脂肪源间充质干细胞

脂肪源间充质干细胞（共4篇）

脂肪源间充质干细胞 篇1

近几年,现代组织工程技术迅猛发展,它能以少量的种子细胞经体外扩增后,与生物材料相结合,来修复器官和组织较大的损伤。这将对组织器官的修复与替代治疗产生十分重要的意义。此工程的前提和基础是种子细胞的获得、培养与诱导分化。现已成功获得骨髓间充质干细胞(marrow stromal cells,MSCs),并证明了它能向多种细胞分化。但骨髓的抽取往往给患者造成痛苦,且来源十分有限。2001年ZUK等人首次从人抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中分离获得了具有多向分化能力的脂肪源间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,AT-MSCs)[1]。由于脂肪组织容易大量获得,脂肪组织抽取后残留于供区的脂肪组织仍可扩增,对供区的损伤小,这就使脂肪源间充质干细胞成为了干细胞生物工程研究的理想来源,并为组织修复提供了又一条途径。近年的研究发现,生长分化因子-5(growth differentiation factor 5,GDF-5)是机体生长发育的重要调节因子,尤其在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌腱韧带损伤修复方面的作用引人注目[2,3,4,5]。本实验体外分离培养大鼠来源的AT-MSCs,经GDF-5诱导向肌腱细胞分化,观察诱导细胞分化的形态学变化,及I型、II型、Ⅲ型胶原蛋白和Bcl-2、Bax(Bcl-2 associated X protein)表达水平的变化,为临床应用AT-MSCs进行肌腱损伤修复,提供新思路及理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

4周龄SD雌性大鼠由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂

胶原酶Ⅰ和DMEM培养基(GIB-CO公司);胰酶、胎牛血清(天津钧尧联赢生物制品有限公司)、Rat r GDF-5(E.coli)、E.Z.N.A.Total RNA Kit II(OMEGA公司)、AMV逆转录酶(Bioflux);d NTP和RNasin(天根生化科技有限公司)、Premix Taq(Ta Ka Ra公司);Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白和Bax基因的上、下游引物由北京奥科生物技术有限公司合成。Ⅱ型胶原蛋白、Bcl-2、β-actin基因上、下游引物由天津润泰科技发展有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 大鼠AT-MSCs的制备

取4周龄雌性SD大鼠1只,乙醚麻醉致死。75%乙醇消毒皮肤,无菌取腹腔脂肪组织,去除血管及其他组织,用含青、链霉素(100 u/m L)的无钙镁PBS缓冲液(Phosphate Buffered Saline)反复冲洗3次后剪成1 mm3的碎块,再次用含双抗的无钙镁PBS缓冲液清洗3次。加入两倍于脂肪体积的0.1%胶原酶Ⅰ工作液,于37℃消化30 min,每5~10 min震荡1次。消化后,加入等体积含20%胎牛血清的高糖DMEM培养液,780 g离心5 min,弃上清。沉淀用含20%胎牛血清的高糖DMEM培养液洗2次,弃上清。用含20%胎牛血清的高糖DMEM培养液吹悬沉淀,过200目筛网,以2×105/m L的密度接种于25 cm2培养瓶中,置于37℃5%二氧化碳孵箱中培养。24 h后换液。待细胞密度达到大约80%时,用0.25%胰酶-EDTA消化,传代培养。

1.2.2 大鼠AT-MSCs的诱导分化

第2次传代时,将细胞转入12孔培养板继续培养,隔日换液。待细胞长满70%时,分别用含0、5、10、50 ng/m L GDF-5的培养液培养细胞,每两天换液1次,倒置显微镜下观察各浓度诱导下AT-MSCs细胞形态学变化。于第4、8和12天分别收集细胞,RT-PCR方法检测I型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原蛋白、Bcl-2和Bax的表达。

