全骨髓法（精选7篇）
全骨髓法 篇1
摘要：目的 对比、探求分离培养人骨髓间充质干细胞 (human mesenchymal stem cells, hMSCs) 的方法, 探讨hMSCs鉴定和标记的方法, 为进一步的实验研究打下基础。方法 采集成人健康志愿者骨髓5mL, 全骨髓贴壁法、全骨髓贴壁改良法、密度梯度离心法分离纯化、培养和扩增, 获得hMSCs, 对比三种方法。“慢冻速融”的原则进行细胞冻存、复苏。流式细胞术检测hMSCs的表面标志。hMSCs经5-溴脱氧尿嘧啶核苷 (Brdu) 标记, 免疫细胞化学法测定并评估。结果 hMSCs运用三种方法均可获得, 比较全骨髓贴壁改良培养法最为方便高效分离获取hMSC、体外扩增迅速。流式细胞仪检测结果显示:CD44阳性及CD71弱阳性, 表达率分别为95.05%, 78.86%;CD34、CD45阴性, 表达率分别为3.40%, 2.88%。Brdu最佳标记浓度和时间分别为10μmol/L和72 h。结论 hMSCs采取全骨髓贴壁改良法进行较好的纯化和扩增, Brdu标记可用于hMSCs的生长和分化的动态示踪观察。有望建立hMSCs库, 为组织工程、细胞移植研究打好基础。
关键词：人骨髓间充质干细胞,分离培养,流式细胞术鉴定,Brdu
骨髓间充质干细胞 (human mesenchymal stem cells, hMSCs) 具多向分化的潜能, 在一定条件下可向骨、脂肪、肌肉等中胚层来源的组织分化[1], 参与这些组织的损伤修复。分离、培养和扩增后仍保留分化潜能, 且具有低免疫原性和免疫调节功能, 稳定表达外源基因和易于转染[2,3], 成为组织工程较为理想的种子细胞, 也为利用骨髓间充质干细胞进行细胞及基因治疗提供了靶向载体。本实验将利用全骨髓贴壁法、全骨髓贴壁改良法和密度梯度离心法分离培养和纯化hMSCs, 并探寻冻存和复苏的条件, 流式细胞术进行鉴定, Brdu标记测定, 为研究hMSCs提供实验细胞来源。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
成人骨髓来自健康志愿者;低糖DMEM (美国Hyclone公司) ;胎牛血清 (FBS, 杭州四季青生物材料有限公司) ;胰蛋白酶 (北京中山生物技术公司) ;红细胞裂解液 (美国Sigma公司) ;Percoll淋巴细胞分离液 (美国Sigma公司) ;荧光标记鼠抗人抗体CD34-ECD、CD44-PE、CD45-FITC、CD71-FITC (美国Pharmingen公司) ;Brdu (美国Sigma公司) ;倒置相差显微镜 ( CK40-32PH , 日本Olympus 公司) ;超净工作台 (苏净集团公司) ;超速低温离心机 (美国Sigma公司) ;自动控温二氧化碳细胞培养箱 (美国Forma公司) ;恒温水浴箱 (上海医用恒温设备厂) ;流式细胞仪 (美国BD 公司) 。
1.2 hMSCs的获取和原代培养
选取20-30岁的健康男性志愿者, 告知志愿者并取得同意, 签订知情同意书后, 于髂后上嵴抽取骨髓5mL置于抗凝管中。
全骨髓贴壁培养法: 75 mL培养瓶中加入1000单位的肝素抗凝, 将上述骨髓对半加入两个培养瓶, 加入含20% FBS 的L-DMEM - F12 培养基 4 -5mL混匀 , 置于37℃、5% CO2 培养箱中恒温培养。48h后全量换液, 弃去红细胞等未贴壁细胞, 以后每3天进行换液。
全骨髓贴壁改良法: 5mL骨髓置于离心管中, 加入15mL红细胞裂解液, 轻轻吹打混匀, 作用10min, 1000rpm离心5min, 离心弃去上层红色清液, 收集沉淀部分, 加入无血清培养液离心洗2-3次, 重悬细胞, 培养液调整细胞浓度为2×105/mL接种于培养瓶中, 置于CO2培养箱中, 48h后换液, 弃去未贴壁细胞。此后每3天换液。
密度梯度离心法: 5mL骨髓转入无菌试管, 与等量无血清L-DMEM培养基混合, 1000r/min离心10min, 弃去脂肪和上清液, 重新垂悬, 另一离心管注入等体积Percoll分离液 (1.082g/mL) , 将骨髓缓缓加入上层, 注意勿混合, 2000r/min离心20min, 取中间单个核细胞层, 以培养液调整细胞浓度为2×105/mL接种于培养瓶中, 置于CO2培养箱, 48h后换液, 弃去未贴壁细胞。此后每3天换液一次。
1.3 hMSCs的纯化和扩增
原代培养10-15d hMSCs融合达到80-90%时进行首次传代。首先弃去原培养液, PBS缓冲液洗涤3遍, 去除残余培养液, 加入0.25%胰酶1mL进行消化, 放入培养箱作用30s到2min, 在相差显微镜下观察细胞解离程度, 低倍下见细胞突起缩回、间隙增大为宜, 立即加入培养液终止消化, 弯头吸管有序吹打瓶底, 以1:2比例将细胞悬液转入传代培养瓶, 加20%FBS 的L-DMEM - F12 培养基 4-5mL放入培养箱中继续培养。观察3-4d后贴壁生长达80-90%时, 再次进行传代, 传代2到3次后即可达到hMSCs的纯化和扩增。
1.4 hMSCs的冻存和复苏
传至第3代的hMSCs消化成悬浮细胞, 加入培养液吹打混匀, 移入离心管中, 以1000r/min离心4min, 见管底细胞沉淀, 弃去上清, 再加入细胞冻存液 (DMSO:FBS 1:9) 重悬细胞, 调整细胞浓度为1-5×106/mL, 移入低温冻存管中, 依次放入4℃冰箱30min、-20℃冰箱30min、-70℃气氮过夜, 最后置于液氮中长期冻存。复苏时将细胞冻存管从液氮中迅速取出, 立即置于37℃水浴箱中快速解冻, 要求30s内融化后转入培养瓶加上5mL培养基置培养箱中, 6h后观察换液去除未贴壁细胞。
1.5 hMSCs的表型鉴定
取第3代hMSCs, 0.25%胰酶消化贴壁细胞, 离心、垂悬, 制成密度为1×108 L-1的细胞悬液。各取悬液100μL, 分别加入MouseIgG-1、IgG-2, CD34、CD44、CD45、CD71各表型抗体10μL, 避光孵育15 min, PBS洗涤后滴入多聚甲醛固定液重悬, 流式细胞仪检测细胞CD34、CD44、CD45、CD71各表面抗原的表达。Cell-Quest软件分析数据。
1.6 Brdu标记及免疫细胞化学染色检测
传代24h内的细胞约50%融合时, 弃去原培养基, 换用Brdu终浓度为10 μmol/L的培养基, 相差显微镜下观察细胞的形态、生长及增殖, 分别于24h、48h、72h消化下细胞, 转入6孔板中爬片。细胞贴壁后用PBS冲洗, 10%多聚甲醛固定15 min, 进行Brdu的免疫细胞化学检测。具体步骤:Triton-X100破膜, 过氧化氢处理, 血清封闭, 滴入Brdu一抗, 37 ℃孵育2 h, 滴加生物素化二抗, 加入显色剂SABC, DAB, 显色5min终止, 中性树脂胶封片, 显微镜下观察。设PBS作一抗进行阴性对照。选取10个视野进行观察计数。
2 结果
2.1 原代培养
原代培养48h换液后, 在倒置相差显微镜下, 全骨髓贴壁法仍见大量未贴壁的红细胞、脂肪细胞等;密度梯度离心法未见其他杂质细胞, 贴壁细胞也较少;改良法可见贴壁的细胞形成了数个细胞的克隆细胞, 也可见较少的漂浮红细胞 (见图1) 。培养3-4d后, 细胞贴壁呈长梭形、类圆形, 细胞壁上少量突起, 细胞核较大, 呈扁圆形。改良法培养10d左右见细胞长满瓶底, 细胞间单层融合, 放射状、漩涡状整齐排列生长 (见图2) 。全骨髓贴壁和密度梯度离心法15d左右贴壁的hMSCs仍较少, 生长缓慢, 不能传代, 仍可见少量杂质细胞。
