的能力，且围手术期易于管理，因此小鼠模型具有一定优势。但其也有一定的局限性：①小鼠自身修复速度比人类快，因此小鼠骨缺损修复模型仅可作为骨缺损修复的分子机制和骨材料短期修复及生物相容性的初步研究；②作为骨替代植入材料在体内的短期评估较有优势，但不能做长期评估。③小鼠骨结构中不含有哈佛系统，不能完全模拟人类的骨骼重建过程，因此不宜用在研究哈佛系统的形态、功能和组织性质方面的实验。④小鼠过于瘦小，操作不便，模型手术要求术者具备一定的显微外科手术基础。大鼠形态比小鼠大，手术操作较为方便，比小鼠更有优势。兔是目前做骨缺损模型最常用的动物。目前最常用的品种是新西兰大白兔，其来源广泛，生物信息已经充分了解，也比较容易饲养，耐受手术和抗感染能力也较强。兔相比于鼠类最大的优势就是兔体型大，操作比鼠类方便，而且经济方面也在能接受的范围内，因此较为常用。

2动物年龄的选择

实验动物的年龄能够影响实验结果的科学性。实验动物年龄过小，动物自身生长发育旺盛，会影响骨移植材料实验结果的说明性。而且如果动物年龄过小，骨骼强度不够，植骨或内固定后，不易固定牢靠，难以操作管理。相反，如果动物年龄过大，骨骼老化，自身修复能力低下，更不利于实验结果。因此，选择年龄合适的动物，对实验的操作，实验结果的科学性都很重要。一般小鼠4到5周达到性成熟，所以应选择2到3个月的小鼠作为模型。一般雌兔5到6个月达到性成熟，所以一般选择6到10个月的兔作为模型。

3实验动物骨缺损部位的选择

临床上骨缺损的种类很多，部位各不相同。所以针对不同部位骨缺损的研究就要设计出不同的动物模型。总的来说，骨缺损的部位可以划分为负重部位骨缺损与不负重部位骨缺损两类。如上肢的骨缺损就是不负重部位的骨缺损，下肢的骨缺损就是负重部位的骨缺损。在动物模型中，多以兔的桡骨部分切除、鼠的胫骨部分切除来模拟不负重部位的骨缺损，因为兔的桡骨缺损后，有尺骨支撑，桡骨不负重，鼠的胫骨缺损后，腓骨支撑，胫骨不负重。这两种骨缺损模型，骨缺损部位可以不用内固定，用来研究促进骨痂生长的因素等。而常用兔的股骨远端和鼠的股骨来模拟负重部位的骨缺损。这些部位都是单骨，缺损后需要植入材料后内固定。

4缺损长度的选择

实验动物骨缺损模型是进行骨缺损内植物研究的基础。若是缺损长度不够，实验动物骨缺损可自行愈合，则无再研究的必要。只有缺损的长度达到无法自行愈合时进行骨组织工程修复才有实验意义。而这个超出骨自行修复最大能力的缺损长度即为临界骨缺损长度（CSD），它是进行骨组织工程研究的基础。

目前国内外关于兔桡骨缺损模型缺损长度的认识上存在一定的差异，有学者采用兔桡骨中段10cm缺损模型，其依据为新西兰大白兔桡骨平均直径约在4～5mm左右，按照Stephen标准，缺损值达到骨直径的1.5～20倍即可认为是骨缺损临界值。桡骨中段1.2cm缺损也是部分学者所采用的骨缺损模型，其实验结果证实该骨缺损模型亦可应用。、Niemeyer等及Geiger等取兔桡骨中段截除1.5cm骨段（包括骨膜）制作骨缺损模型，经10周发现骨缺损两断端硬化，骨缺损区域形成。有研究应用4月龄兔进行桡骨中段1.5cm与20cm骨缺损模型，术中将骨膜于骨间膜均剔除，观察12周，发现16例20cm缺损中有6例是骨不连，15例1.5cm缺损中有7例骨不连，因此认为4月龄兔不宜作为骨缺损模型动物。赵明东等在探讨兔桡骨中段骨缺损的模型的标准化研究中，取6月龄左右健康新西兰大白兔，分别研究了缺损10cm、1.2cm、1.4cm、17cm和20 cm 组，每组16 侧。观察12周，发现骨缺损10cm、1.2 cm组骨缺损在12周时愈合率较高，骨缺损1.4 cm组及以上组的模型，愈合率明显下降。由此认为在进行骨组织工程研究时，应采用桡骨缺损模型1.4 cm及以上长度、6月龄左右健康新西兰大白兔作为骨缺损模型更有说服力。

靳慧勇等制备缺损长度分别为1mm、2 mm 和2.5 mm 的小鼠股骨干中段骨缺损模型，术后观察3个月发现：1mm 的缺损可以通过自身修复机制愈合，而2mm及2.5 mm 的缺损则无法自行愈合。由此得出结论：小鼠股骨缺损>2mm不能自行修复。Nagashima 等为研究双磷酸盐对骨损伤的愈合作用，制备小鼠股骨直径10 mm 打孔缺损模型。Monfoulet等为研究股骨皮质骨和松质骨愈合，制备小鼠直径09mm 缺损。由此可见，骨缺损大小的确定是根据研究目的而定。如果要进行骨缺损的内置物或内固定的研究，动物模型兔的骨缺损在1.4cm以上，小鼠的骨缺损模型在2mm以上具有说明性，也可以设计对照实验来排除动物自身愈合对结果的干扰。如果研究某种植入物或药物对骨缺损修复的机制，可以相应的减少缺损长度。

