脂肪酶测定

脂肪酶测定（共7篇）

脂肪酶测定 篇1

近年来,制革工业中酶法脱脂得到了许多关注和实际应用,并被认为是一种绿色、高效的脱脂方法[1,2,3,4,5,6,7],市场上也出现了多种商品化的制革脂肪酶制剂[4]。制革工序多,条件复杂,适合制革条件下的脂肪酶活力的检测方法,特别是脂肪酶性能的评价方法,对于酶法脱脂至关重要。

检测脂肪酶活力的方法很多。使用的底物主要有三油酸甘油酯、三丁酸甘油酯和橄榄油,另外也有用乙酸对硝基苯酚酯和辛酸对硝基苯酚酯作为底物。橄榄油价格便宜、易得,因此是最常用的底物。用橄榄油为底物,有乳化法和直接测定法。对橄榄油进行乳化可以提高酶与底物作用的表面积,乳化法检测结果的重复性明显高于不乳化的直接法。因此,乳化橄榄油作为底物是脂肪酶活力检测的典型方法[8,9]。在以橄榄油为底物的脂肪酶酶活检测方法中,主要是通过检测脂肪酸的生成速度来测定酶活。测定反应体系中脂肪酸量的方法主要有滴定法和比色法。滴定法是在反应混合液中或将脂肪酸萃取出来后,通过碱滴定测定脂肪酸的量[9,10,11,12];比色法是用铜离子对脂肪酸显色,用分光光度法测定其含量[11,13,14,15,16]。

以乳化橄榄油为底物,在反应混合液中直接滴定脂肪酸的量的方法是脂肪酶活力的经典检测方法,也是目前的国标方法[12]。但该方法存在着一些缺点:(1)橄榄油乳化液显乳白色,会影响对酚酞指示剂变色点的判别;(2)脂肪酸为弱酸,当反应体系具有较强的缓冲性时,会影响中和滴定的准确度[10];(3)特别是当评价p H值或其它物质对酶活力影响时,该方法存在明显的局限性。如,测中性或碱性脂肪酶p H曲线时,由于配制p H9或10的缓冲溶液时,所用的弱酸或弱碱盐的p Ka值为9-10,不能直接滴定[17],其他助剂的存在也会影响滴定结果。

用铜离子对萃取出的脂肪酸显色测定脂肪酶活力的方法,避免了直接酸碱滴定法中缓冲液的缓冲性和乳液对滴定结果的影响,更适合模拟制革过程中不同条件下脂肪酶活力的检测及其性能的评价。但文献中的分光光度法采用橄榄油与脂肪酶直接反应或者采用油包水微乳液进行反应[15],与制革过程中实际使用的酶脱脂系统相差太大,测得的结果对实际应用的指导意义不大,而且检测中使用有毒物质苯,需要离心等繁琐操作,使得该方法应用受到限制。

为克服上述脂肪酶酶活力检测方法的不足,本文研究一种适应性更广、更适合制革条件下的脂肪酶活力的检测方法。用聚乙二醇-橄榄油水乳液(不同p H值)为底物,在水包油的乳液中进行酶促反应(更接近制革过程),采用无毒的异辛烷代替苯萃取乳液中脂肪酸,并以铜离子对脂肪酸显色来检测生成的脂肪酸的量。研究了异辛烷萃取乳液中脂肪酸的最佳条件、脂肪酸萃取率和显色条件等因素,并用改进的铜皂-分光光度法测定几种制革用脂肪酶的活力及活力-p H曲线。

1 实验

1.1 主要仪器和材料

主要仪器:p H S-3C型p H计(上海精科),THZ-82恒温振荡器(广州市富华工贸发展有限公司),T18 basic高速分散机(IKA Works Guangzhou),Vortex-5涡旋振荡器(其林贝尔仪器制造有限公司)和721E可见分光光度计(上海广谱仪器有限公司)等。

主要试剂和材料:酸性脂肪酶制剂AD和碱性脂肪酶UG(工业级,四川达威科技股份有限公司)。橄榄油、油酸、吡啶和异辛烷(分析纯,成都科龙化工试剂厂)、乙酸铜(分析纯,天津市光复精细化工研究)。其他药品试剂如无特别说明均为分析纯。

1.2 实验内容及方法

1.2.1 主要溶(乳)液的配置

1.2.1.1 橄榄油底物乳液配制[12]

称取聚乙烯醇(PVA,聚合度1750)40 g,加去离子水800 m L,在沸水浴中加热、搅拌,直至全部溶解,冷却后定容至1000 m L。用双层纱布过滤后备用。取4%PVA溶液150 m L,加橄榄油50 m L,用T18 basic高速分散机分散9 min,分三次,每次3min,间隔1 min。得到乳白色底物乳液。

1.2.1.2 含油酸橄榄油底物乳液的配制

取一定量的油酸和橄榄油,加入适量的4%PVA溶液,用T18 basic高速分散机分散(分散过程同1.2.1.1),得到含油酸的橄榄油底物乳液。

1.2.1.3 脂肪酶溶液的配置

准确称取一定量的脂肪酶制剂,用相应的缓冲溶液充分溶解,并用缓冲溶液稀释至所需的倍数。

1.2.1.4 铜盐显色剂溶液配制[15]

5.0%醋酸铜水溶液,用吡啶调p H值至6.1。

1.2.2 脂肪酸铜皂标准曲线[15]

配制不同浓度的脂肪酸异辛烷溶液,然后取5.00 m L于试管中,加入1.00 m L铜盐显色剂溶液,在Vortex-5涡旋振荡器上充分振荡,约90 s,常温静置至上层液清澈后,取上层清液在714 nm波长下测定其吸光度,以未加脂肪酸样为空白。

1.2.3 异辛烷萃取橄榄油乳液中脂肪酸的条件

1.2.3.1 乙醇用量对萃取的影响

25 m L试管中加入2.00 m L含一定量油酸的橄榄油底物乳液和3.00 m L p H7.5磷酸盐缓冲溶液(0.05 mol/L),混匀后加入1.00 m L 6mol/L HCl和不同体积的95%乙醇溶液,混匀后加入2.50 m L异辛烷,在Vortex-5涡旋振荡器上振荡90 s,然后常温静置分层10 min。取上层萃取液1.00 m L于试管中,并加入4.00 m L异辛烷和1.00 m L显色剂,后续操作同1.2.2。以未加脂肪酸的橄榄油底物乳液为空白。

1.2.3.2 异辛烷用量对萃取的影响

用不同量的异辛烷萃取含油酸的橄榄油底物乳液中的油酸,95%乙醇用量为6.00 m L,其他操作同1.2.3.1。

1.2.3.3 温度对萃取的影响

2.00 m L含油酸28.380μmol/m L的橄榄油底物乳液和3.00 m L p H7.5磷酸盐缓冲溶液(0.05mol/L)混匀后加入1.00 m L 6 mol/L HCl和95%乙醇6.00 m L,用异辛烷3.00 m L萃取油酸,摇匀后分别在25℃和60℃下静置分层10 min,再在常温水浴中静置、冷却5 min。其他操作同1.2.3.1。

1.2.3.4 酶液和缓冲溶液对萃取的影响

25 m L试管中分别加入2.00 m L含一定油酸的橄榄油底物乳液和2.50 m L不同的缓冲溶液,然后加1.00 m L 6 mol/L HCl和6.00 m L的95%乙醇溶液,混匀后再加入0.50 m L稀释酶液,再混匀,然后加3.00 m L异辛烷,分层温度60℃,其他操作同1.2.3.1。

1.2.3.5 异辛烷对底物乳液中油酸萃取回收率的测定

25 m L试管中分别加入2.00 m L含不同浓度油酸的橄榄油底物乳液。萃取条件为95%乙醇6.00m L、异辛烷3.00 m L,萃取分层温度60℃,分层时间15 min,其他操作同1.2.3.1。根据1.2.2的油酸标准曲线计算萃取的油酸量,与理论值比较,得到体系中油酸的萃取回收率。

1.2.4 脂肪酶活力及酶活-pH值曲线的测定

1.2.4.1 滴定法

按国标法[12]进行。

1.2.4.2 改进的铜皂-分光光度法

25 m L试管中依次加入橄榄油底物乳液(1.2.1)2.00 m L和2.50 m L 0.05 mol/L缓冲液,在40℃±0.2℃水浴中预热5 min,再加入脂肪酶液溶液0.50 m L(预热5 min),混合均匀,在40℃±0.2℃恒温振荡15 min,快速加入1.00 m L 6 mol/L HCl溶液和6.00 m L 95%乙醇溶液终止反应,混匀后加入3.00 m L异辛烷,在Vortex-5涡旋振荡器上充分振荡90 s,60℃静置10 min分层,常温水浴中冷却5 min,取上层异辛烷溶液1.00 m L于试管中,再加4.00 m L异辛烷与1.00 m L显色剂,振荡90 s,静置1 min以上,上层澄清后,取有机相在714 nm检测吸光度。空白实验为振荡结束后加入酸和乙醇于底物乳液中摇匀最后加酶液,其他操作相同。

按上述两种方法测定脂肪酶的活力及活力-p H曲线。

2 结果与讨论

2.1 脂肪酸铜皂标准曲线

脂肪酸与铜盐形成铜皂,铜皂的有机溶液在710~720 nm有明显的特征光谱吸收,而且当显色剂p H处于5.8~6.4时能产生最大吸收[15]。橄榄油的主要脂肪酸组成为油酸、棕榈酸,含量分别为55%~83%和7.5%~20%,而硬脂酸只有0.5%~5.0%,因此选用油酸为标准物,作铜皂吸光度的标准曲线,并与棕榈酸和硬脂酸进行对比。不同浓度的三种脂肪酸的异辛烷溶液用铜盐显色,铜皂溶液的吸光度(714 nm)随脂肪酸酸浓度变化的曲线见图1。

