脂肪酸代谢

脂肪酸代谢（精选8篇）

脂肪酸代谢 篇1

三大营养物质代谢历来是《生物化学》课程中的重点内容, 而脂肪酸分解代谢作为脂类代谢的主要部分, 亦是一个重要内容。但由于其反应过程漫长, 产生能量较多, 是一个较难掌握的内容。笔者在多年的教学实践中发现了其中的一些教学技巧, 并经过实际应用, 获得了较好效果, 现介绍如下。

1 注意区分两个不同的脂酰CoA

脂肪酸分解代谢中脂酰CoA的β氧化过程在教材中介绍篇幅不多[1], 但由于其实际反应过程漫长, 再加上其反应起始物为脂酰CoA, 反应产物中又有脂酰CoA, 这使得很多学生看来看去, 犹如雾里看花, 很不容易看明白。针对这一点, 笔者设定反应起始物名称为“含n个碳的脂酰CoA”, 经过“脱氢、加水、再脱氢、硫解”等4步反应后, 其产物则为一分子“乙酰CoA”和一分子 “含 (n-2) 个碳的脂酰CoA”。这样就不会混淆起始物和产物中的两个“脂酰CoA”, 并且n个碳 (反应起始物中的脂酰基) =2个碳 (乙酰CoA中的乙酰基) + (n-2) 个碳 (产物中的脂酰基) , 反应前后碳原子数目平衡, 很容易理解。

2 脂酰

CoA β氧化前三步反应过程与三羧酸循环最后三步反应过程极为相似

脂酰CoA进入线粒体基质后, 从脂酰基的β碳原子开始, 进行脱氢、加水、再脱氢和硫解等4步连续反应[1], 脂酰CoA β氧化是脂肪酸分解代谢的主要内容, 也是一个重点和难点内容, 要求学生必须掌握。由于参加反应的物质和生成的物质化学结构式很长, 并且又不是完全确定的物质, 只是一个泛指, 这给学生理解造成了一定的困难。笔者在教学实践中发现, 脂酰CoA β氧化前三步反应过程与三羧酸循环最后三步反应过程[2]极为相似, 二者比较见下图。

这两个反应阶段简直一模一样, 都是由脱氢、加水、再脱氢三步反应组成;原子或原子团的转移、化学键的断裂与重组也是一样;连两次脱氢的受体都一模一样, 分别是FAD和NAD+;并且都是在线粒体内进行的化学反应。这也体现了生命现象中的一些基本规律。

由于三羧酸循环历来作为一个极其重要的反应途径, 一直以来都要求所有学生必须掌握, 并且教师讲解得也很详细, 再加上其在脂类代谢前就已经学过, 这样一对比, 对于学生掌握脂肪酸β氧化过程无疑有极大的帮助。

3 脂肪酸氧化能量生成计算

关于脂肪酸氧化能量生成的计算, 大多数教材一般只举一个例子来说明。但由于实际上的脂肪酸种类较多, 其能量生成数量又多, 对于大多数学生来说, 很难在有限时间内完全理解掌握。鉴于此, 笔者在教学实践中给学生总结出几个公式, 有利于其计算。假定某个脂肪酸中共含有n个碳, 则其经过数次β氧化后, 最终生成的产物——乙酰CoA的个数=n÷2个 (因为每个乙酰基中含有2个碳) 。β氧化的次数= (n÷2) -1, 也就是乙酰CoA的个数减去1。因为最后一次β氧化的起始物为含4个碳的丁酰基, 经过β氧化后的产物为2分子乙酰CoA, 不再需要β氧化。由于脂肪酸氧化的能量生成仅与乙酰CoA的个数及β氧化的次数有关, 并且前面已经学过一分子乙酰CoA可产生12分子ATP;一次β氧化有两次脱氢, 产物分别为FADH2和NADH+H+, 分别可生成2分子和3分子ATP, 即一次β氧化共可以产生5分子ATP。那么据此可得出:含n个碳的脂肪酸氧化后可产生ATP数量 = (n÷2) ×12 + [ (n÷2) -1] ×5。净生成ATP数量= 可产生ATP数量-2 (脂肪酸活化成脂酰CoA时消耗的2分子ATP) 。四个公式总结如下:

公式①:含n个碳的脂肪酸β氧化后生成的产物——乙酰CoA的个数= n÷2

公式②:β氧化的次数= (n÷2) -1

公式③:含n个碳的脂肪酸彻底氧化后可 产生ATP数量= (n÷2) ×12 + [ (n÷2) -1] ×5

公式④:净生成ATP数量= (n÷2) ×12+[ (n÷2) -1]×5-2有了这四个公式, 学生很好记忆, 亦有助于其理解, 对实际解题有很大帮助。如:问人体内含量较多的18碳硬脂酸经过彻底氧化分解后共可生成多少分子ATP?即可将n =18套入公式3, 得出总共生成148分子ATP, 以此类推。

摘要：脂肪酸分解代谢反应过程长, 产生能量多, 较难掌握。若在教学中注意以下3点:区分两个脂酰CoA;β氧化与三羧酸循环部分反应相似;能量计算的几个公式, 可获得良好的教学效果。

关键词：脂肪酸,脂酰CoA,β氧化,教学

参考文献

[1]程牛亮, 潘文干.生物化学—脂类代谢 (第5版) [M].北京:人民卫生出版社, 2006:111-113.

[2]李林, 潘文干.生物化学—糖代谢 (第5版) [M].北京:人民卫生出版社, 2006:85-87.

脂肪酸代谢 篇2

黑豆：黑豆是以一种常见的豆类，最近一段时期它的高蛋白、低热量的特点被特别发挥，为许多减肥者所利用，并且黑豆的豆皮中的物质可以提升人体对铁元素的吸收，若女性食用，则可促进改善贫血症状。

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用法：一周3-4次。

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终极腐霉多不饱和脂肪酸代谢分析 篇3

天然EPA的来源主要为海鱼类、贝类等,但由于鱼油来源容易受环境因素影响,且过多捕猎会破坏海洋生态平衡,所以无法满足市场对EPA产量的要求。微生物发酵法生产EPA不受自然条件影响,作为EPA原料明显优于鱼类等天然资源,是取代鱼油原料的最佳选择。目前已发现含有EPA的微生物有真菌、海水细菌、藻类等。含EPA的真菌主要为多种低等菌,目前已在高山被孢霉(Mortierella alpina)、长孢被孢霉(Mortierella elongata)、水霉(Saprolegnia)樟疫霉(Phytophthora ciaoamrnni)、小克银汉霉(Cucorcircinelloides)、极腐霉 (Pythium ultimum)、轮梗霉(Diasporangium sp.)、畸雌腐霉 (Pythium irregulare)、刺腐霉(P.spinosumSawada)等真菌中发现含有EPA[2,3,4]。

作者实验室选择终极腐霉为出发菌株,对其脂肪酸成分进行了气相色谱及质谱测定,分析了脂肪酸的代谢途径,以找出影响终极腐霉产多不饱和脂肪酸特别是EPA的关键影响因子,为提高EPA产量提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:

终极腐霉,购自广西大学农学院。

1.1.2 试剂:

葡萄糖、硝酸钠、磷酸氢二钠、硫酸镁、石油醚(30～60℃沸程)、甲醇、三氟化硼乙醚、正己烷、氯化钠均为分析纯。标准品:二十碳五烯酸甲酯,Sigma公司。

1.1.3 仪器:

电子天平:余姚市金诺天平仪器有限公司;摇床:国华电器有限公司;电热恒温干燥箱:北京科伟永兴仪器有限公司;电热恒温水浴锅:北京科伟永兴仪器有限公司;旋片式真空泵:温岭市挺威真空设备有限公司;Thermo Finnigan Trace DSQ气相色谱-质谱联用仪。

1.1.4 培养基:

葡萄糖5%,酵母膏0.5%,硝酸钠0.3%,磷酸氢二钠0.1%,硫酸镁0.05%。

1.2 方法

1.2.1 培养方法:

终极腐霉接种于培养基中,摇床150 r/min、28℃培养6 d,收获菌丝。

1.2.2 油脂提取:

菌丝80℃烘干至恒重,用研钵把菌丝研成粉末,称取1g菌粉置于10 ml 离心管中,用3 ml 石油醚(30～60℃沸程)抽提2次,蒸干溶剂,测定油脂含量。

1.2.3 脂肪酸甲酯化:

取油脂0.05g,置于10ml具塞试管中,加入0.5mol/L的KOH甲醇溶液1 ml,60℃水浴中皂化15min,冷却后加入14%三氟化硼乙醚甲醇溶液2ml,于60℃水浴中振荡2min,放至室温,加入正己烷1ml,振荡,加入饱和氯化钠溶液1ml,静置,取上清液进样。

1.2.4 GC分析条件:

HP-INNWAX弹性石英毛细管柱30m×0.25mm×0.25μm;载气为高纯氦气,恒流模式,流速1.0ml/min;程序升温150℃(2.0min)6℃/min 230℃(15min),进样口230℃,传输线230℃;进样量1μl,分流比80:1。MS条件:EI离子源,离子源温度200℃,电子能量70eV,电流100mA,电子倍增器1.4kV,溶剂延迟2.0min,全扫描方式,扫描范围10～400amu。NIST02版标准谱库检索。

2 结果与分析

运用气相色谱-质谱联用仪对终极腐霉菌丝的脂肪酸进行分析,并用NIST02版标准谱库检索标准质谱图库分析,获得可能性较大的三种脂肪酸成分,最后根据所含的分子量,并结合终极腐霉的遗传特性和代谢途径,人工分析确定各脂肪酸成分。终极腐霉脂肪酸成分及含量的分析结果见表1。菌丝脂肪酸甲酯的气相色谱图及质谱图分别见图1和图2。

2.1 多不饱和脂肪酸代谢途径分析

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFA)是指含有两个或两个以上双键且碳链长为18～22个碳原子的直链脂肪酸。多不饱和脂肪酸因其结构特点及在人体内代谢的相互转化方式不同,主要可分成n-3、n-6两个系列。n-3系列包括十八碳三烯酸(俗称α-亚麻酸)(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)。n-6系列包括十八碳三烯酸(俗称γ-亚麻酸)(GLA)、二十碳四烯酸(俗称花生四烯酸)(AA)。

多不饱和脂肪酸的合成是以饱和脂肪酸(如硬脂酸)作为底物,通过一系列脱饱和酶(Desaturase,DS,即脱氢酶)和延长酶(Elongase,EL)的催化作用形成的。脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成途径的关键酶,它控制着多不饱和脂肪酸的不饱和程度。微生物利用硬脂酸合成多不饱和脂肪酸的代谢途径见图3。

转化饱和脂肪酸合成EPA的通过n-3途径实现,过程如下:硬脂酸在Δ9脱氢酶的催化下,在Δ9位脱氢形成油酸,油酸在Δ12脱氢酶的催化下形成亚油酸,亚油酸分别在Δ15脱氢酶和Δ6脱氢酶的催化下形成α-亚麻酸和γ-亚麻酸,α-亚麻酸再分别在Δ6脱氢酶、Δ6延长酶、Δ5脱氢酶催化下形成EPA。在碳链延伸及脱饱和过程中,脱氢酶的活性和不饱和脂肪酸的积累主要受温度、分子氧和Mg离子等条件的影响[5]。

从表1看,终极腐霉不饱和脂肪酸共有15种不饱和脂肪酸,分别为11-十四碳烯酸、11-十六碳烯酸、9-十六碳烯酸、9,12-十六碳二烯酸、油酸、亚油酸、γ-亚麻酸(GLA)、α-亚麻酸(ALA)、11-二十碳烯酸、10,13-二十碳二烯酸、7,10,13-二十碳三烯酸、花生四烯酸(AA)、5,11,14,17-二十碳四烯酸、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(EPA)、13-二十二碳烯酸,占总脂肪酸的68.87%。其中油酸含量为28.49%,为所有不饱和脂肪酸含量最高的,存在过量积累,可通过△12脱氢酶的过量表达来提高亚油酸(LA)的含量,以达到下一步EPA的积累。终极腐霉既含α-亚麻酸(1.2%),又含γ-亚麻酸(0.73%),说明同时存在n-3和n-6两条代谢途径,但α-亚麻酸含量高于γ-亚麻酸,表明n-3代谢途径为主流,n-6代谢相对较弱。可通过切断n-6代谢,即筛选△6脱氢酶缺乏菌株实现,或△15脂肪酸脱氢酶的过量表达提高EPA产量。n-3途径代谢中,EPA含量为8.15%,具有高产EPA的能力,△6,△12,△15-脱氢酶为阻碍高产EPA的关键。

2.2 菌体特性

终极腐霉摇床液体培养6d,收获菌体分别测生物量、油脂含量、EPA含量,结果见表2。其中生物量和油脂含量分别为15g/L和18%,仍有待提高,EPA含量较高,占总脂肪酸的8.15%。可见生物量、油脂含量与EPA含量并不呈正比关系,对该菌可通过发酵条件优化进一步提高生物量和油脂产量,从而提高EPA产量。

注:实验数据由3次平行样品的平均值±标准偏差表示;EPA产量=生物量×油脂含量×EPA含量。

3 讨论

国内外科学家对脱氢酶在多不饱和脂肪酸合成代谢中的重要作用进行了大量的研究。由于大部分脱氢酶为膜结合蛋白,导致其难以分离纯化,因此已经分离纯化并鉴定的脱氢酶屈指可数,目前报道较多的是Δ6脱氢酶,与脱氢酶相关的研究主要集中在脱氢酶基因及其表达调控方面。1993年,美国的Reddy教授从一株产γ-亚麻酸的单细胞藻类蓝细菌(Synechocystis sp.),并克隆了Δ6脱氢酶基因,该基因全长1 080 bp,编码359氨基酸,将其转入Δ6脱氢酶基因缺陷的蓝细菌(Anabaena PCC7120)进行表达,成功获得了产γ-亚麻酸的菌株[6]。邢来君课题组采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统,首次成功地将来源于高山被孢霉的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因导入我国东北栽培大豆的6个品种中,使转基因大豆产生了γ-亚麻酸,其含量最高可达25.165%[7]。

同时,也有利用基因工程对真菌中各种去饱和酶进行改造,得到所需要的脂肪酸。张琦等将少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因转化酿酒酵母营养缺陷株,添加外源底物α-亚麻酸后生成十八碳四烯酸占总脂肪酸的7.67%[8]。此后,又建立了少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因在油菜中的表达体系,成功获得转基因油菜,并在转基因油菜叶片中检测到γ-亚麻酸和十八碳四烯酸[9]。刘建民从高山被孢霉中分离花生四烯酸和二十碳五烯酸合成途径中的△6去饱和酶基因、△6延长酶基因和△5去饱和酶基因,并将其连接到带有种子特异表达启动子的植物表达载体上,通过农杆菌介导的方法转化甘蓝型油菜品种,实现了甘蓝型油菜中构筑AA和EPA生物合成的途径[10]。

本文首次对终极腐霉进行脂肪酸成分及代谢途径分析,确定终极腐霉含有15种不饱和脂肪酸,占总脂肪酸的68.87%,EPA含量为8.15%,具有高产EPA的能力,并认为△6,△12,△15-脱氢酶为阻碍高产EPA的关键,为后续提高EPA产量提供了一定的研究基础。

参考文献

[1]马刘江,石俊.二十碳五烯酸的抗肿瘤作用研究进展[J].延边大学医学学报,2011,24(3):232-234.

[2]汤世华,杨建斌,何东平,等.发酵法生产多不饱和脂肪酸的研究进展[J].武汉工业学院学报,2007,26(3):17-20.

[3]S.R.Gandi,J.D.Weete.Production of the polyunsturatured fatty acidsarachidonic acid and eicosapentaenoic acid by fungus Pythium ultimum[J].J.of General Microbial,1991,137:1825-1830.