5总结

骨缺损动物模型的制作要从多方面考虑。首先应根据研究经费及实验目的等综合情况选择合适的动物种类和骨缺损的缺损部位；其次根据动物种类的不同，截取不同长度的骨块，以成功制作骨缺损模型，一般模型兔的骨缺损在1.4cm以上，鼠的骨缺损在2mm以上。然而无论实验目的有何不同，动物年龄的选择一定要合理，要选择生理发育均较稳定的年龄段动物，综合近年来骨缺损模型制作情况来看，选择 2到3个月的小鼠或 6到10个月的兔作为模型，比较合理。

笔者认为一个成功的动物模型的设计，不仅要满足实验目的，提供实验所要收集和观察的指标数据，还要能反映实际临床中该疾病的发病机制。只有以临床实际为基础的实验设计，以每个骨伤科疾病的发病机制为指导设计出的动物模型才更具有说服力及实际意义。

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骨髓炎动物模型研究 篇3

关键词：急性肺损伤,骨髓间充质干细胞,外周血

急性肺损伤 (acute lung injury, ALI) 和急性呼吸窘迫综合征 (aeute respiratory distress syndrome, ARDS) 是临床常见的呼吸系统急危重症。感染、脓毒血症、外伤、休克、中毒等多种临床常见病因均可诱发ALI/ARDS。促炎症细胞因子 (TNF-γ、IL-1、IL-6、IFN等) 和抗炎症细胞因子 (IL-4、IL-10、IL-3、IL-17 等) 的失平衡是其发生的主要机制[1]。其中TNF-α 在ALI发病中起重要作用, 可以使溶酶体破裂酶外泄, 损伤肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞, 还可促进中性粒细胞 (PMN) 与肺血管内皮细胞粘附, 导致PMN在肺内聚集, 产生氧化应激反应, 引起肺炎症反应[2]。大量的研究证实, 骨髓间充质干细胞 (bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSC) 在发生ALI时, 内源性或外源性间充质干细胞 (mesenchy mal stem cells, MSCs) 能够向肺脏迁移并定值, 通过旁分泌作用或多向分化功能平衡炎症介质, 修复损伤内皮[3,4,5,6]。所以, 损伤部位MSCs定值的数量与预后有着密切的关系。关于MSCs向肺损伤的组织迁移和归巢的机制尚未完全明确, 目前较为明确的是粒细胞集落刺激因子和间质细胞衍生因子-1 (SDF-1) 对MSCs有明显的趋化作用[7,8]。研究证实, 肺损伤时, MSCs可以通过免疫调节作用抑制致炎症因子的产生[9], 而炎症因子对MSCs归巢的影响却少有研究。本研究采用TNF-α 抗体干预脂多糖 (LPS) 复制的ALI大鼠动物模型, 观察其对于外周血中MSCs数量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物

健康SD大鼠, 雌雄不拘, 身体质量150~200 g, 由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

1.1.2主要试剂

脂多糖 (LPS, E.coli O111:B4) 、茜素红、油红、抗坏血酸磷酸盐、β-磷酸甘油钠、地塞米松、IBMX、胰岛素 (Sigma-Aldrich公司) ;Percoll密度分离液 (Pharmacia公司, 美国) ;TNF-α单克隆抗体 (英夫利昔单抗, 西安杨森公司) ;TNF-αELISA试剂盒 (美津生物公司) ;胰酶、L-DMEM培养液 (Hyclone公司) ;胎牛血清 (杭州四季青生物公司) 。

1.2 实验方法

1.2.1动物分组

SD大鼠随机分为3组。对照组 (CG) 6只, 每只给等体积的生理盐水气道滴入;模型组 (MG) 组8只, LPS (5 mg/kg) 气道内滴入, 复制ARDS模型;干预组 (IG) 组8只, LPS (5 mg/kg) 气道内滴入同时英夫利昔 (10 mg/m L) 腹腔注射5 mg/kg。同时对照组 (CG) 和模型组 (MG) 腹腔注射等量生理盐水。

1.2.2外周血MSCs的分离培养

造模5 h后麻醉大鼠, 分别从上述3组大鼠心脏取血9.0 m L, 其中取1 m L静置、离心各20 min, 取血清, -80℃保存, 准备行外周血TNF-α含量检测。余8 m L, 加入100 IU/m L肝素抗凝, 磷酸盐缓冲液倍稀释后, 用密度为1.077 g/m L的Percoll分离液分离单个核细胞, 1 500r/min离心25 min, 取白色云雾状细胞层即为单个核细胞层, 计数后以5×104密度接种于12孔板, 加入含10%胎牛血清的L-DMEM培养液培养基 (含100μg/m L青霉素, 100μg/m L链霉素) , 置37℃、5%CO2饱和湿度培养。48 h后换液, 以后每3天换液1次, 观察细胞形态。

1.2.3外周血TNF-α的检测

为明确TNF-α单克隆抗体对外周血TNF-α含量的影响, 检测了不同组大鼠外周血TNF-α含量的变化。取外周血1 m L, 静置, 离心各20 min, 取血清, 依照TNF-α试剂盒说明书测定外周血TNF-α含量 (pg/mg) 。

1.2.4成纤维细胞集落形成单位 (CFU-F) 的检测

每例培养3个孔, 计算CFU-F时取平均值。原代外周血单核细胞培养14 d, 此时集落数较稳定且未融合, 分别计数每组单核细胞形成的集落数。显微镜下计数细胞集落数, 计数≥50个成纤维细胞团为1个CFU-F集落。

