血清脂肪酶论文（共7篇）
血清脂肪酶论文 篇1
慢性肾功能衰竭 (CRF) 是指各种慢性肾脏疾病导致肾脏三大功能渐进性不可逆性减退, 在终末期可出现急性肾衰等严重并发症, 甚至有生命危险[1]。目前CRF诊断的主要临床实验室指标是血清肌酐 (Cr) 、尿素氮 (Urea) 和肾小球率过滤 (GFR) 。脂肪酶 (LPS) 主要是由胰腺和脂肪组织分泌的消化酶, 参与脂类消化, 在正常人血清中LPS检出水平较低, 而在尿液中几乎检测不到[2]。目前临床应用中已普遍将LPS与淀粉酶 (AMY) 联合应用于急性胰腺炎的诊断[3], 并且在近年来国内外文献报道血清脂肪酶是一个比淀粉酶更敏感和特异的指标, 建议用血清脂肪酶代替淀粉酶[4], 但是在肾脏疾病或其他系统疾病的诊治中以血清LPS作为检测指标应用还较少。近年来, 国内外有研究表明CRF患者血清中LPS水平明显高于正常者, 为进一步了解LPS与CRF之间是否存在一定联系, 现对2013年6月~2014年4月于苏大附一院肾内科住院120例慢性肾脏病患者及80例同期健康体检者的LPS、血清肌酐 (SCr) 进行回顾性分析。报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
病例来自2013年6月~2014年4月我院住院患者, 正常对照组为同期健康者, 其中病例均以临床综合诊断为金标准确诊该疾病, 排除临床表现和CT影像学、血清淀粉酶等证据支持急/慢性胰腺炎诊断或疑似诊断及伴随有肿瘤或风湿性疾病患者。共计200例, 其中正常对照组80例, 男31例, 女49例, 年龄89~26 (平均47) 岁;慢性肾功能衰竭组120例, 男69例, 女51例, 年龄87~25 (平均53) 岁。
1.2 材料
1.2.1 仪器
OLYMPUS AU5400全自动生化分析仪。
1.2.2 试剂
将脂肪酶试剂 (Dia Sys Diagnostic Systems Gmb H) 与肌酐试剂 (日本世诺临床诊断制品) 按其分析程序设计并在有效期内使用。
1.2.3 校准血清
校准血清由Dia Sys公司提供, Tru Cal U复合校准品
1.2.4 质控品
Dia Sys公司提供的Tru Lab N和P控制品进行内部质量控制。
1.3 实验方法
所有检测对象均为空腹采集的静脉血3~5ml, 分离血清后2h内检测。
1.3.1 脂肪酶测定为酶比色法
脂肪酶在共脂肪酶和胆汁酸的存在下水解微乳液中的底物1, 2-O-二月桂-外消旋-甘油-3-戊酸-酯为6-甲基试卤灵, 此红色染料引起的吸光度上升与样品中脂肪酶的活力成正比。
1.3.2 肌酐测定为肌氨酸氧化酶法
肌酐在肌酐胺基水解酶 (CRN) 作用下转化为肌酸, 肌酸在肌酸脒基水解酶 (CR) 、肌氨酸氧化酶 (SAO) 和过氧化物酶 (POD) 作用下转化为深红色色素, 测其吸光度可计算得出肌酐浓度。
1.4 统计学处理
所得数据采用SPSS 17.0统计软件进行处理, 试验结果用均值±标准差表示, 两组样本间比较采用t检验作统计分析。
2 结果
比较2组血清肌酐 (Cr) 以及脂肪酶 (LPS) 水平, 结果正常对照组Cr为64±19μmol/L, 处于参考范围之内;而慢性肾衰组Cr为763±444μmol/L, 明显高于正常对照组P<0.01) 。结果见附表。
注:经t检验, 慢性肾衰组与正常对照组之间存在显著差异 (P<0.01)
3 讨论
CRF引起血清LPS升高的可能机制包括: (1) 肾小球率过滤 (GFR) 下降[1], 当GFR下降时, LPS水平开始升高。 (2) CRF病程中释放的毒素作用, 这些毒素可引起血管病变致胰腺血液循环障碍, 会进一步导致继发性胰腺炎[5]。 (3) 继发性甲状旁腺亢进[5,6], 在CRF时, PTH可对各组织产生毒素作用, 对胰腺细胞产生间接损伤。
慢性肾脏疾病患者血清LPS水平常出现增高, 肾内科医生常常怀疑是否合并急性/慢性胰腺炎, 当影像学和临床症状表现不支持这一结果时, 增高的LPS常常会给诊断和治疗带有一定困扰。尤其在CRF中, 可能存在多种机制与LPS升高有关, 机体各物质处于动态平衡中, GFR下降, LPS会随即升高, 同时促进胰液和抑制胰液激素分泌增多, 协同神经系统作用共同致LPS升高。除此之外, 治疗方式等因素也可影响LPS增高的程度, 血液透析患者LPS水平普遍高于腹膜透析患者。虽然CRF引起血浆LPS增高的机制目前还不十分明确, 仍在深入研究之中, 但了解这些原因对患者病程判断、疗效预估及减少诊断失误均有积极作用。我们的研究结果表明CRF患者血清LPS水平明显高于正常对照组 (P<0.01) , 所以我们认为血清LPS可以作为慢性肾功能衰竭的实验室血清学诊断的参考指标。
摘要：研究血清脂肪酶 (LPS) 在慢性肾功能衰竭患者血清中含量变化的临床意义。运用OLYMPUS AU5400全自动生化分析仪, 用酶比色法进行测定, 其中慢性肾功能衰竭组120例, 正常对照组为同期健康体检者80例, 将两组LPS水平进行比较, 并进行相关性统计分析。结果慢性肾衰组血清LPS水平为79.8U/L, 正常对照组为15.3U/L, 两者之间存在显著差异 (P<0.01) 。在临床样本检测中LPS可以作为一种能较好的反映慢性肾功能衰竭的实验室诊断血清学指标, 对于降低急/慢性胰腺炎的误诊率有积极作用。