1.2.3 半定量RT-PCR检测

(1)Ⅰ型胶原蛋白上游引物5'-TGTTCGTGGTTCTCAGGGTAG-3',下游引物5'-TTGTCGTACCAGGGTTCTTTC-3',扩增产物254 bp;Ⅱ型胶原蛋白上游引物5'-GTCCAGATGAC TTTCCTCCGTC-3',下游引物5'-TGTCCACACCAAA TTCCTGATC-3',扩增产物325 bp;Ⅲ型胶原蛋白上游引物5'-ATGGTGGCTTTCAGTTCAGC-3',下游引物5'-TGGGGTTTCAGAGAGTTTGG-3',扩增产物425 bp;Bcl-2上游引物5'-CCTTCTTTGAGTTCGGT GGG-3',下游引物5'-TGATTTGACCATTTGCCTGA-3',扩增产物463 bp;Bax上游引物5'-GCTACAGGG TTTCATCCAG-3',下游引物5'-GCCTTGAGCACCA GTTTG-3',扩增产物304 bp。以大鼠β-actin为内参,上游引物5'-CATGGATGACGATATCGCTGCGCT C-3',下游引物5'-CCGGCCAGCCAGGTCCAGACGC-3',扩增产物550 bp。(2)提取细胞RNA:按E.Z.N.A.Total RNA Kit II说明书进行。(3)RT-PCR反应:RNA 10μL,随即引物1μL,DEPC H2O 3μL,混匀离心3~5 s;70℃5 min;再加入d NTP 3μL,10×AMV逆转录酶buffer 2μL,最后加入AMV逆转录酶1μL,离心3~5 s,37℃60 min;70℃15 min灭活酶活性,所得c DNA-20℃保存。PCR反应体系为50μL,其中Premix Taq 25μL,c DNA 2μL,10μmol/L上下游引物各1μL,DEPC H2O 21μL。PCR反应条件:94℃7 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,30个循环;72℃7 min。取I型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原蛋白的PCR产物10μL,Bcl-2和Bax PCR产物5μL,进行1%琼脂糖凝胶电泳。采用Quantity One软件的轨迹定量法,对目的条带进行光密度测定,以I型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原蛋白和β-actin条带的光密度比值作为表达的相对量,以Bcl-2和Bax条带的光密度比值计算Bcl-2/Bax。

2 结果

2.1 大鼠AT-MSCs诱导前后形态学的改变

传代培养的脂肪源间充质干细胞呈散在分布,排列不规则,以星形和多角形细胞为主。4 d后,空白对照组和5 ng/m L GDF-5诱导4 d的细胞排列松散且不规则,大多呈星形和多角形。经10 ng/m L GDF-5诱导4 d后,出现较多散在分布的梭形细胞。经50 ng/m L GDF-5诱导4 d后,细胞排列紧密,以多角形为主。

培养8 d后,空白对照组细胞排列疏松,大多呈多角形(图1A)。经5 ng/m L GDF-5诱导8 d后,出现较多的梭形细胞,但排列较疏松(图1B)。10ng/m L GDF-5诱导8 d后,梭形细胞明显增多(图1C)。50 ng/m L GDF-5诱导8 d后,细胞呈多角形且排列紧密(图1D)。

培养12 d后,空白对照组细胞呈多角形,排列紧密(图2A)。5 ng/m L(图2B)、10 ng/m L(图2C)GDF-5诱导12 d后,出现较多短梭形细胞。50ng/m L GDF-5诱导12 d后,以紧密排列的多边形为主,同时散在存在短梭形和梭形细胞(图2D)。

2.2 大鼠AT-MSCs诱导前后I型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达

大鼠AT-MSCs经4、8和12 d GDF-5的诱导,以大鼠β-actin为参照,用半定量RT-PCR方法检测I型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达。以Quantity One软件分析电泳条带光密度曲线下面积(单位:CNT×mm),计算I型、Ⅱ型、Ⅲ型胶原蛋白表达的相对量。结果如图3所示。从图3可见,同对照组相比,经GDF-5诱导后,(除外5 ng/m L GDF-5诱导12 d)AT-MSCs的I型和Ⅲ型胶原蛋白表达均有不同程度增加,10 ng/m L GDF-5诱导4 d,5、10 ng/m L GDF-5诱导8 d和50 ng/m L GDF-5诱导12 d的AT-MSCs I型和Ⅲ型胶原蛋白表达增加最为显著;而对照组和各诱导组Ⅱ型胶原蛋白始终未表达。