[4]E.E.Stinson,R.Kwoczak,M.J.Kurantz.Effect of cultural conditionson production of eicosapentaenoic acid by Pythium irregulare[J].J.InD.Microbioc,1991,8(3):171-178.

[5]咸漠,闫吉昌,甄明,等.深黄被孢霉催化转化十八醇合成不饱和脂肪酸[J].高等学校化学学报,2001,11:106-109.

[6]REDDY A S.Isolation of aΔ-6 desaturase gene from the Cyanobacte-rium Synechocystis sp.strain PCC7120[J].Plant Mol Bio,1993,27:293-300.

[7]卜云萍,李明春,胡国武,等.高山被袍霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达[J].中国农业科学,2004,37(8):1104-1109.

[8]张琦,李明春,张飙,等.酿酒酵母中少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶对α-亚麻酸催化活性的研究[J].南开大学学报:自然科学版,2005,5:33-37.

[9]张琦,李明春,蔡易,等.少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达[J].中国农业科学,2006,3:39-45.

脂肪酸代谢 篇4

1 材料与方法

1.1 动物模型

50只200～250g Wistar大鼠 (华中科技大学同济医学院实验动物学部) , 随机分5组。动物自由进食进水, 各组动物饲以不同饲料。空白组 (B组) 饲以SPF大鼠饲料 (北京科澳协力饲料有限公司, 脂肪<4%, 供能约为11.5%) 。实验组每天喂食前分别向饲料中添加等量不同成分的油脂 (每100g添加16.5g油脂, 脂肪供能约为40%) 。其中:混合高脂组 (C组) 添加混合油脂 (牛油∶豆油∶茶油=3∶4∶1, 饱和∶单不饱和∶多不饱和FFAs比例接近1∶1∶1) , 饱和脂肪酸组 (S组) 添加牛油, 单不饱和脂肪酸组 (M组) 添加茶油, 多不饱和脂肪酸组 (P组) 添加豆油。动物饲养70d, 每周测定大鼠体重变化。

1.2 静脉糖耐量试验

动物隔夜禁食12h后以0.6%的戊巴比妥钠, 6mL/kg腹腔麻醉。于一侧股静脉置静脉留置针, 麻醉以后1h取空腹血2次, 每次1mL。于别一侧股静脉快速输入20%葡萄糖液 (2.5mL/kg) 。于输注葡萄后2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 19, 22, 25, 30, 40, 60, 90, 120min分别从静脉留置针抽血0.3mL。

1.3 测定

以日立7 600全自动生化分析仪 (广州市红十字会医院检验科) 测定血糖、甘油三酯 (TG) , 总胆固醇 (TC) , 高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-CHO) , 低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-CHO) 以及极低密度脂蛋白胆固醇 (VLDL-CHO) 。胰岛素测定用大鼠专用放免试剂盒 (RI-13K试剂盒, 美国Linco公司, 批号:RIR-1744) , 以SN-695B型智能放免r测量仪 (上海应用物理所日环光电仪器有限公司) 计数。

1.4 胰岛素抵抗评价

胰岛素敏感性指数 (Si) 、葡萄糖耐量 (Sg) 以Bergman微小模型法计算。程序由广州市红字会医院内分泌科提供。其它指标:急性胰岛素反应 (acute insulin response, AIR) :2, 4, 6min胰岛素浓度的平均值减去空腹胰岛素浓度;胰岛素 (AUCins) 、血糖 (AUCg) 曲线下面积的计算根据梯形计算法。

1.5 统计学方法

组间比较采用单因素方差分析, 静脉糖耐量血糖, 胰岛曲线分析用重复测量方差分析。

2 结果

(1) 动物进食量及其体重变化。

动物初始体重, 试验结束时体重各组间比较均无明显差异 (P>0.05) , 见表1。

(2) 各组动物空腹血浆甘油三酯, 胆固醇等数据, 具体数据见表1。

各高脂饮食组TG, TC, LDL-CHO明显高于空白对照组 (P<0.05) , 各高脂组间比较无显著性差异;各组间HDL-CHO, VLDL-CHO比较差异无显著性。

(3) 静脉糖耐量试验各组空腹胰岛素、血糖、以及Si, Sg, AUCg, AUCins等组间比较

见表2。各组动物静脉糖耐量实验血糖曲线见表1, 静脉糖耐量试验胰岛素曲线见表2。空腹血糖各高脂组均显著高于空白对照组 (P<0.05=;各高脂组间比较无显著差异;空腹胰岛素各组间比较无显著差异。B组ISI最高, 高于其余各组 (P<0.05=C组与M组比较, 差异无统计学意义, 但分别均高于P组, S组 (P<0.05=P组与S组间差异无统计学意义。空白组葡萄糖曲线下面积低于各高脂组 (P<0.05) , P组高于C组 (P<0.05) , 其余各高脂组间比较差异无显著性。

△ 与其余各组比较P<0.05

△ 与其余各组比较P<0.05

以重测量设计的方差分析进行组间比较:各组差异有显著性 (P<0.01) , 其中B组各时间点血糖值与其余各组间差异有显著性 (P<0.05) , 其余各组间差异无显著;分组因素与时间因素之间的交互作用有统计学意义。

以重复测量设计的方差分析进行比较:各组间差异有显著性 (P<0.001=, 其中S组各时间点胰岛素值高于M组 (P<0.05=, 其余各组间差异有显著性;分组因素与时间因素之间的交互作用有统计学意义。

3 讨论

LICHTENSTEIN等[2]在一项流行病学研究中指出在人体, 高脂肪饮食导致胰岛素敏感性的下降, 导致人体出现葡萄糖代谢的紊乱, 这一现象与饮食脂肪酸结构无关。部分学者对此提出不同看法。动物试验发现不仅改变饮食脂肪总量, 而且改变饮食脂肪的类型能调节胰岛素效应。饱和脂肪酸明显增加胰岛素抵抗, 而单不饱和脂肪酸以及多不饱和脂肪酸对胰岛素抵抗的影响较小[3]。日本的一项研究[4]则显示, 在对健康人进行以下不同饮食干预3个月后, 富含单不饱和脂肪酸的饮食相对于富含饱和脂肪酸的饮食有改善健康人的胰岛素敏感性的作用, 但当饮食脂肪供能超过总能量37%时, 这种有益作用消失。本试验拟进一步分析饮食脂肪总量以及结构对机体糖代谢的影响。

本试验采取了插管后1h左右进行取血及静脉糖耐量试验是由于根据文献[5], 以戊巴比妥麻醉的动物进行手术, 其急性应激反应可在约1h左右消散, 动物的胰岛素敏感性与慢性置管的清醒动物无明显差异。本方法操作简单, 但试验条件要求更严格。

本研究中低脂饮食及各种脂肪酸构成比的不同高脂饮食对大鼠体重增长的影响不大但各组间日均进食量不同, 这一结果与前人的研究相似[6]。这可能是试验大鼠受圈养或多食少动的生活模式的影响, 即使给予低脂饮食, 这种生活模式都可导致大鼠肥胖。

试验发现高脂饮食明显升高TG, TC以及LDL-CHO, 但对HDL-CHO, VLDL-CHO无显著影响, 高脂饮食组动物的空腹血糖, 胰岛素敏感性, 葡萄糖曲线下面积均较对照组差异有显著性。高TG血症与胰岛素抵抗综合征之间存在非常密切的关系。高TG血症影响胰岛素敏感性的可能机制:①TG水平升高导致葡萄糖的氧化及利用发生障碍, 导致胰岛素抵抗。②干扰胰岛素在周围组织中与受体结合, 使胰岛素的生物效应降低。③使胰岛素受体数目和活性相对下降。此外TG长期持续的升高还导致细胞内TG堆积, 这是引起β细胞功能障碍的重要原因[7], 是“脂毒性”的关键所在。细胞内TG堆积的长期作用还可能通过细胞凋亡途径影响β细胞功能。我们的研究还表明TG浓度与总脂肪摄入量有关, 故降低食物中的脂肪含量将对降低血TG水平, 改善胰岛素抵抗以及β细胞功能功能有重要意义。