图1可以看出,在铜盐远过量的情况下,铜皂异辛烷溶液的吸光度与显色前溶液中的脂肪酸浓度呈非常好的线性关系,其中,油酸铜皂的标准曲线方程为Y=0.02191X,相关系数R=0.9991,与文献[15]的标准曲线方程基本一致。

考虑到动物油脂的脂肪酸组成中,饱和的棕榈酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)的比例较大,选择这两种饱和脂肪酸与油酸作铜皂吸光度的对比。图1可以看出,三种脂肪酸铜皂的吸光系数相近,相差在10%以内。文献报道[15],同浓度的碳原子数大于10的脂肪酸与乙酸铜-吡啶显色结果基本一致,对于碳原子数小于10的脂肪酸,由于其在水中有一定的溶解度,在低浓度时不能完全被有机溶剂萃取进入溶剂层,因此它们显色后的吸光度小于碳原子数大于10的脂肪酸。因此,对于用橄榄油、动物油为底物,测定脂肪酶活力中,由于底物油脂中脂肪酸组成基本都在C10以上,因此油酸作为标准物,油酸铜皂的浓度和吸光度的曲线作为标准工作曲线是合适的。

2.2 异辛烷萃取橄榄油乳液中脂肪酸条件的确定

铜皂比色法的关键之一,是从橄榄油乳液中对生成脂肪酸萃取的程度,因此,萃取的溶剂选择非常关键。传统的铜皂比色法选用苯作为溶剂萃取橄榄油乳液体系中的脂肪酸,并在苯溶液中显色。由于苯有毒性,且苯与水的密度差异不大(0.879 g/m L,20℃),因此需要离心等操作使油层与水层完全分离,比较繁琐。Kwon[15]等人选用与水密度相差更大,且与水互溶性更小的异辛烷作为脂肪酸的萃取溶剂,但该方法采用的是两相法,橄榄油未被乳化,生成的脂肪酸容易被异辛烷萃取,且与水快速分层。与直接法相比较,对橄榄油进行乳化可以提高酶与底物相互作用的表面积,酶活力测定结果的稳定性高[8,9]。但是,在橄榄油乳液中生成的脂肪酸,相对于直接法,不易被异辛烷萃取出,因此有必要研究从底物乳液中萃取脂肪酸的最佳条件。

从底物乳液中萃取脂肪酸的关键是使底物乳液破乳。在酶促油脂水解反应的末期加酸(6 mol/L盐酸溶液),不仅可以终止反应,使生成的脂肪酸盐转化为脂肪酸,同时也促进底物乳液的破乳。乙醇对PVA乳化的橄榄油乳液有较好的破乳作用,研究了乙醇和异辛烷不同用量对含油酸的橄榄油乳液中油酸萃取量的影响,结果见表1。

1):根据铜皂的吸光度和标准曲线(图1)计算得到;实际底物中油酸浓度为18.120μmol/m L

含油酸的橄榄油底物乳液中,直接加入异辛烷,萃取过程中,分层缓慢,且油、水相间界面不清晰。加入乙醇后,分层效果得到明显的改善。因此,乙醇的加入可以使底物乳液破乳,促进脂肪酸进入异辛烷萃取层,且乙醇和异辛烷不混溶,乙醇停留在水相中。由表1可以看出,随萃取体系中乙醇和异辛烷用量的增加,更多脂肪酸被萃取出。确定95%乙醇用量为6.00 m L,异辛烷用量为3.00 m L。

实际的酶活力检测过程中,体系中存在蛋白质(酶)和不同的缓冲盐,这些因素和萃取温度都可能影响乳液破乳和萃取的效果。在含油酸的橄榄油底物乳液中,加入不同的缓冲溶液,再用盐酸和乙醇破乳,在不同温度下用异辛烷萃取油酸,结果见表2。

1)底物油酸浓度为10.670μmol/ml2)底物油酸浓度为28.380μmol/ml

含油酸的橄榄油乳液中,0.05 mol/L磷酸盐和碳酸盐缓冲溶液和酶溶液的加入及萃取静置的温度对萃取效果几乎没有影响。但当体系中加入酶溶液后,萃取体系在常温(20℃)下静置10 min后分层并不好,可能是由于脂肪酶溶液中的蛋白质有一定的起泡作用所导致的,但是60℃静置10 min能较好地分层。

2.3 橄榄油乳液中脂肪酸的萃取率

同体积的含油酸浓度不同的橄榄油底物乳液,在相同的萃取条件下,用异辛烷萃取油酸,用分光光度法测定萃取液中的油酸浓度(根据图1的标准曲线),由测定结果推算底物中油酸的浓度(假定油酸被完全萃取)。测得的底物乳液中油酸的浓度和其实际浓度之间的关系见图2。

由图2可以看出,在异辛烷萃取脂肪酸过程中,异辛烷不可能完全萃取出底物中的脂肪酸,油酸在两相间有一定的分配行为,在实验的萃取条件下,油酸在两相中的分配系数为5.13。由其回归方程可得,在采用的萃取条件下油酸的萃取百分率为83.68%。因此,在测定脂肪酶活力时,必须对根据图1计算得到的脂肪酸的浓度进行修正,修正系数为1.195。

2.4 酶浓度曲线

在酶活力检测中,要求底物的浓度远大于酶的浓度,因此,必须对酶溶液进行适当的稀释,使测定结果在线性范围区间。2.00 m L橄榄油底物乳液中,加入不同稀释倍数的脂肪酶UG,在p H7.5的磷酸盐缓冲溶液中,按改进的铜皂-分光光度法进行活力测定,酶的稀释程度和产生的脂肪酸铜皂的吸光度曲线见图3。

图3表明,该方法条件下(即40℃下反应15min),形成脂肪酸铜皂的吸光度(OD值)的线性范围为0.154~0.291,对应着,进行酶活力的检测时,酶溶液应稀释至3~5 U/m L。

2.5 脂肪酶活力的检测结果

2.5.1 两种方法测定结果重复性比较

在p H7.5的缓冲溶液中,分别用滴定法和改进铜皂比色法测定脂肪酶UG的活力,分别进行多次检测,考察两种方法检测结果的稳定性,见表3。

滴定法由于缓冲溶液和乳化液对滴定的影响而使得测定结果准确度和重复性差,而改进铜皂比色法先萃取出脂肪酸,避免了上述因素的影响。如表3所示,改进铜皂比色法测定结果的重复性明显优于滴定法。表3中滴定法的RSD与文献[10,11]数据一致。

2.5.2 脂肪酶的活力-pH值曲线

在测定脂肪酶p H曲线过程中,如用硼酸盐或铵盐缓冲系统,由于它们在p H8~10范围内缓冲性强,对中和滴定的终点难以准确判断,滴定的结果重复性差,而且比磷酸盐缓冲溶液中测定值大数倍。当p H值≥9时,不能直接用碱液滴定[17],只能进行反滴定,即在碱性条件下酶促油脂水解后,再加足量的酸使生成的脂肪酸皂转变为脂肪酸后再滴定。棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸的p Ka值分别为[18,19]:8.6~8.8、10.15、9.85和9.24,在水溶液中这些脂肪酸的溶解性差,因此在以酚酞为指示剂的滴定过程中,脂肪酸不能被完全中和。综上所述,碱滴定法在测定脂肪酶p H曲线上具有较大的局限性,分光光度法测定产生的脂肪酸避免了弱酸弱碱的滴定问题。

图4和5为两种方法测定的酸性脂肪酶AD和碱性脂肪酶UG的初始p H值-活力曲线。可以看出,铜皂法测定值大都在拟合的曲线上,而滴定法,最大活力点偏离曲线,结果误差较大。铜皂比色法测得的两种酶的最适p H值范围,都比滴定法测定的要宽,更接近实际的使用情况。大部分情况下,铜皂比色法测定的酶活力值高于滴定法(前者的曲线在后者之上),主要是因为滴定法中,脂肪酸的p Ka较大,在酚酞变色时,还不能完全被滴定的碱中和。

3 结论

开发了一种适应性更广、更适合制革条件下的脂肪酶活力的检测方法。用聚乙二醇-橄榄油水乳液为底物,在水包油的乳液中进行酶促反应(更接近制革过程),采用无毒的异辛烷代替苯萃取乳液中脂肪酸,并以铜离子对脂肪酸显色,通过铜皂-分光光度法检测生成的脂肪酸的量计算出酶的活力。结果表明,在优化的萃取条件下脂肪酸的回收率为83.68%,该方法的线性范围为OD值0.154~0.291。改进的铜皂-分光光度法测定结果的重复性优于滴定法。由于该方法的测定不受反应体系的缓冲性的影响,测得的酶活力-p H曲线更准确。

脂肪酶测定 篇2

该方法在对不同来源的脂肪酶活力测定较为常见, 但由于没有统一的国家或地方性的标准, 该研究对各个条件进行了优化, 在该体系条件下所测酶活力达到最大, 说明此时为最适条件。从而建立一套准确性高、重现性好的脂肪酶活的测定方法[1]。

2试剂和溶液

脂肪酶 (食品级, 深圳绿微康生物工程有限公司) ;脂肪酸 (分析纯, 天津市恒津化学制剂制造有限公司) ;橄榄油 (分析纯, 国药集团化学试剂有限公司) ;吐温-80 (分析纯, 上海苏懿化学试剂有限公司) ;醋酸铜 (分析纯, 天津市恒津化学试剂制造有限公司) ;正己烷 (分析纯, 天津市大茂化学试剂厂) 其他均为国产分析纯;0.05mol/L磷酸盐缓冲液 (p H=7.5) 。

3仪器和设备

磁力搅拌器、高速离心机、振荡器、超声仪、分光光度计等。

4试验

4.1显色剂用量对吸光度的影响

本方法所用显色剂使用5%的醋酸铜溶液, 加入吡啶并将p H调至6.1, 在波长为710nm时, 铜皂在此溶液的吸光度最大, 所以此法配制的显色剂较为理想。但显色剂的添加量又对最终吸光度的影响较大, 添加过少或过多都不能真实反映脂肪酸的生成量。需要试验以确定显色剂的添加量[2]。