图1A:培养8 d后,空白对照组细胞排列疏松,大多呈多角形。图1B:经5 ng/mL GDF-5诱导8 d后,出现较多的梭形细胞,但排列较疏松。图1C:10 ng/mL GDF-5诱导8 d后,梭形细胞明显增多。图1D:50 ng/mL GDF-5诱导8 d后,细胞呈多角形且排列紧密

图2A:培养12 d后,空白对照组细胞呈多角形,排列紧密;图2B和图2C:5 ng/mL(图3B)、10 ng/mL(图3C)GDF-5诱导12 d后,出现较多短梭形细胞;图2D:50 ng/mL GDF-5诱导12 d后,以紧密排列的多边形为主,同时散在存在短梭形和梭形细胞

注:经0 ng/m L和50 ng/m L诱导AT-MSCs 4 d的Bcl-2/Bax未检测

A:8 d 0 ng/mL;B:8 d 5 ng/mL;C:8 d 10 ng/mL;D:8 d 50 ng/mL;E:12 d 0 ng/mL;F:12 d 5 ng/mL;G:12 d 10 ng/mL;H:12 d 50ng/mL,同对照组相比,经GDF-5诱导后,5、10 ng/mL GDF-5诱导8d和50 ng/mL GDF-5诱导12 d的AT-MSCs I型和Ⅲ型胶原蛋白表达增加最为显著;而对照组和各诱导组Ⅱ型胶原蛋白始终未表达

2.3 Bcl-2和Bax在大鼠AT-MSCs诱导前后的表达

大鼠AT-MSCs经4、8和12 d GDF-5的诱导,半定量RT-PCR法检测Bcl-2和Bax的表达,计算Bcl-2/Bax,比较表达的相对量。Bcl-2/Bax结果见附表。从附表可知,经GDF-5诱导8 d和12 d后,Bcl-2表达量均高于未诱导的对照组。经5、10ng/m L GDF-5诱导8 d后,Bcl-2/Bax最大。

3 讨论

肌腱缺损往往需要用肌腱移植修复,然而,自体肌腱移植供区有限、并发症多、异体移植则可引起排异反应及疾病传播等。人工肌腱可引起炎症反应、固定失败等并发症。组织工程技术为肌腱缺损的修复开辟了新的途径,目前这一领域的研究热点之一是寻找和使用理想的种子细胞。肌腱细胞是肌腱组织工程理所当然的种子细胞,然而其一些固有的缺陷,如来源有限,获取的细胞数量低,细胞增殖慢等限制了这一细胞的使用。骨髓源间充质干细胞具备分化成肌腱细胞的能力,已成为肌腱组织工程可靠的种子细胞,但骨髓的获取有一定的并发症,所得的细胞数量低(大约每105个贴附的基质细胞仅有1个为MSC),需要较长时间的体外扩增,不仅花费高,还有污染及细胞丢失的可能。近期的研究表明,粗制脂肪组织含有一定的成人干细胞,其在体外能向成骨、脂肪、软骨或肌肉方向分化[6,7,8,9];相对于骨髓,其获取容易,所得细胞数量大,引起的并发症少,其在一些组织修复中的作用日益受到人们的重视。然而,目前将其诱导成为肌腱细胞的相关报道非常罕见,本实验在此方面做了初步探索。本实验对分离培养的AT-MSCs进行了形态学描述,而且得到的AT-MSCs能自发向脂肪细胞方向分化,在GDF-5诱导下可以向肌腱细胞方向分化,在一定程度上证实了AT-MSCs的存在。