1.2.5骨髓基质干细胞成骨诱导和成脂诱导

取第3代外周血来源MSCs, 接种于12孔板, 细胞70%~80%融合时将其中6孔培养液换为含成骨诱导剂的L-DMEM诱导培养液 (地塞米松100 nmol/L, β-甘油磷酸钠10 mmol/L, 维生素C 50μmol/L, 10%胎牛血清) ;6孔换为含成脂诱导剂的L-DMEM培养液 (地塞米松1μmol/L, 吲哚美辛200μmol/L, IBM×0.5 mmol/L, 胰岛素10μg/m L, 10%胎牛血清) 。每隔3天换液1次, 3周后成脂细胞行油红染色;4周后成骨诱导细胞行茜素红染色。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0 软件进行方差分析, 所有计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血TNF-α

与对照组大鼠比较 (38±21.6) , 模型组大鼠外周血TNF-α 水平显著升高 (354±82.4) , 差异具有统计学意义 (P <0.05) ;与模型组大鼠比较, 干预组大鼠外周血TNF-α 水平显著降低 (206.5±64.1) , 差异有统计学意义 (P <0.05) 。见图1。

2.2 骨髓基质干细胞形态学观察

外周血单核细胞接种后首次48 h换液, 此时大量的造血细胞沉积于培养板底, 贴壁细胞无法辨认, 此后每3 天换液1 次, 6 d之后可见长梭形贴壁细胞, 以集落方式生长, 见图2A。2 周后细胞铺满板低, 可见多角形及不规则形态, 见图2B。传代后, 细胞形态逐渐均一化, 呈梭形的成纤维细胞样形态, 均匀性分布生长, 细胞数增多, 呈漩涡状排列, 见图3。

1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与干预组比较, P<0.05

2.3 外周血CFU-F集落形成分析

模型组大鼠外周血中培养出的成纤维样细胞集落数明显高于对照组, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;而干预组大鼠集落数明显少于模型组, 差异具有统计学意义 (P <0.05) , 见附表。

2.4 外周血来源的骨髓基质干细胞成脂诱导

外周血MSCs经成脂诱导液诱导3 周有少量含脂质空泡出现, 细胞变得宽大, 密度降低, 脂滴量显著增加, 油红染色呈阳性, 见图4。

(个, ±s)

注:1) 与对照组比较, P <0.05;2) 与干预组比较, P <0.05

2.5 外周血来源的骨髓基质干细胞成骨诱导

外周血MSCs成骨诱导后增殖变慢, 形状不规则, 诱导4 周后茜素红染色呈阳性, 见图5。

3 讨论

目前研究已经证实, ARDS的发病机制主要是由肺内炎症细胞 (如嗜中性粒细胞、巨噬细胞) 为主导的肺内炎症反应失控导致的肺水肿。许多炎症介质如TNF-α、IL-8、NF-κB、氧自由基等都参与到这一病理过程中。而该病理过程的中心环节就是毛细血管上皮细胞的损伤。而骨髓基质干细胞作为一种具有多向分化功能及修复功能的干细胞, 发生急性肺损伤时, 在肺组织中的聚集明显增加, 参与肺损伤的修复[10]。骨髓MSCs动员与肺损伤严重程度呈正相关, 即肺组织损伤程度越重, 动员骨髓MSCs进入外周血并归巢到肺组织越明显[11]。该作用机制虽然不完全明确, 但认为和MSCs表达不同的趋化因子受体、一系列趋化因子和炎症因子有关[12,13]。

TNF-α 在内毒素致急性肺损伤的所有炎症因子中处于十分重要的地位, 能诱导肺内皮细胞活化、白细胞迁移、粒细胞脱颗粒和毛细血管渗漏, 积聚的水肿液阻碍了氧气交换, 最终导致ARDS。但在急性肺损伤时, TNF-α 对骨髓MSCs动员的影响, 却并不明确。本实验利用内毒素复制ALI动物模型, 干预组给予TNF-α 抗体干预, 观察外周血中MSCs数量的变化。研究结果显示, 模型组外周血中TNF-α较对照组明显升高, 同时外周血成纤维细胞集落形成单位较对照组明显增加;TNF-α 抗体干预后外周血中TNF-α 含量较模型组下降, 外周血中成纤维细胞集落形成单位较模型组明显降低 (P <0.5) 。证明外周血中TNF-α 水平和MSCs数量有密切的相关性。

急性肺损伤时, TNF-α 对于外周血MSCs影响机制尚不明确。但其他疾病动物模型及体外细胞实验已有研究。RYOSUKE[14]在研究TNF-α 对肿瘤动物模型MSCs定值时发现, TNF-α 可以通过NF-κB信号通路, 促进MSCs表达VCAM-1 和VLA-4, 使得MSCs易于和血管内皮细胞黏附结合, 促进MSCs在损伤部位的集聚。COFFELT和ZHANG体外研究[15,16]证实, TNF-α 可通过促进MSCs合成多种生长因子, 如胰岛素样生长激素-1、血管上皮生长因子、肝细胞生长因子促进MSCs骨髓动员及归巢。SUN的研究显示, 把人脂肪来源的MSCs和TNF-α 共孵育后, MSCs定向迁移能力明显增强, 进一步的研究[17]发现, TNF-α 可使MSCs表达C-C趋化因子受体明显增加, 如CCR1、CCR7;C-X-C趋化因子受体增加, 如CXCR4、CXCR5、CXCR6, 增强其骨髓动员及定值。以上实验研究均提供了TNF-α 作用于MSCs可能机制。而对于急性肺损伤, 涉及到蛋白激酶、核因子 κB (NF-κB) 等转录因子的激活, 炎症因子、趋化因子、活性氧化物、蛋白酶等物质的释放等, 体内各类因子及炎症介质相互作用均可能影响到MSCs的动员及归巢, 而外周MSCs数量的增多, 也是多种因子及炎症介质相互作用的结果, 明确的机制尚需相关实验进一步研究。