根据本试验要求, 取脂肪酸的苯溶液4ml于100ml锥形瓶中, 依次添加0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml不同量的显色剂, 磁力搅拌2min, 静止片刻, 取上层有机相在710nm波长处测定吸光度, 同时以4ml苯作为空白样。根据显色剂用量的曲线图确定最佳用量。

4.2反应时间对测定结果的影响

酶分子和底物的反应, 在初期速度呈线性, 即为酶反应的初速度, 此阶段的时间和产物生成量呈正比, 时间的计算才有意义。时间过长, 产物产量趋于平缓, 再计算平均速度已无实际意义。

为考察时间对酶反应的影响, 设计试验方案, 其他条件如3, 反应时间分别为10、15、20、25、30min, 反应结束后根据吸光度计算不同组脂肪酸的产生量。

4.3反应体系的p H值对测定结果的影响

其它条件如3, 调节缓冲液的p H值分别为3、4、5、6、7、8、9。考察反应体系p H对酶活力测定的影响。

4.4反应体系温度对测定结果的影响

其它条件如3, 调节水浴温度分别为25、30、35、40、45、50℃, 考察反应体系温度对酶活力测定的影响。

4.5底物浓度对测定结果的影响

其它条件如3, 考察底物浓度 (橄榄油) 分别为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 (V/V) 时对酶活测定的影响。底物浓度和酶液浓度的最佳值都是相对而言的, 由于酶促催化反应存在酶饱和现象, 当橄榄油浓度低时, 脂肪酶没有完全被橄榄油饱和, 因而酶活力随着底物浓度的增大而增加。当底物浓度达到一定值后, 脂肪酶被完全饱和, 随着底物浓度增大而酶促反应速率开始放缓, 此时可测得最大酶活。

5结果与讨论

5.1显色剂用量对吸光度的影响

分别测得显色剂在不同添加量0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 ml时的吸光度分别为0.801、0.843、0.877、0.881、0.889、0.902 L/ (g.cm) 。以吸光度为纵轴、显色剂用为横轴作图, 得到图1所示显色剂用量-吸光度曲线图, 从曲线中看出当用量达到1.0ml时吸光度增大不明显, 因此选取1.0ml较为合适[3]。

5.2反应时间对测定结果的影响

反应分别进行10、15、20、25、30 min后测得脂肪酸的浓度为10、14、18、21、23µmol/L。以脂肪酸浓度对反应时间作图, 即得到图2所示曲线, 由图可看出, 反应前25min曲线呈线性, 该段时间内酶促反应处于初速度阶段, 而为了检验步骤的简便, 同时在保证结果准确的情况下, 选取20min为宜。

5.3反应体系的p H值对测定结果的影响

该组试验分别在p H为3、4、5、6、7、8、9条件下进行, 通过对缓冲溶液调节酸碱度实现, 经过反应后得到的结果以百分比的形式表示, 以测得酶活的最大值为100%, 结果分别为21%、44%、79%、88%、97%、86%、15%。用百分比对p H作图, 得到如图3所示曲线, 由图可看出反应最适p H为7, 较低或较高的酸碱度都对结果影响较大。

5.4反应体系温度对测定结果的影响

该组试验分别设置不同的温度进行反应, 分别为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃, 经过反应后得到的结果以百分比的形式表示, 以测得酶活的最大值为100%, 结果分别为51%、93%、98%、89%、58%、5%, 用百分比对温度作图, 得到如图4所示曲线, 由图可看出反应的最适温度为35%左右, 30%以下、45%以上酶的活力急剧下降降幅在50%左右, 这是由于高温下酶分子的空间结构遭到破坏, 酶失去活性, 不再具有降低反应活化能的功能, 而温度过低自然会降低酶反应的速率[4]。

5.5底物浓度对酶活测定的影响

该组反应分别添加不同量的橄榄油, 分别为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 (v/v) , 反应产生的脂肪酸浓度分别为1.10、1.40、1.62、1.90、2.11、2.20µmol/L.min。以脂肪酸浓度对底物浓度作图, 得到如图5所示曲线, 由图可看当底物浓度超过0.3时反应速度增加缓慢, 不呈线性关系, 为了保证结果的准确性, 选取0.25为添加浓度[5]。

5.6注意事项

(1) 固体酶粉的处理应确保酶分子充分浸提, 稀释定容过程中应防止交叉污染, 否则对结果的影响较大。酶液配制完成后应在12h内使用。

(2) 试验过程中发现, 形成微乳液的水来自酶液, 而水含量对酶活又有较大影响, 因此酶液的体积应准确控制。同时, 试验中为降低反应体系中水的生成量, 可采用在低压环境下进行。

6结论

该方法采用分光光度法, 与滴定法相比较而言有较高的灵敏度和可重复性, 失误率也较低, 可作为脂肪酶活性测定的一个可靠方法。不足之处是该方法的反应条件有待更加严谨的确定, 可以采用正交分析法或响应面分析法, 设计出多因素、多水平、数据更加精确的数据, 综合分析出最优的组合, 从而使结果更加接近真实值。该方法的研究也在一定程度上对酶促反应的基本理论的完善奠定了基础, 为行业进一步提高脂肪酶检测的效率和准确率做出了贡献。

摘要：针对该分光光度法, 在研究过程中任何一个因素的改变都会对测定结果造成偏差, 为此对各个因素进行了优化:体积比为0.25的橄榄油微乳液4ml、酶液1ml、体系温度35℃、体系pH7.0、反应时间20min。在该组合条件下所测酶活数值为最大。

关键词：脂肪酶,活力测定,分光光度,条件优化

参考文献

[1]郑毅, 叶海梅.脂肪酶活力测定研究进展.工业微生物, 2005, 35 (04) :36.

[2]张海燕, 丁玉.脂肪酶活力测定的最新研究.生物学通报, 2007, 42 (03) :16.

[3]廖朝晖.在有机介质中固定化脂肪酶反应特性及其动力学研究.南昌大学学报 (理科版) , 2000, 24 (04) :326-331.

脂肪酶测定 篇3

脂肪酶是一种广泛应用的工业酶, 目前使用最多的是中温酶, 其最适温度一般都在50℃左右。同中温酶相比, 低温脂肪酶具有极高的催化常数值, 同时有较低和较稳定的米氏常数值, 其主要特征是具有较低的活化能和低温下的酶活力, 在某些领域有着中温脂肪酶所不可比拟的优越性, 因此在洗涤业、食品加工、生物制药、环境生物技术等领域有着广阔的应用前景[1]。

一、低温脂肪酶的应用

脂肪酶 (Lipase) 是一类能作用于甘油酰基, 并能水解甘油与脂肪酸形成的酯键, 而且能在有机相中催化酯化、转酯、醇解和氨解等多种反应的物质[2]。按其作用特点主要分为碱性脂肪酶、酸性脂肪酶、耐热脂肪酶和低温脂肪酶[3]。

随着工业生物技术的不断发展, 低温脂肪酶在工业生物技术领域的应用逐渐成为研究的热点, 它可在低温环境下催化多种化学反应, 如水解、酯化、转酯及脂类手性合成等, 广泛地应用于洗涤剂、食品、医药、制革、纺织及废物处理等领域[4], 表1列出了微生物脂肪酶在工业生产中的主要应用领域及其作用[5]。

二、产低温酶微生物

通常, 产低温酶微生物主要为适冷微生物。在地球上, 适冷微生物资源丰富, 近年来欧美及日本的科研人员对极地微生物的潜在应用性方面, 尤其低温酶的理化性质、适冷机制及其应用研究方面做了大量的工作, 取得了较大的进展, 而国内对此方向的研究进展较为缓慢[6]。目前报道的大部分低温酶都分离自低温微生物, 但这并不意味着低温微生物产生的所有酶都是低温酶, 在低温微生物中有些酶是以同工酶形式存在, 而这些同工酶对热的敏感性并不相同。

在相当多的情况下低温菌细胞中的酶最适反应温度要比来自中温菌和高温菌的同类酶反应温度低。因而, 利用低温微生物来筛选得到在低温下具有较高活性的低温酶, 具有较高的可行性。

㈠适冷微生物及其分布 适冷微生物也叫低温微生物。它是一群能在低温环境下生存的微生物, 一般分为两类:一类是必须生活在低温条件下, 在0℃可生长繁殖, 最适温度不超过20℃的嗜冷菌;另一类是在0~5℃可生长繁殖, 最适温度可达20℃以上的耐冷菌[7]。

嗜冷菌主要分布于南北两极、高山和深海等常冷的低温环境中, 而耐冷菌则分布广泛[8]。嗜冷菌对温度的变化极为敏感, 当温度超过最适温度时, 很快引起死亡, 其分布受到环境的影响较大, 分布区域较小;相对来说, 耐冷菌对环境温度的择取范围较大, 从常年稳定的低温环境到不稳定的环境中均可分离到。最早的低温微生物是由Forster发现的, 他于1887年报道在冷冻保存的鱼中分离到能在0℃以下生长的细菌[9], 之后一些学者又相继从南极土壤、深海、冰川和积雪等低温环境中分离出多株冷适应微生物, 它们分属于真细菌、蓝细菌、酵母菌、霉菌、藻类及古生菌等[10]。

地球表面大部分地区属于低温环境, 其中90%属于低于5℃的海洋环境, 其余为包括永久冻结带、冰川、极地冰山以及雪山等环境, 这些环境中都存在着大量的低温微生物, 是低温酶的主要来源[11]。