各种不同高脂饮食对葡萄糖负荷后胰岛素分泌的影响程度不一, 这可能与食物中的各种不同类别的脂肪酸对胰岛素敏感性有着不同程度的影响, 胰岛素分泌的变化可能是对胰岛素敏感性变化的一种代偿。研究发现不同脂肪酸对胰岛素敏感性的影响具体机制是不同的。如通过对肌细胞内长链酰基CoA浓度的产生不同影响, 继而影响肌细胞胰岛素刺激的葡萄糖转运/磷酸化过程[8]。此外单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸可阻断基础及胰岛素刺激的糖原合成, 而饱和脂肪酸只对后者起作用[9]。我们的研究表明在大鼠, 不同脂肪酸热能比例达到40%的高脂食物, 均会导致机体胰岛素抵抗, 其中饱和脂肪酸以及多不饱和脂肪酸较单不饱和脂肪酸可以造成更严重的胰岛素低抗。

本研究仅观察了不同脂肪酸对大鼠胰岛素敏感性以及血脂代谢的影响, 以及之间的联系。具体脂肪酸对葡萄糖代谢的影响及其机制仍需深入研究。目前各种脂肪酸长期升高影响葡萄代谢的机制目前仍不十分明确。继续深入探讨和理解各种脂肪酸的作用, 将会有利于我们合理指导糖尿病患者的饮食治疗, 有利于预防和控制糖尿病及其并发症的发生与发展。

摘要：目的:观察各种不同高脂饮食对大鼠血脂代谢以及胰岛素敏感性的影响。方法:50只雄性Wistar大鼠, 随机分5组, 对照组给予普通大鼠饲料, 实验组分别给予含混合油脂、茶油、豆油或牛油的高脂饲料。10周后行静脉糖耐量实验, 测定血糖等血生化指标及评估胰岛敏感性。结果:各高脂饮食组TG, TC, LDL-CHO明显高于对照组 (P<0.05) , 高脂组间比较差异无显著性。空腹血糖各高脂组显著高于对照组, 空腹胰岛素各组间无差异。对照组的ISI高于其它各组。结论:高脂肪饮食长期喂养可导致大鼠血脂代谢异常。在大鼠, 不同类型高脂食物均会导致胰岛素抵抗;饱和脂肪酸或多不饱和脂肪酸比例增加较单不饱和脂肪酸组分可能造成更严重的胰岛素抵抗。

关键词：脂肪酸,饮食,胰岛抵抗,静脉糖耐量试验

参考文献

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脂肪酸代谢 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 核酸适体adipo 8及随机序列

adipo 8共87个碱基, 5'-3'序列为:ATGAGAAGCGTCGGTGTGGT TAAACACGGAACGAAGGTGCAGGAAGATTTGTCG ATGCGGTGCCTGAGCGGGCTGGCAAGGCGCATA;随机序列同样为87个碱基, 均由湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室合成。

1.1.2 动物、仪器及试剂

4周龄雄性C57BL/6小鼠60只, 购置于中南大学实验动物学部;微型渗透压泵购置于北京鼎国昌盛生物技术有限公司;Leica冷冻切片机、正置荧光显微镜、光学显微镜、Image Pro-Plus软件及其他常规仪器及试剂, 由中南大学湘雅医院医学科学研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 核酸适体adipo 8及随机序列的合成及修饰

ABI3400合成仪合成核酸适体adipo 8及随机序列, 应用高效液相色谱法 (HPLC) 对合成产物进行分离纯化。10 OD未修饰adipo 8和10 OD修饰adipo 8分别用cy 3荧光标记, 荧光显微镜下观察。40 OD修饰adipo 8用于连续腹腔输注。修饰的adipo 8进行部分硫代碱基修饰。具体为:每3个碱基构成1个密码子, 最后1个碱基进行硫代修饰。87个碱基, 总共29个硫代修饰。5'-端加20 k D聚乙二醇。87个碱基的随机序列修饰同adipo 8。

1.2.2 构建DIO小鼠模型

4周龄雄性C57BL/6小鼠60只。普通饲料 (24.1%蛋白质, 13.2%脂肪, 62.7%碳水化合物) 适应性喂养2周后, 高脂饲料 (18.1%蛋白质, 61.6%脂肪, 20.3%碳水化合物) 喂养8周, 可复制DIO小鼠模型。复制肥胖模型后, 继续予以高脂饮食。

1.2.3 核酸适体adipo 8与脂肪组织结合

将硫代碱基修饰、结合聚乙二醇的adipo 8注射入4只小鼠腹腔, 剂量为125 nmol/kg。注射后1 h采集肝脏、肾脏、肌肉及附睾脂肪组织于冷冻切片机切片。设置冷冻切片机箱体温度为-23℃。组织固着器先放少量OCT包埋剂, 放上组织, 周围加适量的包埋剂。冻结后切片, 每片厚10μm, 每次切2块。载玻片贴附后吹干。同一组织的2块冷冻切片, 1块于正置荧光显微镜下观察各组织的荧光信号强弱, 另1块用于HE染色, 光学显微镜下观察组织。

1.2.4 腹腔注射未修饰和修饰核酸适体adipo

8取24只DIO小鼠, 随机均分为两组, 分别腹腔注射未修饰和修饰adipo 8, 剂量125 nmol/kg。注射后30min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h处死小鼠, 采集附睾脂肪组织冷冻切片。正置荧光显微镜下荧光显像, 观察比较未修饰adipo 8和修饰adipo 8与脂肪组织结合的荧光信号。见图1。

1.2.5 核酸适体adipo 8对脂肪组织成脂的作用

分别将装有随机序列和修饰adipo 8的微型渗透压泵埋入随机序列组和adipo 8组小鼠腹腔, 连续腹腔输注, 剂量为0.136μg/d。分别于连续腹腔输注第1、2、3、4周, 取小鼠4只撤泵处死, 取附睾脂肪组织冷冻切片, HE染色, 光学显微镜下观察 (×200) , 单个视野, Image Pro-Plus软件测量脂肪细胞大小, 取平均值, 用像素点数目表示。每份标本测量4个视野, 取其均数进行统计分析。见图2。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据处理, 实验数据用均数±标准差 (±s) 表示, 组间计量资料用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 核酸适体adipo 8在DIO小鼠体内可与白色脂肪组织高度特异性结合

腹腔注射硫代碱基修饰、结合聚乙二醇的adipo8 1 h, 小鼠脂肪组织可见较强的荧光信号, 而其余组织仅可见微弱信号。结果证明, adipo 8在DIO小鼠体内可与白色脂肪组织高度特异性结合。见图3。

2.2硫代碱基修饰、结合聚乙二醇的核酸适体adipo 8能有效增强其与脂肪组织结合的强度及延长结合时间

由图4、5显示, 未修饰adipo 8与脂肪组织结合弱且作用时间短 (4、8及24 h均显示为基本无荧光信号) 。硫代碱基修饰、结合聚乙二醇的adipo 8与脂肪组织结合强且时间长, 荧光信号先增强后减弱, 1 h的荧光信号最强, 30 min和24 h仅可见微弱信号。结果说明, adipo 8经硫代碱基修饰、结合聚乙二醇, 增强了其与脂肪组织结合的强度及延长结合时间。

2.3 核酸适体adipo 8可抑制DIO小鼠脂肪组织的成脂作用

分别连续腹腔输注随机序列和硫代碱基修饰、结合聚乙二醇的adipo 8小鼠于第1、2、3、4周后分别处死4只, 取附睾脂肪组织HE染色, 光学显微镜下观察, Image Pro-Plus软件测量脂肪细胞大小平均值。由图6、7显示, 相同放大倍数视野下, 第1周, adipo 8组脂肪细胞大小与随机序列组比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。第2、3、4周, adipo 8组脂肪细胞小于随机序列组 (P<0.05) 。结果表明, 随着腹腔输注adipo 8, DIO小鼠体内脂肪组织成脂受到抑制, 并且此作用随着时间的延长而加强, 即adipo 8在体内抑制成脂的作用呈时间依赖性。

