碱性脂肪酶（共5篇）
碱性脂肪酶 篇1
摘要：通过测定碱性脂肪酶在兔皮脱脂中的应用确定了脱脂工序中脂肪酶的最佳使用条件:脂肪酶的最佳使用温度为30-35℃,使用pH 7.5左右,用量1 g/L,时间约为1 h,与脱脂剂结合使用的时候脱脂效果更好,使油脂轻松释出,加快脱脂的进行。
关键词：碱性脂肪酶,脱脂,兔皮
引言
我国是一个养兔大国,也是兔类产品出口的大国。兔类产品包括兔毛、兔皮、兔肉以及一些副产品。兔毛是高级的纺织原料,精纺后可以做出高级的兔毛纺织品,兔毛产品类型不断扩大,备受消费者的亲睐。兔肉是一种营养丰富的高档食品,与其他的食物相比有着高蛋白、高矿物质、高消化率三大特点。随着国内人们对饮食营养了解不断加深,兔肉的消耗量必定会不断增加,成为21世纪的主要肉类食物。由于人们生活对兔毛、兔肉的不可或缺,兔皮必然也会源源不断的生产提供[1]。随着生物酶研究的不断深入,人们对酶的了解越来越详细,酶作为一种高活性、温和、专一、环保的材料,进入到了裘皮生产行业。酶有着很高的反应催化效率,比一般催化剂的效率高106~1013倍,能加快毛皮浸水速度[2],还能溶解结缔组织与皮板的连接,使揭里更容易。兔皮属于脂肪含量不太高的一类动物皮,虽然低含量的脂肪对于工艺生产影响不大,但为了做出理想裘皮,仍要进行脱脂。酶是兔皮脱脂的主要选择之一,碱性脂肪酶在碱性条件下能将油脂水解为甘油、脂肪酸、甘油二酯和甘油单酯等产物,最终可将甘油三酯完全水解为甘油和脂肪酸,甘油在水中可完全溶解,而且还具备乳化液的稳性和增溶功能,甘油单酯和甘油二酯同样具有乳化作用[3]。
随着我国经济的发展,经济发展模式的改变,国内对环境污染的控制越来越严厉,酶作为一种无污染的材料,越来越受到关注。本次单因素试验就是研究浸水酶和碱性脂肪酶的使用效果,研究怎样才能使用酶来比较好的处理兔皮,以便使兔皮有着更好的回软性能,使化工材料渗透的更好,鞣制更充分,后续工序更好得进行。
1 实验部分
1.1 主要材料和仪器
主要材料:工业食盐,成都天华科技股份有限公司:纯碱,成都天华科技股份有限公司;小苏打,成都天华科技股份有限公司;硫酸,成都市科龙化工试剂厂;甲酸,成都市科龙化工试剂厂;防腐剂Biocide 42L,上海三博生化公司;NM浸水酶,北京泛博科技;MS浸水酶,达威股份有限公司;JA-50脱脂剂,北京泛博科技;TS-80脱脂剂,北京泛博科技;HAC润湿剂,北京泛博科技;甲醛,成都市科龙化工试剂厂;碱性脂肪酶(酶活力:8000 u/g,酶活力保存率:99.9%),法国ATC。
主要仪器:GI热泵循环不锈钢控温转鼓(新达轻工机械有限公司,无锡);数字式皮鞋收缩温度测定仪(陕西科技大学);脂肪测定仪(济南阿尔瓦仪器有限公司)。
1.2 试验准备
1.2.1 脱脂前工艺规程
(1)工艺流程:
称重→预浸水→主浸水→揭里→脱脂。
(2)工艺操作规程
预浸水:取盐湿白色家兔皮进行预浸水,液比20,22~25℃,防腐剂0.3 g/L,HAC 1.0 g/L,浸泡30 min,每小时划动10 min,共3 h。
主浸水:液比20,22~25℃,食盐25~30 g/L,HAC 1.0 g/L,防腐剂0.3 g/L,划动15 min,测p H,用工业硫酸调节至p H 5~6,加入NM浸水酶0.5g/L,划动30 min;每小时划动10 min,共4次,停划槽过夜。次日转20 min。
1.3 实验内容
1.3.1 脱脂
根据前期试验研究发现,一般兔皮经一次脱脂后皮板油脂含量达不到其要求,本次脱脂实验主要根据碱性脂肪酶高效脱脂的性能,进行单因素试验探究其影响因素,优化兔皮脱脂过程最佳工艺条件。兔皮脱脂工艺参数包括:温度,用量,p H和作用时间。
(1)温度对脂肪酶脱脂影响试验
取一张用NM酶浸水揭里好的面积较大的家兔皮,从皮的中间背脊部位分别取四块长10 cm,宽5 cm的皮样,编号为1,2,3,4,按以下工艺处理。
脱脂:液比20,温度X℃,纯碱0.05 g/L,30min后测p H,重复此步骤,p H 7~7.5,碱性脂肪酶1 g/L,1 h后水洗出皮。X分别为20,35,45℃;1号为空白对比不作脱脂处理。
(2)酶用量对脱脂影响试验
取一张NM酶浸水揭里好的较大家兔皮,从皮的中间背脊部位分别取四块长10 cm,宽5 cm的皮样,编号为1,2,3,4。按照⑴的实验流程,脱脂温度为35℃,脂肪酶用量分别为1,2,3 g/L,其他条件不变对以上四块皮脱脂处理,1号为空白对比不作脱脂处理。
(3)p H对脂肪酶脱脂影响试验
取一张NM酶浸水后揭里过的相对较大的皮,清洗之后分别从背脊部位取五块皮样,编号为1,2,3,4,5。按照(1)的实验流程,温度35℃,p H调节为5.0~6.0,7.0~7.5,8.0~8.5,9.0~9.5,用纯碱调节p H,30 min一次,每次用量为0.05 g/L,重复使用直到达到试验所需p H,然后加入脂肪酶1g/L脱脂。1号为空白对比样,不作脱脂处理。
(4)时间对脂肪酶脱脂影响试验
取一张NM酶浸水揭里效果好的较大的家兔皮,清洗之后从背脊部位均匀对称的取四块皮样,编号为1,2,3,4。按照(1)的实验流程,温度35℃,p H 7.0~7.5,脂肪酶1 g/L,时间依次为30,60,90 min。1号为空白对比不作脱脂处理。