由于目前对生物特性的研究尚不够完善, 尚未发现MSCs的特异性表面标记[18], 因此, 目前主要通过细胞形态学特征、细胞表面分子的表达以及具有多向分化潜能对BMSCs进行鉴定。而公认的鉴定MSCs的“金标准”就是细胞形态学及检测其多向分化潜能。本实验中所分离的细胞经过传代, 到P4 及以后的镜下所见:细胞体积较小细长, 呈梭形或纺锤形, 细胞核明显, 核浆比大, 均匀性分布生长, 汇合后呈漩涡状或辐射状排列, 符合骨髓基质干细胞的形态学表现。在成骨诱导4 周以后, 细胞爬片的茜素红染色阳性;成脂诱导3 周后, 油红染色呈阳性。证明研究所分离的细胞有分化潜能, 所培养细胞即为MSCs。

骨髓炎动物模型研究 篇4

【摘要】本文综述了国内外有关黄褐斑实验动物模型的几种方法：雌激素全身攻击法、紫外线照射法和微量定点注射辅以紫外线照射法。在总结每种模型方法特点的同时，指出了黄褐斑中医病证模型的研究方向。

【关键词】黄褐斑;动物模型;综述

【中图分类号】R758.4+2 【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)08-0041-02

黄褐斑为临床常见的慢性黑素增多性皮肤病之一。多表现为形状不规则的淡褐色或淡黑色斑，对称分布于额、眉、颊、鼻、上唇等颜面皮肤，因形似蝴蝶，故又名蝴蝶斑。中医称“面尘”、“黧黑斑”。其病程较长、发展缓慢、以中青年女性多见，严重影响美观，现已成为医学和美容界共同面临的难题。迄今为止，不论中医还是西医都尚无疗效确切的治疗良药。因此，寻找组方合理、高效安全的美白祛斑制剂，已成为目前药学和化妆品领域的一个研究热点。其中建立切实可行的动物模型是药效学得以进行的一个关键环节。关于黄褐斑的动物模型研究国内外均有报道，但无公认的造模方法，现将近几年来的动物造模研究归纳、分析、总结如下，以期对今后的探索有所启迪。

1雌激素全身攻击法

黄褐斑作为中西医的一种疑难皮肤疾患，尽管其病因病机十分复杂，但普遍认为：内分泌失调、紫外线照射、遗传是其发病的主要因素。过伟峰^[1]等根据黄褐斑的发生与内分泌紊乱有关及目前通行的“雌激素和黄体酮增多进而刺激黑素细胞而致色素沉着”的发病学假说，用黄体酮攻击雌性小鼠，使其内分泌紊乱来复制黄褐斑动物实验模型。并以肝、皮肤组织中酪氨酸、MDA（丙二醛）、SOD（超氧化物歧化酶）含量变化及皮肤黑素细胞增长情况为考察造模是否成功的指标。过氏实验结果显示：以2倍、8倍于人临床等效量的黄体酮攻击雌性小鼠1个月后，黄体酮高剂量组的皮肤、肝酪氨酸酶含量明显高于正常及低剂量组（P<0.01），从而证实该小鼠模型符合黄褐班发病的生化学改变特征。病理学检测可见模型组黑素细胞明显增多，成簇分布于毛囊基底细胞团中，呈强阳性反应（P<0.01）。正常组小鼠鼠抗人单克隆抗体HMB45标记皮肤仅在毛囊、皮脂腺基底细胞中见少量黑素细胞；病理图像学多参数定量分析结果显示，模型组皮肤黑色素着色面积、深度明显大于正常组（P<0.05）。这从病理学角度进一步证实，用本方法制作的小鼠黄褐斑动物模型是成功的。此后王氏^[2]成功复制了该造模方法，用以探讨省卫生厅资助课题—蝴蝶霜治疗黄褐斑的作用机理研究。

2紫外线照射法

根据紫外线照射是黄褐斑的主要加重和致病因素之一，国外学者Imokawa^[3]等应用紫外线照射对黑素增多性皮肤病动物模型做了较为详细的研究。Imokawa选用棕黄色豚鼠，分别采用UVB（中波紫外线）、PUVA（光化学疗法）两种方法致黑素形成。在UVB连续3天照射后，可见明显的黑色沉着，一周后色素沉着达到最大量。病理切片显示：未经UVB照射的豚鼠表皮黑素含量为:200-400 /mm2；经UVB照射后豚鼠表皮黑素分布呈树枝状，含量达到800～1000/mm2； PUVA采用UVA（长波紫外线）照射，同时向豚鼠腹腔注射8-MOP（8-甲氧基补骨脂素），连续照射一周后也可产生较为明显的色素沉着。并运用UVB造模观察了酪氨酸酶抑制剂对黑素细胞数和含量影响，证实了采用紫外线照射用于黑素增多性皮肤病动物模型研究的可行性；日本学者猪木彩子^[4]也采用UVB照射小鼠的模型方法研究了木槿提取物抑制黑素生成的作用。国内学者潘扬、曹亮等^[5]参考相关文献，对黄褐斑病因进行分析，日光照射是发生黄褐斑的重要因素。过度日光照射后黄褐斑几乎均加重。长期UVB照射可使黑素细胞增殖。根据这一假说进行了UVB照射复制黄褐斑动物实验模型研究。用UVB照射雌性白色豚鼠一个月，并以豚鼠皮肤黑素细胞病理形态学及皮肤和肝脏组织酪氨酸、SOD、MDA含量变化作为考察指标，进一步证实紫外线照射复制该模型的科学性。李洪武等^[6]应用紫外线照射棕黄色豚鼠的造模方法进行了祛斑中药-白术对豚鼠皮肤色素沉着抑制作用这一国家