关键词：血清脂肪酶,慢性肾功能衰竭,实验室诊断
参考文献
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血清脂肪酶论文 篇2
1 病例资料
1.1 一般资料
82例均为2001年1月-2008年12月我院住院患者, 其中男60例, 女22例;年龄2～38岁, 中位年龄9.8岁。该病全年散发, 以冬春季为多, 平均发病时间4～7d。
1.2 诊断依据
(1) 根据流行病学史, 凡发热并结合腮腺肿大或颌下腺肿大特点者, 临床诊断为流腮。 (2) 流腮病程中出现上腹剧痛或持续性中上腹痛, 发热;伴或不伴恶心、呕吐和腹胀;血、尿淀粉酶升高;血清脂肪酶增高;血白细胞及中性粒细胞增高;B型超声或CT检查显示胰腺体积增大者诊断为流腮。
1.3 临床症状及体征
(1) 82例均有发热, 37.8～41.0℃, 平均39.3℃。 (2) 入院时腮腺肿大63例, 其中60例双侧肿大, 3例单侧肿大。33例伴有颌下腺肿大。 (3) 腹痛13例, 恶心、呕吐28例, 腹胀8例。
1.4 实验室检查
比色法测血淀粉酶186～960U/L (正常参考值80～160U/L) 37例, 尿淀粉酶1298～3980U/L (正常参考值100～1200U/L) 32例, 血脂肪酶1.6～6.0U/L (正常参考值1.0～1.5U/L) 9例。
1.5 并发症
流腮并发脑膜炎15例, 睾丸炎4例, 胰腺炎9例, 经心电图心肌酶谱检查证实有心肌损害6例。
1.6 治疗转归
82例患者经抗病毒及综合对症治疗均痊愈出院。
2 讨 论
流腮病毒可扩散到全身多个器官造成损害, 其中以腮腺受侵多见和直观——腮腺肿大和疼痛[1]。并发症中以脑膜炎为常见, 并发胰腺炎比较少, 并且流腮患者主要是儿童, 由于诉说病史不详细, 表达不够准确给诊断造成困难。目前应用腮腺炎减毒活疫苗进行主动免疫, 使流腮发病减少, 加之症状不典型、认知性不高也给诊断带来困难。本组82例患者中血、尿淀粉酶升高分别占45.1%和39.0%, 血脂肪酶升高占11.0%。82例中有9例并发胰腺炎占11.0%, 且血、尿淀粉酶及血脂肪酶均升高。流腮患者由于胰腺管炎症, 唾液中的淀粉酶排出受阻, 经淋巴管进入血液, 使血、尿淀粉酶升高, 因此流腮患者血、尿淀粉酶升高并不一定代表并发胰腺炎, 从而导致忽视并发胰腺炎的诊断而漏诊。流腮并发胰腺炎患者血脂肪酶常在病后24～72h开始升高, 持续时间长 (7～10) d, 且特异性也较高, 血脂肪酶升高对病程长短无明显影响, 但有助流腮并发胰腺炎的诊断和治疗措施的选择及调整[2]。
参考文献
[1]罗端德.传染病学[M].北京:人民卫生出版社, 2004:82-84.
血清脂肪酶论文 篇3
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集笔者所在医院2013年1月-2014年1月住院的首次发病的急性胰腺炎患者34例,其中男27例,女7例;年龄22~68岁,平均40.3岁。所有患者的诊断均由症状、体征、实验室检查以及影像学检查证实,依照中华医学会消化病学会胰腺疾病学组中国急性胰腺炎诊治指南(草案)标准分为轻型(MAP)、重型(SAP)两组[3]。所有患者均排除了精神病、肿瘤、慢性肾病、肝功能不全、糖尿病、自身免疫性疾病。其中MAP组19例,男15例,女4例;年龄22~68岁,平均36.7岁;SAP组15例,男12例,女3例,年龄24~62岁,平均38.4岁。同时选取20名体检正常者为对照组。各组年龄、性别等比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2 方法
所有患者均于入院当日行常规CT扫描。入院后立即采静脉血检测血清脂肪酶、血常规。血清脂肪酶采用全自动生化分析仪进行测定。血常规采用全自动血细胞分析仪进行测定。LPS参考范围为13~60 U/L,HCT参考范围为38.0%~50.8%。
1.3 统计学处理
2 结果
三组间LPS两两比较,SAP组与MAP组及对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),MAP组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),见表1。SAP组HCT测值高于MAP组及对照组,差异有统计学意义(P<0.05);而MAP组与对照组血清HCT比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。
同时,根据以上数据分别建立ROC曲线,区别SAP及MAP时LPS的最佳cut off值为212 U/L,敏感性为88.24%,特异性为81.47%,而阳性预测值及阴性预测值分别为76.58%、84.63%,提示早期监测LPS水平对于诊断及评估病情有重要的临床意义。
本次研究根据绘制ROC曲线并采用HCT≤48%作为预测重症急性胰腺炎的HCT值,结果HCT阳性预测值为36.16%,阴性预测值78.23%,特异性为81.45%。HCT结果提示阳性预测值低,而阴性预测值高,故在患者早期入院评估排除重症急性胰腺炎具有一定的参考价值。
3 讨论