(5)JA-50脱脂剂-酶脱脂试验
取一张NM酶浸水揭里效果好的较大家兔皮,清洗了之后从背脊部位均匀的取三块皮样,编号为1号,2号,3号。按照(1)的实验流程,温度为35℃,脂肪酶用量1 g/L,脱脂剂JA-50用量1g/L,1号为空白对比不做脱脂处理。
1.3.2 脱脂率的测定
脱脂结束后,以上试验所得皮样清洗之后将毛剪掉,再剪成0.5 mm×0.5 mm大小,放烘箱内在102℃温度下烘4 h,然后对皮样进行称重,用滤纸包好后,置于脂肪测定仪中抽提脂肪,6 h后将皮样拿出称量,按以下公式计算其脱脂率:
其中:W1———空称量瓶质量;W2———称量瓶+含水样品质量;W3———称量瓶+干燥样品质量
其中:W1———皮样质量,W2———空溶剂瓶质量,W3———溶剂瓶+油脂质量
2 结果与讨论
2.1 不同温度下酶的脱脂效果对比
三个皮样与未脱脂的皮样对比结果见表1。
通过表1和图1,我们可以看出20℃和45℃都不是最适的脱脂温度,脱脂之后毛被与皮板效果不好。结果分析:20℃下酶活力不高,脱脂率较低,只有21.05%,未能很好的对毛皮脱脂,毛被和皮板上都有很多油脂未被去除;35℃下酶的活力很高,脱脂率较好,达到44.14%;45℃下酶脱脂效果好,脱脂率高达53.36%,但是有少量掉毛,此温度下会使得皮蛋白过度水解,皮板纤维变松,机械强度下降,此时虽然脱脂率较高,但是对皮板作用也很强,导致皮板太过柔软,不结实,会使毛皮有一定的损伤,而且皮板的脂肪含量并不比35℃下脱脂后脂肪含量明显降低,所以最适温度为30~35℃。
1)1号为揭里过的皮样,2号,3号,4号为从揭里后皮均分脱脂后皮样
2.2 不同酶用量的脱脂效果对比
三个皮样与未脱脂的皮样对比结果见表2。
1)1号为揭里过的皮样,2号,3号,4号为从揭里后皮均分脱脂后皮样
将样品测定脱脂率后,所得数据图如下:
从图2和表2我们可以发现,酶用量并不是越多越好,酶的用量增加不只是增加了生产成本,对毛皮皮板也有很大影响。2号脱脂效果较好,毛光滑,有弹性以及很好的灵动性,脱脂率达到58.86%,脂肪基本脱除;3号皮样脱脂率更高,达到60.89%,皮板脂肪含量较少,脂肪基本脱除;4号用量过大,对毛被的损伤很大,出现了掉毛的现象,没有脱落的毛也很干,不灵动,效果差,所以酶的用量应控制在1 g/L左右。
2.3 不同p H下酶的脱脂效果对比
三个皮样与未脱脂的皮样对比结果见表3。
1)1号为揭里过的皮样,2号,3号,4号,5号为脱脂后皮样
将样品都测定脱脂率之后,所得数据如图3。从实验图表可看到,p H在6.5左右时,酶的脱脂效果不好,皮板上的脂肪仍然很多,在此p H下由于酶活力受到了抑制,没能很好的发挥酶的催化作用;p H8.5时,酶的脱脂效果较好,但是皮板有油腻的感觉,毛被有些发涩,且由于p H过高,对毛被造成了损伤;p H 9.5时,毛被皮板脱脂效果不好,油腻,同时由于p H太高,使毛被受到损伤,发涩,甚至有点浮毛[3]。p H在7.5左右时,脱脂率达到最大,毛被没有损伤,酶脱脂效果最好。
2.4 不同时间酶的脱脂效果对比
三个皮样与未脱脂皮样对比后结果见表4。
1)2号,3号,4号为从揭里后分别脱脂后的皮样,1号为只揭里过的皮样
将样品都测定脱脂率之后,绘制成图表如下:
由表4和图4可知酶脱脂时间不是越长越好,用时90 min时,脱脂率没有明显增加,且时间太长时进入溶液的污染物会重新粘到毛被上,毛被长时间浸泡在碱性液体中对毛也会有损伤[5];用时30 min时,由于时间太短,脱脂率比用时1 h要低很多,皮板有些油腻,会阻碍材料的渗透;用时1 h时,兔皮脂肪已基本去除,而且不会影响到后续工艺的进行。对比三个样本得知,脱脂时间应该控制在1 h左右。
2.5 不同处理方法对兔皮脱脂效果影响
1#号为未处理样品,2#号脱脂剂单独处理样品,3#号为碱性脂肪酶-脱脂剂JA-50配合脱脂,结果见图5。
将脱脂后的两个样本与未脱脂的进行对比,可以看到2号和3号两个皮板脂肪都基本脱尽,溶液都很清澈,但是3号的毛比2号更干。通过实验,我们得出脱脂剂JA-50与酶混合脱脂比单一用酶脱脂效果要好一些,皮板脂肪含量更少,脱脂剂与酶有着叠加作用,而且对毛被也没有明显的损伤,由此可得知:脱脂时可加入脱脂剂,与酶混合使用,使得脱脂效果更好。
3 结论
本文主要研究酶在兔皮脱脂中的应用,通过单因素试验进行脱脂酶最佳使用条件的研究,最终得出:脂肪酶的最佳使用温度为30~35℃;最佳用量为1 g/L;最适p H为7.5左右;最佳脱脂时间为1 h左右;脱脂时加入少量脱脂剂对脱脂效果有促进作用,可进一步提高脱脂率。
参考文献
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碱性脂肪酶 篇2
水稻碱性几丁质酶基因表达载体pCAMBIA1301-RC24的构建
用限制性内切酶Kpn1从质粒pYAO24中切出大小约2.75 kb的片段,此片段包含Actinl启动子、NOS终止子、水稻几丁质酶基因.将其插入到表达载体pCAMBIA1301-imp的多克隆位点内,构建成了水稻碱性几丁质酶基因的表达载体.利用液氮冻融法将构建好的`表达载体导人发根农杆菌LBA4404中,以用于生物工程下游技术研究.
