骨髓间充质干细胞移植

骨髓间充质干细胞移植（精选10篇）

骨髓间充质干细胞移植 篇1

脑卒中是危害人类生命健康的重要疾病之一,每年新发患者约150万,其中75%丧失劳动力,40%中度致残[1]。随着医疗水平的提高,脑卒中后患者的存活率明显升高,但多遗留有躯体运动功能、语言功能、智力、心理及社会认知等方面的残障。目前常规的脑卒中治疗包括急性期的手术治疗、保守的对症治疗以及康复期的物理治疗和功能康复锻炼。干细胞移植是目前神经再生与修复的热点,本研究探讨骨髓间充质干细胞移植对脑卒中0.5年之后所遗留后遗症的临床疗效。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将2011年8月-2012年8月辽宁医学院附属第一医院神经外科就诊的35例脑卒中后遗症患者随机分为移植组和对照组,移植组20例患者,移植组男性17例,女性3例,年龄16～48岁,平均为(29.50±9.43)岁;对照组男性11例,女性4例,年龄18～50岁,平均(30.93±16.93)岁。两组患者平均年龄和性别构成的差异不具有统计学意义(P>0.05),提示一般情况均衡。病例入选标准:(1)年龄<80岁;(2)无意识障碍、颅内感染、高敏体质;(3)病程1年以上;(4)患者及家属同意,并经伦理委员会批准;(5)无心、肝、肾和其他脏器严重的功能伤害;(6)不伴有癫痫。

1.2 方法

1.2.1 骨髓间充质干细胞的制备

术前签署抽取骨髓同意书,排除异常后抽取骨髓20 mL与肝素2 mL混匀后立即送无菌细胞室,严格无菌条件下进行BM-MSCs培养。采用密度梯度离心法,结合贴壁筛选法分离BM-MSCs:用含10%胎牛血清的DMEM重悬细胞,接种于75 cm2培养瓶中,在37℃、5%CO2培养箱中培养,多次换液可达到分离纯化的目的。待贴壁细胞铺满瓶底85%时,用2.5%的胰蛋白酶消化,按1:3进行传代、纯化,流式细胞仪鉴定BM-MSC备用。

1.2.2 移植方式

常规检查排除手术禁忌证后,选取皮下静脉穿刺,将100m L干细胞混悬液缓慢滴入静脉。每隔5-7天移植1次,连续行3次。

1.3 疗效评定

移植组患者于干细胞移植前和移植后的3个月接受运动功能评定(Fugl-Meyer Assessment,FMA)。对照组患者于第一次门诊时和3个月后接受FMA。所有的评定由同一名有资质的康复师完成。为避免其他因素干扰神经功能评定,要求两组患者在3个月内均不得服用影响神经功能评定的药物或接受手术治疗。

1.4 统计学方法

采用SPSS16.0软件进行统计分析,计量资料以表示,两时间点自身前后对照数据比较采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1.1两组患者FMA基线评分信息

干细胞移植组和对照组上肢运动功能基线评分分别为(16.60±11.70)和(15.80±10.97),下肢运动功能基线评分分别为(12.75±6.25)和(13.60±9.31),感觉功能基线评分分别为(15.75±7.25)和(13.33±9.73),平衡功能基线评分分别为(5.40±3.19)和(5.13±3.78),两组总分基线评分分别为(50.50±21.80)和(47.87±28.12)。两组患者入组时五项基线评分差异不具有统计学意义(P>0.05)(见表1)。

2.1.2干细胞移植组患者3个月前后FMA评分比较

干细胞移植组患者移植前后3个月上肢运动功能FMA评分分别为(16.60±11.70)和(19.15±12.42);下肢运动功能评分分别为(12.75±6.25)和(13.90±6.52);感觉功能评分分别为(15.75±7.25)和(16.55±7.35),平衡功能评分分别为(5.40±3.19)和(6.50±3.12),总分分别为(50.50±21.80)和(56.10±23.10)。统计学分析结果:该组患者术后3个月下肢运动、感觉功能评分均较移植前显著改善(P<0.05);而上肢运动功能、平衡功能及FMA总分与移植前改善十分显著(P<0.001)(见表2)。

2.1.3对照组患者3个月前后FMA评分比较

对照组基线和观察3个月后上肢运动功能FMA评分分别为(15.80±10.97)和(16.00±10.87);下肢运动功能及感觉功能3个月前、后评分无任何变化;平衡功能3个月前后评分分别为(5.13±3.78)和(5.26±3.77),观察3个月前后FMA总分分别为(47.87±28.12)和(48.20±28.12)。统计学分析表明,对照组患者经3个月自然观察,前后对比评分在上肢运动、下肢运动、感觉功能、平衡功能各项功能评分及总分均不具有统计学差异(P>0.05),其中下肢运动功能及感觉功能评分3个月前后完全无变化(见表3)。

2.2 干细胞移植组患者治疗及随访期间不良反应

在治疗期间,移植组有2例患者术后24 h内出现发热,体温<38℃。48 h内症状缓解和消失。除此之外,在治疗及随访期间未见发生其他不良反应。

3 讨论

脑卒中后的运动功能障碍是常见的脑血管意外后遗症,目前大量的基础实验及临床治疗证明骨髓间充质干细胞在神经功能修复方面具有非常大的潜力。目前骨髓间充质干细胞在神经修复方面的作用机制主要有以下几个观点:(1)骨髓间充质干细胞分化并替代受损细胞,国外人员通过动物实验发现骨髓间充质干细胞可以分化为类神经细胞及类神经胶质细胞[2,3],从而替代受损的神经细胞及胶质细胞发挥作用。(2)骨髓间充质干细胞可以通过激活内源性修复途径修复受损的神经系统。一些实验研究表明骨髓间充质干细胞能能够增加缺血损伤组织的BDNF及NGF的表达,从而减少细胞凋亡,促进内源性细胞的增值[4,5]。(3)骨髓间充质干细胞可以促进卒中后受损区域的血管再生。LIU等[5]发现骨髓间充质干细胞可以减少损伤面积,诱导血管再生从而改善神经功能。(4)骨髓间充质干细胞可以促进血脑屏障的修复。BORLONGAND等[6,7]通过设立对照组发现,骨髓间充质干细胞对恢复卒中后脑血流量及血脑屏障的重建有肯定效果。

本研究采用骨髓间充质干细胞对35例脑卒中后遗症患者进行移植治疗,手术方式为静脉注射手术。疗效评定采用运动功能评定(Fugl-Meyer Assessment,FMA),分别从肢体运动、感觉、平衡功能等方面进行评价。两组患者在两种评定方法评定前基线评分均衡,提示两组具有可比性。研究结果显示:FMA评价,对照组患者经3个月观察,其上肢运动、下肢运动、感觉、平衡等功能未见明显改善,尤其下肢功能和感觉功能无任何改善,干细胞移植组患者移植3个月后其上肢、下肢、感觉、平衡功能均较前改善,其中上肢运动、平衡功能改善尤其显著(P<0.001)。下一步研究将继续扩大样本量,增加评价方法,如FIM评分,神经电生理检查等评价方法进行专项的研究。

此项研究充分证实骨髓间充质干细胞移植对脑卒中后遗症患者临床治疗的有效性。为脑卒中后的神经功能修复提供了一条新的途径。

参考文献

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骨髓间充质干细胞移植 篇2

骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞的研究进展

骨髓间充质干细胞具有自我更新、分化、增殖的和多向分化的潜能.在体内、体外通过各种物理、化学因素可将其诱导分化为心肌细胞.以此来替代坏死的.心肌细胞,改善心脏功能,防治各种缺血性心脏病,减少心肌重构等,具有广阔的临床应用前景.

作 者：邵华 金秀东 SHAO Hua JIN Xiu-dong 作者单位：牡丹江医学院病理生理教研室,黑龙江,牡丹江,157011刊 名：医学综述 ISTIC英文刊名：MEDICAL RECAPITULATE年，卷(期)：14(4)分类号：Q813.5关键词：骨髓间充质干细胞 诱导 分化 心肌细胞

骨髓间充质干细胞移植 篇3

[关键词] 干细胞 视网膜细胞 分化

视网膜是人体接受外来信息的重要部位。外伤、退行性病变及肿瘤等导致的视网膜损伤常引起严重的视力障碍甚至失明。目前随着干细胞生物学的深入研究，应用不同来源的干细胞及其前体细胞参与视网膜组织修复和细胞再生成为研究的热点。

1 眼源性干细胞分化修复视网膜损伤

1.1 来源于睫状边缘生长区和睫状体的干细胞

睫状体边缘生长区（ciliary marginal growth zone，CMZ）位于视网膜的边缘。视网膜大部分由CMZ产生的视网膜神经元组成，哺乳动物视网膜生成一旦完成，就不再继续生成。此外也没有发现类似CMZ。最近，Abdouh等[ 1 ]在成年鼠眼内注入生长因子，发现睫状体上皮细胞能重新获得胚胎期特征, 并能表达神经前体标记物nestin及视网膜祖细胞的同源转录因子Pax6和Chx10。这一结果提示成年哺乳动物的睫状体可能是潜在的视网膜前体细胞来源，只是正常情况下这些具有干细胞特性的细胞处于静止状态，睫状体内微环境不允许细胞的迁移和神经发生。

1.2 Müller细胞

Müller细胞为一种特殊的神经胶质细胞，在视网膜的发育和功能活动中起重要作用。最近Peter和Patrick等[ 2, 3 ]分别应用出生后的鸡及鱼为对象，研究视网膜神经毒性物质NMDA损伤后视网膜内神经元的再生情况。结果显示：Müller细胞在视网膜受到急性损伤后可重新进入细胞循环，且增殖的Müller细胞具有向损伤区外围扩展的特性。说明在未损伤视网膜内同样可能发生神经再生。Müller细胞可以为视网膜再生提供来源。许多研究还发现在视网膜急性损伤后，许多Müller细胞不仅经历增殖反应，还失去其Müller细胞的形态，并开始短暂表达原仅表达于胚胎前体细胞中的转录因子， 如Pax6、Chx10、甚至Six3[ 3-5] 。这说明增殖的Müller细胞可分化表达视网膜祖细胞。