㈡低温微生物适冷机制 早期对低温微生物适冷机理的研究多集中在嗜冷酶的分离和适冷特点, 但仅通过酶学性质来研究低温微生物的适冷机理有其局限性, 细胞膜在低温条件下流动性的保持以及新陈代谢的调节也是低温适应性机理中非常重要的部分[12]。同时, 对低温微生物胞内物质的研究, 如冷休克蛋白、抗冻蛋白、小分子化合物, 也证明微生物的耐冷性更趋向于整个细胞的适应, 而不仅仅是某一分子特性的改变。近期的研究结果显示:低温环境中的微生物自身形成了一些特殊的机制来适应低温, 如通过提高细胞内液态水的黏度, 降低酶的活性;合成一些低温酶来维持细胞基本代谢;抑制DNA和RNA异常结构的形成;调节细胞膜膜脂的组成来维持膜的流动性等[13]。据已有报道, 低温微生物的适冷机制主要有如下几类。

1. 调节膜脂的组成。膜脂的组成提供了膜流动和相结构的前提条件, 从而保证胶中镶嵌的蛋白质发挥正常的功能。膜中脂类的改变会引起膜流动性的改变, 因此微生物必须通过调节脂类的组成, 从而调节膜的流动性和相结构以适应环境的变化。比如在低温时, 最常看到的变化是微生物中不饱和脂肪酸的比例增加, 而比较低温条件下的中温酵母和嗜冷酵母, 可清楚地发现嗜冷酵母合成的不饱和脂肪酸含量增加。这是由于中温菌在接近0℃时溶质吸收不活跃, 其细胞膜中的运载蛋白对冷敏感, 溶质分子不能与相应的运载蛋白结合, 且在低温条件下由于能量缺乏不能支持营养物质的跨膜运输。但对嗜冷酵母菌株的研究发现, 只有冷适应微生物能在2℃运转葡萄糖[14]。

当细菌处于低温时, 除了不饱和脂肪酸的改变外尚有其他变化, 如酰基链的长度缩短、脂肪酸支链的比例增加, 以及环状脂肪酸的比例减少等。所有这些变化对于低温时维持膜的流动性具有重要意义, 而膜的流动性也为营养物质的转运和吸收提供了基础。

2. 合成冷休克蛋白。冷适应微生物适应低温的另一机制是合成冷休克蛋白 (CSP) 。冷休克蛋白首先是在大肠杆菌中发现的, Jores等[15]将大肠杆菌细胞从37℃突然转移到10℃时中时发现, 它们会诱导生成一组冷休克蛋白, 而这些蛋白对低温的生理适应发挥着重要作用。此后, 又有学者对这一组蛋白的冷休克反应做了一系列研究, 发现在冷刺激后冷休克蛋白会在很短的时间内大量产生。

有些分离自南极的耐冷细菌在22℃和4℃时冷休克基因能正常表达, 当温度从22℃突然降到4℃后的1小时, 冷休克蛋白和m RNA表达量最大。耐冷菌由于生活在温度波动的环境中, 它们必须忍受温度的快速降低, 因而其耐受能力通常与它们产生的冷休克蛋白密切相关。

3. 独特的蛋白质结构。冷适应微生物中的蛋白质在低温条件下能保持结构上的完整性, 这可能是由于其蛋白分子含有更多的氢键和盐键从而能形成相对松动和具有弹性的结构。以嗜冷酶蛋白为例, 通过对嗜冷酶的蛋白质模型及X-射线衍射分析表明:嗜冷酶分子间的作用力减弱、溶剂的作用加强及酶结构的柔韧性增加, 能使酶在低温下更容易被底物诱导产生催化作用, 而当温度提高时, 嗜冷酶的弱键容易被破坏, 酶便变性失活。例如:从南极海水中分离到的枯草杆菌蛋白酶与Novo公司的嗜温枯草杆菌蛋白酶相比较, 前者肽链较长, 酶分子中的盐键数量较少, 芳香作用较低, Ca2+亲和力较小, 与溶剂的相互作用较强。虽然活性中心序列是保守的, 但由于这些变化有利于增加酶的柔韧性, 因而使得南极海水中分离到的枯草杆菌蛋白酶在低温条件下更容易与底物结合。

此外, 冷适应微生物具有在0℃合成蛋白质的能力。这是由于冷适应微生物的核糖体、酶类以及细胞中的可溶性因子等对低温有一定的适应。体外实验表明, 在同样低温条件下冷适应微生物体外蛋白质翻译的错误率最低。许多中温菌不能在0℃合成蛋白质, 一方面是由于其核糖体对低温不适应, 翻译过程中不能形成有效的起始复合物;另一方面是由于低温条件下细胞膜的破坏会导致氨基酸等内容物的泄露。由此可见, 冷适应微生物适应低温的能力表现在蛋白质合成过程中翻译机制的适应性, 以及在低温条件下保持完整膜结构的能力。

4. 低温酶的存在。低温微生物能在低温环境中存在, 是由于它自身的酶能在低温条件下有效地发挥作用, 这从生理代谢及生化特征方面, 都为它的生存提供了良好的保障。自1996年A ghajari等人[16]第一次阐明嗜冷菌淀粉酶的三维晶体结构以来, 科学家们已经先后对Ca-Zn金属蛋白水解酶、磷酸丙酮酸异构酶、柠檬酸合成酶以及苹果酸脱氢酶进行了晶体结构分析, 这些酶均是南极的嗜冷菌分泌的产物。从它们的三维结构可以看出, 这些酶与适中温微生物产生的酶不同[17]。低温酶所特有的一些结构能使酶分子内基团之间的相互作用减弱, 使酶和溶剂分子的相互作用增强, 而这些变化又使得它具有较强的柔韧性, 更易与底物结合, 进而减少了酶促反应能量的消耗, 提高了酶催反应活性。但同时, 松散、柔顺的蛋白质分子结构又会导致低温酶在常温或高温条件下的热不稳定性增强[18]。

一般来说, 酶的比活性和它的热稳定性是密切相关的, 蛋白质的热稳定性主要来源于蛋白质分子的刚性。刚性的增强使得酶与底物的相互作用受到影响, 从而导致酶活性的下降;相反, 柔性的增加使得酶促反应能量消耗的减少, 从而提高了酶的催化活力。

三、结语

脂肪酶固定化工艺研究 篇4

关键词：脂肪酶,固定化,工艺

引言

有机相酶催化是目前生物技术中一个颇具基础性和应用性的研究领域。有许多有机化学反应已可由酶催化来实现。近年来对酶在有机介质中的催化作用的研究越来越多, 并且越来越深入。法国的Langrand etal.[1]1990年报道用13个不同来源的商用脂肪酶催化一些芳香酯的合成。然而, 目前脂肪酶在油脂化学品开发中应用的主要障碍之一是经济费用。为了降低酶催化法的成本, 许多国家如日本、美国、印度等竞相开展了固定化脂肪酶的研究。固定化脂肪酶具有可以回收, 重复使用, 稳定性高, 产品质量高等优点。脂肪酶的固定化技术在工业生产的连续化和自动化上的应用也具有重要意义。

本研究考察了不同种类固定化载体对该脂肪酶活性的影响, 确定了其最佳固定化条件, 为后续有机相酶催化合成工作奠定了基础。

1、实验材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料

芳樟醇:ω (芳樟醇) >97%, 上海石油化工股份有限公司化工研究所;乙酸酐:AR, 中国医药 (集团) 上海化学试剂公司, 使用前均经3A分子筛除水。

回转式恒温调速摇瓶柜, 上海智诚分析仪器制造厂;Perkinelmer高效气相色谱, 美国珀金埃尓默仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脂肪酶的固定化方法:

吸附法, 涂布法。

(1) 水相吸附法:移取10mL酶液, 加入一定量的预处理好的载体, 于30℃摇床中振荡4h, 抽滤, 用缓冲溶液洗涤, 干燥得固定化酶。

(2) 载体涂布法:移取10mL酶液, 加入一定量的预处理好的载体, 搅拌均匀, 30℃真空干燥得固定化酶。

1.2.2 脂肪酶水解活力测定和单位

采用聚乙烯醇橄榄油乳化液法[2]:4m L 4%的PVA (聚合度1750) 橄榄油乳化液和5 mL

0.025mol/L pH7.0缓冲液1mL酶液, 37℃反应15min后, 加入15mL 95%乙醇终止反应, 用0.05mol/L NaOH溶液滴定, 酚酞为指示剂。一个脂肪酶国际单位定义为:在测定条件下, 每分钟释放出1μg分子脂肪酸的酶量。

2、结果与分析

2.1 脂肪酶固定化方法的选择

固定化技术是使酶更广泛、更有效应用的一种重要手段。任何一种限制酶自由流动的技术都可以用于制备固定化酶。目前, 用于制备固定化酶的方法种类繁多, 新方法也层出不穷。综合考虑酶与载体之间的作用力, 固定化酶的状态、载体来源及酶的制备过程等因素, 传统的酶固定化方法大致可分为4类:吸附法[3]、涂布法[4]、包埋法[5]、共价结合法[6]。本实验主要采用涂布法和吸附法对脂肪酶进行固定化。

2.2 脂肪酶固定化载体及条件优化

2.2.1 载体对固定化酶活力的影响

固定化脂肪酶的可用载体非常多, 既有惰性的硅藻土硅胶和玻璃珠等[7,8], 也有阴离子交换树脂。从一些文献中可以看出, 载体对固定化脂肪酶的活力影响较大, 作者采用大孔树脂, 硅藻土, 活性炭, 壳聚糖四种载体作比较, 在进行酶活力测定后发现, 大孔树脂的酶活明显高于其它3种载体, 因此, 选择大孔树脂作为本研究的载体。

2.2.2 加量对固定化效果的影响

图1是在酶量为400 mg, pH为8.0, 浓度为0.1 mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液, 固定化温度为30℃左右时, 不同大孔树脂加入量对酶固定化效果的影响。

2.2.3缓冲液p H值对酶固定化的影响

图2是在酶用量400mg, 大孔树脂为1.00g, 固定化温度为30℃左右。以0.1mol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液, 考察了不同pH值的磷酸盐缓冲溶液对酶固定化效果的影响。缓冲溶液的PH值是影响固定化酶活力的重要因素, 酶固定化时对缓冲溶液的p H值有“记忆效应”。如图2所示, 在pH为6.4时制备的固定化酶活力最大。

2.2.4 缓冲溶液对酶固定化效果的影响

表1是在脂肪酶用量为300mg, 大孔树脂用量为1.00g, 温度为35℃, pH为6.4, 0.1mol/L的3种缓冲溶液对吸附效果的影响。

由表1可知, 缓冲溶液种类对酶固定化效果影响较大, K2HPO4-KH2PO4为缓冲溶液固定化脂肪酶, 其水解酶活最大。

3、结论

通过测定固定化水解酶活可知:大孔树脂作为固定化载体时水解酶活较高, 在p H为6.4, 树脂与酶质量比为2.5:1, 缓冲液为K2HPO4-KH2PO4时, 为最佳固定化条件。

参考文献

[1]Langrand G, Rondot N, Triantap Hylides C, et al.Short chain flavour esters synthesis by microbiol lipases[J].Biotechnology Letters, 1990, 12 (8) :581-586.