2.2 传代培养
传代细胞6-8h可贴壁, 形态与原代类似 (见图3) 。传代细胞生长周期约为3-4d, 80-90%融合后再次传代扩增。随着每次的传代和洗涤, 不贴壁的杂质细胞被逐渐弃去, 使hMSCs得以纯化。传至第3代时, 细胞形态仍与原代细胞相似, 呈成纤维细胞样生长, 镜下看不到其他的杂质细胞 (见图4) 。
2.3 细胞的冻存和复苏
大部分冻存细胞在6h内可贴壁生长, 少数细胞死亡, 无法贴壁。贴壁细胞形态及生长速度与冻存前无显著差异, 这一点对于hMSCs的研究及体内移植具有重要意义。
2.4 hMSCs表型鉴定
流式细胞仪检测第3代hMSCsCD44阳性细胞比率为95.05%, CD71阳性细胞为78.86% (见图5) , CD45为2.88%, CD34为3.40% (见图6) 。
2.5 Brdu标记及免疫细胞化学染色
IHC见Brdu阳性细胞, 阳性反应物位于细胞核, 呈棕色, 颗粒状或弥漫性分布 (见图7) , 数据统计分析标记率达80%。对比24h、48h、72h发现Brdu 最佳标记浓度和时间分别为10 μmol/L和72 h。对照组未见阳性细胞 (见图8) 。
3 讨论
目前hMSCs分离培养的方法主要有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法[4]、免疫学方法[5]等。免疫学法利用hMSCs的表面抗原采用流式细胞分离法或免疫磁性分离法对其分离, 有较高的特异性, 但影响细胞活性[6], 且仪器成本较高, 因此较少应用。密度梯度离心法采用Percoll或Ficon分离液将红细胞、白细胞和单核细胞层有效地分离, 操作步骤较复杂, 所得细胞数量较少, 再通过密度梯度离心获得的hMSCs大大减少, 离心后也影响细胞活性。由于骨髓中含大量红细胞、脂肪细胞等影响间充质干细胞的贴壁, 故全骨髓法分离培养所得细胞杂质较多, 目的细胞较少, 不利后期实验。本实验运用改良贴壁培养法对hMSCs进行分离, 使用红细胞裂解液去除红细胞, 离心去除脂肪细胞。因此改良贴壁培养不影响间充质干细胞的贴壁可用于hMSCs的分离, 方法简便易行。
体外分离培养人骨髓间充质干细胞易受培基血清浓度、种植密度、培养环境等条件的影响[7]。培养基血清浓度以10-20%左右为宜, 浓度过高由于血清中含有大量促进细胞分化的因子, 可引起细胞分化, 不利于目的细胞生长。传代培养时以1:2比例传代为宜, 胰酶消化时间把握适当, 不宜过长, 本实验通常消化30s左右, 镜下见细胞突起缩回、细胞间隙增大即可终止。冻存细胞时要注意冻存液的配比浓度, 另外冻存时应逐步降温, 复苏时快速复温, 这样才利于细胞最大可能的存活。由于间充质干细胞缺乏特异性的干细胞标志, 目前, 体外间充质干细胞是通过一系列的表型和形态结构功能特性来综合鉴定的[8]。研究表明, 间充质干细胞表面抗原表型并不是单一的, 而是兼有间充质、内皮和肌肉细胞的特征[9]。间充质干细胞表达一系列的细胞表面抗原如Stro-1、SSEA-4、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90等, 不表达造血细胞表面抗原如CD34、CD45、CD38、CD14。实验选取CD34、CD44、CD45、CD71四种代表性的抗原标记物, 流式细胞仪分析显示, CD44阳性细胞比率为95.05%, CD71阳性细胞为78.86%, CD45为2.88%, CD34为3.40%。说明分离的细胞群纯度较高。
实验采用Brdu标记hMSCs, 并进行免疫细胞化学染色, 其阳性标记率> 80%, 不影响细胞生长、形态、增殖, 结果显示Brdu标记hMSCs可用于活体内移植的干细胞的检测示踪。
综上所述, 本实验所采用的全骨髓贴壁改良法分离培养间充质干细胞和BrdU标记示踪方法操作简单, 不影响细胞增殖能力, 实验结果稳定, 使用流式细胞术选取细胞表面抗原监测的hMSCs具有代表性, 为今后进一步研究hMSCs的生物特性及其在组织工程方面的应用奠定了基础。
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全骨髓法 篇2
资料与方法
2011年1月-2014年12月收治全血细胞减少患者100例, 均符合血红蛋白<90 g/L、白细胞计数<4×109/L、血小板计数<100×109/L。所有患者知情同意。
研究方法:所有入组患者采集相关病史, 并进行详细的体格检查。血液学方面记录包括完整血像, 即血红蛋白百分率、TLC、DLC、血小板计数、红细胞指标、外周血检查和网织红细胞计数。所有病例同时进行骨髓穿刺和骨髓活检, 标本进行Perl's染色和特殊染色如MPO、PAS和网硬蛋白 (reticulin) 。根据抽吸和活检发现分析全血细胞减少原因, 分析重要参数如病因学、年龄、性别、临床发现、血液学参数、外周血像、骨髓抽吸和活检所见。
结果
研究对象年龄6~78岁, 10~30岁最多, 年龄70岁以上者最少。其中, 64%男性, 36%女性 (1.8:1) 。再生障碍性贫血是最多见的原因, 其次是幼红细胞增生、巨幼红细胞贫血。其他原因包括急性白血病、骨髓纤维化、异形红细胞增生、淋巴肿瘤形成、缺铁性贫血。48%患者骨髓细胞过多, 34%骨髓细胞减少, 18%骨髓细胞正常。
48例细胞系增生患者中16例显示巨幼红细胞血像, 有明确用药史和输血史。外周血像最常见的是不均匀性红细胞异形。分叶过多的中性细胞和有核RBCs亦可见。网织红细胞计数1.0%~1.9%。
骨髓抽吸显示87%患者骨髓多细胞性, 23%正常细胞骨髓像;而活检显示100%患者细胞过多伴红系增生。骨髓抽吸标本应用Perls's Prussian蓝反应进行骨髓铁贮备分级, 63%患者铁贮备增加, 25%铁贮备正常, 12%铁贮备减少。铁贮备增多可能是由于慢性吸收障碍综合征或自身免疫障碍所致。
48例骨髓抽吸显示为红系增生者中20例为幼红细胞性红细胞生成, 其中6例进一步检查诊断为溶血性贫血。贫血原因:异形性贫血64%、正细胞贫血18%、小细胞贫血9%、大细胞贫血9%。网织红细胞计数0.5%~1.6%。骨髓抽吸检查显示87%患者正常细胞骨髓像。活检骨髓像6例显示细胞过多。骨髓铁贮备:增多91%、正常9%。
6例怀疑溶血性贫血。2例有黄疸病史, 4例血清胆红素升高及脾肿大。6例患者均有近期输血史。网织红细胞计数1.2~1.6%。骨骼抽吸显示细胞过多骨髓像及幼红细胞生成, 骨髓活检均为细胞过多及红系增生。4例患者G6PD酶缺陷。所有6例患者均显示铁贮备增多, 可能归因于多次输血。
14例患者表现为亚白血病样白血病, 年龄6~45岁, 男10例, 女4例。临床表现见发热100%, 乏力71.5%。其他包括体重减轻和出血倾向。体格检查:苍白100%, 肝脾肿大85.7%, 淋巴结肿大14.3%。网织红细胞计数0.5%~2.5%。外周血像显示异形71.4%、大细胞14.3%和小细胞14.3%。
34例患者表现为细胞过少骨髓像。4例干抽经骨髓活检确诊。此34例中, 有26例再生障碍贫血。骨髓活检诊断显示骨髓脂肪组织增加和骨髓细胞结构减少, 骨髓内淋巴细胞和浆细胞相对增多。网硬蛋白染色显示所有病例均无纤维化。临床症状依次为乏力76.9%、发热61.5%、体重减轻23%、出血倾向15.4%。最多见的体征是苍白 (92%) 。2例可触及脾脏。网织红细胞计数0.5%~3.2%。23%的患者网织红细胞减少。外周血像异形61.5%, 大细胞23%, 小细胞15.5%。34例中8例骨髓活检显示骨髓纤维化。