1.3 虹膜色素上皮细胞（iris pigment epithelium,IPE）

由于IPE细胞与视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium, RPE）的胚胎来源相似容易得到。且体外培养的IPE细胞又具有RPE细胞的某些功能，如吞噬感光细胞的外节膜盘，维持视网膜的代谢等。 所以可以将IPE细胞移植于视网膜下代替RPE细胞。动物实验显示将自体IPE细胞移植于视网膜下1～3个月，IPE 细胞形成单层或多层排列，移植区感光细胞保持良好；6个月时IPE细胞与RPE细胞形成连接，RPE细胞顶端色素颗粒增多，感光细胞外节变长，IPE 细胞与感光细胞外节接触，视网膜增厚，荧光素造影时没有发现渗漏[6]。近年来，许多临床工作者将IPE进行自体移植治疗视网膜变性疾病都取得了良好的临床效果[ 7]

2 非眼源性干细胞与视网膜修复再生

2.1 脑源性神经干细胞

Dong等[ 8]从人胚胎大脑皮层分离获得神经干细胞，在体外用转化生长因子β3处理后再移植到鼠玻璃体腔内。结果发现这些细胞移行并与宿主视网膜整合，分化成视网膜细胞且有视蛋白阳性表达。这不仅表明人类神经干细胞能移行整合到宿主视网膜，而且更为重要的是这些细胞经过处理后能够分化成视网膜细胞，特别是类感光细胞。 Nishida等将海马来源的干细胞注入到机械刮伤视网膜的成年鼠玻璃体腔内，结果发现移植的海马干细胞整合到宿主视网膜内，免疫组化显示多数细胞能表达nestin，并表现出对微管相关蛋白2ab、MAP5及胶质纤维酸性蛋白的免疫活性，证明了移植干细胞向神经元和星形胶质细胞分化。

2.2 胚胎干细胞( human embryonic stem, hES)

胚胎干细胞具有发育全能性，理论上可以分化出任何细胞类型。Haruta等将鼠胚胎干细胞在体外诱导分化为色素上皮细胞，并移植到4周龄的遗传性视网膜病变RCS鼠的视网膜下间隙。结果发现这些细胞具有正常视网膜色素上皮细胞的形态和生理特性。Meyer等将胚胎干细胞源的神经祖细胞注射到成年的遗传性视网膜退变小鼠玻璃体腔，16周后发现移植细胞与宿主视网膜整合，具有与视网膜神经元类似的形态结构和分布特征，并表达特异性蛋白。Meyer等还发现宿主视网膜神经元，特别是感光细胞的存活明显增加。最近，有学者将人胚胎干细胞进行体外培养，发现在合适的培养条件下大部分hES能够定向成为视网膜前体细胞，并主要分化为视网膜神经元(神经节细胞和无长突细胞) 。而将这种hES来源的前体细胞与视网膜变性小鼠的视网膜共培养，结果发现这些细胞整合到了变性视网膜上，并能表达感光细胞特异性标记物。

上述不同来源的干细胞虽然可以诱导分化产生特化的细胞并表达各种组织的特异性蛋白抗原，但是目前未能真正实现细胞功能。如移植的干细胞是否能够帮助修复受损的视网膜？受损的视网膜如果被修复是否伴随着视功能的恢复？这些问题目前还没有答案。尤其是胚胎干细胞的“成瘤性”问题和干细胞体内移植后如何获取免疫防御功能等一直是干细胞领域亟待正视与解决的关键问题。

2.3 骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）

MSC是目前备受关注的一群具有多向分化潜能的成体干细胞。研究发现MSC 有跨胚层分化能力，体外可经诱导分化为神经元及神经胶质细胞。MSC 能在小鼠视网膜内存活并能与原视网膜结构发生融合，因而有可能成为视网膜移植治疗中具有发育潜能的高纯度视细胞供体，在治疗视网膜变性疾病及视神经病变中有广泛的应用前景。

2.3.1 MSC 体外诱导实验

许多学者运用不同的方法进行了MSC 体外诱导的实验研究，证实MSC 经诱导后可向神经元方向分化。常用的神经细胞诱导介质主要有和二甲基亚砜，神经营养因子及全反维甲酸（ATRA），3-异丁基-1-甲基黄嘌呤及双丁酰环化腺苷酸（dbcAMP）等。

Woodbury等在MSC如何向神经元分化方面取得巨大成果。他们首次确定骨髓间充质干细胞能在体外分化为神经元。此实验中将成年鼠的MSC在培养基中传代20代次，显示了非凡的增殖能力。将其先后用不同的诱导介质来诱导产生神经元表型。分化的细胞群致密表达神经元特异性烯醇化酶（NSE），正在分化的细胞表达神经元前体干细胞特有的nestin，且几乎80%的细胞表达NSE和神经纤维丝蛋白（neurofilament, NF-M）。他们接着又对人类骨髓间充质干细胞的分化潜能进行了研究。证明了人类的间充质干细胞也具有向神经元分化的能力。最近Chiou等将人MSCs与RPE细胞共培养成功诱导分化出视蛋白表达阳性的感光细胞，其机制与RPE细胞释放的色素上皮因子诱导分化有关。

2.3.2 MSC 体内移植实验

国内外学者做了大量工作研究自体骨髓干细胞移植治疗RP的实验。2002年Tomita等报道，用PKH-67标记了富含干细胞的骨髓细胞，注射到用钩针损伤的成年大鼠视网膜下，2周后观察到在损伤部位来源于骨髓的干细胞形成了新的视网膜细胞，外源的干细胞主要存在于损伤部位周围的外核层，并且表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP），钙结合蛋白（calbindin），视紫质和波形蛋白（vimentin），这一结果提供了骨髓来源的干细胞分化为视网膜神经细胞和修补受损视网膜的可能性。

Otani A等从小鼠骨髓中分离得到Lin谱系阴性的造血干细胞（Lin-HSC），移植入两种视网膜退形性变小鼠模型rd1和rd10眼中，使原本发生退形性变的视网膜血管网的数量和长度有了一定增长。与对照组比较，视网膜外核层及内核层的厚度增加，且有核细胞数量增加，同时可以观测到视网膜电图（ERG）记录的明显改善。他们同时进行了视网膜微点阵分析，显示多种抗凋亡基因（如热休克蛋白和转录因子）出现显著上调。

最近还有学者[18]将GFP转基因鼠骨髓源性干细胞移植入经碘酸钠定向诱导RPE受损鼠眼内，结果发现部分细胞能迁移整合到宿主受损RPE层内并拥有了RPE细胞表型，表现RPE细胞形态，表达色素颗粒，并且没有发现细胞融合。由此表明MSC可以成为视网膜组织再生的来源。

MSC 在眼科的应用研究刚刚起步。主要研究重点集中于寻找治疗视网膜色素变性可行的治疗方法上。其作为一种成体干细胞，除具有干细胞的共性外，还具有如下优势：取材方便且对机体无害；由间充质干细胞诱导来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥问题；间充质干细胞在理论上可以向任何组织分化。

尽管近年来对MSC的研究取得了很大进展，但仍然存在以下问题尚待解决：(1)成体干细胞含量极微，每10万个骨髓有核细胞中约含有1个MSC，并且随着年龄的增加或体质的衰弱，细胞的数量逐渐减少；(2)目前尚未能建立鉴定MSC的统一标准，至今还未能筛选到MSC特异性的标记分子；(3)MSC具有多系分化潜能，但向多系分化的效率尚不太理想，尤其是在体外的分化是否会引起MSC遗传特性的改变还有待进一步证实；(4)是何种信号诱导了骨髓MSC向多系分化，其诱导分化的分子机制尚不明了。

综上所述，虽然理论上干细胞研究为眼科学者展示了美好的前景。然而，只有在具有巨大挑战性的屏障问题获得解决，人类疾病的治疗才能迈入“干细胞”时代。

参考文献

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骨髓间充质干细胞移植 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集我院2010年4月—2012年2月收治的脑梗死患者38例, 将其随机分为治疗组和对照组。治疗组20例, 其中男12例, 女8例, 年龄49～74岁, 平均 (56.4±7.9) 岁;对照组18例, 男11例, 女7例, 年龄47～76岁, 平均 (54.3±8.7) 岁。两组患者一般资料无统计学差异 (P>0.05) , 所有患者均符合第四届脑血管病会议确定的诊断标准[2]。

1.2 纳入标准

所有符合诊断标准的脑梗死患者, 包括脑卒中、脑栓塞、脑血栓。

1.3 排除标准

急性脑出血患者, 包括暂时性脑缺血、对治疗药物有不良反应的患者、颅内肿瘤、脑外伤及其他肝脏、肾脏疾病者和无自主能力者。

1.4 治疗方法

对照组采用常规的治疗方法:使用脑神经保护药如单唾液酸四己酸神经节苷酯、脑蛋白水解物等, 口服辛伐他汀等他汀类药物, 同时使用抗凝药物如低剂量阿司匹林等。此外, 加强运动康复如四肢关节的主动运动, 缓慢行走运动等, 培养患者的生活自理能力, 运动疗程大于2个月。治疗组在此基础上进行肝细胞移植。治疗前经患者或家属签署知情同意书, 骨髓穿刺, 取自体骨髓300mL, 同时用肝素抗凝;按照Dharmasaroja法[3]进行培养分离:利用DME/F12 (1∶1) 培养基培养, 培养温度37℃;再用5%的CO2培养箱培养, 每3天换液一次, 直到细胞基本融合后再用胰蛋白酶酶解;最后用生理盐水配置成干细胞液 (1×108/mL) 。将配置好的干细胞液静脉滴注患者, 同时密切观察生命指标, 于3个月后判断疗效。

1.5 评价标准

按照美国国立卫生院的NHISS和BI神经损伤评分评价患者治疗前后的神经功能;再对照治疗前后的影像学判断患者的脑灌注量指标。

1.6 统计学分析

所有研究数据均采用SPSS 17.0统计学软件包进行统计分析, 计量资料以 (珚x±s) 表示, 组间率的比较采用χ2检验。若P<0.05则表示差异有统计学意义。