作 者：高丽美 李永锋 徐子勤 GAO Li-mei LI Yong-feng XU Zi-qin 作者单位：高丽美,李永锋,GAO Li-mei,LI Yong-feng(山西师范大学生命科学学院,山西,临汾,041004)徐子勤,XU Zi-qin(西北大学生命科学学院生物技术省级重点实验室,陕西,西安,710069)
刊 名：山西师范大学学报（自然科学版） 英文刊名：JOURNAL OF SHANXI NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2009 23(3) 分类号：Q782 关键词：质粒pYAO24 几丁质酶基因 表达载体pCAMBIA1301-imp 冻融法 发根农杆菌碱性脂肪酶 篇3
本文对所筛选出来的碱性果胶酶高产菌种进行了初步的产酶条件优化, 并在单因素试验的基础上, 采用Plackett-Burman (P-B) 法[3,4,5]对发酵培养基的影响因素进行了筛选, 然后用Box-Benhnken法对筛选出的重要影响因素进行了中心组合实验设计, 确定了最适宜的发酵培养基, 获得了较为满意的结果, 为进一步实验研究提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) TCCC11286, 土壤中筛选分离得到。
1.1.2 试剂
果胶, 三门峡富达果胶工业有限公司;聚半乳糖醛酸, 北京拜尔迪生物技术有限公司;其余均为国产试剂。
1.1.3 培养基
1.1.3.1 斜面培养基 (g/L) :
葡萄糖10, 蛋白胨5, 牛肉膏5, NaCl 5, 琼脂粉15, pH 7.0
1.1.3.2 种子培养基 (%) :
玉米粉3, 豆饼粉4, (NH4) 2SO4 0.4, MgSO4·7H2O 0.02, Na2CO3 0.025, K2HPO4 0.4, , KH2PO4 0.03, pH 6.5-7.0
1.1.3.3 发酵培养基 (%) :
玉米粉4, 豆饼粉4, (NH4) 2SO4 0.4, MgSO4·7H2O 0.02, Na2CO3 0.025, K2HPO4 0.4, KH2PO4 0.03, pH 6.5～7.0。
1.2 培养方法
1.2.1 斜面培养条件:
将菌种接入斜面培养基, 37℃条件下培养24h。
1.2.2 种子培养条件:
将菌种接入种子培养基中, 37℃、200r/min培养12～14h;装液量为250ml三角瓶中装25ml培养基。
1.2.3 发酵培养条件:
将种子以8%的接种量接入发酵培养基, 37℃、200r/min培养24h;装液量为500ml三角瓶中装50ml培养基。
1.3 酶活测定方法
取20μl发酵稀释酶液加入到2ml含0.2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-NaOH缓冲液 (pH 9.0) , 45℃反应15min, 用3ml 0.03mol/L的磷酸溶液终止酶反应, 在235nm处测定其吸光度值。
一个标准酶活单位定义为:1ml酶液在45℃、pH 9.0条件下, 每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数为4 600L·mol-1cm-1[6]。
2 结果与分析
2.1 培养基中各营养成分对产酶的影响
2.1.1 不同碳源及浓度对产酶的影响
碳源是组成培养基的主要成分之一, 微生物产物的生产能力和碳源的种类有很大关系。分别以玉米粉、乳糖、葡萄糖、糊精、淀粉、蔗糖、果胶为碳源进行产酶实验。结果表明, 以玉米粉作为碳源, 且添加量为4%时产酶最高 (如图1、图2) 。
2.1.2 不同氮源及浓度对产酶的影响
氮源作为枯草芽孢杆菌发酵培养基的另一个主要因素, 在芽孢的形成上也发挥着重要作用。分别以豆饼粉、蛋白胨、酵母浸粉、尿素、NH4NO3、 (NH4) 2SO4、NaNO3为氮源进行产酶实验。结果表明, 以豆饼粉作为氮源, 且添加量为4%时产酶最高 (如图3、图4所示) 。
2.1.3 不同无机盐对产酶的影响
向产酶初始培养基中分别添加不同浓度的MgSO4、 (NH4) 2SO4以及磷酸盐进行发酵实验, 结果表明:所添加的几种无机盐分别对产酶具有一定的促进作用, 且当MgSO4添加浓度为0.04%, (NH4) 2SO4添加浓度为0.4%, 磷酸盐添加浓度为0.05mol/L时酶活提高最大 (如表1所示) 。
2.1.4 金属离子对产酶的影响
某些金属离子会对细菌的生长及代谢起到一定的影响作用, 因此分别对Na+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、K+进行了考察。由表2可以看出, CaCl2、MnSO4、CuSO4、ZnCl2、KCl对产酶具有抑制作用, Na2CO3对产酶影响不显著, 而FeSO4对产酶具有一定的促进作用, 且添加量为0.02%时最佳。
值得注意的是, FeSO4的添加对产酶产生了显著的正效应, 这与其他参考文献中的报道抑制效应或无效应有所区别, 其作用机理还有待进一步研究。