重症急性胰腺炎若不及早诊治即可危及生命,目前判断AP严重程度方法包括48 h Ranson、APACHEⅡ评分等评估系统,已有的评分系统虽有助于临床判断重症急性胰腺炎,但因其受时间限制,实用性不强,临床实际应用不便[4]。而临床使用的增强CT、血清降钙素原及IL-6测定虽可以提供一定的支撑,但检验、检查价格较贵,不能在基层医院普遍推广。重症急性胰腺炎急性期由于大量炎性介质的释放,容易并发全身毛细血管渗漏综合征,造成大量血浆外渗、血液浓缩、微循环障碍,故重症急性胰腺炎早期血液呈浓缩状态,表现为HCT值升高。若入院后行液体治疗,则可能因补液导致血清HCT因稀释而下降,故要求入院早期测定HCT值[5]。Lankisch等[6]报道了早期HCT检测诊断重症急性胰腺炎的灵敏度、特异度分别为74%、45%,阳性预测值和阴性预测值分别为24%和88%,这表明HCT作为重症急性胰腺炎早期识别指标的意义在于其阴性预测值较高,即监测HCT结果不升高者发生重症急性胰腺炎的可能性较小。本次研究中发现,重症急性胰腺炎组的HCT值显著高于轻型组,HCT增高的幅度越大,病程发展进程越快,病情越重,且与治疗结果呈负相关。由此可以表明,初次评估经液体复苏后仍持续高于正常,与胰腺病变严重程度及并发MODS有着密切的关系。目前血常规已作为入院常规检查项目之一,笔者建议将血常规中HCT指标作为初筛指标之一,以便早期筛检出病情可能进行性加重的胰腺炎患者。而对HCT进行动态监测,可为评估患者预后手段之一。
脂肪酶(LPS)是一组特异性较低的脂肪水解酶类,主要来源于胰腺,其次为胃及小肠,能水解多种含长链脂肪酸的甘油酯。急性胰腺炎时脂肪酶和淀粉酶均可增高,但血清淀粉酶增高的时间较短,而脂肪酶在24 h内即出现增高,并可持续10~15 d,而且特异性高,因此脂肪酶广泛用于急性胰腺炎诊断[3]。这是由于在急性重症胰腺炎病情发展过程中,胰腺出现水肿、出血或者细胞坏死的病理学特点。胰腺脂肪坏死导致胰液外渗,胰腺分泌的脂肪酶及淀粉酶入血,然后经过肾脏最后由尿排出,而在肾脏代谢过程中,脂肪酶被肾小管全部重吸收,所以表现为脂肪酶明显增高并持续时间长。由于其增高持续时间长,在动态观察病程发展中检测该指标有利于观察病情变化和判断预后。本次研究发现重症急性胰腺炎组LPS水平较其他两组明显增高,支持血脂肪酶升高与急性重症胰腺炎相关,虽然轻型胰腺炎其亦会增高,但重症急性胰腺炎增高更为明显。故LPS不仅可以作为早期诊断重症急性胰腺炎的措施之一,还可以用于评价重症急性胰腺炎的严重程度及预后。
综上,脂肪酶可以作为早期诊断依据,同时可以结合HCT测值作为重症急性胰腺炎早期评估疾病严重程度及判断预后的衡量指标。但不足之处在于收集病例数少,今后需进一步研究探讨。LPS与HCT测定操作简单,经济适用,对检验设备及试剂要求较低,可以用于各级医院。对于需要早期评估重症急性胰腺炎的患者,可将LPS及HCT作为常规检查项目,以便更好用于指导临床治疗。
摘要：目的:探讨早期血清脂肪酶(LPS)及红细胞压积(HCT)在评估重症急性胰腺炎(SAP)中的临床价值。方法:分析因重症急性胰腺炎入院患者24 h内血清HCT及LPS水平,并与轻型急性胰腺炎(MAP)组及对照组比较,评价发病24 h内HCT、LPS的变化与急性胰腺炎轻重程度的关系及其对重症胰腺炎的早期预测价值。结果:SAP组中LPS水平明显高于轻型急性胰腺炎(MAP)组及对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);SAP组血清HCT明显高于MAP组及对照组(P<0.05),而MAP组与对照组血清HCT相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:联合血清HCT与LPS可作为SAP的早期评估指标。
关键词：急性胰腺炎,血清脂肪酶,血清红细胞压积
参考文献
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血清脂肪酶论文 篇4
1 资料与方法
1.1 临床资料 选择2009年1月-2009年12月我院收治的急腹症患者248例, 以临床综合诊断为金标准 (临床表现、实验室检查影像学检查、手术证实等) 分为AP患者组 (AP组) 120例, 其中男65例, 女55例, 年龄22~65岁;非AP的急腹症的患者为非AP组128例, 其中男75例, 女53例, 年龄24~63岁。另选择正常体检者130例为健康对照组。
1.2 标本采集 入院当日, 测定2组血AMS和LPS。每天抽血, 连续测定至结果转阴, 全部标本均在留取当日测定。AMS试剂盒和LPS试剂盒均采用上海长征试剂公司。全自动生化分析仪。
1.3 检测方法 AMS采用动力学法, LPS采用酶比色法检测。所有操作均按试剂盒说明书进行。同时采用美国贝克曼公司的定值血清作为质控。
1.4 真实性指标计算方法 灵敏度 (Se) =a / (a+c) ;特异度 (Sp) =d/ (b+d) ;准确度= (a+d) / (a+b+c+d) , 其中a为真阳性例数, b为假阳性例数, c为假阴性例数, d为真阴性例数。
1.5 统计学方法 计量资料以
2 结 果
2.1 正常参考水平的测定及临界值的选择
测定了130例正常体检者 (健康对照组) 的AMS和LPS。AMS呈正态分布, 男女之间差异无统计学意义 (P>0.05) , 正常参考水平范围如下:血AMS 20~120U/L, LPS为偏态分布。LPS参考范围0~163U/L。血AMS以500U/L为临界值, LPS以300U/L为临界值, 达到或超过相应临界值, 即为AMS或LPS阳性。