肌腱主要由成纤维细胞样的肌腱细胞与Ⅰ型胶原纤维共同构成的致密结缔组织组成,肌腱中含有大量的Ⅰ型胶原蛋白和很少量的Ⅲ型胶原蛋白。等利用三重免疫荧光技术(triple-immunofluorescence technique)发现肌腱细胞中存在Ⅰ型、Ⅲ型和V型胶原蛋白,Ⅰ型胶原蛋白主要分布于细胞核周围,Ⅲ型胶原蛋白弥散于胞浆之中,V型胶原蛋白含量较少[10]。本实验经GDF-5诱导一段时间后的细胞均表达Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白,与等人得到的结果吻合。肌腱细胞主要分泌Ⅰ型胶原蛋白,而肌腱进行修复时会有Ⅲ型胶原蛋白的表达。因此,Ⅲ型胶原蛋白的表达是肌腱细胞执行修复功能的表现。同时与对照组相比,经GDF-5诱导后,(除外5 ng/m L GDF-5诱导12 d)AT-MSCs的I、Ⅲ型胶原蛋白的表达均有不同程度的增加,提示GDF-5可能具有诱导AT-MSCs向肌腱细胞方向分化的能力。经GDF-5诱导4 d,只有10 ng/mL GDF-

5诱导的细胞表达Ⅰ型胶原蛋白,说明该浓度诱导的AT-MSCs已经开始向肌腱细胞转化;诱导8 d,各诱导组细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达水平均高于对照组,说明AT-MSCs正在进一步向肌腱细胞方向转化。诱导12 d,5 ng/m L和10 ng/m L GDF-5诱导的细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达相对量,与对照组相比略有降低或升高不明显,推测可能与细胞凋亡增加有关。10 ng/m L GDF-5诱导4 d,5、10 ng/m L GDF-5诱导8 d和50 ng/m L GDF-5诱导12 d的细胞I、Ⅲ型胶原蛋白表达增加显著。Ⅰ型胶原较粗大,表达增加可以增加组织的稳定性;同时,Ⅲ型胶原蛋白表达增加是肌腱修复初期的表现。这说明上述的诱导时间和浓度可以较好地促进AT-MSCs向肌腱细胞方向分化。

Ⅱ型胶原蛋白是公认的软骨细胞特征性表型标志。本实验中,空白对照组和实验组细胞均未见Ⅱ型胶原蛋白的表达,表明AT-MSCs没有表现出自发向软骨细胞方向分化的趋势,GDF-5也没有促进AT-MSCs向软骨细胞方向分化。

Bcl-2是Bcl-2基因家族中的抑制凋亡基因,而Bax是促进凋亡基因。Bcl-2/Bax比值越高,细胞越不容易发生凋亡。经GDF-5诱导8 d和12 d后,Bcl-2/Bax均高于对照组,说明GDF-5可能具有防止细胞凋亡的作用。经5、10 ng/m L GDF-5诱导8 d后,Bcl-2/Bax比值最大,说明此时GDF-5的抗凋亡作用最明显。GDF-5诱导12 d的细胞Bcl-2/Bax比值与对照组相比变化不大,与诱导8 d相比明显降低。这可能造成了5 ng/m L和10 ng/m L GDF-5诱导的细胞12 d后,与对照组相比,Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达相对量略有降低或升高不明显。因此提示GDF-5诱导时间过长可能会诱发细胞凋亡。因此,临床使用GDF-5需要严格控制使用时间和浓度,以防副作用的产生。

目前可以肯定的是,适当浓度的GDF-5体外可以诱导AT-MSCs向肌腱细胞方向分化。综合考虑肌腱细胞胶原蛋白表达水平和细胞凋亡的影响,5 ng/m L或10 ng/m L GDF-5诱导8 d,是AT-MSCs分化为肌腱细胞的较佳诱导条件。GDF-5对AT-MSCs增殖、分化及凋亡的详尽调控机制值得进一步深入研究。

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脂肪源间充质干细胞 篇2

关键词：脐带,间充质干细胞,生物学性状

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞，具有高增殖、多分化潜能的特性，可被广泛应用于多系统疾病的治疗[1]。研究发现，MSC在人胎儿和出生后的骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、胎肺、胎肝和脐血中广泛存在。但是，胎儿的应用受到道德伦理和传统观念的限制;脐血含有MSCs，但传代培养困难，不易大量获得[2];骨髓源MSC细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，病毒感染率较高。因此，寻找新的MSC来源成为国内外研究的热点。通过实践探索，本实验室成功地从健康胎儿脐带中分离扩增到脐带源间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cell,hUC MSC)并研究其形态及生长特性，可作为MSC的重要替代源[3]。