2 结果

治疗3个月后, 治疗组和对照组的NIHSS和BI均有提高, 提示我们无论常规药物治疗还是加用干细胞移植治疗, 对脑梗死都有一定疗效, 但治疗组的疗效和脑部灌注量均优于对照组 (P<0.01) , 见表1。

3 讨论

脑梗死具有发病率高、死亡率高等特点, 严重威胁人类的生命安全, 同时脑梗死治疗后易出现偏瘫及行动障碍等, 给社会和家庭带来沉重负担。目前治疗的方式主要是利用一些溶栓或改善微循环药物, 但由于脑梗死发病急、并发症多, 疗效往往不理想, 因此目前对此病的研究重点主要是如何提高神经细胞的再生以改善神经的各项功能, 使患者更好地恢复。

干细胞移植是当今医学研究的热点, 它通过细胞注入来提高机体的自身更新能力。骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的一种非造血干细胞, 有很高的增殖和更新能力, 能够多向分化。大量研究证实[4], BMSCs在治疗脑梗死方面具有极大的优越性, 它主要通过以下途径起到治疗作用: (1) 替代损伤的神经细胞, 有学者发现[5]人类BMSCs移植到脑缺血的大鼠中, 可以分化为神经元细胞, 提高大鼠的神经系统各项功能, 减轻各项功能障碍; (2) 分泌营养因子, 研究发现[6], 移植的BMSCs可以分泌VEGF (血管生成因子) 和神经生长因子来改善神经系统功能和促进脑部新血管的生成; (3) 刺激内源性细胞的生长, 这可能与BMSCs可以分泌细胞生长因子, 改善细胞的形成内环境, 激活新神经元的生成有关; (4) 减少脑部胶质瘢痕形成, 研究证实, BMSCs可以通过炎性调节来抑制脑部胶质细胞的形成, 减少脑部胶质瘢痕形成, 改善脑梗死的症状, 减少后遗症的发生[7]。

本研究发现, 采用自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死, 可以明显提高脑梗死的损伤修复, 增加脑灌注量。治疗组中, 基础治疗加用BMSCs可明显减少NHISS和BI评分, 与对照组相比, 有显著性差异 (P<0.01) ;同时在脑灌注量中, 治疗组 (65.2±16.2) 也明显高于对照组 (46.2±10.5) , 两组差异显著 (P<0.01) 。因此, 骨髓间充质干细胞移植方法治疗脑梗死疗效显著, 值得临床推荐应用。

摘要：目的:探讨骨髓间充质干细胞移植治疗脑梗死及改善患者神经功能的疗效。方法:将38例脑梗死患者随机分为治疗组和对照组, 对照组采用常规治疗方法, 治疗组在此基础上加用自体骨髓间充质干细胞, 于治疗3个月后评价患者的神经系统功能和脑灌注量。结果:治疗组明显减少NHISS和BI评分, 与对照组相比, 有显著性差异 (P<0.01) ;在脑灌注量中, 治疗组 (65.2±16.2) 也明显高于对照组 (46.2±10.5) , 两组差异显著 (P<0.01) 。结论:骨髓间充质干细胞移植方法治疗脑梗死, 能提高患者的神经功能和脑灌注量, 值得临床应用。

关键词：骨髓间充质干细胞,神经系统功能,脑灌注量

参考文献

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骨髓间充质干细胞移植 篇5

成人骨髓间充质干细胞体外培养及诱导分化的研究进展

目的. 探讨成人骨髓间充质干细胞体外培养及诱导分化的研究现状及发展前景.方法 查阅国内外公开发表的相关文献,进行分析、归纳、总结.结果 成人骨髓间充质干细胞可在体外大量扩增,并诱导分化为骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多种组织细胞.结论 成人骨髓间充质干细胞具有成为种子细胞的潜力,在细胞移植方面有广阔前景.

作 者：李亚 赵勇刚 梁萍 LI Ya ZHAO Yong-gang LIANG Ping 作者单位：河南科技大学第一附属医院,河南洛阳,471003刊 名：河南科技大学学报(医学版)英文刊名：JOURNAL OF HENAN UNIVERSITY OF SCIENCE & TECHNOLOGY (MEDICAL SCIENCE)年，卷(期)：27(2)分类号：Q813.1+1关键词：成人骨髓间充质干细胞 细胞培养 诱导分化

骨髓间充质干细胞移植 篇6

1 材料和方法

1.1 动物与材料

健康无眼疾的Sprague-Dawley大鼠(清洁级,由潍坊医学院实验动物中心提供并批准使用)48只,体重250～300 g,雌雄不限,室温环境下饲养。视网膜缺血再灌注损伤后随机分为正常对照组(CON)、缺血再灌注损伤组(IR组)、IR+MSCs视网膜下移植组(ST组)与IR+MSCs玻璃体腔内组(VT组),n=12只/组。细胞培养试剂:DMEM低糖培养基(Hyclone公司)、进口新生牛血清(Gibco公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓MSCs的分离、培养及标记

骨髓MSCs培养采用密度梯度离心法。无菌条件下分离大鼠股骨、胫骨,冲出骨髓离心10 min,弃上清。用DMEM低糖培养液制成骨髓细胞悬液,贴壁缓慢加入装有等体积1.073 g/m L percoil分离液的离心管中,2 000×g,离心30 min。小心吸取界面层细胞,收集细胞,种植密度为(1.0～2.0)×106/m L;3 d后逐步半量换液,隔日1次。待细胞生长接近融合后按1∶2传代。细胞移植前,用1 mg/L Hoechst33324标记24 h。收集传3～5代的骨髓MSCs细胞移植用。

1.2.2 视网膜缺血再灌注模型的建立

采用Daniel M方法[6]建立视网膜缺血再灌注损伤动物模型。1%丁卡因大鼠眼球表面麻醉,剪开外眦部,分离结膜、筋膜囊到眼球后极,暴露视神经,在其根部用3-0涤纶线结扎,打活结,60 min后拆除结扎线,恢复血流,缝合结膜及外眦部。涂红霉素眼膏,常规抗生素眼药水定期点眼。

1.2.3 大鼠骨髓MSCs眼内移植

视网膜缺血再灌注损伤后大鼠左眼立刻进行移植[7]。离心收集Hoechst 33324标记后的细胞,用PBS稀释至2×105/m L。大鼠麻醉后,采用30号针,从鼻侧依次穿过巩膜、脉络膜,分别行视网膜下移植(周边视网膜下注入5×104个活细胞)和玻璃体腔移植(玻璃体腔内注入5×104个活细胞)。

1.2.4 大鼠骨髓MSCs眼内移植的检测

缺血再灌注损伤后28 d,拉颈处死大鼠,制成16μm的冰冻切片,-20℃冰箱保存。荧光显微镜下观察Hoechst33324阳性细胞。

1.2.5 视网膜电图(electroretinogram,ER G)的测定

分别于视网膜缺血再灌注损伤后6 h、24 h、72 h、7d、14 d和28 d检测ERG b波幅值。方法:将大鼠麻醉后接好电极,1%托品卡胺散瞳,暗适应30 min,遮盖对侧眼,以GT-2000型视觉电生理检测仪(重庆医用设备厂生产)检测视网膜闪光ERG,每眼每次测5个波幅值,分别记录各时间ERG b波振幅。

1.2.6标本的收集与组织切片的制备

视网膜缺血再灌注损伤后4周,处死各组大鼠,取眼球,去角膜,制成石腊标本,于平行于视神经矢状轴且以其为平面的视网膜进行连续切片,切片厚约4μm,置于预先用多聚赖氨酸处理的载玻片上,60℃烤箱烤片过夜,分别进行苏木素-伊红(HE)染色与尼氏染色。

1.2.7视网膜苏木素-伊红(HE)染色

石腊切片脱腊至水,放入Harris苏木素液3～5 min,双蒸水冲洗两次,1%盐酸酒精分化,自来水冲洗,梯度酒精脱水;1%伊红染色,95%酒精分色;无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光学显微镜下观察。

1.2.8 视网膜尼氏染色

石腊切片脱腊至水,放入0.1%甲苯胺蓝内,60℃温染1 min,快速蒸馏水洗,70%和80%酒精脱水各1 min,95%酒精镜下分化,直至背景为淡蓝或无色,尼氏体蓝色为止,无水酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。高倍镜下(×400)计数视网膜神经节细胞(retinal ganglial cells,RGC)密度(个/mm2)及视网膜内膜层厚度(μm)。

1.2.9 数据分析用计算机图像分析系统软件(image

tool version 1.0)计数视网膜RGC密度(个/mm2)及内侧视网膜厚度(μm)。

1.3 统计学分析

全部资料应用SPSS 11.5软件与Excel 7.0软件进行处理。所有计量数据用均数±标准差(x±s)表示,并应用单因素方差分析进行比较;P<0.05认为差异有显著性。

2 结果

2.1 大鼠骨髓MS Cs的形态学观察

骨髓细胞梯度离心后,接种到培养瓶中,培养24 h换液,可见大部分细胞贴壁生长,72 h换液后可见散在分布的梭形、纺锤形和多角形细胞,随着培养时间延长,贴壁细胞明显增多并分裂增殖。培养7～8 d后,细胞以贴壁生长的骨髓MSCs细胞为主,呈漩涡状排列,经3、4次传代后,形成较典型的骨髓MSCs,见图1。

2.2 视网膜电图(ERG)记录结果

IRRI后不同时间点,各组动物ERG b波动态变化。与CON组比较,IR组ERG b波逐渐降低,至IRRI后72 h时(35.24±3.95)m V降至最低(P<0.05),后变化不显著(P>0.05);与IR组比较,视网膜下移植组与玻璃体腔内移植组MSCs移植后,ERG b波逐渐升高,并于IRRI后28 d均显著高于IR组(P<0.01),其中视网膜下移植组ERG b波显著高于玻璃体腔内移植组(P<0.05),见图2。