2.2 LPS水平
AP组LPS为 (596±136) U/L明显高于非AP组的 (65±56) U/L及健康对照组的 (74±40) U/L, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 而非AP组与健康对照组的LPS含量差异无统计学意义 (P>0.05) 。
2.3 AMS和LPS分别对AP的诊断价值
患者的AMS和LPS任一项达到或超过临界值的即为阳性, 否则为阴性。248例患者中AMS阳性121例, 其中金标准阳性101例, 阴性20例;AMS阴性的127例中, 金标准阳性23例, 阴性104例, 由此计算AMS测定对AP诊断的灵敏度为81.5%, 特异度为83.9%, 准确度为82.7%。LPS诊断阳性的123例中, 金标准阳性110例, 阴性13例;LPS阴性的125例中, 金标准阳性13例, 阴性112例, 计算LPS测定对AP诊断的灵敏度为89.4%, 特异度为89.6%, 准确度为89.3%。LPS诊断AP的灵敏度, 特异度和准确度均高于AMS。
2.4 AMS、LPS联合诊断价值
AMS、LPS其中任意一项为阳性均列为阳性, AMS、LPS两项均阴性列为阴性。248例患者中AMS+LPS阳性125例, 其中金标准阳性118例, 阴性7例;AMS+LPS阴性123例中, 金标准阳性0例, 阴性123例, 故AMS+LPS对AP的诊断灵敏度为100%, 特异度为94.6%, 准确度95.7%。AMS+LPS的联合诊断AP价值明显高于两者单独诊断AP。
2.5 AP发病时间与敏感度的关系
金标准诊断阳性的118例患者在住院期间每天抽血测定AMS和LPS, 其发病时间与敏感度之间的关系, 见表1。
3 讨 论
长期以来临床诊断AP主要依靠实验室AMS的测定, 但是AMS的特异性不高, 而且AMS来源广泛, 在巨AMS血症、腮腺炎、胆囊炎、十二指肠疾病及其他腹部疾病如消化性溃疡, 胃肠穿孔等均可升高[3], 用于诊断急性胰腺炎的特异性受到一定的限制。即使在AP中, AMS的灵敏度通常也只有70%~90%[4], 且急性胰腺炎发病第2d后, 血中AMS迅速下降, 对急性胰腺炎的诊断和疗效的判断有一定的局限。
LPS主要由胰腺腺泡合成, 正常状态下, 绝大多数进入十二指肠, 只有少量进入血液。急腹症时, 患者的LPS排出受阻, 可使血中脂肪酶的含量轻微上升, 而发生AP时, 胰腺腺泡大量破坏, 胰管阻塞, 阻碍脂肪酶进入十二指肠, 从而返流入血, 使其在血中浓度急剧升高[5], 两者LPS升高程度有着很大区别[6]。陈伟等[7]人报道急性胰腺炎时, AP患者与其他急腹症患者及正常人的LPS含量有着明显不同。本次实验结果与他们报道相似, 也发现AP患者与非AP患者及正常人的LPS含量有很大区别 (P<0.01) 。由此说明AP患者LPS可以特异性的升高, 可用于AP的早期诊断。
本次实验发现, 120例AP患者血AMS在发病后24h内急剧升高, 尿AMS则在36h后急剧升高, 但AMS在血中持续时间短, 第2天后就开始下降;LPS与AMS成平行性改变, 但在血清中出现的时间略晚, 24h后开始升高, 持续时间更长。有资料报道AP时在第6天LPS的阳性率仍达77%, 本次笔者测定结果75.3%与其基本一致。LPS在AP发作时, 出现时间晚、持续时间长, 说明LPS在对急性胰腺炎的治疗和预后判断上均好于AMS。
本次实验单纯测定LPS对AP的敏感度为89.1%, 特异性为89.6%, 说明单纯依靠检测LPS对急性胰腺炎的诊断也是不足。而AMS和LPS联合诊断急性胰腺炎的敏感度可达100%, 特异性达94.6%, 与顾炳权等[8]报道AMS和LPS联合诊断AP的灵敏度100%相同, 略低于相关报道的特异性98.0%。AMS和LPS联合诊断可提高对急性胰腺炎的诊断。
总之, LPS在AP时可特异性的升高, 且持续时间长, 对病后就诊较晚的AP患者有诊断价值[9], 其灵敏度和特异性均优于淀粉酶。LPS和AMS单独用于AP诊断时, 灵敏度、特异度和准确度都受到发病时间、就诊时间等因素的影响, 都具有一定的局限, 而AMS和LPS联合检测, 可提高对AP诊断的敏感度、特异度和准确度。
参考文献
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血清脂肪酶论文 篇5
脂肪酶是一种广泛应用的工业酶, 目前使用最多的是中温酶, 其最适温度一般都在50℃左右。同中温酶相比, 低温脂肪酶具有极高的催化常数值, 同时有较低和较稳定的米氏常数值, 其主要特征是具有较低的活化能和低温下的酶活力, 在某些领域有着中温脂肪酶所不可比拟的优越性, 因此在洗涤业、食品加工、生物制药、环境生物技术等领域有着广阔的应用前景[1]。
一、低温脂肪酶的应用
脂肪酶 (Lipase) 是一类能作用于甘油酰基, 并能水解甘油与脂肪酸形成的酯键, 而且能在有机相中催化酯化、转酯、醇解和氨解等多种反应的物质[2]。按其作用特点主要分为碱性脂肪酶、酸性脂肪酶、耐热脂肪酶和低温脂肪酶[3]。
随着工业生物技术的不断发展, 低温脂肪酶在工业生物技术领域的应用逐渐成为研究的热点, 它可在低温环境下催化多种化学反应, 如水解、酯化、转酯及脂类手性合成等, 广泛地应用于洗涤剂、食品、医药、制革、纺织及废物处理等领域[4], 表1列出了微生物脂肪酶在工业生产中的主要应用领域及其作用[5]。