1 材料和方法

1.1 材料

二氧化碳培养箱(日本SANYO)，细胞培养瓶(美国CORNING)，倒置显微镜(日本Olympus);胎牛血清(Hyclone公司);牛血清白蛋白(Sigma公司)，α-MEM培养基(Hyclone公司)，胰蛋白酶(GIBCO公司)，FITC标记的CD44和CD90(购自CHEMICON公司)。

1.2 方法

1.2.1 hUC MSC的分离与培养

无菌取足月剖宫产健康胎儿脐带，采集后6 h内处理。用加双抗的PBS洗涤至无血迹变白。剪成4 cm左右小段，纵向剖开，去除血管后剪成小片。将几片脐带组织放在直径3.5 cm的小培养皿里剪碎成泥状后转入50 m L离心管中，加PBS,1 200 r/min,10 min，洗涤3遍。洗涤完毕将沉淀用少量培养基浸润混匀后，种到直径10 cm的培养皿中于5%二氧化碳培养箱内培养。48h首次换液，培养第5天、第8天和第11天再换液，第10天可看到有细胞从组织块边缘爬出，到第13天细胞长满皿底，此时用PBS冲掉组织块，5 m L0.25%胰酶消化贴壁细胞，进行传代，种到培养瓶内于5%二氧化碳培养箱继续培养，此时记为P1代。传代培养过程中二三天换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满整个培养孔的底面，再用胰酶消化1∶3传代培养记为P2代，以后以此类推。倒置光学显微镜下观察细胞形态及生长情况，并适时照相。

1.2.2 hUC MSC生长曲线的测定

取生长良好的P1、P5和P10细胞，用0.25%胰酶(含1 mmol ED-TA)消化，以2×107/L接种于24孔板，每天各取3孔消化计数细胞，取平均值，连续培养6 d。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制生长曲线。

1.2.3 hUC MSC表面标志的测定

取生长良好的P5细胞，用0.25%胰酶(含1 mmol EDTA)消化，以5×107/L接种于预先放置盖片的6孔板中，待细胞贴壁3 d后进行免疫荧光染色鉴定(CD44和CD90并设同型对照)。于6孔板中加入4%的多聚甲醛固定细胞10 min，吸去固定液，PBS洗涤3次，37℃烤箱烤片至干。加入牛血清封闭液，将玻片放入湿盒中，37℃孵育1 h。吸去封闭液，加入稀释好的荧光标记，37℃孵育1 h。吸去抗体，PBS洗3遍，封片剂封片，荧光显微镜下观察。

1.2.4 hUC MSC的冻存及复苏

收集生长良好的细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 m L)计数细胞浓度及冻前存活率。将细胞加入到含10%DMSO和30%血清的新鲜培养基中用无菌塑料冷冻保存管(Corning)放入到程序降温盒中，于-70℃24 h后转入液氮保存。30 d后，复苏细胞，用台盼蓝染色检测细胞活性，于37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养，每日倒置光学显微镜下观察细胞生长状况(细胞生长状态及数量)。

2 结果

2.1 倒置显微镜下观察细胞形态

原代脐带组织贴壁7 d后可见少数细胞从组织边缘爬出，第10天已有较多细胞爬出并倍增，见图1。第13天可爬满皿底。传代后细胞呈放射状均匀分布生长，见图2。

2.2 生长曲线分析

传代的细胞生长较原代要快，一般4、5 d左右能达到90%以上融合。传代培养20代内细胞无老化征象。通过对第1、5和10代细胞的生长曲线观察，发现3代细胞具有以下共同特征:传代培养的潜伏期约为24 h，对数增殖期约为2～4 d，对数增殖期后第4、5天进入平台期，见图3。