通过单因素的优化, 确定了产酶培养基组成为:玉米粉4%, 豆饼粉4%, MgSO4 0.04%, (NH4) 2SO4 0.4%, 磷酸盐0.05mol/L, FeSO4 0.02%。
2.2 利用响应面方法进行优化
2.2.1 Plackett-Burman设计法筛选重要影响因素
Plackett-Burman设计法[7]是种部分析因法, 试验选用N=8的设计安排, 对玉米粉 (X1) 、豆饼粉 (X2) 、 (NH4) 2SO4 (X3) 、MgSO4 (X4) 、磷酸盐 (X5) 、FeSO4 (X6) 六个因素进行考察, 每个因素分别取两个水平, 高水平取低水平的1.25倍, 响应值为酶活 (Y) 。实验设计及实验结果见表3。
运用SAS软件[8] (Release 8.01TS Level 01M0) 对表3的实验设计进行回归分析, 并进行方差分析检验, 可信度>90%的几个因素为:豆饼粉、MgSO4和FeSO4, 而其他几个因素的可信度均<90%。
2.2.2 确定因素水平
由Plackett-Burman实验可知, 在碱性果胶酶的发酵中, 豆饼粉、MgSO4和FeSO4这三个因素对产酶有较重要的影响, 且均为负效应, 应减小。实验设计及结果如表4。
根据Plackett-Burman实验和最陡爬坡实验, 确定3因素3水平分别选取豆饼粉:3%, 3.5%, 4%;MgSO4:0.03%, 0.035%, 0.04%;FeSO4:0.01%, 0.015%, 0.02%。
2.2.3 采用中心组合设计实验优化培养基组成
根据Box-Benhnken的中心组合设计[9]原理, 3因素各取3水平, 设计了3因素3水平共15个试验点的响应面分析实验, 如表5。
对表5进行了分析, 一次项对Y有一定的影响, 交叉乘积项有显著影响。失拟项的F值也很小, 说明该方程对实验拟和很好, 实验误差小。由实验结果得到回归方程:
Y=14.64+0.76375X1-0.30375X2-0.7825X3-1.81X1·X1-1.245X1·X2+1.0625X1·X3-1.675X2·X2-0.1275X2·X3-0.6475X3·X3。响应面分析图见图5、图6、图7。
对此进行岭脊分析[9], 得出回归模型存在最大值点, Y的最大估计值为14.89, 此时稳定点 (X1, X2, X3) 对应的代码为 (0.09690, -0.10711, -0.51420) , 实际值为 (3.55%, 0.034%, 0.013%) 。在此优化条件下进行验证试验, 共进行5批次250ml摇瓶试验, 结果分别为14.85、14.76、14.77、14.89、14.82, 试验平均值为14.82。证明预测值14.89与验证试验平均值14.82接近。
3 讨论
碱性果胶酶是一类在碱性条件下催化分解果胶质的酶的总称, 它用在植物药材提取过程中作为浸提辅助剂破坏植物细胞壁的果胶结构, 提高药材有效成分提取率;作为植物药提取液的澄清剂, 加快滤过过程, 提高沉淀速度, 改善澄清度;作为中药材提取后药渣处理再利用的催化剂。碱性果胶酶用于植物药的提取、提取液的分离纯化和药渣再利用中, 操作简便, 成本低廉, 可降低化学试剂的用量, 并具备大生产的可行性。
本文通过筛选得到了一株碱性果胶酶的高产菌株, 经鉴定为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) , 命名为TCCC11286。在单因素试验的基础上, 应用Plackett-Burman和Box-Benhnken中心组合实验设计方法, 对菌种产碱性果胶酶的培养条件进行了优化, 并用优化后的培养基进行了模型的验证, 取得了较好的结果。优化后的碱性果胶酶发酵生产最佳培养基组成为:玉米粉4%, 豆饼粉3.55%, MgSO4 0.034%, (NH4) 2SO4 0.4%, 磷酸盐0.05mol/L, FeSO4 0.013%。在此条件下可得酶活可达14.82U/ml。
单因素的优化中, 在对金属离子的添加种类的研究中发现, Fe2+的添加对产酶具有一定的促进作用, 且最适的添加量为0.02%;这区别于以往的报道, 还需做进一步的研究分析。
摘要：目的:对碱性果胶酶高产菌株的产酶条件进行优化。方法:通过筛选得到一株产碱性果胶酶的枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) TCCC11286, 利用单因素实验对其发酵条件进行优化。采用Plackett-Burman (P-B) 方法筛选出对产酶有重要影响的3个因素 (豆饼粉、MgSO4以及FeSO4的添加量) , 并采用响应面试验设计 (RSM) 对重要因素进行优化。结果:最适的产酶条件为:玉米粉4%, 豆饼粉3.55%, MgSO40.034%, (NH4) 2SO40.4%, 磷酸盐0.05mol/L, FeSO40.013%。结论:优化后其产酶能力得到了明显的提高, 酶活提高到14.82U/ml。