[2]秦昉.碱性脂肪酶测定方法的探讨.无锡轻工大学学报, 1998, 17 (1) :31-34

[3]Allal B, Jacques F, Jacques L, et al.Adsorption of succinylated, lysozyme on hydroxyapatite[J].Journal of Colloid Interface Science, 1997, 189:37-42.

[4]Quinn Z, Zhou K, Chen X D.Immobilization ofβ-2galactosidase on graphite surface by glutaraldehyde[J].Journal of Food Engineering, 2001, 48 (1) :69274.

[5]Markvicheva, Elena A.Immobilized enzyme and cells in poly (Nvinyl caprolactam) based2hydrogels[J].Applied Biochemical Biotechnology, 2000, 88 (123) :145-157.

[6]Yesim Y.Utilization of bentonite as a support material for immobilization of Candida rugosa lipase[J].Process Biochemistry, 2005, 40:2155-2159.

[7]Prady, C.Mecalfe, L, Slaboszewaki, D, et al.JAOCS, 65:917, 1988.

脂肪酶测定 篇5

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种:

作者实验室从南宁、百色等地筛选保存,菌种采用分子生物学的方式对其种属进行鉴定,被鉴定为Serratia marcescens。

1.1.2 试剂:

p-NPP购自Sigma公司,蛋白胨、酵母粉、蔗糖、葡萄糖等生化试剂为进口或国产分析纯。

1.1.3 培养基

种子培养基:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,大豆油0.5%,K2HPO4 0.2%,MgSO4 0.05%(pH7.0)。

初始产酶培养基:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,1%蔗糖,K2HPO4 0.2%,大豆油1%,MgSO4 0.05%,CaCl2 0.01%,吐温80 1%,FeSO4 0.001%(pH7.0)。

1.2 方法

1.2.1 接种和发酵

将菌种接到种子培养基中培养过夜后,按2%的接种量吸取一定量的种子液到发酵产酶培养基中。在培养温度为30℃、转速为160r/min的摇床中发酵18h,获得的发酵液在4℃以10 000 r/min离心5min,收集上清液即得粗酶液。

1.2.2 脂肪酶活力测定方法—分光光度计法[7]

A液:16.5mmol/L的对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)的异丙醇溶液。

B液:含有0.4% Triton X-100和0.1%的阿拉伯树胶的50mmol/L Tris-HCl)缓冲液(pH 8.0)

进行酶活测定时,将相应的A液与B液以1∶9(体积比)的比例混和,取100μL的粗酶液加入900μL上述混合液中,于40℃反应10min,立即加1mL无水乙醇将酶灭活后,于可见光(410nm)下读取光吸收值。在此条件下,对硝基苯的消光系数是1.46×105cm2/mol。

酶活(U)单位定义:每分钟分解p-NPP产生1μmol对硝基苯酚(黄色)所需的酶量定义为一个酶活单位。

2 结果与分析

2.1 最适碳源的选择

改变初始产酶培养基中的碳源的种类,分别以1%的葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、麦芽糊精为碳源进行最适碳源的筛选。实验结果见图1,由图可知,以麦芽糊精为碳源时发酵液脂肪酶活力最高,为12.5U/mL,表明麦芽糊精是最适碳源。其次为可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖。

2.2 最适氮源的筛选

以麦芽糊精为碳源,分别以2%的蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、尿素、硫酸铵为氮源进行最适氮源的筛选。实验结果见图2,以蛋白胨为氮源时发酵液脂肪酶活力最高,为2.92U/ mL,表明蛋白胨是最适氮源。其次为酵母提取物、牛肉膏、尿素、硫酸铵。

2.3 Plackett-Burman设计筛选影响产酶的主效因子

依据已确定的碳源和氮源,选用N=11的Plackett-Burman试验设计,其中有三项为误差项,对可能影响产酶的8个因子[8]进行了考察。每个因子取高、低两个水平(+1、-1)。Placket-burman实验设计及响应值见表1所示。

按模型贡献率大小可以知道对酶活产量有较大影响的依次为:蛋白胨、CaCl2、吐温80、大豆油、初始pH、温度、KH2PO4、糊精。其中初始pH、温度、KH2PO4、糊精对产酶影响不大(模型贡献率小于2)。CaCl2、吐温80、初始pH对产酶呈现出一定的正效应。

要提高脂肪酶的产量,就要减少营蛋白胨、大豆油的含量,而增加CaCl2和吐温80的浓度有助于产酶。在此认识的基础上,设计了如下的最陡爬坡实验。

2.4 最陡爬坡实验

响应面拟合方程只有在考察的临近区域里才能充分近拟真实情况[9],根据Plackett-Burman法筛选出的显著因子效应大小设计它们的步长,进行最陡爬坡试验设计,寻找最大产酶区。试验设计及结果如下表4所示,最大产酶区在第4次附近,故以实验4的条件为响应面实验因素水平的中心点。

2.5 响应面优化重要因素的最佳浓度

2.5.1 二次回归模型拟合及方差分析

实验采用Design-expert系统提供的Box-Behnken正交试验,一共25组实验,实验设计及结果如表4所示。

不同模型方差分析中的均方及检验结果综合来看,二次方程模型的拟合效果比较好。因此,通过Design-Expert软件进行方差分析来验证该二次方程模型及各参数的显著度,结果见表5。

表中P值小于0.05时,模型或因素对酶活有显著影响,小于0.01表示影响高度显著,大于0.1表示对酶活影响不显著。

所构建的模型(线性回归方程)为:

酶活=60.20+28.61×A+16.31×B-2.75×C-6.54×D+5.57×A×B-1.33×A×C-0.51×A×D-2.51×B×C-6.22×B×D-3.65×C×D-17.71×A2-1.27×B2-2.71×C2-7.41×D2

该模型的P值小于0.05,决定系数R2为0.9385,精密度(Adeq Precision)为11.684(大于4),该模型该模型在被研究的整个回归区域拟合很好。可以使用该模型来分析响应值的变化。其中蛋白胨、CaCl2 、大豆油对产酶的影响最大。

图3为拟合模型的残差分布图,如图所示,各点的残差几乎分布在一条直线上,因此模型的拟合情况良好。

2.5.2 响应面交互作用分析与优化

由表6可知,在四因素的交互作用下,它们对产酶的影响顺序为:(CaCl2*大豆油)BD>(蛋白胨*CaCl2)AB>(吐温*大豆油)CD>(CaCl2*吐温)BC>(蛋白胨*吐温)AC>(蛋白胨*大豆油)AD。其中AB为正效应,其余为负效应。

通过Design-expert软件[10]对试验参数进一步优化,即在获得最佳的产酶情况下,各参数的取值最优方案。表6为获得最佳产酶量时的优化方案,从下表可以看出:在蛋白胨为0.7%,CaCl2 0.3%吐温 1.68%, 大豆油1.81%时可获得最佳的产酶量,产酶量达到97.52U/mL。

3 讨论

粘质沙雷氏菌是重要的产脂肪酶细菌,它所产的脂肪酶具有在有机溶剂稳定性好、广泛的底物特异性和异构体选择性[11],它不仅可以合成冠状动脉血管扩张剂地尔硫卓的手性前体[12],还可以用于转酯化反应生产生物柴油。因此研究和开发本该细菌产生的脂肪酶,对于扩大脂肪酶的应用领域具有现实意义。为了高效地筛选产酶条件,本实验采用响应面法进行产酶条件的优化。Plackett-Burman 设计法和响应面分析法是20世纪中叶后发展起来的优化试验条件统计学方法[13],能用较少的实验数据推算出目标值的优化条件,优化效率高,在微生物发酵方面已有广泛应用[14]。本研究在产脂肪酶粘质沙雷氏菌初始酶活的基础上,通过逐因子试验确定其最适碳源和氮源分别为麦芽糊精和蛋白胨。在此基础上,运用Plackett-Burrman设计在众多影响产酶因素中快速有效筛选出主效因素蛋白胨、CaCl2、吐温80和大豆油。考虑到4因素工作量太大,对前3个因素模拟一阶线性模型以指导运行参数快速进入最优点临近区域,然后沿着一阶线性模型指定的路径进行最速上升试验以逼近产酶最大区域,在上升最高点处进行了真实反应面模拟,通过求函数最大值得到产酶最高点处主效因素参数设置,试验证明我们模拟的二阶模型可以较好预测实际发酵情况,预测最高发酵液酶活力为97.52U/mL,在该培养条件下进行实验,得到实际发酵酶活为95.2U/mL,与模型预测值基本吻合,这说明该模型是合理有效的。

4 结论

脂肪酶测定 篇6

制革用原料皮内一般都含有油脂,特别是猪皮、绵羊皮等多脂皮,油脂的存在将会阻碍水介质中化学材料向皮内的渗透以及与皮纤维上活性基团的反应[1],而且油脂水解产生的脂肪酸与后续工序的Ca2+、Cr3+等金属离子形成不溶性的金属皂,不利于染色的均匀性[2],所以必须对多脂皮进行脱脂。脱脂是制革和毛皮加工业的关键工序之一,皮张脱脂效果对成品的质量具有重大影响[3]。只有将裸皮所含天然油脂脱除到一定程度,才能使胶原纤维松散并使成革达到理想的效果,脱脂不良将影响到鞣制、染色及效饰等后续工艺,并导致成革手感僵硬、表面油腻感增强、涂层脱落掉浆以及染色不均等缺陷,严重影响成革的等级率。脱脂工艺可以分为机械去脂和化学去脂,对于脂含量高的皮张既要采用机械去脂,又要采用化学去脂,才有可能将皮上的脂肪尽可能地去除干净。