2.3 细胞表面标志检测结果

免疫荧光染色后细胞膜着色明显，CD44和CD90阳性率均大于90%，见图4、5。

2.4 细胞冻存及复苏生长特性分析

台盼蓝计数细胞存活率90%以上，增殖能力强，和未冻存过的传代细胞具有同样的生长特性。

3 讨论

脂肪源间充质干细胞 篇3

1 材料和方法

1.1 材料

HG-DMEM培养基 (美国Gibco) 、胎牛血清 (FBS) 、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、二甲基亚砜 (DMSO) 、MTT、地塞米松、左旋抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、1, 25- (OH) 2VitD3、骨钙素 (OC) 多克隆抗体、Ⅰ型胶原多克隆抗体 (美国Sigma) , SP免疫组化试剂盒 (北京中杉) , 倒置相差显微镜 (日本Olympus) 。

1.2 方法

1.2.1 ADMSCs的分离培养

外科手术条件下获取人腹部皮下脂肪组织, PBS清洗、剪碎, 0.1% I型胶原酶37℃消化50min, 1000r/min离心10min, 弃上清及上层组织, 加入完全培养液 (含10%FBS、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的HG-DMEM培养基) , 于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。待生长至70%～80%融合时, 0.25%胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 ADMSCs的冻存复苏

消化收集生长状态良好的第4代ADMSCs, 加入冻存液 (含20%FBS、10%DMSO、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的HG-DMEM培养基) , 调整密度为1×106个/ml, 先于-20℃预冷2h, 再转入液氮中。6月后于40℃水浴中快速冻融, 置CO2培养箱内培养。倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况。

1.2.3 检测存活率

将复苏后的细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液按9∶1混匀, 光镜下计数被染成蓝色的死细胞数和拒染的活细胞数, 计算存活率:细胞存活率 (%) =活细胞数/ (活细胞数+死细胞数) ×100%。

1.2.4 绘制生长曲线

分别消化收集冻存前、后的ADMSCs, 调整密度为2×107个/ml, 接种于96孔板, 每孔200μl, 自第2d起每天取1板, 各孔内加入5mg/mL MTT 20μl, 37℃孵育4h后加入DMSO 150μl, 温和振荡10min。酶标仪490nm波长处测得吸光度 (OD) 值, 连测8d。以细胞数量 (OD值) 为纵坐标, 时间 (天) 为横坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.5 成骨诱导

待复苏后ADMSCs生长至70%融合时, 加入成骨诱导培养液 (含10%FBS、10-8mol/L地塞米松、50mg/L左旋抗坏血酸、10mmol/L β-甘油磷酸钠、10mmol/L 1, 25- (OH) 2VitD3的HG-DMEM培养基) , 隔天换液。对照组仅常规换液。

1.2.6 免疫细胞化学染色

诱导后第14d时, 丙酮固定细胞, 以1∶100稀释一抗, 按SP免疫组化试剂盒说明书步骤行骨钙素 (OC) 、Ⅰ型胶原染色, 然后DAB显色, 苏木素复染, 乙醇脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片观察。

1.2.7 统计学处理

实验数据采用SPSS 10.0软件进行统计学分析, 组间比较采用单因素方差分析 (one-way ANOVA) , P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复苏后ADMSCs的形态及存活率

倒置相差显微镜下观察复苏后的ADMSCs为成纤维细胞样生长, 排列具有方向性, 呈平行样、旋涡样或辐射样, 与冻存前比较无明显差别, 传代后仍保持旺盛的生长状态, 如图1所示。经台盼蓝拒染试验检测, 细胞存活率较高, 为 (92.83±2.34) %。

2.2 冻存前后ADMSCs的生长曲线

MTT法绘制细胞生长曲线呈“S”形, 第1、2天为潜伏期, 第3天进入对数生长期, 第7天达顶峰, 第8天略有减少。冻存前后无明显差别, 如图2所示。

2.3 成骨鉴定

复苏后ADMSCs经成骨诱导14d时, 免疫细胞化学染色方法检测骨组织标志物骨钙素 (OC) 及Ⅰ型胶原, 结果显示诱导组阳性表达, 对照组阴性, 如图3所示。

(a) OC阳性表达 (b) I型胶原阳性表达

3 讨论

脂肪间充质干细胞以其取材方便、来源充足、体外易于分离培养、不存在伦理道德问题, 且具有低免疫原性等优点[7], 在再生医学, 特别是骨组织工程领域有着非常广阔的应用前景[8,9], 是较胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞更为理想的种子细胞。如果有科学的方法能够将ADMSCs在体外长期保存, 并保留其生物学性状的稳定, 就可以在需要的时候进行择期自体细胞移植, 或者同种异体细胞移植, 使骨组织再生, 有助于运动系统功能的恢复。