基金项目的实验研究。具体造模方法为：选健康雄性棕黄色豚鼠，每只实验动物背部取9个相离区域，使用SS-04B型紫外线光疗仪(上海希格玛高技术有限公司)。照射前用剪刀剪除豚鼠背部面积为6 cm x 6 cm的长毛。电动剃须刀剃尽短毛。UVB紫外灯灯管的光谱值为280～320 nm，灯管距豚鼠背部距离15 cm，照射总量为500 mJ／cm。照射1周开始用药，模型组区域连续照射3周后做组织活检并作镜下观察分析。结论显示该造模方法成功，且白术对豚鼠皮肤色素沉着有抑制作用。方晶^{[7等则成功复制了该造模方法，研究了橙皮苷对皮肤色素沉着的抑制作用；潘氏[8]也应用此造模方法探讨了烟酰胺对UVB致豚鼠皮肤色素沉着的抑制作用研究；马景昕[9]则采用该造模方法，以棕色雌性豚鼠为动物模型，采用mRNA原位杂交观察了旱莲草等7种中药外涂对豚鼠皮肤酪氨酸酶mRNA水平的影响。}

3微量定点注射辅以紫外线照射

由于经日光曝晒或紫外线的过多照射可促发黄褐斑并使其加剧。有学者^[10]据此以及色斑的外形采用微量定点注射法将黑斑形成液注入幼年猪皮下不同深度，辅用紫外线照射以形成类似褐斑的实验动物模型。具体实验方法为：采用特制黑斑定位板固定在动物已备皮处，消毒后，将已配制好的黑斑形成液充分混匀后依次进行皮下注射。以后每天1次用黑斑形成液轻轻点擦外部相应处并每天用紫外线灯照射，对照组用生理盐水代替黑斑形成液，连续60天后，取猪背部的对照皮肤和黑斑形成处皮肤进行切片、染色，并用光镜和电镜进行观察。结果：受试动物皮下形成肉眼可见的类似褐斑形状和大小的黑斑斑点。通过皮肤组织切片染色并用光镜和透射电镜观察，黑斑形成处黑素细胞产生的黑素颗粒比与正常对照组有明显增多（P<0.05）。

综上所述，目前黄褐斑的动物造模主要有：雌激素全身攻击法、紫外线照射法及微量定点注射辅以紫外线照射等几种方法。其中，过氏采用的雌激素全身攻击小鼠，使其内分泌紊乱及国内外的紫外线照射法与黄褐斑的发病原因相似；微量定点注射辅以紫外线照射形成的动物黑斑则完全依赖黑斑形成液和紫外光等外源性因素诱导产生，故应注意到动物模型本身并不完善，只是单一的从病因的一个方面反映了疾病的表现，尚不能完全理解黄褐斑病因病机的复杂性，且动物的病因学与人的相似性仍存在不确定性，基础实验与临床应用还有差距。紫外线照射法从黄褐斑病因和症状两个方面来模拟，相比其他造模方法要成熟，但仍要对建立模型的各项指标如照射剂量、观察时间及测量指标进行优化比较；并且对采用实验动物的种类、性别等也应进行分析研究，进一步完善黄褐斑动物的实验模型。 另外，黄褐斑的实验动物模型还应注重在中医理论指导下，采用模拟症状和模拟中医病因相结合的造模方法，塑造出符合中医辨证论治要求的病证结合模型。

参考文献

[1]过伟峰，徐立，项晓人，等.建立小鼠黄褐斑实验动物模型的初步研究[J]. 中国中医基础医学杂志，2001,7(2):49-51

[2]王志国.蝴蝶霜治疗黄褐斑的实验研究[J].中国药师，2006,9(7):588-590

[3]Imokawa G, Kawai M, Mishima Y, et al. Differential analysis of experimental hypermelanosis induced by UVB, PUVA, and allergic contact dermatitis using a brownish guinea pig model[J]. Arch Dermatol Res. 1986,278(5):352-362

[4]猪木彩子.木槿提取物抑制黑素生成的作用(2) [J].国外医学中医中药分册，2005，27（4）：246

[5]潘扬，曹亮，许惠琴，等.建立黄褐斑实验动物模型的初步研究[J]．成都中医药大学学报，2003,26(4):27-29

[6]李洪武，朱文元，夏明玉，等.白术等对UVB诱导豚鼠皮肤色素沉着的抑制作用[J].中华皮肤科杂志，2000,33(6):386-388

[7]方晶，朱文元，张美华. 橙皮苷对中波紫外线诱导豚鼠色素沉着抑制作用的研究[J]. 临床皮肤科杂志，2007，36（3）：141-144

[8]潘建英，张玉彬，帕它木•莫合买提，等.烟酰胺干预UVB诱导豚鼠皮肤色素沉着的作用[J]．中华现代皮肤科杂志，2005，2（ 2）：97-99

[9]马景昕，涂彩霞，陈晓燕. 中药对豚鼠皮肤酪氨酸酶mRNA水平的影响及致色素作用[J].中华皮肤科杂志，2005，38（2）：92-94

[10]丁克祥，陈华东，赵莉，等. 实验动物黑斑模型的建立及其研究[J]. 中国美容医学，2000,9(1):6-9

(收稿日期：2009.02.10)