目前国内外常用的脱脂方法有溶剂脱脂法、皂化脱脂法和乳化脱脂法3种,传统的溶剂法的脱脂效果好,但需要使用有机溶剂,有毒性,使用安全性低和成本高等;皂化法主要进行表面脱脂,存在脱脂不完全的问题;乳化法脱脂是目前常用的方法,对于油脂含量高的原皮,需要使用大量的乳化剂(有时甚至超过皮质量的10%),而大量乳化剂的使用,将产生环境污染问题,同时对皮革防水性雾化值产生不良影响[4]。因此,探寻开发皮革及高档毛皮的高效无污染脱脂剂,具有十分重要的意义。

酶法脱脂主要是指将不溶于水的油脂水解成能溶于水的小分子进而除去油脂的方法。同传统的脱脂方法诸如皂化法、乳化法和溶剂法等相比,酶脱脂的主要优点表现在以下几方面:脂肪酶水解并分散脂肪,不仅对表面油脂具有较好的去除作用,而且能将位于生皮深层的纤维间的游离脂肪水解。因而皮纤维间能充分且均匀充水,达到快速、均匀的浸水效果同时由于脂肪酶只作用脂肪,对纤维蛋白无破坏作用,因而浸水更安全。纤维间脂肪的去除使得后续化料能够容易渗入和作用,也使浸灰化料及软化酶能对纤维充分分散。在浸水、浸灰、软化等工序中使用脂肪酶,裸皮表面更平整、洁净无油腻;对于多脂皮的脱脂,可以避免使用溶剂脱脂,从而降低生产成本;表面脂肪的去除及纤维充分分散,带来的较多活性基团,使得染料能较多牢固地结合在皮革表面,颜色也会更鲜艳、均匀;可以提高成革质量,尤其是改善绒面革的质量,有利于制造低雾化值的汽车坐垫革。脱脂废液中的油脂更易分离回收[5]。有些酶脱脂废液作为中性有机物溶液可以作农田肥料[6]。在制革准备工段使用脂肪酶能有效地分解掉天然脂肪外的保护膜,使得脂肪更容易被除去,提高了产品质量并大大减少了表面活性剂和硫化钠等的用量[7],酶法脱脂能促进清洁化制革工业的发展。但目前国内商品化的制革专用脱脂酶的研究和开发,仍存在诸如成本高、原料利用率低等亟需解决的问题,因此对脂肪酶的进一步研究仍是需要重点关注的问题。

脂肪酶ZG是从油田边缘土壤中分离得到的黑曲霉菌株,经过基因改良后的基因工程菌产生的,能够催化动物油脂生成脂肪酸甲酯,专门用于生物柴油的合成制备工艺。同时由于又能水解脂肪,近年来已经在动物饲料的生产中得以应用。在饲料中添加脂肪酶ZG能增进家畜对油脂的消化吸收,提高油脂类饲料原料的能量利用率。基于脂肪酶ZG能够水解动物脂肪的特性,考虑将其引入皮革领域作为脱脂酶使用。

本文将对目前用于生物柴油合成的脂肪酶ZG进行制革性能应用研究,期望将其开发为皮革及高档毛皮的高效无污染脱脂剂。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试验材料

脂肪酶ZG,工业级(出厂酶活3万U/mL),胜达科技股份有限公司;

橄榄油、聚乙烯醇1799、磷酸二氢钠,分析纯,成都市科龙化工试剂厂

异辛烷,分析纯,天津市美琳工贸有限公司;

乙酸铜,天津市瑞金化学品有限公司;

无水乙醇,分析纯,成都长联化工试剂有限公司;

吡啶,分析纯,天津市科密欧化工试剂有限公司;

十二水合磷酸氢二钠,分析纯,广东省化工试剂工程技术研究开发中心;

脱脂剂TF-B,工业级,四川祥兴科技有限公司。

1.1.2 试验仪器

UV-1100型紫外可见分光光度计,上海美谱达仪器有限公司;

WH-2微型漩涡混合仪,上海沪西分析仪器有限公司;

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器,郑州长城科工贸有限公司;

BS-124S电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司;

DHG-9053 A型电热恒温鼓风干燥箱,上海精宏实验设备有限公司;

QZX-C空气振荡器,哈尔滨市东明医疗器械厂;

81-2型恒温磁力搅拌器,上海司乐仪器厂;

pHS-2C酸度计,上海大中分析仪器厂。

1.2 脂肪酶ZG的酶学性能研究

1.2.1 改进铜皂法测定脂肪酶ZG活力

脂肪酸铜皂标准曲线:配置不同浓度的脂肪酸(使用的是油酸)异辛烷溶液,然后取5.00mL于试管中,加入1.00mL铜盐显色剂溶液,在Vortex-5涡旋振荡器上充分震荡约90s,常温静置至上层液清澈后,取上层清液在714nm波长下测定其吸光度,以未加脂肪酸样为空白,以此得到油酸铜皂的浓度和吸光度的标准工作曲线。

改进铜皂法测脂肪酶活操作:取4支25mL比色管,分别作为空白A和样品B1、B2、B3,分别加入2mL橄榄油底物乳液及2.5mL缓冲液,于(40±0.2)℃水浴中预热5min,加入0.5mL预热5min的脂肪酶ZG溶液,立即混匀记时,准确反应15min后,立即加入6.0mL 95%乙醇溶液以及1.0mL6mol/L HCI终止反应。混匀后向试管中加入3mL异辛烷,在WH-2微型漩涡混合仪上充分振荡90s,置于60℃恒温干燥箱中保温10min,取出,水浴冷却5min,吸取1mL上清液,加入4.0mL异辛烷与1.0mL乙酸铜/吡啶显色剂,振荡90s,上层澄清后,取有机相在714nm处检测吸光度。空白试验为振荡结束向底物乳液中加入酸和乙醇,摇匀后再加酶液,其他操作相同。

根据所测的吸光度结合脂肪酸铜皂标准工作曲线,得出产生的脂肪酸溶液的浓度,然后根据公式计算得到所测脂肪酶活力。

式中:X—脂肪酶活力,U·mL-1;

c一脂肪酸浓度,μmol·mL-1;

V—脂肪酸溶液体积,mL;

V1一酶液用量,mL;

t一作用时间,min。

试验中采用相对酶活力的表示方法,即以最大吸光度对应的酶活力为100%,其他组的酶活力为最大酶活的百分数,即为该组酶的相对酶活。

1.2.2 脂肪酶ZG的最适温度[8]

在25～70℃(间隔5℃)下分别测定脂肪酶ZG的活力,以最大吸光度对应的酶活力为100%,其它温度下的酶活力为最大酶活力的百分数,作为该酶在所对应温度下的相对酶活力。

1.2.3 脂肪酶ZG的温度稳定性

在40、45、50、55、60℃下,分别将酶液保温0、30、60、90和120min后,测酶活力变化(以相对酶活表示,%)。

1.2.4 脂肪酶ZG的最适pH值测定[9]

分别在pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的缓冲体系中,测定脂肪酶ZG的活力。

1.2.5 脂肪酶ZG的pH稳定性[10]

将脂肪酶ZG置于不同pH (pH值为5.0、V6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)的缓冲液中,25℃分别放置0、2、4、6和8h,然后分别测定酶活力(以相对酶活表示,%),以未放置的(0h)为对照。

1.2.6 金属离子对脂肪酶ZG活力的影响[11,12,13,14,15,16]

向反应体系中分别加入0.05mo1/L的NaCl、KCl、ZnCl2、MnCl2、CaCl2、MgCl2各100μL,在标准条件下分别测脂肪酶ZG的活力,以不加任何离子为对照。

1.2.7 脂肪酶ZG的皮革脱脂性能研究

为了确定脂肪酶ZG是否对制革原料皮具有脱脂效果,采用绵羊服装革工艺作为试验工艺,在主浸水阶段分别加入0.3%的化学脱脂剂TB以及0.3%的脂肪酶ZG和脂肪酶G20,脱脂结束取样,用索氏抽提法测定皮样的油脂含量。

2 试验结果与讨论

2.1 脂肪酶ZG的最适作用温度

不同温度下的酶具有不同的活性,因为每一种酶都有其最适的作用温度。温度对酶促反应的影响表现为2个方面:一是当温度升高时,反应速度加快,酶活力增加;二是由于酶是一类特殊的蛋白质,随着温度的升高,酶会因变性而失活。

以橄榄油乳液为底物,测定不同温度下脂肪酶ZG的活力,结果如图1所示。

由图1可知:当温度达到60℃时,脂肪酶ZG活力达到最大值,说明脂肪酶ZG的最适酶促反应温度为60℃。同时可以发现,该酶在40～60℃范围内均具有较高的酶活力,说明脂肪酶ZG适用的温度范围较广,能够满足制革脱脂温度不能超过40℃的基本要求。

2.2 脂肪酶ZG的热稳定性

由图2可知:在同一温度下,随着保温时间的延长,脂肪酶ZG的活力出现下降趋势,即酶的稳定性逐渐降低。在其最适作用温度60℃下,保温120min后,其剩余酶活力为30%左右,说明虽然该酶的最适作用温度为60℃,但其高温稳定性较差。相反地在40℃下保温120min,脂肪酶ZG的剩余活力仍维持在80%以上,说明该酶在此温度下具有较好的热稳定性。制革脱脂温度不能超过40℃,否则皮蛋白会发生变性。以上试验结果表明:脂肪酶ZG在40℃时的温度稳定性能够使酶在90min的脱脂过程中维持较高的酶活力,达到良好的脱脂效果。因此,能够满足制革脱脂工艺条件的要求。