2.3 骨髓MS Cs移植后检测

IRRI后28 d,视网膜下移植组与玻璃体腔内移植组荧光显微镜下观察:移植大鼠视网膜内可见Hoechst阳性细胞,核染成蓝色。

2.4 视网膜HE染色结果

IRRI后28 d,各组视网膜各层细胞核呈蓝黑色,胞质淡红色。IR组视网膜内层较薄,内核层排列紊乱,节细胞层变薄,RGC目较少;视网膜下与玻璃体腔内移植组各层排列仍紊乱,视网膜内层较厚,节细胞层神经节细胞数目较多,见图3。

注:1)与IR组比较,P<0.01;2)与ST组(视网膜下移植组)比较,P<0.05

A为IR组,神经节细胞层神经节细胞较少,视网膜内层较薄;B为视网膜下移植组,神经节细胞层神经节细胞较多,视网膜内层较厚;C为玻璃体腔内移植组,神经节细胞层神经节细胞较多,视网膜内层较厚。GCL为神经节细胞层;IPL内丛状层;INL为内核层;ONL为外核层。标尺为50μm。

2.5 视网膜Nis s l染色结果

Nissl染色(甲苯胺蓝染色)是神经元尼氏体染色的常用方法,光镜下观察,尼氏体染成深蓝色,细胞核染成蓝色。IR组及移植组视网膜结构破坏,RGC密度及内层视网膜厚度发生变化。

2.5.1 R GC密度检测

IRRI后28 d,IR组(181.25±30.11)个/mm2RGC数目较少,显著少于视网膜下移植组(273.43±19.67)个/mm2(P<0.01)与玻璃体腔内移植组(251.62±21.35)个/mm2(P<0.01);视网膜下移植组RGC数目显著多于玻璃体腔内移植组(P<0.05)。

2.5.2 内层视网膜厚度检测缺血再灌注损伤后28

d,IR组内层视网膜厚度变薄(48.91±10.78)μm,显著薄于视网膜下移植组(79.21±13.59)μm(P<0.01)与玻璃体腔内移植组(67.34±11.32)μm(P<0.01);视网膜下移植组内层视网膜厚于玻璃体腔内移植组(P<0.05)。

3 讨论

视网膜缺血再灌注损伤目前仍没有一个较理想的治疗方案。近日研究发现,干细胞视网膜移植可以显著减轻视网膜损伤或改善视网膜退行性疾病[1,3,4,5]。目前干细胞移植治疗视网膜疾病常见的移植途径有视网膜下移植与玻璃体腔内移植两种方案,均可有效减轻视网膜疾病。MSCs视网膜下移植与玻璃体腔内移植是否均可以减轻视网膜缺血再灌注损伤,采取何种移植途径才能达到最佳疗效呢?本文在这些方面进行了深入研究。

视网膜缺血再灌注损伤后神经功能的改变是反映治疗效果的重要指标,ERG是客观有效地反映视网膜功能变化的敏感指标,正常的ERG反应有赖于视网膜和脉络膜结构的完整性,b波主要起源于视网膜内层的双极细胞和Muller胶质细胞,反映了视网膜内核层区域细胞的电活动,是视网膜缺血的敏感指标[8]。而本研究采用血管结扎法[6]制成视网膜缺血再灌注损伤模型,损伤的部位主要是视网膜内层,故本研究中检测各组ERG b波的动态变化,探讨骨髓MSCs不同途径移植对视网膜缺血再灌注损伤的影响。ERG结果发现:IR组ERG-b波在缺血再灌注损伤后逐渐下降,且缺血再灌注损伤后72 h降到最低,说明缺血再灌注损伤后视网膜节细胞损伤较重,以缺血再灌注损伤后72 h为重;视网膜下移植组与玻璃体腔内移植组于缺血再灌注损伤后28 d ERG-b波均显著高于IR组,而视网膜下移植组ERG-b波要显著高玻璃体腔内移植组,说明MSCs视网膜下与玻璃体腔内移植均可减轻视网膜缺血再灌注损伤,视网膜下移植组疗效优于玻璃体腔内移植组。

HE染色是组织形态学观察的常用染色方法,结果发现IR组视网膜内层变薄,节细胞层神经节细胞数目较少,而视网膜下移植组与玻璃体腔内移植组视网膜内层较厚,节细胞层神经节细胞数目较多。RGC密度与内层视网膜厚度是检测视网膜损伤修复程度的常用指标[9,10]。尼氏染色是神经元尼氏体染色的常用方法,可以通过尼氏染色方法检测RGC密度与内层视网膜厚度。结果发现:IR组RGC数目较少,视网膜内层较薄,显著高于视网膜下移植组与玻璃体腔内移植组,而视网膜下移植组RGC数目及内层视网膜厚度均高于玻璃体腔内移植组,说明视网膜下移植组与玻璃体腔内移植组均可以有效减轻视网膜缺血再灌注损伤,其中视网膜下移植组治疗效果较佳,分析其机制可能与玻璃体腔内移植的骨髓MSCs不能完全与视网膜整合以减轻视网膜损伤[11],从而导致玻璃体腔内移植组的治疗效果较视网膜下移植组差。

总之,骨髓MSCs视网膜下移植与玻璃体腔内移植均能显著减轻视网膜缺血再灌注损伤,骨髓MSCs视网膜下移植治疗效果较为显著,从而为骨髓MSCs移植治疗视网膜缺血再灌注损伤的临床应用提供实验依据。

摘要：目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗大鼠视网膜缺血再灌注损伤的最佳途径。方法Sprague-Dawley大鼠48只,随机分为正常对照组(CON)、视网膜缺血再灌注损伤(IR)组、视网膜下移植(ST)组与玻璃体腔内移植(VT)组,12只/组。缺血再灌注损伤后6h、24h、72h、7d、14d和28d,动态检测各组ERGb波;缺血再灌注损伤后28d,采用HE与尼氏染色法检测各组RGC密度及内层视网膜厚度的变化。结果IR组缺血再灌注后,ERGb波下降,缺血再灌注后72h,IR组ERGb波降到最低幅值,缺血再灌注后28d,ST组与VT组ERGb波高于IR组(P<0.01);HE染色光镜下观察,IR组视网膜神经节细胞减少,内层视网膜变薄,ST组与VT组节细胞层神经节细胞较多,视网膜内层较厚;IR组视网膜神经节细胞密度较小,内层视网膜厚度较薄,均低于ST组与VT组(P<0.01),ST组视网膜神经节细胞密度与内层视网膜厚度均高于VT组(P<0.05)。结论骨髓MSCs视网膜下移植与玻璃体腔内移植均能显著减轻视网膜缺血再灌注损伤,骨髓MSCs视网膜下移植治疗效果较为显著。

关键词：骨髓间充质干细胞,视网膜,缺血再灌注损伤,细胞移植

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[10]DUAN XC,QING GP,LI C.Quatitative analysis of retinal ganglion cells in animals[J].International Journal of Ophthalmology,2006,6(3):667-670.Chinese

骨髓间充质干细胞移植 篇7

1 MSCs的来源及生物学特性

MSCs是一类梭形、成纤维细胞样、贴壁生长并可形成集落的非造血多潜能干细胞[2],属来源于中胚层的早期细胞,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富,胎儿脐血和外周血中也可分离得到[3]。具有以下特性:(1)自我更新性:通过不对称分裂,一方面维持自身干细胞数量,另一方面实现增殖与分化。(2)多潜能性:在合适分化条件下不仅可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌肉细胞等同胚层细胞,还可跨胚层分化为外胚层的神经元、神经胶质细胞[4],和内胚层的肝细胞、内皮细胞[5]。MSCs在体外、体内特定条件下可诱导分化为神经细胞,这为其移植治疗缺血性脑卒中提供了理论前提。(3)形态和生长方式:呈成纤维样或不规则样,胞浆丰富,核染色质细,核仁明显;平行排列或旋涡样生长。(4)免疫表型:利用流式细胞仪检测,表面抗原具有非专一性,表面表达SH2、SH3、CD44、CD29、CD105、CD44、CD90、白介素6-8(IL-6-8)、IL-11、IL-12、IL-14等。不表达造血细胞表面抗原(CD14、CD31、CD34、CD45、CD117、CD133)和主要组织相容性复合物分子(如HLA-DR)。

2 MSCs治疗缺血性脑损伤的实验研究

2.1 移植部位和途径

移植物的存活和分化需要各种细胞因子的营养、微环境的平衡及一定的血液供应,因此,最适合的注射部位应在梗死区周边的半暗带区。目前移植途径主要包括脑内立体定位移植实质、经静脉注射移植及经颈内动脉注射移植。脑内立体定位移植可将MSCs直接送达缺血部位,提高移植物抵达靶点的数量,使移植效果更为明确,其中因单点注射具有可避免多点注射后引起脑组织损伤和局部感染等并发症的优点而多被采用。马学玲等[6]通过同侧脑缺血周边区注射MSCs治疗大鼠MCAO模型的研究证明了立体定位途径对脑梗死神经功能恢复的有效性。此方法有其缺点,主要是造成新的损伤和细胞数量相对较少[7]。经静脉移植可以避免脑组织损伤,同时植入的MSCs能更均匀分布并聚集在脑梗死灶[8],然而Chen等[9]报道由静脉注射仅有1%的MSCs细胞到达大鼠的脑损伤部位,因此与脑内直接注射相比静脉注射需要更多细胞,同时静脉注射的MSCs还有可能有通过肝脏代谢而有潜在肝毒性危险。动脉途径较脑内注射侵袭性小,因而也较为安全,但以[10]等经颈内动脉和脑内立体定位注射两种途径治疗脑缺血模型鼠,发现前者无明显效果,而后者使脑缺血大鼠的神经功能得到显著改善。