二、产低温酶微生物
通常, 产低温酶微生物主要为适冷微生物。在地球上, 适冷微生物资源丰富, 近年来欧美及日本的科研人员对极地微生物的潜在应用性方面, 尤其低温酶的理化性质、适冷机制及其应用研究方面做了大量的工作, 取得了较大的进展, 而国内对此方向的研究进展较为缓慢[6]。目前报道的大部分低温酶都分离自低温微生物, 但这并不意味着低温微生物产生的所有酶都是低温酶, 在低温微生物中有些酶是以同工酶形式存在, 而这些同工酶对热的敏感性并不相同。
在相当多的情况下低温菌细胞中的酶最适反应温度要比来自中温菌和高温菌的同类酶反应温度低。因而, 利用低温微生物来筛选得到在低温下具有较高活性的低温酶, 具有较高的可行性。
㈠适冷微生物及其分布 适冷微生物也叫低温微生物。它是一群能在低温环境下生存的微生物, 一般分为两类:一类是必须生活在低温条件下, 在0℃可生长繁殖, 最适温度不超过20℃的嗜冷菌;另一类是在0~5℃可生长繁殖, 最适温度可达20℃以上的耐冷菌[7]。
嗜冷菌主要分布于南北两极、高山和深海等常冷的低温环境中, 而耐冷菌则分布广泛[8]。嗜冷菌对温度的变化极为敏感, 当温度超过最适温度时, 很快引起死亡, 其分布受到环境的影响较大, 分布区域较小;相对来说, 耐冷菌对环境温度的择取范围较大, 从常年稳定的低温环境到不稳定的环境中均可分离到。最早的低温微生物是由Forster发现的, 他于1887年报道在冷冻保存的鱼中分离到能在0℃以下生长的细菌[9], 之后一些学者又相继从南极土壤、深海、冰川和积雪等低温环境中分离出多株冷适应微生物, 它们分属于真细菌、蓝细菌、酵母菌、霉菌、藻类及古生菌等[10]。
地球表面大部分地区属于低温环境, 其中90%属于低于5℃的海洋环境, 其余为包括永久冻结带、冰川、极地冰山以及雪山等环境, 这些环境中都存在着大量的低温微生物, 是低温酶的主要来源[11]。
㈡低温微生物适冷机制 早期对低温微生物适冷机理的研究多集中在嗜冷酶的分离和适冷特点, 但仅通过酶学性质来研究低温微生物的适冷机理有其局限性, 细胞膜在低温条件下流动性的保持以及新陈代谢的调节也是低温适应性机理中非常重要的部分[12]。同时, 对低温微生物胞内物质的研究, 如冷休克蛋白、抗冻蛋白、小分子化合物, 也证明微生物的耐冷性更趋向于整个细胞的适应, 而不仅仅是某一分子特性的改变。近期的研究结果显示:低温环境中的微生物自身形成了一些特殊的机制来适应低温, 如通过提高细胞内液态水的黏度, 降低酶的活性;合成一些低温酶来维持细胞基本代谢;抑制DNA和RNA异常结构的形成;调节细胞膜膜脂的组成来维持膜的流动性等[13]。据已有报道, 低温微生物的适冷机制主要有如下几类。
1. 调节膜脂的组成。膜脂的组成提供了膜流动和相结构的前提条件, 从而保证胶中镶嵌的蛋白质发挥正常的功能。膜中脂类的改变会引起膜流动性的改变, 因此微生物必须通过调节脂类的组成, 从而调节膜的流动性和相结构以适应环境的变化。比如在低温时, 最常看到的变化是微生物中不饱和脂肪酸的比例增加, 而比较低温条件下的中温酵母和嗜冷酵母, 可清楚地发现嗜冷酵母合成的不饱和脂肪酸含量增加。这是由于中温菌在接近0℃时溶质吸收不活跃, 其细胞膜中的运载蛋白对冷敏感, 溶质分子不能与相应的运载蛋白结合, 且在低温条件下由于能量缺乏不能支持营养物质的跨膜运输。但对嗜冷酵母菌株的研究发现, 只有冷适应微生物能在2℃运转葡萄糖[14]。
当细菌处于低温时, 除了不饱和脂肪酸的改变外尚有其他变化, 如酰基链的长度缩短、脂肪酸支链的比例增加, 以及环状脂肪酸的比例减少等。所有这些变化对于低温时维持膜的流动性具有重要意义, 而膜的流动性也为营养物质的转运和吸收提供了基础。
2. 合成冷休克蛋白。冷适应微生物适应低温的另一机制是合成冷休克蛋白 (CSP) 。冷休克蛋白首先是在大肠杆菌中发现的, Jores等[15]将大肠杆菌细胞从37℃突然转移到10℃时中时发现, 它们会诱导生成一组冷休克蛋白, 而这些蛋白对低温的生理适应发挥着重要作用。此后, 又有学者对这一组蛋白的冷休克反应做了一系列研究, 发现在冷刺激后冷休克蛋白会在很短的时间内大量产生。
有些分离自南极的耐冷细菌在22℃和4℃时冷休克基因能正常表达, 当温度从22℃突然降到4℃后的1小时, 冷休克蛋白和m RNA表达量最大。耐冷菌由于生活在温度波动的环境中, 它们必须忍受温度的快速降低, 因而其耐受能力通常与它们产生的冷休克蛋白密切相关。
3. 独特的蛋白质结构。冷适应微生物中的蛋白质在低温条件下能保持结构上的完整性, 这可能是由于其蛋白分子含有更多的氢键和盐键从而能形成相对松动和具有弹性的结构。以嗜冷酶蛋白为例, 通过对嗜冷酶的蛋白质模型及X-射线衍射分析表明:嗜冷酶分子间的作用力减弱、溶剂的作用加强及酶结构的柔韧性增加, 能使酶在低温下更容易被底物诱导产生催化作用, 而当温度提高时, 嗜冷酶的弱键容易被破坏, 酶便变性失活。例如:从南极海水中分离到的枯草杆菌蛋白酶与Novo公司的嗜温枯草杆菌蛋白酶相比较, 前者肽链较长, 酶分子中的盐键数量较少, 芳香作用较低, Ca2+亲和力较小, 与溶剂的相互作用较强。虽然活性中心序列是保守的, 但由于这些变化有利于增加酶的柔韧性, 因而使得南极海水中分离到的枯草杆菌蛋白酶在低温条件下更容易与底物结合。