26例再生障碍性贫血显示细胞过少骨髓像患者中, 6例表明灶性细胞减少, 细胞结构25%~50%;20例患者细胞结构少于25%。所有患者网硬蛋白染色显示无纤维化。所有患者骨髓抽吸显示铁贮备增加, 即3级 (53.8%) 、4级 (38.5%) 与5级 (7.7%) 。对2例干抽经骨髓活检进行铁贮备检测。
讨论
全血细胞减少是一组涉及多系统的临床疾病状态。全血细胞减少的基础病因因地理环境不同而不同。全血细胞减少的最常见原因是再生障碍性贫血 (10%~52.7%) , 本研究进一步证明再生障碍 (26%) 为重要原因, 最多见的主诉是发热和出血倾向。苍白是常见体征, 其次是肝和脾脏肿大。外周血像显示多叶白细胞和异形细胞增生最多见。外周血细胞涂片和骨髓检查是诊断巨幼细胞贫血的重要诊断工具, 与抽吸和活检高度相关。本研究中, 正常形态红细胞增生约18%, 与其他研究相似[1]。正常形态红细胞增生与全血细胞减少的关系尚不清楚。这些病例可能代表增生低下/再生障碍演变的某一时相, 可能是难治性贫血的某些情况。这些组的鉴别标准仍然有争议, 这些患者应保持定期血液学随访[2]。本研究中6例患者诊断溶血性贫血, 与临床所见、血液检查、骨髓抽吸和活检所见一致。黄疸病史见于66.7%的患者, 而肝和脾脏肿大占33.3%。6例患者增多表现为正常形态幼红细胞增生。研究显示脾脏机能亢进和全血细胞减少患者骨髓抽吸可以揭示潜在的血液恶性病变或感染过程。溶血性贫血出现可能是与DIC有关。自身免疫性疾病如Grave’s病、恶性贫血和乳糜泻, 亦可表现为全血细胞减少和相关自身免疫性溶血性疾病。6例患者均有明显的药物使用史。一些药物如头孢西丁可诱发溶血性贫血和全血细胞减少。医生就要想到药物诱发毒性, 应当监测这些患者的血细胞计数。评价患者溶血性贫血很重要, 应认真分析溶血的潜在病因。
本研究中34例患者骨髓抽吸表现低细胞骨髓像, 骨髓活检评价患者骨髓纤维化;其中, 26例诊断再生障碍性贫血, 8例骨髓纤维化, 骨髓纤维化可能是特发性或继发性。本研究中4例患者有明确药物史, 2例患者的HIV感染正在治疗, 另2例患者为类风湿性关节炎, 接受治疗。这几例患者可以作为继发性骨髓纤维化的代表, 停止用药可以缓解。轻微-严重纤维化患者的生存比较无纤维化者要差, 可增加非白血病性死亡, 并可增加演变为白血病的概率。因此, 骨髓纤维化分级具有预后价值。本研究中亦有1例再生障碍性贫血几个月后出现急性髓样白血病, 其白细胞计数正常。骨髓抽吸证实诊断而活检显示细胞过多骨髓像, 再生障碍性贫血转换为急性髓样白血病被认为是一种少见现象。
参考文献
[1]Addo GB, Amoako YA, Bates I.The role of bone marrow aspirate and trephine samples in hematological diagnosis in patients referred to a teaching hospital in Ghana[J].Ghana Med J, 2013, 47:75-78.
全骨髓法 篇3
关键词：血液疾病,造血机制,生理学分析
正常血细胞量的维持是它不断生成和不断破坏达到动态平衡的结果。PCP是指外周血象中红细胞、白细胞、血小板同时减少。常见于血液病, 亦可见于其他系统疾病, 涉及的病因可累及骨髓造血、造血原料缺乏、血细胞生成调控异常及外周血细胞成分破坏过多等。本文对全血细胞减少的病因进行了探讨, 并从发病机制等方面进行了生理学分析。
1 资料与方法
1.1 一般资料
275例全血细胞减少患者中, 男159例, 女116例, 年龄6~83岁 (中位年龄数45岁) 。
1.2 临床表现
头昏、乏力147例、发热53例、肝大18例、脾大34例、出血41例、淋巴结肿大25例、黄疸24例、胸骨压痛28例、双下肢肿12例、皮疹3例、酱油色尿9例。
1.3 骨髓穿刺并涂片
瑞氏染色分类200个有核细胞行形态观察, 同时进行铁染色和中性粒细胞碱性磷酸酶染色 (NAP) , 急性白血病标本加做过氧化物酶 (POX) 、苏丹黑B (SBB) 、非特异性酯酶 (NSE) 及氟化钠抑制 (NSE-NaF) 试验等细胞化学染色。有必要加做细胞免疫组化, 骨髓活检, 染色体, 融合基因检测。
1.4 诊断标准
全血细胞减少诊断标准:连续2次以上检查血红蛋白<100 g/L, 白细胞<4.0×109/L, 血小板<100×109/L[1];造血及非造血系统疾病参照全国统一标准[2]。
1.5 方法
对所有患者结合病史、体检、实验室检查、特殊检查, 按上述诊断标准明确诊断。对275例全血细胞减少疾病的病因进行回顾性临床分析和血细胞生理学分析。
2 结果
本组275例全血细胞减少患者中, 因造血系统疾病引起203例 (73.82%) , 其中包括再生障碍性贫血39例 (14.2%) , 急性白血病52例 (18.9%) , 骨髓增生异常综合征36例 (13.1%) , 巨幼细胞性贫血26例 (9.5%) , 淋巴瘤12例 (4.4%) , 多发性骨髓瘤9例 (3.3%) , 恶性组织细胞病1例 (0.36%) , 溶血性贫血21例 (7.6%) , evans综合征2例 (0.7%) , 缺铁性贫血3例 (1.09%) , 免疫相关性全血细胞减少2例 (0.7%) ;非造血系统疾病72例 (26.18%) , 其中包括:肝硬化17例 (6.18%) , 脾功能亢进15例 (5.45%) , 慢性肝炎3例 (1.09%) , 急性肝炎2例 (0.7%) , 系统性红斑狼疮11例 (4%) ;感染性疾病9例 (3.27%) , 骨髓象报告为反应性组织细胞增多症3例 (1.09%) , 恶性肿瘤12例 (4.36%) :其中肝癌5例, 胃癌4例, 乳腺癌2例, 前列腺癌1例。
骨髓细胞学检查骨髓增生明显活跃51例、活跃74例、低下39例;粒红比例增高11例、正常30例、减低5例。放射免疫法测叶酸降低17例、维生素B12降低9例;测定血清铁蛋白, 降低3例;酸溶血试验阳性4例;抗人球蛋白试验阳性14例, 糖水试验阳性5例。谷丙转氨酶升高17例, 乙肝病毒血清标志物阳性10例、肾功能异常5例, 骨扫描例示为骨转移癌4例。
3讨论
全血细胞减少 (PCP) 是一种较为常见的血液学现象, 而非一种独立的疾病。其原因是:
(1) 骨髓造血功能衰竭:正常造血取决于造血干细胞 (HSC) 及周围微环境细胞。抑制性T淋巴细胞异常扩增, 可引起HSC缺陷及克隆性异常, 基因缺陷可致HSC的诱导缺陷及破坏、骨髓间质的微环境衰竭、造血细胞生长因子的生成或释放异常以及骨髓的细胞或体液免疫受到抑制 (即免疫系统对骨髓的攻击) 等可对骨髓造血产生直接抑制和骨髓结构的破坏。如再生障碍性贫血 (AA) , 其原因为造血干细胞缺乏或缺陷、造血微环境的缺陷, 包括造血组织中支持造血的结构成分和造血的调节因素等缺陷以及造血干细胞的免疫抑制导致了骨髓造血功能衰竭, 最终表现为外周血三系减少。恶性肿瘤细胞对骨髓造血组织的破坏及其释放的各种细胞因子对造血的抑制也可造成骨髓造血功能减退或衰竭, 如乳腺癌。尸解材料证明, 60%~65%的血行转移到肺, 其余为肝、骨髓[3]。其引起PCP的机制是癌细胞骨髓转移, 破坏骨髓, 甚至导致骨髓坏死。