2.2 移植效应

MSCs移植效应主要体现在移植后MSC存活、分化、定向迁移及改善神经功能缺损等。Kim等[11]应用MRI在大鼠体内示踪菲立磁(ferumoxides)标记的MSCs,发现移植的细胞可存活10周,并显示亲病灶性。郭亮等[12]将BrdU标记的骨髓间充质干细胞尾静脉注射到脑梗死大鼠,细胞移植后28d发现脑梗死灶(海马)边缘聚集大量BrdU阳性细胞,而健侧脑组织中BrdU阳性细胞数量相对较少。少量BrdU阳性细胞表达神经元特异性烯醇化酶。段春礼[13]将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的MSCs通过侧脑室和尾静脉2种注射方式分别注入纹状体损伤的大鼠体内,用免疫组化学方法均观察到2种方式植入大鼠体内的bMSCs,且EGFP阳性的细胞呈现出神经元和神经胶质细胞的形态并能表达神经元和神经胶质细胞的特异性标志物。

在定向迁移方面,Li等[14]将Brdu标记的MSCs移植入大脑中动脉闭塞后的大鼠纹状体内,28天后发现移植的MSCs在缺血脑内成活并向缺血区迁移大约2.2mm,其中1%表达NeuN,8%表达GFAP,尽管移植后脑梗死范围无明显改变,但神经功能明显改善。为了探讨MSCs能否通过血脑屏障、能否定向迁移和定居于脑损伤部位,林章雅等[15]将MSCs分别通过尾静脉移植和立体定向移植到大鼠缺血侧纹状体,发现两种移植途径MSCs均能够在宿主中存活,对宿主脑组织结构无破坏,有很好的相容性,并随着时间的推移向缺血灶不断迁移,聚集于缺血区域,在非缺血区分布较少。其机制可能为,在损伤部位细胞因子等信号的作用下,能向损伤部位迁移并聚集[16]。这些研究为间充质干细胞移植治疗脑缺血提供可信的证据。但最近Skvortsova等[17]通过磁共振体层摄影术发现在局灶性缺血区,部分移植的MSCs死亡,部分呈现出神经元和神经胶质细胞的标志物,而无迁移现象。

在改善神经功能方面,马学玲等[18]采用前肢不对称应用试验及姿势反射试验观察大鼠行为学变化。经立体定位将MSCs注入大鼠脑梗死灶周边区,在1,3,7,28 d通过前肢不对称应用试验及姿势反射试验观察大鼠神经功能障碍的改善情况。发现脑缺血大鼠随着细胞移植后时间延长神经功能逐渐恢复,并且移植后7d好于其它时间点。Horita等[19]研究发现转入了GDNF基因的MSCs移植组的大鼠神经功能恢复明显优于单纯用MSCs移植组。

3 MSCs治疗缺血性脑损伤的可能机制

3.1 替代作用

MSCs具有多潜能干细胞特性,能分化为神经样细胞,表达神经核蛋白和胶质纤维酸性蛋白等神经细胞的特异性标记,替代损伤和坏死细胞,重建神经环路,从而达到恢复神经功能的目的。MSCs不仅可分化为神经元细胞和神经胶质细胞[20],还可诱导MSCs分化为多巴胺神经元[21],这为神经通路重建奠定了物质基础。另有学者认为MSCs进入脑后,激活了存在于室管膜下区的神经干细胞(NSC),被激活的内源性NSC进一步定向分化为神经细胞,起到脑保护作用[22]。

3.2 血管再生作用

脑缺血后,神经再生、神经功能的恢复与缺血部位新血管的形成、重塑密切相关。Shen等[23]通过颈内动脉给脑梗塞24 h后的大鼠注射MSCs,观察28 d后发现移植了MSCs的大鼠神经功能评分明显改善,免疫组化检测表明梗死区周围新生血管周径和密度都有增高。Chen等[24]用激光扫描共聚焦显微镜、免疫组织化学及ELISA方法分析缺血边缘带的血管发生和宿主脑内的血管内皮生长因子及其受体水平,发现MSCs能促进大鼠脑内血管发生,可能与其通过增加了内源性血管内皮生长因子及其受体水平有关,Poon[25]的研究也证实这一点。新生血管的形成和血液循环的重建,有助于脑缺血半暗带区受损而未死亡神经元的修复,为自身神经干细胞向缺血区迁移和分化、植入的MSCs的成活和分化提供必要的微环境,进而促进脑缺血损伤后神经组织的修复与重建[26]。

3.3 营养作用

MSCs能分泌脑源性神经营养因子[27]、神经生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和白细胞介素等营养因子,这些因子在神经系统发育、成熟中发挥着重要作用。移植入宿主脑内的MSCs分泌这些因子,可以改善神经元修复的微环境,调节神经细胞的生长、增殖及分化,有利于神经元的修复。Chen等[28]将雄性大鼠的MSCs移植给雌性中风鼠,免疫组化发现缺血周边区域碱性成纤维生长因子(bFGF)阳性细胞明显增加。Li等[29]用ELISA法发现脑梗死大鼠植入MSC后的BDNF、NGF水平明显增加。最近,李昕华等[30]应用免疫组织化学和原位杂交技术发现移植入缺血鼠脑后胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)及其受体GFRoal、c-Ret的表达增加。Phinney等[31]发现MSCs与宿主脑相互作用导致自分泌和旁分泌神经营养因子(neurotrophic factor,NTF)增加。因此,MSCs分泌的这些营养因子能够促进中枢神经系统中特定神经元的存活和分化,并在脑损伤后的神经可塑性、再生潜能及神经凋亡的抑制中扮演重要角色。

4 新的研究热点

MSC不仅有多向分化潜能,还能够转染和表达外源基因,被认为是理想的基因载体细胞,从而将细胞移植与基因治疗相结合用于脑梗死。因此,基因治疗成为MSCs应用研究的又一个热点。目前主要使用脑源性生长因子(BDNF)、胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管形成素-1(Ang-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等细胞因子,通过腺病毒、1型单纯疱疹病毒和质粒等载体介导,对MSCs基因修饰,使MSCs定向分化为神经细胞,修复受损脑组织,改善神经功能。Naokado[32]以单纯疱疹病毒为载体将成纤维生长因子-2 (Fibroblast Growth Factor-2,FGF-2)转入MSCs后移植脑梗死大鼠模型,结果显示转基因细胞治疗组FGF-2的分泌量显著增多,大鼠脑梗死的体积明显减少,行为功能的改善也更为明显。最近,Toyama等[33]用Ang和VEGF两种促血管生成因子以腺病毒为载体修饰hMSCs,静脉注射脑缺血大鼠,发现脑损伤面积减少,脑内的血管生成和神经功能修复作用优于非修饰组。国内陈柏龄等[34]给大鼠大脑中动脉栓塞模型股静脉注射Ang-1修饰的rMSCs,,应用荧光激发及荧光免疫组化发现转染组细胞移植后可迁移至脑梗死灶周围,分化表达神经细胞标记物并较长期存活,MSCs移植与其分泌的Ang-1蛋白可协同促进脑梗死后神经功能恢复。黄等[35]将BDNF基因修饰的MSCs移植到脑梗死大鼠模型,发现基因治疗组的BDNF浓度高于对照组,并明显地改善脑缺血鼠的神经功能缺失症状。

5 问题与展望

MSCs移植治疗缺血性脑卒中的研究已取得可喜进展,但主要处于动物实验的初级阶段,要将此技术推向临床还需进一步解决一系列难题,如:(1)寻找和鉴定MSCs所特有的细胞表面标志分子及简单而高效分离、培养、诱导和标记MSCs的方法均缺乏通用的较为理想的模式。(2) MSCs改善神经功能是通过直接分化为神经细胞,还是通过释放神经营养因子促进内源性神经细胞再生而发挥作用的,目前还没有定论。(3)如何适当调节MSCs移植促进新生血管形成,既有利于新生神经元的存活,又可避免血管生长因子引起血管渗透性增加、加重脑水肿以及致癌作用。(4)采用MSCs进行基因治疗还涉及到靶向性、转染效率、转染后能否持续表达以及基因表达的可控性等问题。(5)人的MSCs生长缓慢且分裂能力低,生物学特性与鼠MSCs不尽相同,关于鼠MSCs的研究能否应用于人仍值得商榷。

通过组织培养技术获取自体干细胞可以解决免疫排异问题,并可以诱导成不同的组织细胞,为MSCs的应用提供了依据。MSCs亦是很好的载体,可以把外源性基因转导到干细胞内可以稳定的表达,为脑缺血损伤及神经系统的其他疾病提供很好的载体。分子生物学的飞速发展为MSCs的进一步深入研究提供了前提条件。相信随着人MSCs研究的深入,脑缺血性损伤的治疗将进入一个新时代。

骨髓间充质干细胞移植 篇8

1 材料和方法

1.1 研究对象

动物实验:选择21头中国小型雄性家猪21头(徐州医学院动物房提供,经检疫合格),3～4月龄,体重30～40 kg。

临床实验:选择本院2006年10月至2007年4月急性心肌梗死致HF患者8例,其中男5例,女3例,年龄(54±8)岁;下壁心梗2例,前壁心梗6例;合并糖尿病4例,高血压5例;2例前壁心梗合并功能性室壁瘤。所有入选患者左室射血分数(LVEF)<45%,B型钠脲肽(BNP)>100 pg·ml-1。

1.2 动物心力衰竭模型的制备

经股动脉穿刺行选择性左冠状动脉造影,经6F导管送入0.014 inch导丝,导丝先端达回旋支(LCX)或前降支(LAD)远端后固定导丝。在连续X线透视下缓慢退出右冠状动脉导管,再沿导丝导入球囊(2.0～2.5×7～10 mm)至LCX或LAD远端。以4 atm(1 atm=101.325 kPa)扩张5 min共3次,然后以4 atm扩张50～75 min制作心肌梗死模型,术中注意心电图改变,撤出球囊及导丝,术毕结扎股动脉。术后心脏彩超及单光子发射型计算机断层扫描(ECT)测定LVEF<45%及BNP>100 pg·ml-1的动物定为心肌梗死后HF模型成功,随机将模型动物分为实验组(n=11)及对照组(n=10)。