关键词：枯草芽孢杆菌,碱性果胶酶,发酵,Plackett-Burman设计法,响应面法
参考文献
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碱性脂肪酶 篇4
自1972年日本学者Koki Horikoshi首次用嗜碱细菌制得碱性果胶酶以来[7], 至今已分离鉴定出几十种碱性果胶酶, 但其中能应用于工业化生产的不多, 仅Novo Nordisk公司在1999年研制出用基因工程菌生产的碱性果胶酶Bio-Prep, 以及于2003年推出的一种碱性果胶裂解酶ScourzymeL, 但高昂的生产成本限制了其广泛应用[8]。因此, 如何提高、提纯PGL的产量并降低生产成本是其开发应用的关键。本实验针对从土壤中分离得的一株相对酶活较高的菌株, 进行优化、提纯方面的研究, 为进一步应用于工业生产提供依据。
1. 材料和方法
1.1 菌种
枯草芽孢杆菌TCCC11286, 这是本实验中心菌种库的编号, 筛选编号为521
1.2 试剂
1.3 培养基
(1) LB培养基 (g/L) :蛋白胨20、酵母粉10、NaCl 20于121℃下灭菌20min
(2) 种子培养基 (g/L) :蔗糖20、蛋白胨10、玉米浆30、MgSO41、K2HPO418.4、KH2PO46、pH=7于121℃下灭菌20min
(3) 发酵液 (g/L) :乳糖20、蛋白胨3、CaCl23、果胶20、酵母膏3、MgCl20.2、pH=7.0~7.5于121℃下灭菌20min
(4) 筛选培养基 (g/L) :果胶5、酵母膏5、蛋白胨5、MgSO42、K2HPO41、琼脂20、pH=7.0~7.5于121℃下灭菌20min
(5) 斜面培养基 (g/L) :葡萄糖10、蛋白胨5、牛肉膏5、NaCl 5、琼脂条20、pH=7.0于121℃下灭菌20min
(6) 优化发酵培养基 (g/L) :果胶20、淀粉20、NH4NO315、MgCl20.2、MgSO42、CaCl23、K2HPO44、pH=8.0于121℃下灭菌0min
(7) 测生长曲线用无机盐种子培养基 (g/L) :蔗糖20、 (NH4) 2SO440、MgSO4·7H2O 0.2、K2HPO44、KH2PO40.3、pH=6.5~7.0于121℃下灭菌20min
(8) 测生长曲线用无机盐发酵培养基 (g/L) :蔗糖40、 (NH4) 2SO440、MgSO4·7H2O 0.4、K2HPO4-KH2PO40.05mol/L、FeSO40.2 pH=6.5~7.0于121℃下灭菌20min
1.4 筛选方法
1.4.1 富集培养
将从公园中采集到的月季、马兰、竹、美人蕉、菊、迎春、松的培养土分别称取5g土样溶于45ml去离子水中, 吸取5ml菌悬液加入到45ml (用250ml锥形瓶配制, 121℃灭菌20min) 的富集培养基中, 作摇床培养, 培养温度为37℃, 转速为100rpm, 培养24h。
1.4.2 初筛
将富集培养的样品稀释分离后涂布在筛选培养基中, 放入37℃倒置培养24h观察, 并在平板倒入少量 (1%) 十六烷基三甲溴化铵, 静置10min观察并测量菌落周围出现透明圈的直径 (d/cm) 和菌落直径 (d/cm) , 有透明圈者则为有果胶酶活性的菌株。将产果胶酶的菌种接种于斜面培养基贮藏于4℃下。
1.4.3 复筛
将初筛得到的51株菌接种到斜面, 37℃, 培养24h后, 接种到摇瓶进行一级发酵, 200r/min, 24h后对发酵液进行酶活测定。
1.5 培养方法
再挑取单菌落接入种子培养液中。 (种子培养液按25ml/250ml的量于锥形瓶中分装, 并单独灭菌) , 作摇床培养, 转速为200rpm, 在37℃下培养24h。然后种子液按8%的接菌量接入发酵培养基中, (发酵培养基按50ml/500ml的量分装于500ml的锥形瓶中, 并单独灭菌) , 作摇床培养, 转速为200rpm, 在37℃下培养24h后测酶活。
1.6 菌种鉴定
1.6.1 菌体形态特征
将菌种接种于平板LB培养基上, 培养24h后, 用双目生物显微镜在油镜下观察菌体形态。
1.6.2 菌落形态特征
将菌种接种于平板LB培养基上, 培养24h后, 按常规方法观察菌落形态。
1.6.3 生理生化鉴定
按照伯杰氏细菌鉴定手册方法进行
1.6.4 16SrDNA测序鉴定
这部分工作由天津科技大学生物工程学院菌种鉴定中心完成
1.7 碱性果胶酶酶活测定方法
取20μl发酵液稀释酶液加入到2ml含0.2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液 (pH9.0) , 45℃反应15min, 用3ml0.03mol/L的磷酸溶液终止酶反应, 在235nm处测定其吸光值。
一个标准酶活单位 (1U) 定义为:每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数为4600L/mol·cm[9].