(2) 骨髓无效造血:骨髓无效造血为程度较轻的骨髓造血干细胞的异常克隆增生, 导致造血细胞及其前体细胞性质异常、成熟存在缺陷, 如骨髓增生异常综合征 (MDS) 。MDS是一组由1个异常的造血干细胞衍生的克隆性疾病, 某个恶变的细胞 (多为髓系干细胞, 也可为多能干细胞) 克隆性增生, 引起多能造血干细胞的癌基因异常表达, 致使由其所决定的相应蛋白质出现异常合成, 进而影响到该细胞的增殖与成熟的调控, 呈现出肿瘤克隆性扩展, 造成骨髓多能干细胞池的损害, 即骨髓内原始与较幼稚各种前体细胞的成熟缺陷, DNA合成期的细胞占进入细胞增殖周期细胞的比例减少, 虽然骨髓中前体细胞和早期祖细胞的增殖一般正常甚至是增加的, 但发生凋亡的晚期前体细胞数量明显增加, 从而呈现骨髓的2种乃至3种细胞系同时存在增生异常活跃, 但不能积聚形成足够数量的各细胞系列的成熟细胞, 导致病态的无效造血和PCP。
(3) 骨髓细胞的异常克隆增生:其抑制了骨髓正常造血功能导致正常细胞增生受抑。多见于克隆性髓细胞疾病和非髓细胞疾病。克隆性髓细胞疾病如急性髓细胞白血病、MDS;克隆性非髓细胞疾病如急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、恶性组织细胞病等。
多发性骨髓瘤引起PCP是由于骨髓瘤细胞异常克隆恶性增生, 抑制了骨髓正常造血功能, 导致正常细胞增生受抑;异常增高的免疫球蛋白, 扰乱了机体的体液免疫, 免疫功能紊乱。
恶性淋巴瘤引起PCP的原因是骨髓弥漫性肿瘤浸润, 肿瘤浸润脾脏, 脾脏肿大, 脾功能亢进, 全血细胞减少;免疫功能紊乱。
恶性组织细胞病引起PCP是因为原发肿瘤免疫抑制, 导致染色体异常, 异常组织细胞吞噬血细胞, 组织细胞及其前身细胞异常增生累及造血器官。
(4) 造血原料缺乏及利用障碍:造血原料指的是用以合成血红蛋白的铁, 以及参与DNA合成的叶酸, 钴胺素 (维生素B12) 。在幼红细胞的发育成熟过程中, 细胞核的存在对于细胞分裂和合成血红蛋白有着重要的作用。合成细胞核的主要构成物质—DNA必须有维生素B12和叶酸作为辅酶。维生素B12和叶酸缺乏, 使DNA合成受阻, 细胞发育停滞在S期, 有丝分裂迟缓, 此时细胞生成发育成熟、功能均异常, 这种幼稚细胞寿命均缩短, 在骨髓中早期死亡, 不仅在红系, 粒系、巨核系均有影响, 所以当叶酸、维生素B12缺乏到一定程度时即表现为全血细胞减少, 如巨幼细胞贫血。铁缺乏导致血红蛋白合成障碍所致的是缺铁性贫血, 铁还参与调控血细胞的分化增殖、成熟等, 因此, 重度缺铁性贫血及巨幼贫时, 三系细胞减少[4]。胃癌患者营养差, 常伴上消化道出血, 细胞内维生素B12和叶酸缺乏, 骨髓有核细胞分裂不能顺利进行, 在三系出现形态和功能上均异常的巨幼细胞, 造成三系无效生成。
(5) 血细胞破坏过多:按其破坏的场所可分为髓内和髓外, 均与免疫调节的失控密切相关。生理情况下, 机体的细胞和体液免疫参与造血调控, 亏促盈抑, 维持血细胞在正常水平, 当免疫功能失调, 特别是对造血系统的负调控亢进时, 抑制血细胞生成或破坏不同阶段的血细胞, 而导致全血细胞减少。髓内的血细胞破坏活动机制与免疫调节的失控相关, 特别是对造血系统的负调控亢进, 抑制血细胞生成或破坏不同阶段的血细胞, 临床上表现为不同类型的免疫相关性全血细胞减少症。感染性疾病, 由于病原体对淋巴细胞的过度激活, 从而导致免疫损伤, 使得炎症性细胞因子释放, 刺激组织细胞和吞噬细胞增多, 导致骨髓内造血细胞被破坏, 最终出现外周全血细胞减少。髓外的血细胞破坏如肝癌、肝硬化引起的脾功能亢进、系统性红斑狼疮、evans综合征等。脾亢后, 血细胞易于在脾脏中被过度滞留和破坏, 可以是免疫性的或是吞噬细胞的作用及机械性的破坏, 从而产生血细胞减少的症状。肝脏的库普弗细胞亦能引起血细胞的破坏, 但不如脾功能亢进时的破坏明显。
(6) 造血系统被癌细胞浸占:如急性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤。
(7) 促红细胞生成素:红细胞生成素 (EPO) 是一种由肾脏合成的糖蛋白, 在肝细胞和巨噬细胞也有少量合成, EPO主要作用是促进晚期红系祖细胞的增殖、分化, 以及幼红细胞的成熟, 加速网织红细胞的释放以及提高红细胞膜抗氧化酶的活性等。部分AA患者的红系祖细胞促红细胞生成素受体有缺陷所致。
尽管引起外周血PCP的疾病很多, 如果熟悉机体造血的生理机制, 从而了解这些疾病的发病机制, 根据详细的体格检查和病史询问, 再结合各种实验室检查如骨髓穿刺、活检, 骨髓影像学、流式细胞术、细胞遗传学检查等, 必能对外周血全血细胞减少症作出正确的诊断。
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全骨髓法 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料
55例中男33例, 女22例, 年龄60～81岁, 平均 (67.3±5.5) 岁;其中11例>70岁老年人全血细胞减少依据文献进行判断[1]。55例老年人全血细胞减少的主要病因及临床表现见表1。
1.2 方法
55例全血细胞减少疾病的老年患者, 均在治疗前首次骨髓穿刺作骨髓细胞学检查, 并通过细胞化学染色如中性粒细胞碱性磷酸酶 (NAP) 染色、铁染色、过氧化物酶 (POX) 染色作辅助手段, 符合诊断标准[2]。
注:MgA:巨幼细胞性贫血;AL:急性白血病;MDS:骨髓增生异常综合征;HPS:噬血细胞综合征;IDA:缺铁性贫血;脾亢:脾功能亢进
2 结果
2.1 55例老年人全血细胞减少血象检查结果
见表2。
2.2 55例老年人全血细胞减少骨髓细胞学检查结果
骨髓象特征为:各阶段有核红细胞均有明显巨幼改变, 成熟红细胞体积增大, 细胞内铁为 (83.6±16.1) %;粒系见巨晚幼、巨杆状及分叶过多, 粒细胞白血病细胞占 (48.2±20.3) % (M5 4例, M7 2例, M2 1例, L2 2例) , 2例原始细胞分别为12%和16%, 同时可见小巨核细胞, 为MDS-RAEB;1例环铁34%, 为MDS-RAS, 1例红系明显病态造血, 为MDS-RA。组织细胞明显增多, 2例均见噬血组织细胞, 1例见幼稚组织细胞红细胞呈小细胞低色素改变, 细胞内铁分别为2%和8%, 细胞外铁阴性。3例粒系明显成熟停滞, 其中1例有巨核成熟停滞。骨髓分类未见明显异常。见表3。
表2结果显示, 全血细胞减少的血液系统疾病在其外周血涂片中可见特征性的细胞形态, 如MgA可见分叶过多粒细胞和大红细胞, AL和MDS可见数量不等的原始细胞, IDA则以小细胞低色素性红细胞为主。由于血象是骨髓象的继续, 仔细观察细胞形态并及时报告, 将为临床查找老年性全血细胞减少的病因提供最直接的参考依据。
3 讨论
全血细胞减少是指外周血中白细胞、红细胞、血小板减少, 是多种疾病造成的一种外周血血象改变, 除常见于造血系统疾病外, 也可见于其他系统的疾病。大部分患者均通过骨髓象检查查出。病因而作出诊断。根据不同地区的文献资料统计, 由造血系统疾病引起老年人全血细胞减少多占70%左右[3,4,5], 低者分别达59.0%和55.4%[6,7]。本组病例造血系统疾病占78.2%, 非血液疾病占21.8%, 与文献报道相近[3,4,5];统计还显示, 由于地区不同其主要病因亦存在较大差异。本组病例显示, MgA (41.9%) 和AL (16.4%) 是老年人全血细胞减少的主要病因, 其后依次为MDS、脾亢和HPS等, 与文献报道相似[5]。