1.3 MSCs的分离、培养及移植

动物实验:所有动物抽取髂骨骨髓40 ml,以40 ml DMEM培养液稀释,与等量percoll液(相对密度1.077)梯度水平离心分离骨髓单个核细胞,将上述所得骨髓单个核细胞按个2×106个·cm2接种于DMEM培养液中,并在孵育箱中应用贴壁法培养MSCs,MSCs扩增至108数量级后进行移植。动物心肌梗死后10～14 d在局麻下行冠状动脉造影,实验组在梗死区中心经微导管注入2 ml MSCs悬液(约108个细胞),对照组则以同法注入PBS。

临床试验:患者抽取髂后上棘骨髓40～60 ml,骨髓液移至肝素生理盐水离心管中等倍稀释,同法进行骨髓单个核细胞分离、培养至第3代MSCs,移植前稀释成10 ml肝素生理盐水细胞悬液备用,细胞计数约108个细胞。患者在局麻下行冠状动脉造影,在0.014 inch导丝导引下,将微导管置于病变血管处,撤出导丝后经微导管缓慢将细胞悬液注入冠状动脉内,推注时间10 min。

1.4 结果判定

所有动物及患者均于MSCs移植术前及术后8周应用心脏彩超(惠普5500)行超声心动图(UCG)测定左室收缩末期直径(LVSd)、收缩末期容积(SYS vol)、梗死区室壁厚度(IWT)及LVEF;美国博适Triage快速测定和诊断仪测定BNP;西门子SPECT行心肌灌注扫描,同时使用Emory University的Cardiac Toolbox心肌分析软件包获得心肌梗死部位面积大小和灌注图像心肌缺血总分值。

1.5 统计学处理

采用SPSS 12.01统计软件处理数据,计量资料以undefined表示,心功能比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

动物实验:实验组中1头动物于干细胞移植麻醉时死于HF,另有2头动物未达到HF标准;对照组中2头动物于模型制备时死于室颤和急性心包填塞,1头经UCG及ECT证实制模不成功,故最终实验组及对照组分别有8头和7头制模成功。

临床试验:8例患者中靶血管为LAD 6例,右冠脉(RCA)2例;其中5例行经皮冠脉血管成形术(PCI)。所有患者术中均顺利,无一例发生心律失常、心肌梗死及HF,仅1例术后寒战数分钟自行缓解。术后除1例患者因经济原因未能随诊外,其余7例患者获随访资料,动物实验和临床研究的具体情况见表1。

2.2 心功能变化

2.2.1 动物实验

MSCs移植后8周UCG显示,实验组室壁活动与移植术前增强,对照组室壁活动与移植术前比较无明显变化;实验组MSCs移植后LVEF增加,BNP水平由(298±17)pg·ml-1下降至(87±15)pg·ml-1,对照组无明显改变(图1、表2)。

2.2.2 临床试验

MSCs细胞移植后8周心脏彩超结果显示,LVEF较细胞移植前增加(表3),ECT检查示梗死面积缩小,LVEF升高(图2),BNP由(326±34)pg·ml-1下降至(101±7)pg·ml-1。

A. 实验组;B. 对照组

与对照组移植后比较,*P<0.05;与同组移植前比较,#P<0.05

与细胞移植前比较,*P<0.05

1、3、5排为术前ECT检查结果; 2、4、6排为术后8周ECT检查结果

3 讨论

心力衰竭已经成为心血管病中最常见的、对患者危害最大的疾病之一,严重影响患者的生活质量,造成医疗费用支出庞大,因此,必须寻找有效的HF的治疗方法。近年来,MSCs移植作为一种崭新的生物学疗法,引起了人们日益广泛地关注。

2001年,自Orlic等[1]首次采用骨髓干细胞移植成功地治疗动物心肌梗死以来,已有许多动物实验证实,骨髓干细胞移植能明显改善动物缺血心肌的心脏功能。2001年Strauer等[2]的临床研究结果显示,与对照组比较,自体骨髓干细胞移植后,室壁运动障碍范围减少约20%。2004年,由德国Wollert等[3]完成的首次将干细胞随机移植到心肌的研究结果显示,接受干细胞移植患者的左心室功能得到改善。本研究应用UCG、ECT及BNP作为诊断心力衰竭和评价疗效的指标,尤其采用了BNP定量检测,用量化的标准使实验结果更加客观可靠。本研究结果显示,动物MSCs移植后8周,实验组左室功能整体增强,室壁运动得到改善,收缩末期左室容积减少,室壁厚度增加,心室重构程度、心脏收缩功能的改善明显优于对照组。临床研究中我们选择了8例急性心肌梗死后心力衰竭患者,有5例患者行支架植入术同时予MSCs移植,其中1例未能随诊,4例UCG及ECT均提示左室收缩功能和室壁运动改善。余3例因经济原因未行支架置入术,仅予MSCs移植,其中1例患者UCG示心功能无明显改善,但ECT示梗死面积缩小,收缩功能改善。本研究结果显示,MSCs移植后左心室射血分数增加,与Bolognese等[4]研究结果相近。我们认为虽然自体MSCs移植可改善心功能,但自体MSCs移植成功与否还有赖于心肌局部环境、血流供应等因素,在心力衰竭早期MSCs移植辅以PCI术,由于局部充分的心肌血供,可以更有效地改善心肌收缩功能。我们的动物及临床实验证实,自体MSCs取材方便,移植过程简单安全,对机体损伤小,排斥性小,较心肌细胞移植有更好的可塑性,且治疗过程中患者多无不适,无明显的副作用,术后数小时即可活动,在临床治疗心力衰竭方面有更好的应用前景。

骨髓干细胞移植改善心功能的可能机制为[5]:(1)移植细胞分化为心肌样的细胞,与宿主同步收缩从而改善心功能;(2)移植细胞通过分泌血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素-1(IL-1)等细胞因子,促进血管再生和内源性血管新生,再生的心肌细胞同样有营养需要,因此维持心脏微血管的血液供应是心肌再生治疗的一个关键。

综上所述,自体MSCs可作为心肌细胞重建术的来源,自体骨髓干细胞移植具有方便、微创,易于开展的特点,但自体骨髓干细胞的存活与否依赖于环境、血液供应、局部炎症反应等因素。细胞移植结合PCI术是移植细胞改善心功能的理想方法,有可能成为HF患者的一种新的治疗模式和选择,对此,临床上还需要进行更大规模随机、双盲研究,以观察其疗效和可能的副作用,同时更需要进一步的基础研究阐明其机制。

摘要：目的观察自体骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对心肌梗死后心力衰竭的疗效。方法选择21只中国小型家猪,应用闭胸经股动脉介入法制作心肌梗死后心力衰竭模型,术后动物左室射血分数(LVEF)<45%、B型钠脲肽(BNP)水平>100 pg.ml-1为心力衰竭建模成功。随机将动物分为实验组(n=11)和对照组(n=10),术后2周内实验组及对照组经冠状动脉途径分别移植MSCs及磷酸盐缓冲液,8周后,行心脏彩超、单光子发射型计算机断层扫描(ECT)及BNP检查,观察心功能的改变。同时,选择心肌梗死致心力衰竭[左室射血分数(LVEF)<45%,BNP>100 pg.ml-1]患者8例,发病2周内经皮冠状动脉途径植入MSCs,术前及术后8周行心脏彩超、ECT及BNP检查,监测心功能的变化。结果动物实验组和对照组分别有8头和7头猪造模成功;心脏彩超结果显示:实验组MSCs移植后LVEF由(39±1.70)%增加至(51±3.52)%,ECT心血池显像显示LVEF由(35.08±3.12)%升高至(52.15±1.21)%,BNP水平由移植前的(298±17)pg.ml-1下降至(87±15)pg.ml-1;对照组以上指标无明显改变。临床观察显示:MSCs移植后患者心脏彩超显示LVEF由(34.06±2.13)%增加至(52.08±1.02)%,ECT心血池显像显示LVEF由(34.12±3.09)%增加至(53.03±1.01)%,BNP水平由(326±34)pg.ml-1降低至(101±7)pg.ml-1。结论自体MSCs移植是治疗急性心肌梗死后心力衰竭安全、有效的新方法。

关键词：心肌梗死,急性,心力衰竭,细胞移植,自体骨髓间充质干细胞

参考文献

[1]Orlic D,Kajstura J,Chimenti S,et al.Mobilized bone marrowcell repair the infarcted heart,improving function and survival[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:(18)10344-10349.

[2]Strauer B E,Brehm M,Zeus T,et al.Myocardial regeneration after interacoronary transplatation of human autogous stem cells following acute myocardial infarction [J].Dtsch Med Wschr,2001,126(34- 35):932- 938.

[3]Wollert K C,Meyer G P,Lotz J,et al.Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction:the BOOST randomised controlled clinical trial [J].Lancet,2004,364 (9429):141- 148.

[4]Bolognese L,Neskovic AN,Parodi G,et al.Left ventricular re-modeling after primary coronary angioplasty:patterns of leftventricular dilation and long-term prognostic implications[J].Circulation,2002,106(18):2351-2357.