此外, 冷适应微生物具有在0℃合成蛋白质的能力。这是由于冷适应微生物的核糖体、酶类以及细胞中的可溶性因子等对低温有一定的适应。体外实验表明, 在同样低温条件下冷适应微生物体外蛋白质翻译的错误率最低。许多中温菌不能在0℃合成蛋白质, 一方面是由于其核糖体对低温不适应, 翻译过程中不能形成有效的起始复合物;另一方面是由于低温条件下细胞膜的破坏会导致氨基酸等内容物的泄露。由此可见, 冷适应微生物适应低温的能力表现在蛋白质合成过程中翻译机制的适应性, 以及在低温条件下保持完整膜结构的能力。
4. 低温酶的存在。低温微生物能在低温环境中存在, 是由于它自身的酶能在低温条件下有效地发挥作用, 这从生理代谢及生化特征方面, 都为它的生存提供了良好的保障。自1996年A ghajari等人[16]第一次阐明嗜冷菌淀粉酶的三维晶体结构以来, 科学家们已经先后对Ca-Zn金属蛋白水解酶、磷酸丙酮酸异构酶、柠檬酸合成酶以及苹果酸脱氢酶进行了晶体结构分析, 这些酶均是南极的嗜冷菌分泌的产物。从它们的三维结构可以看出, 这些酶与适中温微生物产生的酶不同[17]。低温酶所特有的一些结构能使酶分子内基团之间的相互作用减弱, 使酶和溶剂分子的相互作用增强, 而这些变化又使得它具有较强的柔韧性, 更易与底物结合, 进而减少了酶促反应能量的消耗, 提高了酶催反应活性。但同时, 松散、柔顺的蛋白质分子结构又会导致低温酶在常温或高温条件下的热不稳定性增强[18]。
一般来说, 酶的比活性和它的热稳定性是密切相关的, 蛋白质的热稳定性主要来源于蛋白质分子的刚性。刚性的增强使得酶与底物的相互作用受到影响, 从而导致酶活性的下降;相反, 柔性的增加使得酶促反应能量消耗的减少, 从而提高了酶的催化活力。
三、结语
脂肪酶固定化工艺研究 篇6
关键词：脂肪酶,固定化,工艺
引言
有机相酶催化是目前生物技术中一个颇具基础性和应用性的研究领域。有许多有机化学反应已可由酶催化来实现。近年来对酶在有机介质中的催化作用的研究越来越多, 并且越来越深入。法国的Langrand etal.[1]1990年报道用13个不同来源的商用脂肪酶催化一些芳香酯的合成。然而, 目前脂肪酶在油脂化学品开发中应用的主要障碍之一是经济费用。为了降低酶催化法的成本, 许多国家如日本、美国、印度等竞相开展了固定化脂肪酶的研究。固定化脂肪酶具有可以回收, 重复使用, 稳定性高, 产品质量高等优点。脂肪酶的固定化技术在工业生产的连续化和自动化上的应用也具有重要意义。
本研究考察了不同种类固定化载体对该脂肪酶活性的影响, 确定了其最佳固定化条件, 为后续有机相酶催化合成工作奠定了基础。
1、实验材料与方法
1.1 材料与仪器
实验材料
芳樟醇:ω (芳樟醇) >97%, 上海石油化工股份有限公司化工研究所;乙酸酐:AR, 中国医药 (集团) 上海化学试剂公司, 使用前均经3A分子筛除水。
回转式恒温调速摇瓶柜, 上海智诚分析仪器制造厂;Perkinelmer高效气相色谱, 美国珀金埃尓默仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 脂肪酶的固定化方法:
吸附法, 涂布法。
(1) 水相吸附法:移取10mL酶液, 加入一定量的预处理好的载体, 于30℃摇床中振荡4h, 抽滤, 用缓冲溶液洗涤, 干燥得固定化酶。
(2) 载体涂布法:移取10mL酶液, 加入一定量的预处理好的载体, 搅拌均匀, 30℃真空干燥得固定化酶。
1.2.2 脂肪酶水解活力测定和单位
采用聚乙烯醇橄榄油乳化液法[2]:4m L 4%的PVA (聚合度1750) 橄榄油乳化液和5 mL
0.025mol/L pH7.0缓冲液1mL酶液, 37℃反应15min后, 加入15mL 95%乙醇终止反应, 用0.05mol/L NaOH溶液滴定, 酚酞为指示剂。一个脂肪酶国际单位定义为:在测定条件下, 每分钟释放出1μg分子脂肪酸的酶量。
2、结果与分析
2.1 脂肪酶固定化方法的选择
固定化技术是使酶更广泛、更有效应用的一种重要手段。任何一种限制酶自由流动的技术都可以用于制备固定化酶。目前, 用于制备固定化酶的方法种类繁多, 新方法也层出不穷。综合考虑酶与载体之间的作用力, 固定化酶的状态、载体来源及酶的制备过程等因素, 传统的酶固定化方法大致可分为4类:吸附法[3]、涂布法[4]、包埋法[5]、共价结合法[6]。本实验主要采用涂布法和吸附法对脂肪酶进行固定化。
2.2 脂肪酶固定化载体及条件优化
2.2.1 载体对固定化酶活力的影响
固定化脂肪酶的可用载体非常多, 既有惰性的硅藻土硅胶和玻璃珠等[7,8], 也有阴离子交换树脂。从一些文献中可以看出, 载体对固定化脂肪酶的活力影响较大, 作者采用大孔树脂, 硅藻土, 活性炭, 壳聚糖四种载体作比较, 在进行酶活力测定后发现, 大孔树脂的酶活明显高于其它3种载体, 因此, 选择大孔树脂作为本研究的载体。
2.2.2 加量对固定化效果的影响
图1是在酶量为400 mg, pH为8.0, 浓度为0.1 mol/L的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液, 固定化温度为30℃左右时, 不同大孔树脂加入量对酶固定化效果的影响。
2.2.3缓冲液p H值对酶固定化的影响