骨髓炎动物模型研究 篇5

【摘要】随着世界人口的老龄化，阿尔茨海默症已成为严重威胁老人健康的四大疾病之一。研究并建立可靠的AD动物模型对于探明阿尔茨海默症的病因、发病机制及防治药物的研究与开发均具有重要意义。本文对AD动物模型的研究进展及其评价作一简要综述。

【关键词】阿尔茨海默症；动物模型

【中图分类号】R741.04【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0018-03

Advances and evaluation on research of Animal model of Alzheimer's disease

ZHANG Jie LONG Yinf HU Xiqi CAO Ping ZHRENG Yaofan LI Xianhui

(1.Medicine Department,clinical,class 1 grade 2006 of Jishou University ，Jishou Hunan, 416000,China;

2 Department of Physiology of Jishou University Medicine Department , Jishou Hunan ,416000, China）

【Abstract】 With the aging of world's population, Alzheimer's disease has become one of the four serious diseases which threat to the health of the elderly.It is very important to research and establish a reliable animal model for AD in proving Alzheimer's disease etiology, developing of prevention drug research. In this paper, an animal model of AD research and evaluation are reviewed .

【Keywords】Alzheimer's disease;animal model

阿尔茨海默症(Alzheimer disease ,AD) 是发生在老年期或老年前期的一种中枢神经系统慢性渐进性退行性疾病,以脑细胞内神经纤维缠结(nervefiber tangles , NFT ) 和细胞外老年斑( senileplaques ,SP) 以及大量神经元丢失为主要神经病理特征^[1]。由于阿尔茨海默症（AD）的发病机制至今不明，因此研究并建立可靠的AD动物模型对于探明阿尔茨海默症的病因、发病机制及防治药物的开发与研究具有重要的意义。虽然完全理想的AD动物模型目前尚不存在，但随着神经生物学和分子生物学的进步，许多AD动物模型相继被制作，并在研究中得到广泛的应用，这些模型为理解AD的病理机制和实验新的药物发挥了重要作用。

1损伤模型

1.1前脑胆碱能系统损害模型前脑胆碱能系统损害模型是建立在AD胆碱功能障碍假说的基础上。前脑胆碱能系统与学习记忆和认知功能有着密切的联系，因此前脑胆碱能系统的损害导致AD患者的学习记忆和认识功能的损害^[2]。

1.1.1乙酰胆碱M受体阻断剂所致的动物模型给大鼠腹腔注射胆碱能拮抗剂（如东莨菪碱、樟柳碱等），可阻断大脑皮层中的乙酰胆碱受体的结合位点，从而引起胆碱能系统功能障碍。该类药能特异性阻滞信息由第一级向第二级的传递过程从而干扰了获得新近信息（近期记忆）的能力^[3]。评价：乙酰胆碱M受体阻断剂动物模型可造成认知障碍，但缺乏AD特殊病理生理所必需的特征，且主要是可逆性阻断突触后的乙酰胆碱M受体，而AD是一种进行性不可逆的神经性疾病，突触后乙酰胆碱M受体并无明显减少，因此，只是模拟了AD的部分特征。同时，应注意乙酰胆碱M 受体阻断剂东莨菪碱慢性给药对大鼠学习记忆能力有一定损害,但对长时记忆和海马神经元结构无明显影响^[4]。

1.1.2兴奋性毒素所致的动物模型使用兴奋性神经毒素氨基酸，如红藻氨酸（KA）、鹅膏覃氨酸(IBO)、使君子氨酸(QUIS)、N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)等注入大鼠Meynert可造成动物一系列类似AD的行为改变。兴奋性神经毒素氨基酸有强烈的神经毒性作用，通过与神经元胞体或树突上的NMDA受体结合，使神经元中毒损伤而溃变。兴奋性神经毒素氨基酸可使大脑皮层和海马M受体结合量下降，突触数量减少，胆碱能的标志酶含量下降，学习记忆能力减退。评价：该模型模拟了与学习记忆有关的胆碱能神经系统损害的信息，但无神经炎斑块及NFT的组织病理学改变且神经毒氨基酸对乙酰胆碱系统的损伤可逆转。同时应注意兴奋性神经毒素氨基酸对非胆碱能神经元也有影响。

1.1.3选择性胆碱能神经毒素所致的动物模型向大鼠脑室注射特异性的胆碱毒1-乙基-1-（2-羟乙基）-氯化氮丙啶（AF64A），大鼠会出现胆碱能系统和记忆功能损害。AF64A，1-乙基-1-（2-羟乙基）-氯化氮丙啶是一种胆碱能神经元特异性的突触前损伤神经毒素。其结构与胆碱相似,能选择性地作用于高亲和力胆碱转运( HAChT)系统,同时在其体内积聚部位产生毒素作用。评价：该模型可以模拟大脑皮层、海马等脑区胆碱能神经系统损害和记忆认知行为的改变,但不能形成Aβ沉积、NFTs等组织病理学改变^[6]。