骨髓间充质干细胞移植 篇9

1 资料与方法

1.1 一般资料

本组27例, 男16例, 女11例, 其中2例为双侧股骨头发病, 其余为单侧。年龄25~51岁, 平均年龄34.2岁。根据病因分类:激素性ANFH13例, 酒精性ANFH10例, 创伤性ANFH2例, 特发性2例。ANFH按ARCO分期:Ⅰ期11髋, Ⅱ期18髋。所有患者术前均有患侧髋关节疼痛、跛行及功能障碍等症状, 术前常规行髋关节正位X片、CT或MRI检查予以确诊, 术后股骨头坏死局部骨质病理检查予以证实。本组病例发病至手术时间为5~23个月, 术前均经过3个月及以上的非手术治疗, 疗效欠佳。钽棒为美国Zimmer公司产品, 其头端为一半球形, 体部由直径10mm的圆柱体组成, 末端由直径为14mm、长为25mm的螺纹组成。

1.2 BMSCs的制备

局麻下从髂前上棘处穿刺进针, 穿刺成功后用20ml的一次性注射器多点抽取骨髓血约100~200ml, 肝素抗凝。采用密度梯度离心法, 进行BMSCs的分离和扩增, 将其调整成10ml、浓度为1×108/L悬液备用, 本步骤在南宁市生殖医疗中心实验室进行。

1.3 手术方法

采用连续性硬膜外麻醉或全身麻醉, 患者仰卧于可透视的骨科手术床上, 患侧臀部垫高约20°。常规消毒、铺巾, 于股骨大转子下方行一长约5cm之纵形切口, 逐层切开皮肤、皮下组织及深筋膜, 沿肌纤维方向分离股外侧肌, 显露股骨上段外侧骨皮质。在C型臂X线透视下, 选择通过股骨小转子水平线与股骨外侧皮质交点向上约0.5cm处作为进针点, 以约15°左右的前倾角向股骨头坏死中心置入导针。在进行股骨外侧皮质开孔后, 逐次以空心环钻扩大钉道直至10mm。分别利用不同角度的长柄弯头刮匙, 经此通道进行股骨头内坏死骨组织的清除, 直至有鲜血渗出。在环钻经过骨坏死区时, 可感到阻力明显增加, 此时应注意缓慢向前钻入, 避免用力过大致股骨头软骨损伤。术中所取坏死骨组织常规送病理检查。取出定位导针, 以测深器测量钉道长度后进行攻丝, 调整手术床适当倾斜, 自体BMSCs通过注射器注入股骨颈减压骨髓道内, 于此钉道内旋入同长度的金属钽棒, C型臂X线透视下确认钽棒头端植入股骨头软骨下骨约0.5cm, 大转子外侧通道植骨后以骨蜡封闭, 避免其渗出。对于坏死体积较大、钽棒不能完全填充死骨清除后形成缺损的股骨头, 在植入钽棒前, 取自体髂骨适当修整后通过髓芯减压通达打压植入, 使钽棒在股骨头内获得良好的初始稳定, 以利于骨坏死的修复。

1.4 术后治疗及随访复查

术后常规予以预防感染1~2d, 同期予以改善微循环、促进骨折愈合等药物对症治疗。3个月内患肢不负重, 3个月后根据股骨头内骨坏死修复情况进行患肢部分负重直至完全负重。术后1年内每3个月复查患髋X片或MRI1次, 1年后每半年复查1次。

2 结果

所有患者术后无感染及股骨颈骨折等并发症发生。27例患者获得7~24个月 (平均13个月) 的随访, 进行髋关节Harris评分, 以最后1次随访资料作为评价依据。结果显示髋关节Harris评分由平均术前的 (54.2±7.1) 分提高到术后的 (83.9±8.6) 分, 手术前后比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。除2例2髋股骨头塌陷、进展为ARCOⅢ期外, 其余股骨头内囊性变消失, 股骨头外形完整, 关节间隙正常, 患侧髋关节疼痛基本消失, 活动范围接近或恢复正常。

3 讨论

ANFH的发病机制尚未完全阐明, 目前认为其与股骨头局部血供中断、髓内压增高及股骨头内软骨下骨支撑力不足有关, 现阶段缺乏一种确切的治疗手段能阻止股骨坏死向其中晚期发展。髓芯减压术可降低股骨头内的压力, 减轻骨髓水肿, 改善坏死骨组织内的微循环, 促进骨坏死的修复, 具有操作简便、创伤小等优点, 在ANFH早期应用广泛[1,2]。然而在进行髓芯减压后, 坏死股骨头内的软骨下骨支撑力进一步减弱, 短期内易出现股骨头塌陷, 故本术式多联合自体或异体骨及其他生物材料局部植入治疗ANFH。自体髂骨或腓骨移植存在手术时间长、创伤大、并发症较多等缺点, 同种异体腓骨移植则存在排异反应和潜在的感染传染性疾病等风险。

金属钽棒的弹性模量与骨组织相当, 且具有良好生物相容性, 加之其多孔的蜂窝状结构在植入股骨头内后, 不仅可提供良好的生物学支撑, 同时可诱导局部骨组织长入, 增强骨坏死区域内的血管化, 近年来已广泛应用于临床治疗早期股骨头缺血性坏死, 且取得了较好的疗效[3~5]。但也有研究表明, 单纯的钽棒植入治疗早期ANFH疗效欠佳。Floerkemeier等[6]对19例 (23髋) ANFH患者采用髓芯减压联合钽棒植入治疗, 在经过1年的随访后发现, 13髋需要进一步接受髋关节置换治疗, 髓芯减压联合钽棒植入后, 股骨头局部应力明显增高, MRI检查结果显示钽棒周围有液体信号, 提示钽棒缺乏完全性骨长入。Tanzer等[7]用扫描电镜证实13例应用钽棒失败的病例中, 在钽棒的边缘有少量的骨长入, 而坏死区无新骨形成和骨长入, 其认为钽棒植入失效与骨长入少有关。ANFH患者股骨头内BMSCs较正常人数量少, 且其成骨分化能力降低, 故此可能与钽棒植入后骨长入少有关[8,9]。有学者提出将钽棒植入与BMSCs移植联合治疗早期ANFH, 且取得了良好的效果[10,11]。本组病例在应用髓芯减压、钽棒植入的同时, 联合自体BMSCs植入坏死股骨头内, 经过平均13个月的随访, 术后患侧髋关节疼痛及活动障碍明显改善, Harris评分由平均术前的 (54.2±7.1) 分提高到术后的 (83.9±8.6) 分, 手术前后比较差异有统计学意义, 除2例患者股骨头坏死进展为ARCOⅢ期外, 其余患者股骨头坏死均得到修复, 股骨头囊变坏死区消失, 髋关节疼痛等症状缓解, 表明其近期临床疗效满意。在应用BMSCs治疗ANFH过程中, 常需进行BMSCs的体外扩增与培养, 需要较长的时间, 且操作方法较复杂, 在基层医院较难开展是其不足。

骨髓间充质干细胞移植 篇10

目前, 对于骨髓间充质干细胞 (MSCs) 全抗原对于肿瘤预防免疫应激的研究尚无报道。MSCs属于成体干细胞, 存在于骨髓基质中可向三个胚层组织进行诱导分化, 取材简单、培养容易, 且其研究及临床运用均不存在伦理争议[5]。本研究采用MSCs为目的瘤苗制备WCAs, 分次对小鼠进行预防接种后进行以人肺腺癌A549细胞荷瘤造模, 观察肿瘤生长情况并初步探索分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

倒置显微镜 (日本Olympus公司) ;荧光定量PCR仪 (日本TOYOBO东洋纺定量PCR仪器型号:Biored IQ5) ;凝胶成像系统 (美国Protein Simple公司) ;低温高速离心机 (美国Beckman公司) 。

1.2 实验动物与主要试剂

BALB/c野生小鼠 (军事医学科学院) ;RPMI-1640、低糖型培养基 (DMEM) (美国Hyclone公司) ;胎牛血清 (美国Hyclone公司) ;胰白酶干粉 (美国Sigma公司) ;10×多聚赖氨酸 (北京中杉公司) ;胶考马斯亮蓝 (美国Sigma) ;BCA蛋白浓度测定药盒 (PIERCE公司) ;丙烯酞胺 (美国Sigma) ;甲又丙烯酞胺 (美国Sigma) ;Tris碱 (上海生工生物技术公司) ;一抗antiPCNA, anti-Ki-67 (美国Santa) ;二抗-辣根 (北京中杉公司) 。

1.3 实验方法

1.3.1 MSCs培养、鉴定及A549培养

①MSCs:全骨髓贴壁法培养MSCs, 6周小鼠的股骨和胫骨, 以10%胎牛血清 (FBS) -低糖DMEM冲出骨髓, 直接接种在培养瓶里, 24~48 h后去悬浮, 再接下来的每3~4天换液, 直到需要传代。②人肺腺癌A549细胞:从液氮罐中取出A549细胞冻存管, 放入37℃水浴锅中解冻, 1000 r/min离心5 min, PBS吹打清洗重新离心后, 以10%FBS+5%RPMI-1640培养, 每2~3天换液, 直到需要传代。

1.3.2 MSCs全细胞抗原制备、免疫应激BALB/c小鼠及实验分组

X线照射裂解法获得抗原, 具体如下调整3~5代A549细胞密度为1×106, 接种于培养皿中行X线照射, 照射强度为15 Gy;照射后的抗原4℃保存不超过6 h。获得WCAs后, 根据是否接受抗原刺激将BALB/c小鼠随机分成两组, 每组各24只;其中实验组小鼠每3天接受1次皮下注射瘤苗应激 (抗原液加PBS共2 m L) , 2周后 (共5次) 进行肿瘤荷瘤造模。对照组小鼠每3天接受1次皮下注射2 m L的PBS, 同样2周后行荷瘤造模。

1.3.3 A549皮下移植造模及肿瘤测量

获得复苏后3~4代A549细胞, 调整细胞密度为1×106接种小鼠上肢下方 (腋窝下) 皮肤, 接种后分别于第3、5、7、15、21、30天观察肿瘤增长情况;处死小鼠后, 取下肿瘤组织, 测量最长径与最短径, 计算肿瘤体积, 公式为公式V=2πab/6 (a为长径, b为短径) 。

1.3.4 Western blot检测PCNA、Ki-67蛋白表达

接种后第7、30天, 提取细胞总蛋白, 紫外分光光度计检测蛋白浓度后将蛋白上样, 以堆积胶80 V, 分离胶120 V, 电泳时间90 min;移入玻璃皿中加入Coomassie染色液2 h后脱色;再转至PVDF膜上, 5%脱脂奶粉封闭1 h, 一抗孵育, 一抗的封闭液稀释为1∶20, 同时抗人GAPDH (甘油醛-3-磷酸脱氢酶) 单克隆抗体作为阳性对照, 其封闭液稀释为1∶1000。室温作用2 h, TBST冲洗5 min×4次;辣根酶标记二抗, 封闭液稀释为1∶2000, 室温1 h后TBST冲洗;定影、显影。结果用数码相机摄取并用NCBI的Melanie Viewer 7.0软件分析进行图像分析, 测定各个条带的灰度值, 将SIRTI条带灰度值与其相应的GAPDH条带灰度值相比较, 每组所得数值求均数。