本组病例MgA 23例 (41.9%) , 在病例统计中所占比例较高, 23例患者中, 由消化道疾病致MgA有13例, 其中萎缩性胃炎5例, 胃、十二指肠炎2例, 胃溃疡3例, 胃癌1例, 肠吸收不良1例, 肝脓肿1例;另外有心血管系统疾病5例;2型糖尿病3例;肺部感染和银屑病各1例。提示老年人MgA多有胃肠道原发疾病, 引起叶酸、VitB12吸收不良;而心血管系统和内分泌系统等疾病引起MgA, 可能是由于这些患者进食差, 叶酸、VitB12供给不足致DNA合成障碍及DNA复制速度缓慢, 导致细胞核发育障碍所致的骨髓三系细胞核浆发育不平衡及无效造血性贫血。
本组结果显示, 造血系统恶性疾病AL和MDS是引起老年人全血细胞减少的另一主要病因。AL患者表现为全血细胞减少, 其原因可能是一定程度正常干细胞原发性缺陷、血细胞生成过程中正常体液性调节因子的量和 (或) 质的异常、正常细胞成熟受白血病细胞和 (或) 由此种白血病细胞释放的抑制因子的抑制等因素所致, 确切的机制有待于更精确的实验进一步探索[8]。MDS致全血细胞减少可能是造血干细胞异常克隆增生, 抑制了骨髓正常造血功能, 导致正常细胞增生受抑。本组AL和MDS共13例 (23.6%) , 其中7例 (12.7%) 表现为骨髓增生减低, 提示老年人全血细胞减少的恶性血液病骨髓象以低增生为主, 且老年性AL中以M5较多见。我们知道, 大多数IDA仅有贫血, 本组2例IDA患者亦表现为全血细胞减少, 2例患者均为女性, 其中1例临床诊断为高血压性心脏病, 1例年龄75岁, 肝肾功能均正常, 推测可能是因年龄增大, 骨髓造血功能减退所致。12例非血液系统疾病中, 2型糖尿病2例, 肺癌、肺结核、肺部感染、肝癌、肝囊肿、病毒性肝损害、丙肝后肝硬化、肾功能不全、甲状腺肿和风湿性心脏病各1例, 提示这些疾病可继发全血细胞减少, 应引起高度重视。
由于老年人易患各种疾病, 原发病临床表现常不典型且与并发症常常交错。表1结果显示, 55例老年患者有不同程度发热25例 (45.5%) , 肝肿大10例 (18.2%) , 脾肿大19例 (34.5%) , 尚有少量淋巴结肿大和出血表现, 这些症状均以血液系统疾病多见, 因此在诊断老年性全血细胞减少时, 应特别注意临床表现和体格检查。
血常规检查是诊断全血细胞减少的基础, 在临床工作中, 如遇老年全血细胞减少的患者, 必须作血涂片分类并观察细胞形态。
骨髓细胞形态学检查是诊断造血系统疾病致全血细胞减少的最根本方法。表3结果表明, 通过骨髓细胞计数和细胞形态学观察, 对MgA、AL、MDS-RAEB可以作出肯定性诊断的。对IDA、脾亢、MDS-RA等可以作出提示性诊断或疑似性诊断。
综上所述, 本组由造血系统疾病引起的老年人全血细胞减少占78.2%, 其中以MgA为主占41.9%, 其次为血液系统恶性疾病 (AL和MDS) 占23.6%, 而血液系统疾病的诊断主要依靠骨髓细胞形态学检查。因此, 笔者建议:临床实验室一旦发现老年性全血细胞减少, 不能仅仅依靠血液分析仪, 必须作血涂进行分类计数并仔细观察细胞形态变化;临床医生从检验结果获得全血细胞减少信息和血细胞形态变化特征后, 应详细询问病史和体格检查, 凡遇全血细胞减少并有发热、肝肿大、脾肿大、淋巴结肿大、出血等老年患者, 应该尽快作骨髓细胞形态学检查, 做到早诊断、早治疗, 有利于改善老年人全血细胞减少患者的预后和提高老年患者生活质量。
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全骨髓法 篇5
1资料与方法
1.1基本资料:选取2013年1月至2014年12月我院收治的92例全血细胞减少性疾病患者作为研究对象,其中男性患者52例,女性患者40例,患者的年龄16~81岁,平均年龄为(41.27±7.92)岁。患者白细胞的含量为(0.8~3.9)×109个/L,平均为(2.2±1.2)×109个/L;血红蛋白含量为21~100 g/L,平均为(51.8±21.2)g/L;血小板含量为(6~98)×109个/L,平均为(39.7±31.2)×109个/L。
1.2诊断标准:血常规检查时,有2次或2次以上患者的白细胞含量低于4×109个/L,血红蛋白含量低于100 g/L,血小板含量低于100×109个/L,则可以认为患者血液中的白细胞、红细胞以及血小板均出现了异常的减少,可初步诊断为全血细胞减少性疾病[4]。
1.3方法:使用希森美康XT4000i全自动血细胞分析仪对血液中的白细胞、红细胞以及血小板的数量进行计数,采集患者外周全血作为血液标本,制作血片,对血细胞的形态进行观察。在患者的髂后上棘处进行穿刺,采取反吸法收集患者的骨髓,并将骨髓制作成均匀厚度的骨髓片,厚度约为1.0~1.5 mm,对骨髓片进行染色处理,并置于油镜下进行观察[5]。询问患者是否有相关疾病史,询问患者的药物使用情况。根据患者的具体情况,选择是否对患者进行体格检查、实验室检查以及骨髓活检。
2结果
2.1病因分析:92例患者中,65例患者的病因是造血系统疾病,所占比例为70.7%;27例患者的病因是非造血系统疾病,所占比例为29.3%。造血系统疾病引起的全血细胞减少性疾病中,有20例患者是由再生障碍性贫血引起的,所占比例为21.7%;14例患者是由急性白血病引起的,所占比例为15.2%;8例患者是由巨幼细胞贫血引起的, 所占比例为8.7%;9例患者是由骨髓增生异常综合征引起的,所占比例为9.8%;4例患者是由脾功能亢进引起的,所占比例为4.3%;3例患者是由溶血性贫血引起的,所占比例为3.3%;3例患者是由原发性的骨髓纤维化引起的,所占比例为3.3%;2例患者是由多发性骨髓瘤引起的,所占比例为2.2%;1例患者是由血小板减少性紫癜引起的, 所占比例为2.2%。非造血系统疾病引起的全血细胞减少性疾病中, 有10例患者是由肝性贫血引起的,所占比例为10.7%;10例患者是由炎性疾病引起的,所占比例为10.7%;3例患者是由结缔组织疾病引起的,所占比例为3.3%;1例患者是由骨髓转移癌引起的,所占比例为1.1%;其余3例患者的病因尚未明确,所占比例为3.3%。对病因未明确的患者进行其他检查,诊断其为免疫相关性疾病。
2.2骨髓细胞学特征:造血系统疾病引起的全血细胞减少性疾病患者有65例,有37例患者的骨髓的增生活跃性升高,所占比例为56.9%; 28例患者的骨髓增生活跃性降低,所占比例为43.1%。患者的骨髓细胞形态均出现异常,中性粒细胞、红细胞以及巨噬细胞均出现病态造血情况。
非造血系统疾病引起的全血细胞减少性疾病患者有27例,有20例患者的骨髓的增生活跃性升高,所占比例为74.1%;7例患者的骨髓增生活跃性降低,所占比例为26.9%。患者的骨髓细胞形态均呈感染骨髓象。
3讨论
全血细胞减少性疾病病因复杂,通常可分为造血系统疾病和非造血系统疾病。本次研究选取的92例患者中,65例患者的病因是造血系统疾病,所占比例为70.7%,27例患者的病因是非造血系统疾病, 所占比例为29.3%。在对疑似为全血细胞减少性疾病的患者进行诊断时,应对患者的病史、用药情况进行仔细的询问,对患者进行全面的体检,还应对患者进行实验室检验,骨髓细胞的检验十分重要,不可忽视。对患者进行骨髓细胞学检验,能够对患者的骨髓增生情况进行明确[6],能够了解患者骨髓细胞是否出现异常,通过对骨髓细胞进行染色,从而确定其是否出现异常[7]。以骨髓细胞检验结果为依据,并综合考虑患者的临床检查,对患者进行诊断,能够避免误诊、漏诊的发生。