1.8 酶液的分离纯化
1.8.1 果胶酶粗酶液的制备
分别挑一环521菌接种于2个250ml锥形瓶中, 每瓶分装25ml种子培养基 (灭菌) , 作37℃摇床培养, 200r/min, 培养24h后, 以8%的接菌量接入10个500ml锥形瓶中, 每瓶分装50ml优化发酵培养基中 (灭菌) , 作37℃摇床培养, 200r/min, 培养24h后, 于4000r/min, 4℃下离心10min, 取上清液。分别测定其酶活力和蛋白含量。
1.8.2 硫酸铵梯度盐析提纯
将以上酶液中酶活力在0.3~0.8μg/ml的锥形瓶中的酶液混合得310ml酶液。取70ml的酶液分装于7个250ml的锥形瓶中, 以如下的比例浓度加入硫酸铵沉淀过夜。
分别将7个瓶中的酶液在4000r/min, 4℃下离心10min, 分别收集上清液测酶活力及蛋白含量;将每个样的离心后的沉淀溶于等体积的PH9.0的甘氨酸-NaOH-CaCl2缓冲溶液中, 测定酶活力和蛋白含量, 并与相对应的酶液的酶活力作对照。取分离效果显著的浓度作为其余240ml酶液处理的最适浓度, 并分别测定上清与沉淀的酶活力与蛋白含量。
1.8.3 透析和浓缩
将上清液分装于透析袋中静置于去离子水中, 4℃下透析过夜, 然后, 取出透析袋, 在周围洒上分子量为20000的PEG, 静置于4℃下浓缩过夜。
1.8.4 Sephadex G-75柱层析
20×1000mm的玻璃柱装好Sephadex G-75萄聚糖凝胶, 先用0.02mol/L PH 8.0 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液平衡, 上样, 以0.02mol/L pH 8.0 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗脱, 流速30ml/h, 收集各组分, 用于酶活和蛋白含量测定
2. 结果和讨论
2.1 菌体形态特征
521枯草芽孢杆菌的形态特征:单个细胞0.7~0.8×2~3微米, 着色均匀。无荚膜, 无鞭毛。最适生长温度为37℃, 在保藏培养基上37℃培养10h后菌体呈杆状。产芽孢, 芽孢0.6~0.9×1.0~1.5 (μm) , 椭圆到柱状, 位于菌体中央或稍偏, 芽孢形成后菌体膨大。
2.2 菌落形态特征
菌株521的菌落呈不规则形, 由无色变淡粉红再时间长变为黑色, 腊状, 光滑, 不透明, 边缘较整齐。
2.3 16SrDNA测序鉴定
经16SrDNA测序鉴定521菌株为枯草芽孢杆菌
2.4 碱性果胶酶的一般酶学性质研究
2.4.1 生长曲线和产酶曲线
521菌株的纯无机盐发酵培养基发酵生长情况及产酶情况如下图3-2所示。可以看出, 521菌在5h~18h为对数生长期, 菌量生长快速。同时在11h~17h时开始大量产酶, 并在13h和17h出现两个明显的酶活峰, 以13h出现的酶活峰为最高。表明果胶酶出现在细胞代谢和生长旺盛时期, 与细胞生长增殖有关。因而加大菌体含量可大大提高酶活力。
2.4.2 碱性果胶酶的动力学曲线
酶反应动力学常数Km和Kcat可表达酶反应性质、反应条件和酶反应速度之间的关系。对于特定的反应、特定的反应条件来说, 米氏常数Km (Michaelis constant) 是一个特征常数, 米氏常数 (Michaelis constant) (Km) 它的意义如下:它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度[S], 单位为mol/L。它可以表示酶和底物之间的亲和能力, Km值越大, 亲和能力越弱, 反之亦然。其中Km值最小的那个反应的底物就是酶的最适底物。Km是一种酶的特征常数, 只与酶的种类有关而与酶的浓度无关, 与底物的浓度也无关, 这一点与Vm是不同的, 因此, 我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。但是它会随着反应条件 (T、pH) 的改变而改变。竞争性抑制剂米氏常数不变, 最大反应速度减小;反竞争性抑制剂米氏常数减小, 最大反应速度减小。
影响酶促动力学常数的主要有以下五点:底物浓度, 酶的量, pH值, 温度, 抑制剂和激活剂。
底物浓度:主要应由酶的Km值决定。当[S]>>Km, 反应成0级反应;当[S]<<Km, 反应成1级反应;当[S]在Km值附近时, 反应介于0级与1级反应之间。所以测Km值时, 底物浓度要适宜。当[S]>10Km, 速度达到理论最大反应速度的91%;当[S]过小时, 一是底物溶液的配制不好掌握, 二是反应速度太小;一般酶的Km值多在10-5~10-3mol/L, 所以[S]应在0.05~5mmol/L之间。而且随着[S]的增大, 反应速度也应逐渐增大。
酶的浓度:酶的浓度越大, 反应速度越快。酶的浓度太大, 会导致反应速度太快, 吸光度无法测量;酶的浓度太小, 又会导致反应速度太慢, 时间扫描时形成的时间-吸光度曲线趋于平缓, 效果不明显。所以, 酶浓度应控制在使反应在3~5min内到平衡的范围内, 一般在10-12~10-7mol/L之间。
图中的横轴截距为-Km, 纵轴截距为Km/Vmax, 斜率为1/Vmax, 求得
即当果胶酶的酶促反应速度达到最大速度的一半时 (0.127g/s) 时, 底物浓度为0.4123g/L。
2.4.3 pH对果胶酶酶活力的影响
2.4.3. 1 碱性果胶酶最适作用pH的确定
pH通过改变酶和底物分子解离状态影响反应速率, 酶催化活性最高时反应体系pH称为酶促反应的最适pH。如图2-4所示, 最适作用pH是8.0。
2.4.3. 2 碱性果胶酶的pH稳定性
从图2-5可以看出, 当酶液在不同pH缓冲液范围内耐受30min后, 碱性果胶酶在pH8.0~12均具有酶活性。在pH9.5时酶活达到最高, 最高耐受范围在pH12, 从图的整体趋势可以看出, 果胶酶中聚半乳糖醛酸裂解酶的碱性稳定范围在p H9.5~12。这种特性很适合工业生产中耐碱性的条件。