第1周, adipo 8组脂肪细胞大小与随机序列组比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。第2、3、4周, adipo 8组脂肪细胞小于随机序列组 (P<0.05)

3 讨论

肥胖是指体内脂肪组织过度蓄积, 超过正常生理需要, 且有害于身体健康和正常功能活动的一种疾病, 是现代社会最亟待解决的流行病之一, 与多种严重危害人类健康的疾病, 如2型糖尿病、心脑血管疾病以及癌症等的发生、发展密切相关。肥胖不仅直接降低人们的生活质量和减少预期寿命, 也给患者及社会带来了沉重的经济负担[6]。肥胖以机体白色脂肪组织过度积聚为重要特征, 白色脂肪组织可分泌瘦素、脂联素、抵抗素等多种脂肪因子, 是肥胖治疗最重要的靶组织之一[7,8]。近年来针对作用于脂肪组织的药物开发以防治肥胖备受关注。有些针对脂肪组织的小分子药物, 在体外显示出良好的调节脂肪代谢的作用, 但这些药物缺乏特异性并有毒副作用, 限制了其进一步应用于体内用于肥胖的治疗[9]。因此, 通过新的分子技术, 开发特异性作用于脂肪细胞的载体及药物, 为肥胖等代谢性疾病的防治提供新思路和新方法, 显得尤为重要。

核酸适体是在体外通过SELEX筛选得到的短链核苷酸。体外研究已经证实, 核酸适体可以与靶标高特异性、高亲和力稳定地结合, 同时能确保目标分子保持天然构象, 最大程度保留其生物功能。那么在体内, 核酸适体是否同样具有在体外显示的作用?早在1990年, 人们便尝试着将核酸适体用于体内实验。2004年Pegaptainb (Macugen) 经美国FDA批准用于治疗年龄相关性黄斑变性, 成为第1个应用于临床治疗的核酸适体[10]。近年来, 越来越多被筛选出的核酸适体应用于体内, 包括各种疾病的诊断与治疗, 例如:应用于血栓、急性冠状动脉综合征、血管性血友病因子相关疾病、急性髓系白血病等已处于不同临床试验阶段[11,12,13]。此外, 核酸适体还被应用于生物标志物的发现, 纳米载体、分子成像等[14]。本研究将通过Cell-SELEX筛选到的脂肪细胞特异性核酸适体adipo 8应用于DIO小鼠体内, 证实adipo 8在肥胖小鼠体内可与白色脂肪组织高度特异性结合。

体外筛选出的核酸适体主要通过静脉注射、皮下注射、腹腔注射、吸入、鞘内注射等方式进入体内。经血循环吸收后, 最终作用于靶细胞膜蛋白。未修饰的核酸适体进入体内, 迅速被核酸酶经内源性嘌呤代谢和嘧啶代谢途径分解, 半衰期可短至2 min[15]。核酸适体主要通过2’-Fluoro、2’-O-methyl、硫代碱基等修饰以降低核酸酶的分解。硫代修饰, 主要适用反义实验中降低寡核苷酸被核酸酶分解。可以选择全硫代修饰, 但随着硫代碱基的增加, 寡核苷酸的Tm值会降低, 为了降低这种影响, 可以对引物两端部分碱基进行部分硫代修饰[16]。核酸适体分子量低, 一般为5~15 k D, 主要通过结合聚乙二醇或胆固醇来增加其分子量, 以延缓核酸适体的肾脏清除率[17]。本研究将硫代碱基修饰、结合聚乙二醇的adipo 8应用于DIO小鼠体内, 增强了其与脂肪组织结合的强度及延长结合时间。

KAIDA等[18]筛选出针对晚期糖基化终末产物 (advanced glycationend products, AGEs) 的核酸适体, 硫代碱基修饰并进行[γ-32P]ATP同位素标记。小鼠腹腔连续输注AGEs核酸适体8周, 通过检测放射性核素单位CPM值显示, AGEs核酸适体主要分布于肾脏、主动脉和肌肉。AGEs核酸适体通过阻断AGEs-AGEs受体轴, 减少肾小球AGEs沉积, 抑制肾小球的肥大和细胞外基质蛋白的积累, 减少血肌酐、尿素氮浓度, 降低尿白蛋白和8-羟化脱氧鸟苷排泄率, 降低肾脏炎症反应和纤维化等, 从而明显延缓糖尿病肾病进展。本研究通过给DIO小鼠连续腹腔输注脂肪细胞特异性核酸适体adipo 8, 发现adipo 8在肥胖小鼠体内可以抑制脂肪组织成脂, 并且该作用随着时间的延长而加强, 即adipo 8在体内抑制成脂的作用呈时间依赖性。

综上所述, 使用SELEX体外筛选所得的脂肪细胞特异性核酸适体adipo 8在DIO小鼠体内, 同样显示出与脂肪组织的高度特异性结合, adipo 8在肥胖小鼠体内可以抑制脂肪组织成脂。本研究结果为进一步探索adipo 8的生物功能、阐明脂肪细胞代谢调控机制提供了新证据, 为开发新的防治肥胖的靶向药物提供了有效的分子工具, 具有重要的意义。

摘要：目的 通过研究体外筛选的脂肪细胞特异性核酸适体adipo 8在肥胖小鼠体内是否可以与脂肪组织特异性结合, 初步探讨adipo 8在肥胖小鼠体内对脂肪组织成脂的影响作用。方法 1高脂喂养雄性C57BL/6小鼠60只复制肥胖小鼠模型;2取小鼠4只, 腹腔注射cy 3荧光标记并硫代碱基修饰, 结合聚乙二醇的adipo 8, 注射后1 h取肝脏、肾脏、肌肉及附睾脂肪组织于冷冻切片机制成冰冻切片2块, 荧光显微镜下观察各组织荧光信号和HE染色;3取小鼠24只分为未修饰adipo 8组和修饰adipo 8组, 每组12只。Cy 3荧光标记的未修饰和修饰adipo 8分别腹腔注射入两组小鼠体内, 注射后30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h分别取附睾脂肪组织制成冷冻切片, 荧光显微镜下显像;432只小鼠分为随机序列组和adipo 8组, 每组16只。微型渗透压泵埋入小鼠腹腔, 分别连续腹腔输注随机序列和修饰adipo 8, 于连续腹腔输注第1、2、3、4周, 分别取附睾脂肪组织制成冷冻切片, HE染色观察分析脂肪细胞大小改变。结果 1腹腔注射cy 3荧光标记并修饰的adipo 8, 1 h荧光显微镜下观察显示:脂肪组织可见非常强的荧光信号, 而其余组织仅可见微弱信号;2未修饰adipo 8与脂肪组织结合弱且作用时间短, 修饰adipo 8与脂肪组织结合强且时间长。修饰adipo 8组中, 脂肪组织的荧光信号呈先增后减, 1 h最强, 30 min和24 h信号弱;3光学显微镜相同放大倍数单个视野内, 第1周, adipo 8组脂肪细胞大小较随机序列组无明显差异 (P>0.05) , 第2、3、4周, adipo 8组脂肪细胞小于随机序列组 (P<0.05) 。结论 1核酸适体adipo 8在肥胖小鼠体内可与白色脂肪组织高度特异性结合;2Adipo 8经硫代碱基修饰、结合聚乙二醇, 增强了其与脂肪组织结合的强度及延长结合时间;3Adipo 8在肥胖小鼠体内可以抑制脂肪组织成脂, 并且该作用随着时间的延长而加强, 即adipo 8在体内抑制成脂的作用呈时间依赖性。

脂肪肝与代谢综合征 篇6

在美国, 成人治疗指征 (ATPIII) 是确定胰岛素综合征最常用的系统。这两种定义的一些主要区别包括:①在WHO的标准中列出了微量蛋白尿, 而在ATPIII中并未提及;②WHO中将胰岛素抵抗直接作为依据, 而在ATPIII中并没有将其用于定义代谢综合征;③在ATPIII的定义中只认为快速升高的血糖值是重要的, 在WHO的标准中承认所有的胰岛素抵抗参数。