综上所述,引起全血细胞减少性疾病的因素主要为造血系统疾病,但在进行诊断时不能忽略非造血系统疾病因素。骨髓细胞学检验对诊断全血细胞减少性疾病具有较高的临床价值,能够为全血细胞减少性疾病的诊断提供可靠的依据,具有重要的参考价值。
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全骨髓法 篇6
关键词：补肾解毒活血法,环磷酰胺,骨髓抑制,小鼠,血细胞,骨髓有核细胞,造血祖细胞
化疗是恶性肿瘤治疗的主要手段之一,但由于化疗引起的骨髓抑制限制了化疗用药剂量和治疗节奏,影响了治疗效果,并容易引起严重感染、出血等并发症,严重影响患者生存质量并威胁患者生命。近年来出现的各种细胞集落刺激因子,虽然具有见效快、有效率高、应用普遍等优点,但费用高昂、副作用多、效果不持久。中医学多将化疗后骨髓抑制归于脾肾两虚、气血不足[1,2],临床多以益气补血为主要的治疗方法,但疗效还不尽理想。笔者在多年临床实践中体会到在补肾基础上配合解毒活血药效果会更好,但其作用机制不明,相关的实验研究也罕有报道。本实验观察了补肾解毒活血法对环磷酰胺诱发骨髓抑制的影响,并对其作用机理作了初步探讨。
1 材料
1.1 动物
SPF级昆明种小鼠60只,雌雄各半,体重18~22 g,由军事医学科学院实验动物中心提供,常规饲养,动物合格证号:SCXK(军)2007-004,生产条件许可证:SYXK(军)2007-004。
1.2 主要试剂与仪器
MethoCult®03534培养基和MethoCult®03334 培养基(加拿大StemCell Technologies公司);电热恒温培养箱:DH4000A(天津泰斯特);超净工作台(北京昌平空气净化公司);Napco-5410 CO2细胞培养箱(shelden公司);光学显微镜OLYMPUS(日本);Sysmex-820自动血细胞计数仪(日本);注射用环磷酰胺,产品批号10012621,规格0.2 g(江苏恒瑞医药股份有限公司)。
1.3 中药
补肾解毒活血中药由熟地10 g、何首乌10 g、肉苁蓉10 g、苦参10 g、白花蛇舌草10 g、川芎15 g、当归10 g、丹参15 g组成,共计90 g/d。按《中药药理研究方法学》[3]计算小鼠的等效剂量为0.36 g·kg-1·d-1。以上药物均由解放军总医院中药房提供,经鉴定后,水煎、过滤、浓缩、配制成含生药1 g/ml的药液,置4 ℃保存备用。
2 方法
2.1 模型制作
小鼠常规饲养3天适应环境后,观察无异常者,于次日按100 mg/kg剂量腹腔注射环磷酰胺,连续3天,制成骨髓抑制模型小鼠。
2.2 分组与给药
实验分空白对照组、模型组、中药治疗组。造模完成后次日开始灌胃给药,中药治疗组给予补肾解毒活血中药汤液,空白对照组和模型组分别给予等体积的生理盐水,连续10天。
2.3 外周血细胞分析
每组随机抽取10只,于造模前1天及造模后第1、3、5、7、10、14天,每只实验小鼠尾静脉取血20 μl,用Sysmex-820自动血细胞计数仪检测外周血细胞。
2.4 骨髓有核细胞计数及造血祖细胞培养
制模后第11天,颈椎脱臼处死小鼠,剥取股骨,用6号针头以PBS冲出骨髓细胞,再用4号针头过滤制成单个骨髓细胞悬液,在显微镜下按白细胞计数法进行骨髓有核细胞计数。按文献方法[4]进行集落培养,检测小鼠骨髓粒细胞-巨噬细胞集落生成单位(CFU-GM)、 红细胞爆裂型集落生成单位(BFU-E)、定向体外红系集落形成单位(CFU-E)的生成能力。
2.5 统计学处理
运用SPSS 17.0统计学软件统计,各组实验数据以均值±标准差
3 结果
3.1 补肾解毒活血汤对血虚小鼠外周血象的影响
外周血白细胞(WBC),模型组在造模后第1天降到最低点,与空白对照组相比差异有非常显著性意义(P<0.01),造模后第3天仍低于空白对照组,至第5天恢复正常,但在第7天时出现明显高于正常组的“反跳”现象,而中药治疗组在造模后第3天虽低于空白对照组(P<0.01),但明显高于模型组(P<0.01),第5天恢复正常且保持稳定。见表1。
外周血血小板(PLT),模型组在造模后第5天降到最低然后回升,至第10天达到正常,而中药治疗组自第3天即开始回升,第7天时即与空白对照组持平,且其最低值明显高于模型组(P<0.01)。见表2。
各组红细胞变化不明显,故省略表。
3.2 补肾解毒活血法对骨髓抑制小鼠骨髓有核细胞计数和造血祖细胞集落的影响
结果显示模型组小鼠BMNC和CFU-GM、CFU-E、 BFU-E计数较空白对照组均明显减少(P<0.01),经补肾解毒活血中药汤液治疗后,小鼠BMNC计数和CFU-GM、CFU-E、 BFU-E较模型组明显增多(P<0.01)。
4 讨论
机体造血主要依靠造血祖细胞来扩增。造血祖细胞在多种造血因子的调控下进一步增殖分化 ,不断发育形成各种成熟血细胞[5]。当受到化学药物等损伤时,即会发生造血功能障碍,其主要原因之一是杀伤了赖以维持造血功能的造血干/祖细胞[6],这是化疗药引起骨髓造血功能下降及外周血细胞减少的主要原因。各种血细胞对化疗药物的敏感性取决于它们的半衰期长短[7]。白细胞半衰期最短6小时,故最易受到抑制,引起白细胞减少;血小板半衰期为5~7天,亦较易引起减少;而红细胞半衰期长达120天,因此红系祖细胞数目减少常不易从外周血红细胞中表现出来。
注: 与空白对照组比较aP<0.05,bP<0.01;与模型组比较cP<0.05,dP<0.01。
注: 与空白对照组比较aP<0.05,bP<0.01;与模型组比较cP<0.05,dP<0.01。
注: 与空白对照组比较aP<0.05,bP<0.01;与模型组比较cP<0.05,dP<0.01。
中医学认为血液的生成与心、脾、肾等多脏腑有关,其中与肾的关系最为密切。因肾藏精,主骨生髓,精髓化生血液。即《景岳全书》中“肾为水脏,主藏精而化血”。《张氏医通》中亦有“血之源头出于肾”之说。因此补肾法是临床常用的治疗化疗后骨髓抑制的方法。但临床上单用补肾法治疗常难以获得预期疗效,结合该病的临床表现和临床治疗经验,笔者认为化疗药物为热毒之品,邪毒内侵,热毒内蕴,瘀阻骨髓脉络,导致气血瘀滞,因此在补肾法的基础上结合解毒和活血法治疗本病,才能达到邪去而元气自复,瘀去而气血畅通的效果。方中熟地甘温,补血养阴,填精益髓,善补肾阴,为补肾阴之要药,《本草纲目》称其能“填骨髓,长肌肉,生精血,补五脏内伤不足”,何首乌补肝肾、益精血,治血虚萎黄。《本草纲目》谓其能养血益肝、固精益肾。肉苁蓉甘温助阳,为补肾阳、益精血之良药,三药平补肾之阴阳,药性平和,为补肾之良药。苦参苦寒,能清热燥湿解毒,白花蛇舌草也有较强的清热解毒作用,清除蕴积于体内的邪热和毒邪。川芎活血行气为血中之气药,当归补血活血,丹参活血调经,祛瘀止痛,即“一味丹参散,功同四物汤”。三药活血化瘀而生新,共同达到治疗骨髓抑制的效果。
表1、表2表明,中药治疗组可以促进WBC的恢复,且相对于模型组来说其恢复过程较稳定;效果更为明显的是,中药治疗组血小板降低幅度小、持续时间短,因而提示补肾解毒活血法尤其能提高环磷酰胺所致骨髓抑制情况下的血小板再生。表3表明,环磷酰胺可以引起红系、粒系造血功能的下降,但由于红细胞半衰期长达120天,本实验外周血中未出现明显变化,而补肾解毒活血法可显著升高BFU-E、CFU-E和CFU-GM集落产率,从而促进红系和粒单系造血能力的恢复。这可能是其治疗化疗后骨髓抑制的有效环节。