2.3 脂肪酶ZG的最适pH值

pH值对酶影响很大,主要表现在2个方面:一是改变底物分子和酶分子的带电状态,从而影响酶和底物的结合;二是影响酶的结构。通常过高或过低的pH都会使酶的蛋白质结构遭受不可逆破坏,造成酶活力降低甚至失活。因此酶只有在最适pH范围内才会发挥最大的作用。

图3显示pH值对脂肪酶ZG酶活力的影响曲线呈现“马鞍”状。在pH值5.0～6.0的弱酸性范围内,脂肪酶ZG的酶活力较低,催化作用较弱。随着pH值从6.0增加到7.0,酶活力急剧增大,在pH值7.0时达到最大值,并在pH值7.0～8.0之间维持较高水平,可见该酶的最适作用pH值在7.0～8.0的范围内,属于中性脂肪酶。之后pH值继续增加,酶活力急剧减小。当pH值11时,酶活力仅为最适pH下酶活力的27.74%。

2.4 脂肪酶ZG的pH稳定性

由图4可以看出:随着酶在不同pH值介质中的稳定时间延长,剩余酶活力呈现不同程度降低;且介质pH值越高或越低,酶活力损失越大。

25℃下,在不同pH值的介质中稳定2h,当pH值为5～9时,脂肪酶ZG的剩余活力维持在90%左右,即使pH值增加到1 1,剩余活力也在80%左右,可见酶活力损失不大。在2h内,该酶在弱酸性、中性、弱碱性范围内均具有较好的稳定性。可以初步确定在90min的正常脱脂时间内,脂肪酶ZG都具有较高的活力水平,因此,ZG酶应该具有较理想的脱脂效果。

2.5 金属离子对脂肪酶ZG活力的影响

金属离子能以不同的方式与酶产生极强的亲和力,从而导致酶空间结构的改变,并且也能够与底物、酶的活性产物结合,进而引起酶活力的改变。有些金属离子会降低酶活力,被称为酶的金属离子抑制剂;有些则激发酶的催化功能,使酶活力增加,称之为酶的金属离子激活剂。

图5的试验结果显示:当金属离子浓度为0.05mol/L时,K+、Mn2+、Ca2+对脂肪酶ZG具有明显的激活作用,说明这3种金属离子与酶结合后,能够使底物与酶的活性中心更加有效地结合,因此激发了酶的催化功能,尤其是Ca2+对酶的激活作用,对脂肪酶ZG在制革生产中的应用具有重要意义。因此可以考虑在应用试验中将脂肪酶ZG应用于浸灰和复灰工序;同时在脂肪酶ZG的复配研究中,可以考虑将Ca2+作为激活剂。

Na+对脂肪酶ZG的激活虽然不明显,但也没有抑制作用,因此可以将脂肪酶ZG应用于浸水工序;而Zn2+、Mg2+的抑制作用明显,因此在脂肪酶ZG的应用过程中应注意水的Zn2+、Mg2+含量。

2.6 脂肪酶ZG的脱脂效果

相同用量下(皮质量的0.3%)的化学脱脂剂TB、脂肪酶ZG以及脂肪酶G20的脱脂效果见表1。

由表1可知:脂肪酶ZG的脱脂效果略优于化学脱脂剂TB,稍逊于进口脂肪酶G20。说明脂肪酶ZG对制革原料皮具有脱脂效果,对其进行性能优化后用于生皮脱脂是可行的。

3 结论

(1)脂肪酶ZG的基本性能研究表明:脂肪酶ZG的最适温度、pH值分别为60℃、7.0;在40℃下保温120min后,仍具有80%以上的酶活力;在25℃下,pH值5～11范围内稳定2h后,仍具有80%以上的酶活力,说明该脂肪酶的温度稳定性较好,且pH适用范围较广。初步确定该酶的基本性能能够满足制革原料皮的脱脂需求。

(2)当金属离子浓度为0.05mol/L时,K+、Mn2+、Ca2+对脂肪酶ZG具有明显的激活作用,Zn2+、Mg2+具有明显的抑制作用,Na+对其影响不大,所以该酶可以用于盐湿皮的浸水工序。

酵母脂肪酶的制备及应用新进展 篇7

1 酵母脂肪酶的制备

1.1 酵母脂肪酶的种类

1.1.1 常见的酵母脂肪酶

产脂肪酶的酵母菌主要有:皱褶假丝酵母(Candida rugosa)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、南极假丝酵母(Candida antarctica)、柱状假丝酵母(Candida cylindracea)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、双孢子毕赤酵母(Pichia bispora)、木糖毕赤酵母(Pichia xylosa) 等[4]。其中假丝酵母脂肪酶是目前应用最为广泛的脂肪酶类型。

1.1.2 新型酵母脂肪酶类型的筛选

为获得各种不同特性的新型脂肪酶,很多研究者致力于筛选和分离新的产脂肪酶酵母菌。目前筛选新型脂肪酶的研究主要集中在寻找含不同底物特异性、不同立体选择性或含极端活性(能耐受极端温度、pH、有机溶剂等)的脂肪酶。

最近,有研究者通过采用棕榈油琼脂平板水解圈法,从南极凯西站分离到一株具有脂肪酶活性的专性嗜冷菌,该菌被鉴定为白冬孢酵母属(Leucosporidium sp.)。通过考察该菌在4 ℃、27 ℃ 和37 ℃下的生长情况,发现其仅在4 ℃下生长[5]。Srimhan Purimprat等[6]采用棕榈油-罗丹明琼脂平板一步法从石油污染过的土样中筛选到一株耐甲醇的产脂肪酶酵母菌,经鉴定为Rhodotorula mucilagenosa P11I89,对棕榈油的水解活力为1.2U/ml,表现出转酯化和酯化活性。当加入6摩尔比(与底物之比)的甲醇时,能生成83.2%的脂肪酸甲酯。Kumar S.Suresh等人从印度新德里石油淤泥区的土样中筛选到一株新型的具脂肪酶活性的阿萨希丝孢酵母菌Trichosporon asahii MSR 54,其脂肪酶活力为3 U/ml,对苯乙酸乙酯呈现出S型选择性脱乙酰作用[7]。

1.2 酵母脂肪酶的制备

目前微生物脂肪酶的生产主要有液态发酵和固态发酵两种方法,而大约90%的工业生物催化剂由液态发酵产生。由于固态发酵具有耗能低、不产生废水、环境污染少、后续处理加工方便、设备简单、成本低等优点而重新受到重视[8,9]。但与液态发酵相比,固态发酵的放大比较困难,而且固态发酵中反应参数的控制有难度,目前其应用受到一定的限制。酵母脂肪酶生产一般采用液态发酵法。

1.2.1 产酶工艺优化

筛选获得高产菌株后,产酶条件的研究是生产脂肪酶的必需步骤,亦是工业化制备的前提。近年来已有许多采用响应面法优化各种发酵培养基和菌体培养条件的成功实例。Kumar S.Suresh等人[7]将阿萨希丝孢酵母菌Trichosporon asahii MSR 54产脂肪酶的培养基通过单因素实验,Plackett Burman设计和响应面设计进行优化,脂肪酶酶活提高了30倍,达到104U/ml,显示了培养基优化的作用。Darvishi Farshad等人[10]研究了以不同植物油作为碳源时,对Yarrowia lipolytica DSM 3286酵母产脂肪酶的影响,发现橄榄油是Y.lipolytica DSM 3286酵母产脂肪酶的最佳碳源,脂肪酶活力为34.6±0.1U/ml,表明Y.lipolytica DSM 3286能够利用低成本的植物油为底物生产高附加值的脂肪酶。应用废弃油脂作为产脂肪酶酵母菌的碳源,可大幅度减少生产脂肪酶的成本。有学者研究了9株白地霉属酵母菌在以2%和3%的废弃煎炸油为碳源的培养基中产胞外和胞内脂肪酶的能力,结果发现Geotrichum candidum MSK3-11是产胞外脂肪酶的最佳菌种,并利用该菌种在AK-210反应器中进行脂肪酶的合成研究[11]。

1.2.2 酵母脂肪酶的纯化和性质研究

与纯化酶相比,采用微生物细胞作为工业催化剂更为经济方便。高纯度脂肪酶能够更高效地催化反应进行,广泛应用于一些精细化学品、药品、化妆品的生产。对于纯化酶,便于确定其氨基酸序列和结构,建立结构和功能的关系,从而更好地解释其催化机制。目前许多学者致力于酵母脂肪酶的纯化,以获得各种新型的酵母脂肪酶,并研究影响脂肪酶活力和稳定性的有关因素。这些对酵母脂肪酶特性的研究有助于更好地确定其适用环境和工业应用范围。

Kumar S.Suresh等[12]将筛选得到的阿萨希丝孢酵母菌Trichosporon asahii MSR 54发酵液采用超滤和疏水层析法进行脂肪酶的纯化,并研究了该纯化的脂肪酶在有机溶剂中的动力学调节机制。他们发现在单一水相中,该脂肪酶更容易水解中链和短链脂肪酸酯类,而且能S型立体选择性水解外消旋的1-苯乙基乙酸酯。在pH 9.0的 Tris-HCl 缓冲液中加入等体积的不同log P的有机溶剂,发现随着有机溶剂log P值的增大,该脂肪酶就更易水解短链脂肪酸酯类。当加入等体积的异丙醇,脂肪酶对外消旋的1-苯乙基乙酸酯水解的立体选择性由S型逆转为R型;而加入等体积的己烷,立体选择性消失。他们认为,若是单纯依靠微生物细胞的整体反应开展研究,将很难发现这种调节机制。国内有学者研究了白地霉(lip42)脂肪酶的纯化和理化性质[13],他们将白地霉(Geotrichum candidum)发酵液的上清液经硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、DEAE纤维素柱层析,以及Sephadex-75凝胶柱层析纯化处理,得到的脂肪酶比活力达到121.68 U/mg,纯化倍数为粗酶液的7.3倍,回收率为30.25%,显示了纯化酶的优势。