1.1.4免疫毒素所致的动物模型向大鼠脑内Meynert注射免疫毒素1921IgG-Saporin（由低亲和性神经生长因子（NGF）受体的单克隆抗体IgG与同样带有NGF受体的细胞毒性Saporin结合而成），可选择性的损伤基底前脑胆碱能细胞，从而使大鼠的学习记忆能力明显受到损害^[7.8]。评价：该模型主要用于研究胆碱能神经元选择性损害和AD认识障碍的关系机制，拟胆碱能药物治疗AD的药物筛选、疗效评价，胚胎基底前脑胆碱能细胞脑内移植治疗AD的实验。

1.1.5电损毁及外科损毁模型电损害、外科损伤如损毁穹隆海马伞通路等方法破坏基底前脑胆碱能投射纤维,造成动物一系列类似AD 的行为改变^[9]。评价：电损伤模型缺少说服力是由于大鼠脑内不同分区组织中单胺氧化酶β活性与正常组比较没有显著性升高，而单胺氧化酶作为脑组织老化相关酶已被国内外学者所证实。虽然外科手术损伤所致动物模型造模方法具有周期短的优点，但又有创伤大，邻近组织难免受到损害等不足，且无典型AD病理特征，如老年斑和神经纤维缠结等缺点，所以不是AD的理想模型。

1.2β-淀粉样多肽所致的损伤模型向大鼠大脑海马注射或向大鼠大脑侧脑室内灌注Aβ25～35可导致海马神经元减少等AD的病理改变。Aβ具有神经营养和神经毒性双重作用，注射Aβ25～35后，主动和被动回避性反射及空间分辨力降低，皮质和海马神经元减少、退变，皮质下血管淀粉样变，脑内出现纤维蛋白丝状物^[10]。评价：Aβ25～35注射模型多用于研究AD治疗药物在Aβ沉积、神经毒性作用和小胶质细胞炎症反应等方面，在一定程度上体现了AD的认知功能障碍和某些病理改变，但该模型不能体现神经纤维缠结等AD重要病理改变。应该注意在导入Aβ25～35的同时每一注射动物都有一局灶型损伤，且要使大量Aβ弥散分布到脑是该模型所需要解决的问题。另外，海马注射Aβ是一种急性单因素模型，不符合AD慢性起病的特点。

1.3铝损伤模型用AlCl3处理兔可诱发细胞损伤，神经纤维缠结等AD症状。铝具有神经毒作用，铝能抑制蛋白磷酸酯酶2A和2B的活性，从而促使异常磷酸化的tau蛋白产生，继而利于神经纤维缠结的形成^[11]。评价：该模型模拟了AD胆碱能神经系统功能下降及记忆力减退的特征，但此模型只是表达出AD的部分特征，形成的神经纤维缠结中tau蛋白没有磷酸化成PHF，且不能反映年龄依赖性Aβ沉积的SP形成，胆碱能系统也是正常的，造模周期也较长。

1.4脑缺血所致的损伤模型结扎16月龄大鼠双侧颈总动脉同时烧灼一侧椎动脉，可造成脑长期供血不足，动物出现与AD患者相似的行为缺失和脑组织病理生理改变^[12]。该模型建立于脑供血不足，可引起脑损伤和一系列的AD临床症状，如神经元丢失，蛋白免疫反应增强等。评价：该模型适用于研究混合型老年性痴呆的发病机制和有关药物治疗的研究，但此模型出现的神经病理学改变广泛，不仅限于AD的表现，从而限制了他的应用。

2衰老模型

2.1自然衰老认知障碍动物模型衰老肯定是AD的危险因素。随着年龄的增长，AD患病率呈增高趋势。形态学观察可见，自然衰老鼠隔区、斜角带核及Meynert基底核神经元萎缩、丧失，同时有感觉、运动、学习记忆等多种功能下降，这些都是自然衰老AD模型的基础。评价：自然衰老认知障碍动物模型神经系统的改变是自然发生的，较其他动物模型更为接近AD的真实病理改变。正常衰老动物只是部分模拟了AD病理改变，极少形成神经纤维缠结及淀粉样蛋白沉积。此外，老年动物价格昂贵，且健康状况差，不易得到，在一定程度上制约了该模型的研究进展。

2.2快速老化小鼠（SAM）模型竹田俊男通过对AKR/T自然变异小鼠进行交延代培养得到一种自然快速老化小鼠，该家族诸多品系中的SAM-P/8可作为AD模型。SAM-P/8在2月龄就出现学习记忆功能减退，并随着年龄的增加而加重，处于一种低紧张、低恐怖的痴呆状态。同时SAM-P/8具备AD的多种特征，诸如皮质萎缩、皮质和海马锥体神经细胞数目下降、PAS阳性颗粒和Aβ样颗粒（β-CIGS）广泛沉着^[13]。评价：该模型是一种比较理想的衰老模型，与自然衰老动物模型相比，其病理特征更加明显，可广泛用于增强学习记忆功能及促智药物的研究。

2.3D-半乳糖衰老模型D-半乳糖衰老模型是由我国学者首先提出的，向大鼠腹腔注射D-半乳糖，使机体细胞内半乳糖浓度增高。在醛糖还原酶的催化下，还原成半乳糖，此物质不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内，影响细胞的正常生理代谢^[14]，动物表现为学习记忆力下降、行动迟缓等衰老征象。评价：D-半乳糖拟衰老模拟是目前研究AD的常用工具之一，它可以得到较为真实的AD病理改变。但此D-半乳糖引起的氧化应激反应在AD的发病机制研究深度不够，同时没有资料证明D-半乳糖能产生AD的老年斑和神经缠结等病理学特征。