2 脂肪代谢

2.1 正常脂肪代谢

在肝脏脂肪合成、分解代谢过程中, 许多激素参与了调节作用。胰岛素抑制外周脂肪组织中的HSL, 减少了肝脏游离脂肪酸的来源, 在肝内胰岛素抑制线粒体内β氧化, 刺激葡萄糖转化合成脂肪酸。相反, 肾上腺素和去甲肾上腺素在外周脂肪组织中上调HSL的活性, 使游离脂肪酸的产生增多, 而在肝内, 胰高血糖素刺激β氧化和抑制内源性脂肪酸的合成[2]。

2.2 脂肪肝的病理代谢

肝脏是胰岛素作用的靶器官, 是脂肪摄取、氧化脂酸代谢、胆固醇合成、磷脂、脂蛋白合成和分泌的中枢。正常情况下脂质代谢在肝脏中处于动态平衡, 当脂质代谢紊乱时, 大量脂肪进入肝细胞, 肝内合成脂肪增加超出肝细胞氧化利用和合成脂蛋白运送能力时, 脂质则在肝细胞内沉积, 导致肝细胞变性、肿大而形成脂肪肝。高脂血症对脂肪肝的形成密切相关, 尤其与高TG血症关系密切。高TG血症与脂肪肝发病率呈正相关, 随着TG浓度的升高, 脂肪肝发生率也升高。胰岛素抵抗是2型DM的特征之一, 多数报道认为[3]:高TG血症的游离脂肪酸增多干扰了胰岛素在周围组织中与受体结合, 使胰岛素作用下降, 并产生胰岛素抵抗 (1R) , 同时高胰岛素血症和IR又促进肝脏合成TG和VLDL, 当肝中合成TG速度超出将其组成VLDL并分泌人血的速度时, 便出现肝中TG堆积, 形成脂肪肝。此后由于大量脂肪积聚在肝细胞内, 使糖异生加强, 而糖向脂肪的转化因脂肪代谢障碍而相对减弱, 导致血糖增高, 加快了糖尿病病情的进展速度。有研究表明胰岛素抵抗在脂肪肝发病过程中起着重要作用[4]。2型糖尿病患者脂肪肝的发生与慢性胰岛素水平升高有关, 而不是与血糖有关。

3 两者的关系

脂肪肝与代谢综合征关系密切。与以往研究结果一致, 代谢综合征发生、发展的中心环节是体内存在胰岛素抵抗。既往研究表明, 胰岛素抵抗可作为原发病因参与非酒精性脂肪肝的发生和发展, 各种原因所致的肝细胞脂肪堆积也可诱发和加剧胰岛素抵抗。胰岛素抵抗时, 肝脏和外周脂肪、肌肉组织对胰岛素作用的生物反应降低, 发生多元代谢紊乱。肝摄取游离脂肪酸增加, 肝细胞内脂氧化酶CYP2EI和CYP4A表达增高, 游离脂肪酸氧化或利用减少, 形成TG增多, 肝细胞脂肪转运出肝能力受损, 引起肝细胞内脂肪堆积, 并可促进脂肪化的肝脏发生炎症、坏死和纤维化。脂肪肝时, 血液和肝脏中显著增多的游离脂肪酸、肿瘤坏死因子、纤溶酶原激活物抑物-1、瘦素等可促进胰岛分泌胰岛素, 形成高胰岛素血症和胰岛素抵抗。Venturi等[5] 报道校正BMI后脂肪肝与胰岛素抵抗仍呈显著相关性。Kim等[6] 认为非酒精性脂肪肝是早期代谢紊乱的指标, 尤其是体重正常的人群。另有学者研究发现, 血糖和BMI正常的NAFLD患者存在空腹及糖负荷后高胰岛素血症和高TG血症, 提示即使体重和糖耐量均正常, 高胰岛素血症和胰岛素抵抗亦为非酒精性脂肪肝的重要组成部分。最近, 有学者[7] 提出非酒精性脂肪肝不但与胰岛素抵抗相关, 也是胰岛素抵抗的早期标志。另外, 还显示在体重指数正常的脂肪肝中, 空腹血糖、血脂、血压、BMI以及尿酸水平较对照组有显著增加, 且血糖、血脂、BMI的OR也有增加, 提示正常体重的脂肪肝已出现了代谢综合征的表现。国内成人健康体检已将肝脏B超列为常规项目, 且其检查简便、费用低廉, 部分地区脂肪肝的检出率达到8.8%~12.9%。临床上需警惕脂肪肝作为代谢紊乱危险因素聚集的可能性, 应积极重视脂肪肝的防治。

脂联素 (adiponectin) 是近年新发现的一种脂肪细胞特异性细胞因子, 包含3个外显子和2个内含子, 全基因组扫描显示其定位于染色体3q27, 且该区域存在2型糖尿病和代谢综合征的易感位点。编码脂联素的基因正是定位于此, 提示脂联素基因可能是2型糖尿病和代谢综合征的一个新易感基因。由于非酒精性脂肪肝病 (nonalcoholicfatty liver disease, NAFLD) 通常发病于超重/肥胖、2型糖尿病/胰岛素抵抗 (IR) 、高血压和高脂血症等代谢紊乱的病人, 它是代谢综合征的重要组成部分。因此, 推测脂联素可能与NAFLD相关,

脂联素存在于血脂循环中, 2型糖尿病和肥胖者血清脂联素水平低下, 可导致胰岛素抵抗NAFLD。脂联素可增加胰岛素的敏感性, 降低IR, 在动物实验中亦已发现给脂肪萎缩的小鼠注射脂联素可使IR部分逆转。脂联素可改善胰岛素抵抗和糖代谢作用, 源于它能增加骨骼脂肪酸氧化并抑制肝糖异生。此外, 还能通过抑制巨噬细胞的活性抑制其产生TNF-α, 对肝细胞损伤起保护作用。血清脂联素不仅可反映胰岛素抵抗和脂肪肝的病情变化程度, 还可反映其疗效, 并可作为2型糖尿病合并脂肪肝患者的评估指标。

多组横断面研究发现, 血清脂联素水平除与脂肪的量有关外, 亦与脂肪的分布有关[8,9]。腹部脂肪可通过CT扫描或腰臀比、腰围、臀围测定。本研究显示, 血清脂联素水平与BMI、腰围、臀围呈负相关, 亦提示脂联素水平与肥胖尤其是内脏型肥胖呈负相关。

血清脂联素浓度及代谢综合征是预测严重脂肪肝的标志, 因此我们认为, 当与代谢综合征相关时, 脂肪肝对机体损伤更为严重, 应该将其从良性脂肪肝中区分出来。对于脂肪肝来说, 代谢综合征 (将2型糖尿病、脂代谢异常及高血压与内脏型脂肪组织分布相联系) 比肥胖程度更为重要。最近的研究发现, 在腹型或内脏型肥胖时, 脂联素及其调节异常可能参与了代谢综合征和脂肪肝的发展[10]。脂联素可恢复外周和肝脏的胰岛素敏感性。临床和实验数据表明, 胰岛素抵抗是代谢综合征和脂肪肝共同的最重要的致病因素。胰岛素抵抗使胰岛素敏感组织中脂肪的储存和降解发生异常, 脂肪酸由脂肪组织转移到肝脏而引起脂肪肝。本研究中脂肪肝组研究对象的脂联素浓度明显低于对照组 (P<0.01) , 而且随着脂联素浓度 (四分位数法) 升高, 脂肪肝的患病率显著降低 (P<0.001) 。这一保护性作用也可从多变量模型中显示出来 (OR-0.15, P<0.001) , 提示低浓度的血清脂联素可增加脂肪肝的患病率, 是脂肪肝重要的独立致病因素。