2 酵母脂肪酶的应用

在各种来源的脂肪酶中,酵母脂肪酶尤其是假丝酵母类脂肪酶是用途最为广泛的一类脂肪酶。皱落假丝酵母脂肪酶(CRL)和南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的应用涉及多个领域,脱颖而出成为应用最成功的商业脂肪酶,因此,本文将着重就这两种脂肪酶的应用予以论述。

2.1 酵母脂肪酶在食品工业领域应用

2.1.1 香味化合物的合成

由于短链脂肪酸酯具有各种香味,很多被应用于食品工业中作为调味剂和香味加强剂。这些短链香味酯可通过从天然植物中提取,化学合成和生物催化合成。催化羧酸和醇类脱水合成短链酯是微生物脂肪酶的一个重要作用,可应用于食品中香味剂的合成。

戊酸乙酯是具有青苹果味的酯类,广泛应用于食品,医药,化妆品领域。目前,有研究者用微乳凝胶固定化皱落假丝酵母脂肪酶(CRL)在有机溶剂中催化戊酸和乙醇合成戊酸乙酯[14]。研究表明环己烷是最佳反应介质,在最佳反应条件下,固定化脂肪酶重复利用9次后酶活几乎没有降低。李相等[15]利用Novozyme 435催化甘油和油酸合成甘油二酯,用响应面优化得到最佳反应条件,反应后油酸转化率为45.42%,甘油二酯质量分数为70.01%。Habulin Maja等用南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)分别在有机溶剂体系和超临界二氧化碳(SC CO2)体系中催化β-香茅醇和月桂酸合成香茅醇月桂酸酯[16]。在一个标准大气压下,以正庚烷为反应介质,底物转化率可达81%。在超临界二氧化碳(SC CO2)体系中反应时,采用乙基甲基酮为助溶剂,转化率达到了77%。

2.1.2 结构脂脂质的合成

结构脂脂质是近几年兴起的一种新型功能性油脂,目前主要利用具有区域选择性作用的脂肪酶水解天然甘油三酯甘油骨架上的l,3位酯键,再引入其它有生理功能或低热量的脂肪酸,重组合成结构性甘油三酯。

最近,有学者利用来源于Pichia lynferdii NRRL Y-7723的新耐冷脂肪酶催化璃苣油辛酸酸解合成结构脂脂质,NRRL Y-7723脂肪酶具有1,3位区域选择性作用[17]。Magnusson Carlos D.等[18]采用化学-酶法合成甘油骨架端位含相同的短链脂肪酸,2位含n-3多不饱和脂肪酸的对称的结构性甘油三酯。他们首先用具有l,3位区域选择性作用的Candida antarctica脂肪酶B在甘油骨架的l,3位引入相同的短链酯(C2、C4 和C6),再用碳二亚胺偶联剂将二十碳五烯酸(EPA)或二十二碳六烯酸(DHA)引入2位,从而合成了对称的结构性甘油三酯。

2.2 酵母脂肪酶在手性化合物合成上的应用

脂肪酶对很多手性化合物都具有高立体选择性作用,能进行酯化、转酯化、醇解和氨解等反应,且反应条件温和,催化效率高,环境友好,因此被广泛应用于手性化合物的合成。不同的立体异构体在体内的药效学、药代动力学和毒理学性质不同,并表现出不同的治疗作用与不良反应,研究与开发手性药物是当今药物化学的发展趋势。

2.2.1 酵母脂肪酶催化合成手性纯胺类化合物

光学纯胺类化合物被广泛应用于精细化工产业,如拆分试剂,手性助剂,而且是合成手性药物的手性砌块。用脂肪酶催化手性胺类不对称酰化得到光学纯胺是一条高效的,环境友好的拆分方法。Wen Sai等人采用自制的固定化Yarrowia lipolytica 脂肪酶(YlLip2),以乙酸乙酯为酰基供体,在含助溶剂的己烷中催化 (±)α-苯乙胺不对称性酰化,得到(R)-(+)-α-苯乙胺酸酯[19]。当在15 ml己烷中加入3%的DMSO助溶剂,产物的ee值从35 % (无助溶剂)增加到 96 %,对映体选择率(E)从2.5(无助溶剂)增加到190。固定化脂肪酶重复使用5次后仍能保持很高的E值(≈190)。这是第一次将YlLip2用于胺类化合物拆分。

2.2.2 酵母脂肪酶催化合成手性纯羧酸类化合物

光学纯的手性羧酸是很多手性药物的中间体,如2,2-二甲基环丙烷甲酸是西司他丁的关键中间体。笔者所在课题组利用脂肪酶Novozyme 435催化外消旋2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯不对称性水解得到高光学纯度的S-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸。在最佳反应条件下,底物浓度为65mmol/L,产物的收率和光学纯度分别为45.6%和99.2%[20]。Dong Hua-Ping等人利用Novozyme 435脂肪酶催化不对称性水解二乙基-3-羟基戊二酸合成(S)-3-羟基戊二酸[21],在最佳反应条件下,底物浓度0.15 mol/L,产物(S)-3-羟基戊二酸ee值达到95%以上,转化率为98.5%。Yilmaz Elif等[22]用共价结合法和溶胶凝胶包囊法将Candida rugosa 脂肪酶(CRL)固定化于戊二醛活化的氨丙基玻璃珠,用于不对称性水解外消旋萘普生甲酯生成S-萘普生。溶胶凝胶包囊法固定化脂肪酶的活性和对映体选择性都比共价结合法固定化脂肪酶高,对映体选择率(E)达到400以上,S-萘普生ee值为98%。

2.2.3 酵母脂肪酶催化合成手性醇类化合物

手性醇是非常重要的具有生物活性的手性原料,在制药领域有着重要作用。Maciejewski Maciej等采用乙酸乙烯酯为酰基供体,脂肪酶Novozyme 435为催化剂,在叔丁基甲基醚中有效催化拆分了几种新的3-苯氧基-1-卤基丙-2-醇,ee值范围为89%～99%,E值范围为64%～99%,将这些醇用异丙胺和叔丁胺通过亲核卤代反应合成了1-烷氨基-3-苯氧基丙-2-醇,并体外测试了1-烷氨基-3-苯氧基丙-2-醇的β-肾上腺素受体拮抗剂作用[23]。Habulin Maja等人采用脂肪酶Novozyme 435,以乙酸乙烯酯为酰基供体,催化拆分外消旋的1-苯乙醇,并进行了反应体系的筛选和反应参数的优化[24],如酶量、离子液体、底物浓度等,测定了1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐[bmim][PF6]、1-丁基-3-甲基咪唑四氟磷酸盐[bmim][BF4]和1-乙基-3-甲基咪唑三氟甲磺酰亚胺盐[emim][NTf2]三种离子液体对反应的影响。当在9.520 mol/L[bmim][PF6]中加入6.6%(w/w)酶量,等摩尔比的乙酸乙烯酯和1-苯乙醇,在313.15 K下反应3 h,转化率达到50%,ee值>99%。

2.3 酵母脂肪酶在生物柴油生产中的应用

生物柴油是动植物油脂与短链醇经酯交换反应而得到的脂肪酸单烷基酯,是可替代石油原料的可再生清洁能源,国内外很多学者进行了这方面研究。在生物酶法制备生物柴油的研究中,国内外研究最多是酵母脂肪酶催化法。由于利用食用油生产生物柴油和利用一些商业脂肪酶成本过高,不符合可持续发展政策,很多学者转向寻找新的低成本非食用原料油和新的廉价高效的脂肪酶,或者建立新的脂肪酶固定化方法,实现酶的多次重复利用。

北京化工大学谭天伟教授课题组筛选得到一株高产假丝酵母脂肪酶菌种Candida sp.99-125,并以共固定剂活化的纺织品为载体,以吸附法固定化Candida sp.99-125脂肪酶,自制的固定化Candida sp.99-125脂肪酶已成功应用于生物柴油的酶法合成。例如他们用固定化的Candida sp.99-125脂肪酶催化从白米糠中提取的非食用米糠油合成生物柴油[25]。合成的脂肪酸甲酯的得率为87.4%,固定化脂肪酶重复利用7次后仍能保持稳定。Candida antarctica脂肪酶B(CALB)也是一种在生物柴油合成上被广泛关注的脂肪酶,但是由于商业形式的CALB固定于中度亲水的Lewatit VPOC1600载体上,甘油很容易被吸附,在酶分子周围形成亲水层,阻碍了甘油三酰酯转移到酶活性中心,从而大大降低了CALB的转化效率。因此有研究者用高度疏水的大孔聚丙烯化合物Accurel MP代替Lewatit VPOC1600固定化CALB,消除了甘油吸附的影响[26]。最佳的大孔聚丙烯支持物类型为Accurel MP1001 (粒径<1 000μm),用丙酮代替乙醇预处理支持物时,蛋白吸附率和固定化酶量达到最大。

3 问题及措施

由于脂肪酶催化反应的类型多,而且一些脂肪酶在水相和有机相中都有较高的催化活性,一直受到广泛的关注。但是对于酵母脂肪酶的研究还存在以下问题:(1)酵母脂肪酶种类较单一,虽然酵母脂肪酶应用最为广泛,但主要集中在Candida antarctica脂肪酶B(CALB)、Candida rugosa 脂肪酶(CRL)、Yarrowia lipolytica脂肪酶(YLL2)等少数几种脂肪酶。(2)在产业化方面,脂肪酶催化的反应类型较多,但由于大部分脂肪酶成本高,活性不理想,其应用受到一定的限制。(3)极端酵母脂肪酶较少,产脂肪酶的极端微生物多为细菌。因此挖掘更多的新型高活性脂肪酶,降低脂肪酶的生产成本,提高酶的重复利用率是今后亟待解决的问题。

4 前景与展望