2.4.4 温度对碱性果胶酶酶活力的影响
2.4.4. 1 碱性果胶栈酶的最适作用温度
温度对果胶酶的酶促反应速率具有双重影响。当温度下降时, 酶活力也呈下降趋势, 当温度升高时酶活力又呈上升趋势, 但当温度太高时, 则由于酶蛋白的热变性而会使酶活降低, 所以, 酶促反应的最适温度就是这两种作用综合的结果, 即使酶促反应速率表现最快时反应体系的温度。如图2-6所示, 果胶酶的最适作用温度为45℃。
2.4.4. 2 果胶酶酶促反应的温度稳定性
如图2-7所示, 酶促反应在45℃作用30min时, 具有最大酶活, 随着温度的升高酶活呈下降的趋势, 在65℃还具有酶活性;
2.4.5 金属对碱性果胶酶酶活力的影响
将等体积的酶液与浓度为1mmol/L的Co2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、K+、Ba2+溶液混合, 充分作用30min, 然后测定酶活。以空白水为对照, 结果如表2-8所示, Ca2+和Cu2+具有明显的激活作用, Mg2+对酶促反应没有影响作用, 而Co2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、Zn2+、K+、Ba2+对酶具有抑制作用。
2.4.6 碳源种类对产酶的影响
碳源一菌体合成自身骨架的主要物质来源, 是影响菌体生长和代谢产物合成的关键因素。本实验以原始发酵培养基中乳糖、果胶、酵母膏为碳源作为对照, 分别取总碳摩尔数相同 (以10g/L的葡萄糖为基准) 的豆饼粉+玉米粉、乳糖、葡萄糖、糊精、淀粉、蔗糖、果胶、淀粉+果胶作为替换的碳源, 对照相对比活率。结果如图2-9, 521菌对于豆饼粉+玉米粉的利用率比较高, 酶活相对提高50%, 同时对淀粉+果胶的利用率也比较高, 酶活相对提高了44%。考虑到, 在实际工业生产中, 淀粉+果胶的水溶解度均比豆饼粉+玉米粉要好, 而且成本低, 因而成为优化培养基的首选。
2.4.7 氮源种类对产酶的影响
氮源是菌体合成自身蛋白和遗传物质的主要来源, 也是代谢产物中氮元素的来源之一。本实验以原始发酵培养基中以蛋白胨为氮源作为对照, 分别称取总氮摩尔数相同 (以10g/L为基准) 的酵母浸粉、尿素、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钠作为替换的氮源, 对照相对比活率。结果如图2-10, 521菌对于硫酸铵的利用最好, 相对酶活提高了8%。说明521菌对于无机NH4+具有高利用率, 可以考虑在大规模发酵生产中使用富含铵根离子的物质。
通过不同离子、碳源、氮源对产酶的影响结果, 确定521菌的优化培养基为 (g/L) :果胶20、淀粉20、NH4NO315、MgCl20.2、MgSO42、CaCl23、K2HPO44、p H=8.0。在这个优化培养基条件下, 经过发酵, 以8%的接种量, 250ml三角瓶装25ml培养基, 在37℃, 200r/min回转式摇床上培养24h后测酶活达到28μ/ml, 比目前国内报道的最高酶活34U/ml略低, 但比原始酶活提高了30%。
2.5 酶的分离纯化
2.5.1 果胶酶粗酶液的制备、盐析
用优化培养基作为521菌的发酵培养基, 经发酵后获得的粗酶液首先用硫酸铵盐析。由于中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响, 一般在低盐浓度下随着盐浓度升高, 蛋白质的溶解度增加, 此谓盐溶;当盐浓度继续升高时, 蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出, 这种现象称盐析, 将大量盐加到蛋白质溶液中, 高浓度的盐离子 (如硫酸铵的SO42-和NH4+) 有很强的水化力, 可夺取蛋白质分子的水化层, 使之“失水”, 于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。在一般文献报道中, 大多分离纯化蛋白酶均使用50%~70%的硫酸铵, 本实验采用30%的硫酸铵盐析, 结果收集的上清液中, 提纯总收率达到了141。
2.5.2 Sephadex G-75柱层析
粗酶液在经过盐析、透析和浓缩后, 经过SephadexG-75柱层析, 进一步除盐, 并根据组分中蛋白分子量大小的不同, 依次洗脱, 从而分离蛋白组分。以时间为横坐标, 以收集的每管液体的酶活为纵坐标, 绘出其洗脱曲线如图2-11。
可以看出, 在洗脱曲线中, 在20min和100min处明显有两个酶活峰, 均具有聚半乳糖醛酸裂解酶。
最后酶液的分离提纯结果如下表2-1所示。
3. 结论
本研究从公园的不同花土中分离得到一株相对高产碱性果胶酶的产生菌并进行了鉴定, 鉴定为枯草芽孢杆菌, 编号为TCCCC11286。
菌株TCCCC11286所产碱性果胶酶的温度稳定性在45℃~60℃, 最适作用温度为45℃, PH稳定性为9.5~12, 最适作用PH为8.0, 这些耐高温和耐碱性的特点很适合在实际纺织工业中碱性环境下处理织物的特点, 因而具有很好的开发前景。
通过产酶条件的初步优化, 该菌株的产酶能力相对提高30%。从氮源和碳源的考察中可知, 菌株TCCCC11286对于铵根离子和淀粉的利用能力较强, 可以考虑在大规模发酵生产中使用廉价的富含铵根离子的化学物质和低成本的淀粉。
在菌株TCCCC11286所产碱性果胶酶的分离纯化中, 本实验采用了30%的硫酸铵盐析、SephadexG-75柱层析等方法, 由于酶液中含杂离子浓度小, 得到很好的纯化分离酶的效果。这种处理方式在实际生产中由于所需盐量少, 也节约了酶提纯的成本。本实验的方法为进一步开发工业用菌提供了很好的理论和数据依据。