4 结论

代谢综合征是胰岛素抵抗导致的一组症候群, 它的出现意味着这将会显著增加患动脉粥样硬化性疾病的危险。在过去的10年中, 代谢综合征患者中常存在NAFLD。通过检测手段能够发现, 超过40%的代谢综合征患者有进展到NAFLD的征象。不仅如此, 1项最近的研究证明代谢综合征患者中NAFLD 的发病率高于无代谢综合征人群。值得注意的是, 同时患有NAFLD和代谢综合征的病人与单纯NAFLD病人相比, 发生严重组织学变化 (例如肝硬化[11]) 的危险性更高。许多研究显示NAFLD 病人中有非常高的代谢综合征流行率, 而代谢综合征的存在则预示着更为严重的组织学变化 (例如脂肪性肝炎和肝脏纤维化[12]) 。脂联素及代谢综合征可用于预测脂肪肝的严重程度。尽管目前的结果尚不足以阐明脂联素、代谢综合征及脂肪肝之间潜在的联系机制, 但我们推断, 可能存在一条共同的通路。脂联素具有降低血脂血糖、改善胰岛素敏感性的作用, 同时可拮抗动脉粥样硬化。长期给予小鼠高脂及含乙醇的饮食, 小鼠血浆脂联素水平可显著降低, 给这类小鼠静脉注射重组脂联素可明显减轻肝脏肿大和脂肪肝的程度。因此, 是否可将脂联素或刺激脂联素分泌的药物如胰岛素增敏剂 (噻唑烷二酮类) 等应用于临床防治老年人脂肪肝及与胰岛素抵抗、动脉粥样硬化相关的疾病, 值得进一步深入研究。

摘要：脂肪肝的发生、发展过程对糖尿病的进展有一定的作用, 脂肪性肝炎 (nonalcoholic steatohepatitis NASH) 现已成为仅次于慢性病毒性肝炎和酒精性肝病 (alcoholic live rdisease ALD) 肝硬化前期的重要病变[1], 约15%～50%的NASH患者可发生不同程度的纤维化和肝硬化。代谢综合征与脂肪肝的关系问题, 一直是学术界争论的重点, 许多学者认为糖、脂代谢紊乱可导致脂肪肝, 而临床观察中糖、脂代谢紊乱发生之前就已经有脂肪肝的存在。本综述着重就脂肪肝的正常生理代谢、病理变化与代谢综合征和脂联素的关系作一阐述, 研究脂肪肝和代谢综合征的相关性, 提示脂肪肝为一个重要的危险因子。

关键词：脂肪肝,代谢综合征,脂联素,综述

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动物脂肪代谢关键基因的研究进展 篇7

1 脂肪酸合成酶 (FAS)

FAS是一种基本的代谢酶类, 催化乙酰Co A和丙二酸单酰Co A合成软脂酸, FAS的多少和活性的高低对动物体脂沉积具有重要意义, 在动物体脂沉积过程中发挥重要作用, 其表达水平的升高能够显著增加三酰甘油在体内的沉积[1]。

在能量代谢过程中, 乙酰Co A是合成脂肪的起点, 它可以进入三羧酸循环, 完全氧化, 为生物细胞提供能量来源。丙二酰Co A是脂肪酸合成酶的主要底物, 它的增多意味着能量过剩, 如不控制, 将加速脂肪合成。

近年来的研究发现, 癌细胞的生长依赖于FAS的活性, 且与肥胖、癌症等疾病的关系密切, 在具有侵袭性的癌组织中持续高表达。FAS抑制剂的研制有望为相关疾病的治疗提供新的方法。经FAS抑制剂处理的小鼠, 可以减少进食量, 增加能量消耗, 有明显的减肥效果;肿瘤的发生常与FAS的不正常表达密切相关, 已发现其在多种恶性肿瘤中过度表达, 抑制FAS的表达和活性可以抑制直肠癌发生肝转移[2]。

研究发现, FAS基因在小尾寒羊尾部脂肪组织中的表达水平随着日粮中能量水平的增加而呈升高的趋势。猪脂肪组织中的FAS与胴体脂肪量、胴体脂肪率呈极显著正相关[3]。FAS在猪腹脂中的基因表达规律是随着日龄的增加而呈现升高的趋势。

饲喂高蛋白质日粮可降低脂肪组织FAS mRNA的表达量, 但不影响肝脏组织FAS mRNA的数量, 有利于体脂肪的沉积减少, 生产出高瘦肉率、低脂肪的肉类[4]。

2 乙酰辅酶A羧化酶 (ACC)

ACC是脂肪酸合成限速酶, 具有催化乙酰辅酶A形成丙二酸单酰Co A的羧化作用, 是脂肪合成和代谢过程中重要的中间代谢产物[5]。已确认的ACC有两种形式, 即ACCα和ACCβ, 它们由不同基因编码, 在不同的组织中表达, 具有不同功能。在进食后和高胰岛素水平下, ACCα处于激活状态, 协助机体以脂肪形式储存能量或减少摄食;而在空腹状态下, ACCβ是被抑制的, 有利于脂肪的水解和氧化。因此, 可通过激活ACCα或抑制ACCβ来达到治疗糖尿病的目的。

在下丘脑, ACCα可能参与了饱感的过程, 丙二酰Co A在下丘脑中有调控摄食的重要作用, 高的胰岛素和血糖水平 (餐后状态) 激活ACCα, 可以抑制动物的摄食行为[6]。哺乳动物ACCβ被证实可以作为治疗肥胖、糖尿病等代谢疾病的活性靶标[7]。肥胖小鼠血清中的三酰甘油和总胆固醇浓度高于正常小鼠。研究发现, ACC抑制剂能抑制小鼠体重的增加, 减少肥胖小鼠的肥胖程度, 降低血清中三酰甘油和胆固醇含量, 提示ACC抑制剂对肥胖小鼠有减肥作用。

ACC在多种肿瘤组织中呈高表达, 不同的ACC抑制剂能有效抑制脂肪酸合成, 具有抗肿瘤细胞增殖的作用, 并且可以引起细胞凋亡及周期阻滞, 这些结论均表明抑制ACC活性可能成为治疗恶性肿瘤的新靶点。

3 肾母细胞瘤过度表达 (NOV) 基因

NOV是CCN家族成员之一, 与大多数CCN家族成员的结构和功能相似, NOV可参与调节细胞增殖、分化、黏附及血管形成等复杂的病理和生理过程, 还可促进骨骼、神经和血管的发育。NOV基因与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关, 它是一种原癌基因[8]。在鸡胚胎和成体脑组织中存在一定量的NOV mRNA, 提示在这些组织中NOV基因可能有一定的促细胞生长、分化作用[9]。

研究发现, NOV可调节细胞内钙离子水平, 并对某些肿瘤有抑制生长作用, 其生物学效应也许与效应细胞种类有关。NOV基因对成纤维细胞生长也有抑制作用, 可使细胞从生长转为静止状态。

最新的研究结果表明, 背最长肌组织中NOV基因表达量与肌间脂肪含量之间具有负相关关系 (P<0.01) 。另外, NOV基因还可以在育肥牛血液中表达, 其表达丰度与育肥日龄有一定关系[10]。

4 胰岛素样生长因子-Ⅰ (IGF-Ⅰ)

IGF-Ⅰ是胰岛素样生长因子家族中的一种, 通过与IGF-Ⅰ受体结合产生生物学效应。IGF-Ⅰ是生长激素发挥促生长作用的重要调节因子。IGF-Ⅰ在哺乳动物、禽类的胚胎期和出生后的生长过程中起重要作用, 与初生重、日增重、背膘厚度等性状均有一定的相关性[11]。

IGF-Ⅰ是一种碱性多肽, 具有调节机体生长发育、生殖免疫和机体代谢的功能;此外, 还具有类似于胰岛素样的生物合成代谢功能, 能够调节机体血糖水平。研究发现, IGF-Ⅰ能够抑制多种类型细胞凋亡, 促进细胞增殖和分化。在肌细胞形成过程中, IGF-Ⅰ可促进肌细胞分化;在骨骼肌生长过程中, IGF-Ⅰ可调节骨骼肌的生长。

