骨特异性碱性磷酸酶

骨特异性碱性磷酸酶（精选7篇）

骨特异性碱性磷酸酶 篇1

慢性肾脏疾病是指肾损害大于3月,伴或不伴GFR下降的一个大类疾病概念,可由于药物、长期代谢性酸中毒、继发性甲旁亢等多因素造成患者不同程度的骨损害。本文通过检测患者骨特异性碱性磷酸酶,初步探讨骨特异性碱性磷酸酶在慢性肾脏疾病患者中的表达及意义。

1 材料与方法

1.1 病例及资料

本研究纳入患者86例,其中男性44例,女性42例。平均年龄39.81±19.21岁,其中年龄大于60岁患者27例,占31.39%。所有患者均符合K/DOQI[1]关于慢性肾脏疾病定义。全部纳入患者疾病谱如下:狼疮肾炎11例,慢性肾炎33例,糖尿病肾病13例,维持性透析患者29例。其中维持性透析患者因终末期肾病患者骨活动影响因素较多,部分患者基础疾病难以追述,故未进一步统计其基础疾病情况。

1.2 检测方法

所有患者空腹取抽取静脉血标本送检,常规分离取血清保存于-70OC冰箱,集中分批进行检测。每次检测保重所用试剂批号及检测条件一致。检测试剂购自英国IDS公司(批号:20080675A03),按照产品说明书采取亲和素-生物素的酶免分析方法检测,加样结束后在主波长405nm,次波长600-650 nm的酶标仪上读取吸光度,经与产品标准曲线对比求出检测样品骨特异性碱性磷酸酶浓度,结果以(ug/L)表示,每个检测样本均设复孔。按照所用检测试剂推荐参考值12.3±4.3ug/L,本研究认为当检测结果小于8ug/L时,骨特异性碱性磷酸酶过低。

1.3 统计学方法

数据采取均数±标准差表示,相关分析采取Logistic回归法进行统计分析,自变量以逐不回归方法进入方程,以P<0.05有统计学意义。研究相关因素取值方法见表1。其中老年定义为患者年龄大于60岁,营养不良定义按照欧洲NRS 2002[2]定义为风险评分大于3分

2 结果

2.1 一般情况

纳入患者86例均完成检测,骨特异性碱性磷酸酶平均9.21±3.61 ug/L,其中骨特异性碱性磷酸酶降低患者35例,最低达3.67 ug/L。全部患者均行血清碱性磷酸酶生化检测,其中低于检测值18例,占20.93%,其中1例狼疮肾炎患者在初诊狼疮后1年发生股骨头坏死,留取其股骨头摄片见图1,回顾分析其骨特异性碱性磷酸酶为3.95ug/L,显著低于正常。

2.2 危险因素分析

按照研究方法统计患者是否骨特异性碱性磷酸酶降低分为低表达组及正常组分别统计其合并危险因素情况见表3。按多因素统计回归显示长期使用激素、女性、营养不良与低骨特异性碱性磷酸酶相关(P<0.05),以长期使用激素OR值最大。详见表4。

3 讨论

慢性肾脏疾病可能因多种原因发生骨病,其表现多样,肾病综合征特别是长期使用激素的患者中可见到股骨头坏死的发生,在终末期肾脏疾病中可以见到骨矿化不量,纤维骨炎等。由骨病引起的并发症已经严重影响慢性肾脏疾病患者生活质量。深入研究慢性肾脏疾病中存在的骨骼相关的并发症十分必要。

虽然慢性肾脏疾病骨病表现多样,而且发病机制和始动因素不一,但都存在骨代谢活动异常,成骨活动低下或破骨活动增强都可能导致骨骼相关疾病。本研究所监测的骨特异性碱性磷酸酶为成骨活动指标,已在内分泌及骨代谢性疾病中广泛使用[3]。在正常人体代谢中,骨骼是分泌碱性磷酸酶的重要器官,其分泌量约为总碱性磷酸酶的50%[4]。在病理状态成骨低下状态骨骼分泌碱性磷酸酶明显减少。我们以往所进行的全血碱性磷酸酶并不能充分反映骨分泌碱性磷酸酶情况,而在本研究中我们也仅见有18例患者全血碱性磷酸酶降低,与骨特异性碱性磷酸酶检测结果相比,提示全血碱性磷酸酶敏感性尚有缺陷。

我们选择的相关指标分析都是临床中我们认为可能慢性肾脏疾病中与成骨代谢相关的重要危险因素。由于终末期肾病可能导致成骨代谢低下的因素比较多,而本研究纳入例数有限,尚不足满足讨论太多危险因素条件,所以本研究仅涉及讨论终末期肾脏疾病是否为成骨不良的单独危险因素。

从本研究结果看,长期使用糖皮质激素,女性,营养不良与骨特异性碱性磷酸酶相关,P<0.05。提示以上因素可能是慢性肾脏疾病合并骨形成不良的重要危险因素。其中以激素的长期使用影响最为明显,OR值达12.38,这与激素相关骨质疏松研究一致[5],值得我们高度重视。本研究中出现的1例在长期使用激素后发生股骨头坏死的女性狼疮患者,从CT摄片看其骨密度降低比较明显,可进一步印证我们的研究结论。我们也注意到,终末期肾脏疾病按照本研究结果并不是成骨不良的危险因素,我们分析这可能和终末期肾病影响骨代谢是全方位的,可能不仅仅是骨形成不良,也可能导致骨破坏增多,所以从整体上讨论终末期肾病对成骨的影响并未表现出统计学差异,这还需要我们下一步工作去进一步证实。