在本实验中, 采用人体脂肪组织作为实验材料, 更具临床实用意义。采用二甲基亚砜 (DMSO) 作为冻存细胞的保护剂, 配合“慢冻快融”的方法实现了ADMSCs的冻存复苏过程。实验表明, 复苏后的ADMSCs存活率较高, 能够保持稳定的一般生物学性状及成骨分化潜能, 证实人ADMSCs可以耐受低温冻存, 为今后建立干细胞库以及临床应用提供实验依据。

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脂肪源间充质干细胞 篇4

关键词：脂肪间充质干细胞,无血清,雪旺细胞

雪旺细胞作为周围神经组织工程的种子细胞在周围神经再生中的重要作用已被广泛证实, 诱导间充质干细胞向雪旺细胞的分化是目前研究的热点, 已有从骨髓基质干细胞、脂肪间充质干细胞诱导转化为雪旺细胞的报道[1,2]。将诱导后的雪旺细胞作为种子细胞移植入的是一个无血管供血的体内环境。本实验将模拟体内环境, 探讨在无血清培养下将脂肪间充质干细胞诱导成雪旺细胞的可行性, 为以后的脂肪间充质干细胞向雪旺细胞的体内诱导分化提供理论基础。

1 资料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1动物

近交系SD大鼠10只, 清洁级, 体重180 ~200g, 2月龄, 雌雄不限, 由温州医学院实验动物中心提供。

1. 1. 2主要试剂

0. 1% Ⅰ型胶原酶 ( sigma, 美国) , 10% 胎牛血清 ( 碧云天公司, 杭州) , DMEM/F12培养基 ( Gibco, 美国) , 100X青链霉素, β-巯基乙醇 ( sigma, 美国) , 全反式维甲酸 ( sigma, 美国) , forskolin ( Peprotech, 英国) , 碱式成纤维生长因子 ( basic fibrgblast growth factor, bFGF, Peprotech, 英国) , 血小板源性衍生因子 ( platelet derived growth factor, PDGF, Peprotech, 英国 ) , 神经胶质生长因子 ( glial growth factor, GGF, Peprotech, 英国) 。

1. 2 方法

1. 2. 1 大鼠脂肪间充质干细胞分离培养

采用Zuk等[3]的方法分离大鼠脂肪间充质干细胞并培养。2个月龄SD大鼠麻醉后取双侧睾丸周围脂肪组织, 去除肉眼可见血管以及结缔组织, 剪成约1 cm × 1 cm × 1 cm大小, 0. 1% Ⅰ型胶原酶震荡消化60 min, 等体积DMEM/F12 终止消化, 200 目筛网过滤, 1 000 r/min离心10 min, 去上清液, 沉淀用含15% 胎牛血清的DMEM/F12 重悬并接种于25 cm2培养瓶中。48 h换液去除未贴壁细胞, 每3 天换液。取第三代脂肪间充质干细胞行倒置显微镜形态学观察、CD44、CD90 和CD45 流式细胞仪鉴定细胞表面标志

1. 2. 2 分组

将第3代大鼠脂肪干细胞分为实验组及对照组, 实验组予无血清培养基 ( 100% DMEM/F12) 诱导培养, 对照组继续DMEM/F12完全培养基 ( 90DMEM/F12 + 体积分数10% FBS) 诱导培养。

1. 2. 3大鼠脂肪间充质干细胞向雪旺细胞诱导方法

将2组细胞消化计数, 吹打分散成单个细胞悬液后接种于25 cm2培养瓶, 24 h后分别加入含1 mmol/Lβ-巯基乙醇的培养基, 24 h后PBS清洗, 加入含40 ng / m L全反式维甲酸的培养基, 培育72 h去除培养基, PBS清洗, 加入含5 ng / m L PDFG , 10 ng / m L b FGF, 14 μmol / L forsklin, 200 ng / m L GGF的培养基中培育2 周, 期间3 天换液一次。