IGF-Ⅰ可促进骨细胞、肌肉细胞的增殖和前脂肪细胞分化, 瘦肉型猪血浆中IGF-Ⅰ含量高于脂肪型, 血浆中IGF-Ⅰ水平与体重及增重呈正相关。选择较低水平的IGF-Ⅰ会得到更多的瘦肉, 更快地生长和更有效益的猪。

研究发现, IGF-Ⅰ与断奶重及肉牛的初生重相关, 与某些猪种的背膘厚度相关。IGF-Ⅰ基因位点的多态性对日增重、瘦肉率, 以及骨、皮、脂含量等性状有显著影响[12]。育成牛血液中IGF-Ⅰ的浓度与平均日增重之间存在着正相关, 血清中的IGF-Ⅰ浓度可作为改善生长和饲料效率的选择指标而被应用于育种中[13]。

5 小结

动物的生长育肥过程受众多因子、酶体系的调控, 其生化过程极其复杂, 并非单一的对应关系, 综上所述的关键酶mRNA表达量高, 并不一定等于酶蛋白的含量高或酶的活性高, 还可能受其他因素共同影响。迄今为止的大部分研究多局限于动物营养代谢和单一的生化过程。今后的研究应定位于特定组织与基因表达特性, 研究生长与脂肪代谢相关信号通路和分子调控通路, 从分子水平揭示动物体内营养代谢及其调控机制。

摘要：动物脂肪代谢包括合成代谢和分解代谢, 两者共同调控着脂肪的沉积。在两个动态调控过程中, 脂肪酸合成酶 (FAS) 、乙酰辅酶A羧化酶 (ACC) 、肾母细胞瘤过度表达 (NOV) 和胰岛素样生长因子-Ⅰ (IGF-Ⅰ) 基因参与细胞的分化和脂肪的形成, 并且扮演着较为重要的角色。文章对FAS、ACC、NOV和IGF-Ⅰ基因的生理功能及研究进展进行了综述。

脂肪酸代谢 篇8

虽然KCS家族在植物形成长链脂肪酸中发挥重要功能已有报道, 部分家族成员的具体作用机制也已被证实, 但其成员At KCS12在不同种类脂肪酸形成过程的功能却鲜有报道。本研究利用分子遗传的方法, 对在拟南芥中编码脂肪酸代谢途径中关键酶的基因At KCS12的功能进行研究, 为下一步克隆油料作物中的At KCS12, 改善油料作物的含油量, 提供更多长链以及超长链脂肪酸打下基础。

1材料与方法

1.1实验材料

野生型拟南芥 (Arabidopsis) 的种子采自本实验室。TIANScript c DNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司;INVSc1酵母本实验室保存;转化入p YES2的E·Coli本实验室保存。其他相关试剂购自上海生物工程公司。

1.2拟南芥RNA提取及c DNA合成

拟南芥叶片的RNA采用CTAB-Li Cl法提取[5]。c D N A合成参见T I A N S c r i p t c D N A第一链合成试剂盒 (TIANGEN, China) 。

1.3酵母表达载体的构建

分别用Sac I和Xba I, Sac I和Eco RI两种酶对KCS p EASY质粒和p YES2质粒进行酶切, T4连接酶连接, 重组质粒的转化。

1.4重组质粒转入INVSc1酵母细胞

INVSc1酵母在缺His、Leu、Try、Ura的缺陷培养基上不能生长。p YES2质粒可合成尿嘧啶, 故用尿嘧啶缺陷筛选。挑单个菌落接种于20 m L YPD液体培养基中, 将1μg质粒DNA, 10μL变性鲑鱼精子DNA (10 mg/m L) 于上述酵母溶液混匀;加入1×Li Ac/40%PEG-4000/1×TE, 混匀;加入88μLDMSO混匀, 42℃加热7 min;12 000 rpm离心10 s, 重悬细胞, 12 000 rpm再离心;涂布于SC-U固体培养基。

1.5酵母脂肪酸的分析

收集酵母菌体后进行酵母脂肪酸的提取与甲酯化[6]。石英毛细管柱HP-5 (30 m×0.35 mm, 0.25μm) , 程序升温:从180℃开始, 以5℃/min升到230℃, 保持20 min;载气为He, 柱流量1.5 m L/min, 进样口温度230℃, 检测器温度为FID为230℃, 分流比30∶1。色谱柱信息:Agilent Technologies, Inc。货号:125-3237。型号:DB-FFAP 30 m×0.530 mm, 0.5Micro[7]。

1.6数据处理

采用SAS 6.0统计软件分析, 比较转基因酵母与对照组酵母中脂肪酸含量的差异。若概率P<0.05, 则认为结果是显著的;若P<0.01, 则认为结果是极显著。

2 结果与分析

2.1 At KCS12的克隆和序列分析

克隆At KCS12 c DNA序列片段 (见图1A) , 将其连接到p EASY载体后双酶切 (Sac I和Eco RI) 验证。结果如图1B所示, 双酶切 (Sac I, Xba I) 和 (Sac I, Eco RI) 后两条带的大小分别为1 500 bp左右与5 900 bp左右, 结果与目的基因预期分子量大小相符合。

At KCS12含有一个1431bp的开放阅读框架 (ORF) , 编码一个含476个氨基酸的多肽。At KCS12基因编码的氨基酸多肽, 是缩合酶超家族的一员, 包含查尔酮合酶 (CHS_like) 高度同源区域, 该区域为91-1266bp编码的392个氨基酸序列, 结果表明, 该c DNA序列很可能编码脂肪酸代谢途径中3-ketoacyl-Co A synthase。

2.2 酵母转化子鉴定

将目的基因-p YES2重组表达载体转入INVSc1酵母中, 转化效果良好, 随机挑选4个单菌落将其进行扩培, 提取质粒并进行PCR验证是否成功将表达质粒转入酵母, 结果见图2。

由图2可以看出, 含目的基因的p YES2重组表达质粒成功转入酵母中, 接下来将通过诱导培养基诱导目的基因表达, 收集菌体, 进行脂肪酸的提取与检测分析。

2.3 At KCS12功能分析

利用气相-质谱联用技术 (GC-MS) 分析酵母主要脂肪酸种类以及总脂肪酸含量。分别培养、诱导酵母转化子和对照酵母, 收集菌体, 提取油脂, 经甲酯化后进行气相质谱分析, 主要有4个脂肪酸甲酯的峰, 分别为C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1。将所得的数据用SAS软件分析, 比较转基因酵母与对照组酵母脂肪酸含量的差异。分析结果如表1, 数据以平均值标准方差的形式表示, 而*表示样品与对照组之间的差异显著, **表示样品与对照组之间的差异极显著。

At KCS12转基因酵母和对照的脂肪酸组成分析结果如图3所示。可以看出, 与对照组相比, At KCS12在转基因酵母中表达使得酵母中的棕榈酸 (16∶0) , 硬脂酸 (18∶0) 的相对含量增加了4.5%, 22.78%, 十八烯酸 (18∶1) 的相对含量减少了5.85%, 棕榈烯酸 (16∶1) 的含量变化不显著。

3 讨论

本实验克隆了拟南芥c DNA文库中的At KCS12基因, 并在酵母 (INVSc1) 中进行表达。分析脂肪酸组成发现, 转基因酵母和空白对照中只有C16∶0、C16∶1、C18∶0和C18∶1这4种长链脂肪酸, 与空白对照相比, 转At KCS12基因的酵母没有检测到超长链脂肪酸的合成。推测At KCS12蛋白不能利用酵母中的C16∶0、C16∶1、C18∶0和C18∶1脂肪酸作为催化底物合成超长链脂肪酸, 或者在酵母中异源表达的At KCS12蛋白没有酶活性。

参考文献

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[6]Paul S, Gable K, Beaudoin F, et al.Members of the Arabidopsis FAE1-like 3-ketoacyl-Co A Synthase Gene Family Substitute for the Elop Proteins of Saccharomyces Cerevisiae[J].Journal of Biological Chemistry, 2006, 281 (14) :9018-9029.