摘要：从公园的花土中分离出一株相对高产碱性果胶酶的菌株, 经16srDNA鉴定为枯草芽孢杆菌, 命名为TCCCC11286。在初步的酶学性质研究中表明, 它耐高温耐碱, 最适作用温度为45℃, 到60℃仍有酶活, 最适作用pH为8.0。经过培养基的初步优化, 菌株TCCCC11286对于富含铵根离子的化学物质和淀粉具有很好的利用能力。本实验还对酶的分离纯化进行了初步研究。
关键词：枯草芽孢杆菌,优化,分离纯化
参考文献
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碱性脂肪酶 篇5
关键词：玉米蛋白,碱性蛋白酶,水解度,小肽
有研究表明, 蛋白质吸收的主要形式不是以氨基酸的形式而是以小肽的形式完整吸收, 并且一些小肽能够调节机体的生命活动, 具有众多有利于动物生长的功能和特点[1,2,3]。也有研究表明, 在饲料中添加一定量的生物活性肽能够调节动物消化系统, 提高生产性能, 增强免疫力。小肽在动物蛋白质营养中的作用越来越受到关注[4]。玉米蛋白粉是玉米湿法生产淀粉的副产物玉米面筋粉 (corn gluten meal, CGM, 俗称玉米渣) , 大约含60%的蛋白质。玉米蛋白水溶性差, 组成复杂, 口感粗糙, 严重影响了其在动物肠道系统内的吸收、利用。可以采用生物酶制剂通过较容易的控制条件实现对玉米蛋白粉的有限水解, 获得含量较高的可吸收小肽。研究通过正交试验设计对碱性蛋白酶酶解玉米蛋白粉的工艺条件进行了优化, 探索了各因素对玉米蛋白水解度的影响, 为今后玉米小肽的制备及中试工艺的建立奠定基础, 现报道如下。
1 材料与方法
1.1 原料
玉米蛋白粉 (蛋白含量为61.8%) , 购自河南新麦兹淀粉厂;碱性蛋白酶 (酶活力为10万U/mL) , 购自诺维信酶制剂公司;4.62 mol/L NaOH溶液, 自配。
1.2 pH值对玉米蛋白氮溶解指数的影响
将50 g玉米蛋白粉原料放入500 mL水中搅拌, 配制成固液比为1∶10的玉米蛋白悬液, 分别调pH值至2, 4, 6, 8, 10, 12, 4 000 r/min离心10 min;取上清液采用微量凯氏定氮法测定玉米蛋白在不同pH值条件下的氮溶指数 (NSI) 。NSI=上清液中总氮含量/玉米蛋白溶液总氮含量×100%。
1.3 碱性蛋白酶水解玉米蛋白粉最佳酶解条件正交试验优化
pH值、温度、碱性蛋白酶添加量以及变性剂的用量对玉米蛋白的水解度都有显著的影响。将50 g玉米蛋白粉原料放入500 mL水中搅拌, 配制成固液比为1∶10的玉米蛋白悬液, 滴加4.62 mol/L NaOH溶液保持恒定的pH值。采用pH-Stat法, 将pH值、温度 (℃) 、酶量 (mL) 、变性剂A量 (g) 作为影响玉米蛋白水解度的4个因素, 各因素分别取5个水平, 以酶解1 h 耗碱量作为评价水解度大小的指标, 选用L25 (56) 正交表安排试验, 试验设计见表1。
1.4 玉米蛋白粉水解度的计算
水解度计算公式:DH=B×Nb×1/a×1/MP×1/htot×100% (pH值>6.5) 。
式中:B为碱液体积 (mL) ;Nb为碱液的浓度 (mol/L) ;a为α-氨基酸的解离度, a=[10 (pH值-pK) ]/[1+10 (pH值-pK值) ], 其中的pK (解离常数) 值为α-氨基酸的平均pK值, 按7.0计算;pH值为反应起始的pH值;MP为底物中蛋白质的总量 (g或kg) ;htot为单位质量底物蛋白质中的肽键总数 (mmol/g) , 玉米蛋白htot为7.35 mmol/g[5]。
根据水解度的计算公式可知, 当底物中玉米蛋白总量底物中蛋白质的总量一定时, 玉米蛋白的水解度DH与水解过程中的耗碱量成正比, 故可以用耗碱量来表征水解度的大小[5]。
2 结果与分析
2.1 pH 值对玉米蛋白氮溶指数的影响 (见图1)
由图1可见, 随着溶液pH值的变化, 玉米蛋白的氮溶指数在pH值>7时变化明显, 随着pH值的升高而迅速增大。
2.2 碱性蛋白酶酶解玉米蛋白正交试验优化设计结果 (见表2)
由表2中计算的各指标极差 (R) 的结果可以看出:各因素对玉米蛋白水解度影响的主次顺序为A>C>B>D, 即pH值对玉米蛋白水解度的影响最大, 其他依次是酶量、温度及变性剂A量。根据水平均值 (k) 可以得出最优水平组为A3C5B2D3, 即pH值为9, 酶量为3.0 mL, 温度为50 ℃, 变性剂A量为1.5 g。经测定, 此条件下耗碱量为17.01 mL, 玉米蛋白水解度可达34.95%。
3 讨论
由图1可以看出, 玉米蛋白在酸性或中性条件下水溶性较差, 在偏碱性条件下氮溶指数逐步升高, 玉米蛋白溶解性迅速提高, 而生物酶只作用于溶解状态的玉米蛋白, 增加水溶性是提高玉米蛋白水解度的前提, 因此, 选择碱性蛋白酶作为酶解玉米蛋白的生物酶制剂。
由表2可知, 在生物酶酶解玉米蛋白过程中, 溶液的pH值和酶的添加量是影响水解度的重要因素, 而水解度的大小又会影响所得小肽分子质量的大小, 小肽分子质量的大小又会影响小肽在动物肠道的吸收, 因此, 在酶解过程中要严格控制这两个指标。
注:最优方案为A3C5B2D3。
4 结论
碱性蛋白酶酶解玉米蛋白粉的最佳工艺条件:pH值为9, 酶量为3.0 mL, 温度为50 ℃, 变性剂A添加量为1.5 g, 此时玉米蛋白水解度DH可达34.95%。
酶解玉米蛋白工艺条件的建立, 给通过酶解玉米蛋白生产小肽奠定了一定的理论基础。同时生产小肽技术使得用植物蛋白原料代替配合饲料中的优质动物蛋白原料成为可能, 符合中国植物饼粕多的国情, 符合绿色、环保与低碳的产业政策, 又符合世界饲料工业发展的趋势。在产品的安全性、性价比方面也具有很大优势, 市场前景广。
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