1. 3 观察指标

脂肪间充质干细胞倒置显微镜下形态学观察。脂肪间充质干细胞CD90和CD44、CD45流式鉴定。诱导形态观察: 诱导后2周倒置显微镜下观察诱导脂肪间充质干细胞形态学变化。S-100和GFAP免疫荧光细胞化学染色: 诱导脂肪间充质干细胞诱导后细胞爬片, 铺满后4%多聚甲醛固定, 各组细胞封闭、一抗、二抗孵育, 封片后倒置荧光显微镜下观察并计算阳性率。

1. 4 统计学分析

应用SPSS统计分析软件, 符合正态分布的数据采用 ( ± s) 表示, 数据采用两组样本t检验, 以P < 0. 05为差异有显著性意义。

2 结果

原代脂肪间充质干细胞呈成纤维样细胞, 贴壁生长。流式细胞仪鉴定细胞表面标记, 间充质干细胞相关的CD90 和CD44 表达阳性, 而造血细胞相关的CD45 表达阴性 ( 见图1~ 3) 。2 组第三代脂肪间充质干细胞经诱导后, 大部分细胞成梭形, 长出两极突起, 突起带有光晕, 各相邻细胞突起之间相互连接, 成树杈状排列 ( 图4 ~ 5) 。经S-100 和GFAP免疫荧光染色后, 2 组大量细胞的S-100 和GFAP免疫荧光细胞染色阳性, 实验组S-100 阳性率 ( 82. 1 ±5. 31) % , 对照组S-100阳性率 ( 79. 15 ±6. 38) % , 比较无明显差异 ( P > 0. 05) , 实验组GFAP阳性率 ( 78. 39 ± 6. 92) % , 对照组GFAP阳性率 ( 80. 51± 3. 29) % , 比较无明显差异 ( P > 0. 05) , ( 见图6 ~ 9) 。

3 讨论

雪旺细胞具有营养神经、趋化和使周围神经再生轴突成熟的重要功能, 在修复周围神经缺失的过程中具有重要的作用。脂肪间充质干细胞是近年来较热门的种子细胞, 人体脂肪组织含量丰富, 容易提取, 且大量研究表明脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能[4,5]。国内外学者都曾报道了将脂肪间充质干细胞诱导成雪旺细胞的研究。但目前没有模拟移植初期体内的缺血环境, 因此本实验用无血清的培养基模拟体内的缺血环境, 将脂肪间充质干细胞诱导分化为雪旺细胞。

雪旺细胞来源于神经嵴细胞, 再由神经嵴细胞经雪旺细胞前体、未成熟的雪旺细胞, 最后发育为神经细胞。β-巯基乙醇能提高细胞内的c-AMP水平, 适量浓度的 β-巯基乙醇可以促进间充质干细胞向神经细胞分化[6], 全反式维甲酸能促进早期的神经细胞向神经嵴细胞分化, 同时能促进细胞有丝分裂[7,8]。PDFG, b FGF, forsklin, GGF是可以促进神经细胞向周围神经分化以及成熟, 并提高对神经营养因子的应答的细胞因子, 在使用全反式维甲酸诱导脂肪间充质干细胞分化为神经细胞后, 应用PDFG, b FGF, forskllin, GGF, 细胞体形更加两极化, 并出现光晕, 成树杈状排列, 符合雪旺细胞的形态学改变。

S100 和GFAP是雪旺细胞富含的蛋白, 是鉴定雪旺细胞的常用指标。本实验在无血清培养条件下, 采用逐步诱导的方法, 将脂肪间充质干细胞逐步诱导为雪旺细胞。经细胞免疫荧光鉴定符合雪旺细胞特性, 与血清培养条件下比较, 在形态学和细胞免疫荧光鉴定阳性率无明显差异。

脂肪间充质干细胞在无血清培养条件下, 能定向诱导分化为雪旺细胞。

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