本实验还发现,该种造模方法动物恢复快,引起的骨髓抑制持续时间短,而由于中药作用时间长、起效慢,因而难以很好地反映出中药防治化疗后骨髓抑制的比较优势;另一方面,由于红细胞半衰期长达120天,本实验中未出现明显变化,临床上反复化疗而引起的贫血也未出现,故有必要考虑进一步改进造模方法。
综上所述,本实验结果提示补肾解毒活血法治疗骨髓抑制可通过增加骨髓造血祖细胞数量,从而促进环磷酰胺致骨髓抑制小鼠外周血WBC、PLT的稳定恢复。
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全骨髓法 篇7
目前, 对于骨髓间充质干细胞 (MSCs) 全抗原对于肿瘤预防免疫应激的研究尚无报道。MSCs属于成体干细胞, 存在于骨髓基质中可向三个胚层组织进行诱导分化, 取材简单、培养容易, 且其研究及临床运用均不存在伦理争议[5]。本研究采用MSCs为目的瘤苗制备WCAs, 分次对小鼠进行预防接种后进行以人肺腺癌A549细胞荷瘤造模, 观察肿瘤生长情况并初步探索分子机制。
1 材料与方法
1.1 主要仪器
倒置显微镜 (日本Olympus公司) ;荧光定量PCR仪 (日本TOYOBO东洋纺定量PCR仪器型号:Biored IQ5) ;凝胶成像系统 (美国Protein Simple公司) ;低温高速离心机 (美国Beckman公司) 。
1.2 实验动物与主要试剂
BALB/c野生小鼠 (军事医学科学院) ;RPMI-1640、低糖型培养基 (DMEM) (美国Hyclone公司) ;胎牛血清 (美国Hyclone公司) ;胰白酶干粉 (美国Sigma公司) ;10×多聚赖氨酸 (北京中杉公司) ;胶考马斯亮蓝 (美国Sigma) ;BCA蛋白浓度测定药盒 (PIERCE公司) ;丙烯酞胺 (美国Sigma) ;甲又丙烯酞胺 (美国Sigma) ;Tris碱 (上海生工生物技术公司) ;一抗antiPCNA, anti-Ki-67 (美国Santa) ;二抗-辣根 (北京中杉公司) 。
1.3 实验方法
1.3.1 MSCs培养、鉴定及A549培养
①MSCs:全骨髓贴壁法培养MSCs, 6周小鼠的股骨和胫骨, 以10%胎牛血清 (FBS) -低糖DMEM冲出骨髓, 直接接种在培养瓶里, 24~48 h后去悬浮, 再接下来的每3~4天换液, 直到需要传代。②人肺腺癌A549细胞:从液氮罐中取出A549细胞冻存管, 放入37℃水浴锅中解冻, 1000 r/min离心5 min, PBS吹打清洗重新离心后, 以10%FBS+5%RPMI-1640培养, 每2~3天换液, 直到需要传代。
1.3.2 MSCs全细胞抗原制备、免疫应激BALB/c小鼠及实验分组
X线照射裂解法获得抗原, 具体如下调整3~5代A549细胞密度为1×106, 接种于培养皿中行X线照射, 照射强度为15 Gy;照射后的抗原4℃保存不超过6 h。获得WCAs后, 根据是否接受抗原刺激将BALB/c小鼠随机分成两组, 每组各24只;其中实验组小鼠每3天接受1次皮下注射瘤苗应激 (抗原液加PBS共2 m L) , 2周后 (共5次) 进行肿瘤荷瘤造模。对照组小鼠每3天接受1次皮下注射2 m L的PBS, 同样2周后行荷瘤造模。
1.3.3 A549皮下移植造模及肿瘤测量
获得复苏后3~4代A549细胞, 调整细胞密度为1×106接种小鼠上肢下方 (腋窝下) 皮肤, 接种后分别于第3、5、7、15、21、30天观察肿瘤增长情况;处死小鼠后, 取下肿瘤组织, 测量最长径与最短径, 计算肿瘤体积, 公式为公式V=2πab/6 (a为长径, b为短径) 。
1.3.4 Western blot检测PCNA、Ki-67蛋白表达
接种后第7、30天, 提取细胞总蛋白, 紫外分光光度计检测蛋白浓度后将蛋白上样, 以堆积胶80 V, 分离胶120 V, 电泳时间90 min;移入玻璃皿中加入Coomassie染色液2 h后脱色;再转至PVDF膜上, 5%脱脂奶粉封闭1 h, 一抗孵育, 一抗的封闭液稀释为1∶20, 同时抗人GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶) 单克隆抗体作为阳性对照, 其封闭液稀释为1∶1000。室温作用2 h, TBST冲洗5 min×4次;辣根酶标记二抗, 封闭液稀释为1∶2000, 室温1 h后TBST冲洗;定影、显影。结果用数码相机摄取并用NCBI的Melanie Viewer 7.0软件分析进行图像分析, 测定各个条带的灰度值, 将SIRTI条带灰度值与其相应的GAPDH条带灰度值相比较, 每组所得数值求均数。
1.3.5 Real-time PCR检测PCNA、Ki-67 m RNA表达
接种后第7、30天, 提取细胞总RNA提取, 所得RNA溶解于DEFC水中;紫外分光光度计测定总RNA浓度取2μL总RNA稀释至600μL, 测260处光密度OD值, RNA浓度 (μg/m L) =OD×300×40。加入逆转录及PCR扩增反应体系。扩增过程:取2μL模板, 在25μL PCR扩增反应体系中先将模板于97℃, 2 min, 加入Taq DNA聚合酶, 循环仪中循环35次。PCR扩增条件及引物见表1。反应完成后, 取10μL PCR反应液在1.5%琼脂糖凝胶中电泳分离, EB染色后照相, 软件系统扫描。以目的m RNA扩增带的平均光密度对GAPDH m RNA扩增带平均光密度的比值代表组织中目的m RNA的表达水平。
注:PCNA:增殖细胞核抗原;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差 (±s) 表示, 两组间比较采用t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MSCs形态
原代接种1 d即可见较多贴壁细胞, 外观呈纺锤形和多角形, 并可见细胞核, 48~72 h后细胞数量明显增多, 呈现纤维长条样梭型细胞;图1示不同放大倍数下MSCs的形态, 可看到不甚均一的梭型排列的细胞, 400倍镜下可见到有部分细胞细胞核内有双核仁。
在倒置显微镜下MSCs多呈纺锤形和多角形, 部分细胞呈现纤维长条样梭型细胞, 400倍镜下可见部分MSCs的细胞核内有双核仁, 提示细胞增殖活跃, 细胞状态良好
2.2 移植瘤体积及其增殖曲线评估
分别对两组小鼠的肿瘤进行测量, 首先评估体内肿瘤增殖情况, 如图2所示, 实验组皮下移植肿瘤明显小于对照组;进一步解剖获得肿瘤, 分别测量两组肿瘤的最长径与最短径计算出其体积, 第3天时, 对照组移植瘤的短径及长径均大于实验组, 但是差异无统计学意义 (P>0.05) , 然而自第5天开始, MSCs抗原进行预防接种, 实验组其短经与长径都小于对照组 (P<0.05) ;第3、5、7、15、21、30天实验组体积均明显小于对照组 (P<0.05或P<0.01) , 见表2。并进一步获得其增殖曲线, 发现实验组的增殖趋势明显低于对照组。
注:与对照组同期比较, *P<0.05, **P<0.01
实验组皮下移植肿瘤明显小于对照组;实验组体积明显小于对照组, 增殖趋势明显低于对照组