3以tau蛋白过度磷酸化为特征的模型

通过ALZET微型渗透泵向大鼠侧脑室灌注OA（一种磷脂酸酶抑制剂），OA选择性抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶1A和2A，引起大鼠脑内出现类似老年性痴呆病理改变的双螺旋细丝（PHF）样的磷酸化tau蛋白和Aβ淀粉样沉积斑块^[15],能造成AD模型。评价：由于OA选择的抑制蛋白磷酸酯酶1A和2A的和提高PKC的活性，并能同时表现出AD标志性的病理改变——老年斑和神经纤维缠结。该模型主要适用于：①研究AD发病的病理机制，Aβ和tau在AD病变中的相互作用；②验证现有AD治疗方法和药物的疗效。

4三倍体16鼠（Ts16鼠）模型

1991年Richard S-J等学者将双侧平衡罗伯逊易位的16染色体雄性小鼠与正常雌性小鼠交配后，把其中含有三倍体胚胎和整倍体胚胎的海马和皮层组织分离出来，经胰蛋白酶消化研磨后制成细胞悬液，种植在组织培养皿上。从psi-2源的生产细胞株中获得感染性逆转录因子和选择性抗G418新霉素基因。用逆转录因子转染Ts16和整倍体原代培养物，33℃下培养2～4天后加入G418，经3～4周筛选出克隆。将克隆的Ts16胚胎移植到小鼠体内在移植了三倍体小鼠胚胎的小鼠体内。他们用Aβ抗体，a1-抗糜蛋白抗体、tt蛋白抗体和Ubiquitin染色，可观察到类似于AD的抗原性病理变化。评价：Ts16鼠是AD与Downs综合征的理想模型，有编码APP的基因序列，Ts16鼠能较好的模拟AD的特征。但由于Ts16鼠多妊娠18～20天后死亡，极大的限制了此模型的应用。

5转基因动物模型

利用分子遗传学和胚胎学技术理论,将人体与AD有关的基因整合入小鼠的基因组中，如APP^[16]、ApoE、tau、psI及PsⅡ、R406W^[17]，该动物模型能够在分子水平上反映老年性痴呆的病理生理状况，使其脑内产生老年斑和神经元纤维缠结等阿尔茨海默症的典型病理特征，是目前老年性痴呆病药物临床前研究推荐的模型。评价:转基因动物模型的最大优点是模拟了AD的神经病学特征，包括胞外β沉淀、老年斑、突触丢失、神经胶质增生等。但目前也存在了一些问题，比如转基因动物模型难以重复、外源性基因表达不稳定、繁殖能力低、抗病能力差、成本昂贵。

6复合式模型

目前，主要有以D-半乳糖(D-galactose,D-gal)致衰老为基础的联合诱导和由Aβ与转移生长因子β联合诱导两种方法^[18]。前者D-gal是复合模型中最常用的处理因素，包括Aβ与D-gal联合诱导、鹅膏蕈(ibotenic acid,IBO)与D-gal联合诱导、喹啉酸(QA)与D-gal联合诱导、氯化铝(AlCl3)与D-gal联合诱导、亚硝酸钠(NaNO₂)与D-gal联合诱导、东莨菪碱(SCOP)与AlCl3以及D-gal联合诱导、IBO与Aβ1-40以及D-gal联合诱导、IBO与醋酸氢化可的松龙以及D-gal联合诱导等八种AD模型。后者的代表有2007年方芳等^[19]用大鼠侧脑室内连续14d注入A β1-40，连续5d注入1%氛化铝溶液，首次注射时在丘脑前背侧核注入IOngTGFβ1的多因素损伤的方法，对大鼠脑组织的病理改变同人类AD患者脑内神经元丢失、SP、NFT、和颗粒空泡变性等主要病理特征性表现相似，且淀粉样蛋白(主要为Aβ40/42)积聚和ChAT活性降低这些改变与AD患者脑组织内一致^[5]。评价：复合动物模型较单因素模型更能体现AD的复杂性和病变的广泛性,故更接近AD的病理改变。目前，D-gal与Aβ联合和D-gal与IBO联合诱导的AD模型最为常见,但存在药物注射的剂量、时间以及脑内单侧注射与双侧注射等很多不规范、不统一之处。用Aβ1-40、1%氯化铝溶液和TGFβ13种药物相互作用，能较全面的复制人类AD由复杂的多种因素引起的中枢神经系统慢性、进行性变性的病变特征，且病变持续时间长。而其他复合模型研究均尚处于探索阶段,如AlCl3与D-gal联合诱导的AD模型,有的采取灌胃方式而有的则采用皮下注射方式,孰优孰劣还难以判断。另外，复合模型动物的自愈倾向和自愈时限、是否能建立稳定性和重复性好的模型等问题都还需开展大样本的模型验证研究,尤其是对AD病理特征的研究需进一步加以探索论证。

7结语

综上所述，目前建立AD模型的方法很多，但由于AD的发病机制和病变过程复杂，目前尚无能够全力再现、模拟AD病理、生化、行为等方面全部特征的动物模型。但多数学者认为，复合动物模型会表现出更为典型老年性痴呆的病理及行为表现，为老年性痴呆的研究提出了更深入的探索方向。总之，良好的AD动物模型一定会出现，它将会对AD的研究和药物开发有着跨时代的意义。

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