图2是在酶用量400mg, 大孔树脂为1.00g, 固定化温度为30℃左右。以0.1mol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液, 考察了不同pH值的磷酸盐缓冲溶液对酶固定化效果的影响。缓冲溶液的PH值是影响固定化酶活力的重要因素, 酶固定化时对缓冲溶液的p H值有“记忆效应”。如图2所示, 在pH为6.4时制备的固定化酶活力最大。
2.2.4 缓冲溶液对酶固定化效果的影响
表1是在脂肪酶用量为300mg, 大孔树脂用量为1.00g, 温度为35℃, pH为6.4, 0.1mol/L的3种缓冲溶液对吸附效果的影响。
由表1可知, 缓冲溶液种类对酶固定化效果影响较大, K2HPO4-KH2PO4为缓冲溶液固定化脂肪酶, 其水解酶活最大。
3、结论
通过测定固定化水解酶活可知:大孔树脂作为固定化载体时水解酶活较高, 在p H为6.4, 树脂与酶质量比为2.5:1, 缓冲液为K2HPO4-KH2PO4时, 为最佳固定化条件。
参考文献
[1]Langrand G, Rondot N, Triantap Hylides C, et al.Short chain flavour esters synthesis by microbiol lipases[J].Biotechnology Letters, 1990, 12 (8) :581-586.
[2]秦昉.碱性脂肪酶测定方法的探讨.无锡轻工大学学报, 1998, 17 (1) :31-34
[3]Allal B, Jacques F, Jacques L, et al.Adsorption of succinylated, lysozyme on hydroxyapatite[J].Journal of Colloid Interface Science, 1997, 189:37-42.
[4]Quinn Z, Zhou K, Chen X D.Immobilization ofβ-2galactosidase on graphite surface by glutaraldehyde[J].Journal of Food Engineering, 2001, 48 (1) :69274.
[5]Markvicheva, Elena A.Immobilized enzyme and cells in poly (Nvinyl caprolactam) based2hydrogels[J].Applied Biochemical Biotechnology, 2000, 88 (123) :145-157.
[6]Yesim Y.Utilization of bentonite as a support material for immobilization of Candida rugosa lipase[J].Process Biochemistry, 2005, 40:2155-2159.
[7]Prady, C.Mecalfe, L, Slaboszewaki, D, et al.JAOCS, 65:917, 1988.
血清脂肪酶论文 篇7
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种:
作者实验室从南宁、百色等地筛选保存,菌种采用分子生物学的方式对其种属进行鉴定,被鉴定为Serratia marcescens。
1.1.2 试剂:
p-NPP购自Sigma公司,蛋白胨、酵母粉、蔗糖、葡萄糖等生化试剂为进口或国产分析纯。
1.1.3 培养基
种子培养基:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,大豆油0.5%,K2HPO4 0.2%,MgSO4 0.05%(pH7.0)。
初始产酶培养基:蛋白胨1%,酵母粉0.5%,1%蔗糖,K2HPO4 0.2%,大豆油1%,MgSO4 0.05%,CaCl2 0.01%,吐温80 1%,FeSO4 0.001%(pH7.0)。
1.2 方法
1.2.1 接种和发酵
将菌种接到种子培养基中培养过夜后,按2%的接种量吸取一定量的种子液到发酵产酶培养基中。在培养温度为30℃、转速为160r/min的摇床中发酵18h,获得的发酵液在4℃以10 000 r/min离心5min,收集上清液即得粗酶液。
1.2.2 脂肪酶活力测定方法—分光光度计法[7]
A液:16.5mmol/L的对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)的异丙醇溶液。
B液:含有0.4% Triton X-100和0.1%的阿拉伯树胶的50mmol/L Tris-HCl)缓冲液(pH 8.0)
进行酶活测定时,将相应的A液与B液以1∶9(体积比)的比例混和,取100μL的粗酶液加入900μL上述混合液中,于40℃反应10min,立即加1mL无水乙醇将酶灭活后,于可见光(410nm)下读取光吸收值。在此条件下,对硝基苯的消光系数是1.46×105cm2/mol。
酶活(U)单位定义:每分钟分解p-NPP产生1μmol对硝基苯酚(黄色)所需的酶量定义为一个酶活单位。
2 结果与分析
2.1 最适碳源的选择