2.3 MSCs全细胞瘤苗抗原对PCNA及Ki-67的影响
MSCs作用后, 肿瘤组织的PCNA及Ki-67的表达都明显下调, 本研究检测了7、30 d的PCNA与Ki-67的表达, 可见在蛋白水平及m RNA水平PCNA与Ki-67的表达, 实验组显著低于对照组, 差异均有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。见表3、图3~4。
注:与对照组同期比较, *P<0.05, **P<0.01;PCNA:增殖细胞核抗原
与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01;PCNA:增殖细胞核抗原;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶
与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01
3 讨论
肿瘤免疫治疗源于Burnet提出的“肿瘤免疫监视”理论, 认为机体的免疫系统能够通过细胞免疫机制识别并产生免疫应答。研究表明, 该种免疫应答的机制十分复杂, 涉及多种免疫细胞及其分泌的产物, 包括T淋巴细胞、NK细胞、NC细胞和巨噬细胞等免疫细胞介导的特异或非特异的细胞免疫, 抗体介导的体液免疫以及补体、细胞因子的抗肿瘤作用[6];因此, 探索有效、安全的应激源即“识别”是免疫治疗的基础[7]。
肿瘤的胚胎特性的认识由来已久, 并且二者在增殖分化、侵袭、血管侵蚀和新生血管形成、免疫逃逸及细胞凋亡等诸多方面具有惊人的相似性[8]:二者表达相同的表面抗原, 即癌胚抗原 (carcino-embryonic antigens, CEA) , 在肿瘤状态时会使得机体一些机体发育过程中许多原本“关闭”的基因激活, 可重新生成和分泌这些胚胎期的蛋白如甲胎蛋白、CEA、FSA等[9,10]。正是基于此, 研究者开始探索干细胞与肿瘤的关系。大量研究, 在多种实体肿瘤中都存在少数具有干细胞特性即自我更新能力和多向分化潜能的细胞亚群, 这种细胞亚群被称为肿瘤干细胞, 其对肿瘤形成、复发、转移及化疗耐药性都有着重要影响[11]。2009年, Li等[4]创新性地发现以胚胎干细胞体外制作瘤苗可以起到抑制肿瘤增殖的作用, 这项研究也使得人们在瘤苗探索的道路上多了新的思路, 即干细胞可以作为瘤苗来源。那么, 除了胚胎干细胞别的干细胞是否具有类似的作用呢?
本研究首次评估了MSCs作为瘤苗具有肿瘤免疫接种作用。笔者以X线照射MSCs获得裂解抗原, 每周3 d一次给予BALB/c小鼠皮下接种, 连续4周获得瘤苗应激模型;再以GFP-A549皮下注射对其进行荷瘤造模, 并设置第3、5、7、15、21、30天观察肿瘤增殖情况, 本研究发现瘤苗接种组从第3天开始其肿瘤体积小于对照组, 并且随着时间的延长, 其差别愈发明显, 说明疫苗应激产生的抑瘤作用可能是长期的。Li等[4]采用胚胎干细胞系H9获得疫苗, 观察其免疫刺激后荷瘤的增殖情况, 同样发现自第3天开始其免疫应激的抑瘤作用开始凸显;又有学者比较胚胎干细胞瘤苗对于不同数量的腺瘤细胞移植后肿瘤增殖的影响, 发现无论移植初始细胞计量多少, 干细胞瘤苗均可以产生明确的抑瘤作用[12]。
PCNA由Miyachi等[13]于1978年在系统性红斑狼疮患者的血清中首次发现并命名, 因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名;Mathews等[14]发现PCNA与细胞周期蛋白 (Cyclin) 属于同一物质, 并与细胞增殖程度直接相关;后来人们在乳腺癌、肺癌、肝癌、大肠癌等多种肿瘤中都监测到PCNA表达的上调[15,16];总之, 在不同的调控通路中, PCNA可以作为多种蛋白的功能转换因子发挥作用。在细胞增殖、分化及凋亡事件中, PCNA都参与了十分重要的角色, 尤其是反映细胞增殖状态的良好指标。Ki-67是一种大分子蛋白质, 存在于细胞核内, 1993年, 学者得出其氨基酸序列[17], 发现其包含有40个弱的和10个强的PCST区 (富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸) ;研究显示, Ki-67与细胞增殖至关重要, 可以用来识别生长中的正常和肿瘤细胞, 评估细胞的增殖程度, 但对静止期的细胞无作用, 故Ki-67已成为细胞增殖的标志之一;研究者发现Ki-67的作用是在有丝分裂过程中有维持DNA规则结构的重要作用, 是具有结合特性的重要的结构蛋白, 在细胞增殖过程中不可缺少[18];研究已经证实其在乳腺癌[19]、肺癌[20]、结直肠癌[21]等几乎所有的恶性增殖的肿瘤中都高表达。
因此, 为了初步评估MSCs瘤苗用于A549的接种的分子机制, 本研究检测了第7、30天接种组和对照组肿瘤增值因子PCNA及Ki-67的蛋白及m RNA表达情况。正如本研究结果中描述的一样, 瘤苗应激刺激后无论蛋白水平和RNA水平, PCNA及Ki-67的表达都显著下调, 从而推测, 瘤苗可能由于免疫状态的改变下调了抑制瘤的增殖活性, 从而抑制了移植瘤的增殖。当然, 细胞的免疫通路纷繁复杂, 其内在的具体的分子通路及免疫机制有待进一步深入研究。
摘要：目的 观察骨髓间充质干细胞 (MSCs) 的全细胞抗原 (WCAs) 对人肺腺癌细胞株A549荷瘤的影响, 并探讨肿瘤相关增殖抗原的改变揭示其可能的抑制机制。方法 全骨髓贴壁法原代培养小鼠MSCs, 取3~5代MSCs以15 Gy X线灭活获取WCAs, 将BALB/c小鼠随机分成实验组和对照组, 每组各24只。实验组皮下接种WCAs (1次/3 d, 共2周) , 获得免疫接种小鼠模型, 对照组皮下注射同体积的磷酸缓冲液。观察两组小鼠肿瘤生长情况, 测量肿瘤直径、计算肿瘤体积, 并于接种后第7 (Day7) 、30天 (Day30) 行Western blot及实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测增殖细胞核抗原 (PCNA) 及Ki-67因子的蛋白及mRNA水平。结果 肺腺癌A549细胞皮下移植成功使小鼠荷瘤, 实验组小鼠的肿瘤体积显著小于对照组 (P<0.05) ;实验组PCNA蛋白水平显著低于对照组[Day7: (6.42±0.54) 比 (18.67±0.96) , P<0.01;Day30: (2.12±0.14) 比 (4.32±0.25) , P<0.05];PCNA mRNA水平低于对照组[Day7: (11.64±0.28) 比 (25.18±1.37) , P<0.01;Day30: (2.11±0.18) 比5.69±0.41) , P<0.01];实验组Ki-67蛋白水平显著低于对照组[Day7: (1.57±0.51) 比 (4.84±0.23) , P<0.05;Day30: (2.75±0.28) 比 (5.66±0.19) , P<0.01];Ki-67 mRNA水平也明显下调[Day7: (2.12±0.43) 比 (5.94±1.03) , P<0.01;Day30: (3.71±0.72) 比 (8.62±0.35) , P<0.01]。结论 采用MSCs获得全细胞抗原进行免疫应激可产生抑制肿瘤生长作用, 其机制可能与及肿瘤增殖相关因子PCNA、Ki-67的下调有关, 其内在的免疫分子机制有待深层次的探索。