1.3.5 Real-time PCR检测PCNA、Ki-67 m RNA表达

接种后第7、30天, 提取细胞总RNA提取, 所得RNA溶解于DEFC水中;紫外分光光度计测定总RNA浓度取2μL总RNA稀释至600μL, 测260处光密度OD值, RNA浓度 (μg/m L) =OD×300×40。加入逆转录及PCR扩增反应体系。扩增过程:取2μL模板, 在25μL PCR扩增反应体系中先将模板于97℃, 2 min, 加入Taq DNA聚合酶, 循环仪中循环35次。PCR扩增条件及引物见表1。反应完成后, 取10μL PCR反应液在1.5%琼脂糖凝胶中电泳分离, EB染色后照相, 软件系统扫描。以目的m RNA扩增带的平均光密度对GAPDH m RNA扩增带平均光密度的比值代表组织中目的m RNA的表达水平。

注:PCNA:增殖细胞核抗原;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差 (±s) 表示, 两组间比较采用t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSCs形态

原代接种1 d即可见较多贴壁细胞, 外观呈纺锤形和多角形, 并可见细胞核, 48~72 h后细胞数量明显增多, 呈现纤维长条样梭型细胞;图1示不同放大倍数下MSCs的形态, 可看到不甚均一的梭型排列的细胞, 400倍镜下可见到有部分细胞细胞核内有双核仁。

在倒置显微镜下MSCs多呈纺锤形和多角形, 部分细胞呈现纤维长条样梭型细胞, 400倍镜下可见部分MSCs的细胞核内有双核仁, 提示细胞增殖活跃, 细胞状态良好

2.2 移植瘤体积及其增殖曲线评估

分别对两组小鼠的肿瘤进行测量, 首先评估体内肿瘤增殖情况, 如图2所示, 实验组皮下移植肿瘤明显小于对照组;进一步解剖获得肿瘤, 分别测量两组肿瘤的最长径与最短径计算出其体积, 第3天时, 对照组移植瘤的短径及长径均大于实验组, 但是差异无统计学意义 (P>0.05) , 然而自第5天开始, MSCs抗原进行预防接种, 实验组其短经与长径都小于对照组 (P<0.05) ;第3、5、7、15、21、30天实验组体积均明显小于对照组 (P<0.05或P<0.01) , 见表2。并进一步获得其增殖曲线, 发现实验组的增殖趋势明显低于对照组。

注:与对照组同期比较, *P<0.05, **P<0.01

实验组皮下移植肿瘤明显小于对照组;实验组体积明显小于对照组, 增殖趋势明显低于对照组

2.3 MSCs全细胞瘤苗抗原对PCNA及Ki-67的影响

MSCs作用后, 肿瘤组织的PCNA及Ki-67的表达都明显下调, 本研究检测了7、30 d的PCNA与Ki-67的表达, 可见在蛋白水平及m RNA水平PCNA与Ki-67的表达, 实验组显著低于对照组, 差异均有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。见表3、图3~4。

注:与对照组同期比较, *P<0.05, **P<0.01;PCNA:增殖细胞核抗原

与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01;PCNA:增殖细胞核抗原;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶

与对照组比较, *P<0.05, **P<0.01

3 讨论

肿瘤免疫治疗源于Burnet提出的“肿瘤免疫监视”理论, 认为机体的免疫系统能够通过细胞免疫机制识别并产生免疫应答。研究表明, 该种免疫应答的机制十分复杂, 涉及多种免疫细胞及其分泌的产物, 包括T淋巴细胞、NK细胞、NC细胞和巨噬细胞等免疫细胞介导的特异或非特异的细胞免疫, 抗体介导的体液免疫以及补体、细胞因子的抗肿瘤作用[6];因此, 探索有效、安全的应激源即“识别”是免疫治疗的基础[7]。

肿瘤的胚胎特性的认识由来已久, 并且二者在增殖分化、侵袭、血管侵蚀和新生血管形成、免疫逃逸及细胞凋亡等诸多方面具有惊人的相似性[8]:二者表达相同的表面抗原, 即癌胚抗原 (carcino-embryonic antigens, CEA) , 在肿瘤状态时会使得机体一些机体发育过程中许多原本“关闭”的基因激活, 可重新生成和分泌这些胚胎期的蛋白如甲胎蛋白、CEA、FSA等[9,10]。正是基于此, 研究者开始探索干细胞与肿瘤的关系。大量研究, 在多种实体肿瘤中都存在少数具有干细胞特性即自我更新能力和多向分化潜能的细胞亚群, 这种细胞亚群被称为肿瘤干细胞, 其对肿瘤形成、复发、转移及化疗耐药性都有着重要影响[11]。2009年, Li等[4]创新性地发现以胚胎干细胞体外制作瘤苗可以起到抑制肿瘤增殖的作用, 这项研究也使得人们在瘤苗探索的道路上多了新的思路, 即干细胞可以作为瘤苗来源。那么, 除了胚胎干细胞别的干细胞是否具有类似的作用呢?

本研究首次评估了MSCs作为瘤苗具有肿瘤免疫接种作用。笔者以X线照射MSCs获得裂解抗原, 每周3 d一次给予BALB/c小鼠皮下接种, 连续4周获得瘤苗应激模型;再以GFP-A549皮下注射对其进行荷瘤造模, 并设置第3、5、7、15、21、30天观察肿瘤增殖情况, 本研究发现瘤苗接种组从第3天开始其肿瘤体积小于对照组, 并且随着时间的延长, 其差别愈发明显, 说明疫苗应激产生的抑瘤作用可能是长期的。Li等[4]采用胚胎干细胞系H9获得疫苗, 观察其免疫刺激后荷瘤的增殖情况, 同样发现自第3天开始其免疫应激的抑瘤作用开始凸显;又有学者比较胚胎干细胞瘤苗对于不同数量的腺瘤细胞移植后肿瘤增殖的影响, 发现无论移植初始细胞计量多少, 干细胞瘤苗均可以产生明确的抑瘤作用[12]。

PCNA由Miyachi等[13]于1978年在系统性红斑狼疮患者的血清中首次发现并命名, 因其只存在于正常增殖细胞及肿瘤细胞内而得名;Mathews等[14]发现PCNA与细胞周期蛋白 (Cyclin) 属于同一物质, 并与细胞增殖程度直接相关;后来人们在乳腺癌、肺癌、肝癌、大肠癌等多种肿瘤中都监测到PCNA表达的上调[15,16];总之, 在不同的调控通路中, PCNA可以作为多种蛋白的功能转换因子发挥作用。在细胞增殖、分化及凋亡事件中, PCNA都参与了十分重要的角色, 尤其是反映细胞增殖状态的良好指标。Ki-67是一种大分子蛋白质, 存在于细胞核内, 1993年, 学者得出其氨基酸序列[17], 发现其包含有40个弱的和10个强的PCST区 (富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸) ;研究显示, Ki-67与细胞增殖至关重要, 可以用来识别生长中的正常和肿瘤细胞, 评估细胞的增殖程度, 但对静止期的细胞无作用, 故Ki-67已成为细胞增殖的标志之一;研究者发现Ki-67的作用是在有丝分裂过程中有维持DNA规则结构的重要作用, 是具有结合特性的重要的结构蛋白, 在细胞增殖过程中不可缺少[18];研究已经证实其在乳腺癌[19]、肺癌[20]、结直肠癌[21]等几乎所有的恶性增殖的肿瘤中都高表达。

因此, 为了初步评估MSCs瘤苗用于A549的接种的分子机制, 本研究检测了第7、30天接种组和对照组肿瘤增值因子PCNA及Ki-67的蛋白及m RNA表达情况。正如本研究结果中描述的一样, 瘤苗应激刺激后无论蛋白水平和RNA水平, PCNA及Ki-67的表达都显著下调, 从而推测, 瘤苗可能由于免疫状态的改变下调了抑制瘤的增殖活性, 从而抑制了移植瘤的增殖。当然, 细胞的免疫通路纷繁复杂, 其内在的具体的分子通路及免疫机制有待进一步深入研究。

摘要：目的 观察骨髓间充质干细胞 (MSCs) 的全细胞抗原 (WCAs) 对人肺腺癌细胞株A549荷瘤的影响, 并探讨肿瘤相关增殖抗原的改变揭示其可能的抑制机制。方法 全骨髓贴壁法原代培养小鼠MSCs, 取3~5代MSCs以15 Gy X线灭活获取WCAs, 将BALB/c小鼠随机分成实验组和对照组, 每组各24只。实验组皮下接种WCAs (1次/3 d, 共2周) , 获得免疫接种小鼠模型, 对照组皮下注射同体积的磷酸缓冲液。观察两组小鼠肿瘤生长情况, 测量肿瘤直径、计算肿瘤体积, 并于接种后第7 (Day7) 、30天 (Day30) 行Western blot及实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测增殖细胞核抗原 (PCNA) 及Ki-67因子的蛋白及mRNA水平。结果 肺腺癌A549细胞皮下移植成功使小鼠荷瘤, 实验组小鼠的肿瘤体积显著小于对照组 (P<0.05) ;实验组PCNA蛋白水平显著低于对照组[Day7: (6.42±0.54) 比 (18.67±0.96) , P<0.01;Day30: (2.12±0.14) 比 (4.32±0.25) , P<0.05];PCNA mRNA水平低于对照组[Day7: (11.64±0.28) 比 (25.18±1.37) , P<0.01;Day30: (2.11±0.18) 比5.69±0.41) , P<0.01];实验组Ki-67蛋白水平显著低于对照组[Day7: (1.57±0.51) 比 (4.84±0.23) , P<0.05;Day30: (2.75±0.28) 比 (5.66±0.19) , P<0.01];Ki-67 mRNA水平也明显下调[Day7: (2.12±0.43) 比 (5.94±1.03) , P<0.01;Day30: (3.71±0.72) 比 (8.62±0.35) , P<0.01]。结论 采用MSCs获得全细胞抗原进行免疫应激可产生抑制肿瘤生长作用, 其机制可能与及肿瘤增殖相关因子PCNA、Ki-67的下调有关, 其内在的免疫分子机制有待深层次的探索。