改变初始产酶培养基中的碳源的种类,分别以1%的葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、麦芽糊精为碳源进行最适碳源的筛选。实验结果见图1,由图可知,以麦芽糊精为碳源时发酵液脂肪酶活力最高,为12.5U/mL,表明麦芽糊精是最适碳源。其次为可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖。
2.2 最适氮源的筛选
以麦芽糊精为碳源,分别以2%的蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、尿素、硫酸铵为氮源进行最适氮源的筛选。实验结果见图2,以蛋白胨为氮源时发酵液脂肪酶活力最高,为2.92U/ mL,表明蛋白胨是最适氮源。其次为酵母提取物、牛肉膏、尿素、硫酸铵。
2.3 Plackett-Burman设计筛选影响产酶的主效因子
依据已确定的碳源和氮源,选用N=11的Plackett-Burman试验设计,其中有三项为误差项,对可能影响产酶的8个因子[8]进行了考察。每个因子取高、低两个水平(+1、-1)。Placket-burman实验设计及响应值见表1所示。
按模型贡献率大小可以知道对酶活产量有较大影响的依次为:蛋白胨、CaCl2、吐温80、大豆油、初始pH、温度、KH2PO4、糊精。其中初始pH、温度、KH2PO4、糊精对产酶影响不大(模型贡献率小于2)。CaCl2、吐温80、初始pH对产酶呈现出一定的正效应。
要提高脂肪酶的产量,就要减少营蛋白胨、大豆油的含量,而增加CaCl2和吐温80的浓度有助于产酶。在此认识的基础上,设计了如下的最陡爬坡实验。
2.4 最陡爬坡实验
响应面拟合方程只有在考察的临近区域里才能充分近拟真实情况[9],根据Plackett-Burman法筛选出的显著因子效应大小设计它们的步长,进行最陡爬坡试验设计,寻找最大产酶区。试验设计及结果如下表4所示,最大产酶区在第4次附近,故以实验4的条件为响应面实验因素水平的中心点。
2.5 响应面优化重要因素的最佳浓度
2.5.1 二次回归模型拟合及方差分析
实验采用Design-expert系统提供的Box-Behnken正交试验,一共25组实验,实验设计及结果如表4所示。
不同模型方差分析中的均方及检验结果综合来看,二次方程模型的拟合效果比较好。因此,通过Design-Expert软件进行方差分析来验证该二次方程模型及各参数的显著度,结果见表5。
表中P值小于0.05时,模型或因素对酶活有显著影响,小于0.01表示影响高度显著,大于0.1表示对酶活影响不显著。
所构建的模型(线性回归方程)为:
酶活=60.20+28.61×A+16.31×B-2.75×C-6.54×D+5.57×A×B-1.33×A×C-0.51×A×D-2.51×B×C-6.22×B×D-3.65×C×D-17.71×A2-1.27×B2-2.71×C2-7.41×D2
该模型的P值小于0.05,决定系数R2为0.9385,精密度(Adeq Precision)为11.684(大于4),该模型该模型在被研究的整个回归区域拟合很好。可以使用该模型来分析响应值的变化。其中蛋白胨、CaCl2 、大豆油对产酶的影响最大。
图3为拟合模型的残差分布图,如图所示,各点的残差几乎分布在一条直线上,因此模型的拟合情况良好。
2.5.2 响应面交互作用分析与优化
由表6可知,在四因素的交互作用下,它们对产酶的影响顺序为:(CaCl2*大豆油)BD>(蛋白胨*CaCl2)AB>(吐温*大豆油)CD>(CaCl2*吐温)BC>(蛋白胨*吐温)AC>(蛋白胨*大豆油)AD。其中AB为正效应,其余为负效应。
通过Design-expert软件[10]对试验参数进一步优化,即在获得最佳的产酶情况下,各参数的取值最优方案。表6为获得最佳产酶量时的优化方案,从下表可以看出:在蛋白胨为0.7%,CaCl2 0.3%吐温 1.68%, 大豆油1.81%时可获得最佳的产酶量,产酶量达到97.52U/mL。
3 讨论
粘质沙雷氏菌是重要的产脂肪酶细菌,它所产的脂肪酶具有在有机溶剂稳定性好、广泛的底物特异性和异构体选择性[11],它不仅可以合成冠状动脉血管扩张剂地尔硫卓的手性前体[12],还可以用于转酯化反应生产生物柴油。因此研究和开发本该细菌产生的脂肪酶,对于扩大脂肪酶的应用领域具有现实意义。为了高效地筛选产酶条件,本实验采用响应面法进行产酶条件的优化。Plackett-Burman 设计法和响应面分析法是20世纪中叶后发展起来的优化试验条件统计学方法[13],能用较少的实验数据推算出目标值的优化条件,优化效率高,在微生物发酵方面已有广泛应用[14]。本研究在产脂肪酶粘质沙雷氏菌初始酶活的基础上,通过逐因子试验确定其最适碳源和氮源分别为麦芽糊精和蛋白胨。在此基础上,运用Plackett-Burrman设计在众多影响产酶因素中快速有效筛选出主效因素蛋白胨、CaCl2、吐温80和大豆油。考虑到4因素工作量太大,对前3个因素模拟一阶线性模型以指导运行参数快速进入最优点临近区域,然后沿着一阶线性模型指定的路径进行最速上升试验以逼近产酶最大区域,在上升最高点处进行了真实反应面模拟,通过求函数最大值得到产酶最高点处主效因素参数设置,试验证明我们模拟的二阶模型可以较好预测实际发酵情况,预测最高发酵液酶活力为97.52U/mL,在该培养条件下进行实验,得到实际发酵酶活为95.2U/mL,与模型预测值基本吻合,这说明该模型是合理有效的。
4 结论