综上,骨特异性碱性磷酸酶可能是一个慢性肾脏疾病骨形成障碍的重要监测指标,对于长期使用激素激素、女性、伴随营养不良的患者应注意其可能伴随的成骨活动低下及相关并发症。

参考文献

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骨碱性磷酸酶与血钙检测结果分析 篇2

关键词：骨源性碱性磷酸酶,血钙,临床检测分析

现在随着人们生活水平的不断提高, 人们越来越注意营养保健, 特别是对于发育期的儿童, 由于受到社会各种营养品的不断充斥, 进补营养品在目前社会日益泛滥, 特别是对于儿童的补钙, 儿童是否补钙以及如何补钙、到底需不需要补钙是日益矛盾的课题[1], 鉴于此, 本院检验科对436例儿童进行骨碱性磷酸酶测定, 以及血钙判定, 现就其临床检测结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本室采集2013年4月~2014年2月来本院进行入托前健康体检的儿童的血清, 进行骨碱性磷酸酶和血钙检测, 共436人, 年龄2.5~6岁, 平均年龄 (4.6±1.5) 岁, 其中男孩229人、女孩207人。

1.2 标本采集

取被检者早晨的空腹静脉血3ml, 首先用标准微量吸管吸取40μl加入专用微量元素稀释液中, 待血液凝固完全后离心分离血清, 标本不能有溶血、黄疸、脂血, 以免影响结果的准确性。

1.3 试剂和仪器

北京普析通用MB5血液五元素分析仪, 试剂:专用微量元素血液稀释液;南京神州英诺华D360全自动生化分析仪, 试剂:上海长征体外诊断试剂。

1.4 结果测定

操作严格按照试剂盒说明书进行, 分析测定过程杜绝钙离子污染。

2 结果

BALP及血钙的检测结果 (血清钙的正常参考值为1.6~2.3mmol/L, 骨碱性磷酸酶的正常参考值为:42~128 U/L) 见表1。

3 讨论

3.1 缺钙的原因

儿童处于生长发育的高峰期, 生长速度较快, 对于营养物质需要量大, 但是儿童的消化器官发育不完善, 不能将进食的食物全部吸收, 再加上生活中对于儿童的喂养不当, 孩子偏食、挑食以及缺乏钙、维生素D的补充, 就很容易造成儿童缺钙。常见症状, 有夜惊、多汗、吵夜、厌食、出牙迟、发稀、站立迟、语言迟等。

3.2 骨碱性磷酸酶与血钙的检测

骨碱性磷酸酶在维生素D不足时, 会明显升高, 因为, 维生素D的缺乏, 造成成骨细胞的活跃, 并且研究表明[2], 儿童年龄越小, 生长发育越快, 骨碱性磷酸酶的阳性率就越高, 所以, 骨碱性磷酸酶检测对于早期诊断维生素D缺乏造成的佝偻病意义较大;由于维生素D缺乏性佝偻病初期往往血钙趋于正常, 检测带来了困难, 但对于佝偻病激期与维生素D缺乏搐溺症具有诊断意义[3]。

总之, 通过本组研究病例发现, 骨碱性磷酸酶与血钙存在一定的关系, 血钙较低的患儿, 其骨碱性磷酸酶一般较高。同时还发现, 骨碱性磷酸酶与血钙在对于佝偻病的预防上各有长短, 骨碱性磷酸酶能够对于维生素D缺乏造成的佝偻病有敏感性, 然而血钙的检测只能说明儿童的钙来源或者吸收不好, 不能用于患儿佝偻病的临床诊断, 但是对于患儿因为佝偻病造成手足抽搐意义较大。

参考文献

[1]Magnusson P, Hager A, Larsson L.Serum osteocalcin and boneand liver alkaline phosphatase isoforms in healty children and adolescents.PediatrRes, 1995, 38 (6) :955-961.

[2]Magnusson P, sharp CA, Farley JR.Different distribution of humanbone alkaline phosphatase isoforms in serum and bone tissue ex-tracts.Clin Chim Acta, 2002, 325 (1-2) :59-70.

骨特异性碱性磷酸酶 篇3

1 对象

根据孕产妇系统管理标准要求, 产妇产后42~56天要进行健康体检, 来自城区和乡村的784名产妇在我院妇女保健科接受产后42天健康体检, 体检内容包括血压、子宫复旧情况、腹部切口或会阴切口情况和白带常规、血常规检查, BALP测定, 询问母乳喂养等情况, 了解产妇产后健康恢复状况, 产后哺乳期有否缺钙等情况。

2 方法

取外周血3ml, 用日立7170型自动生化分析仪进行B A L P检测, 进行临床观察及测定B A L P活性, 正常参考值为<200U/L, 200~250U/L为可疑产后缺钙, >250U/L为临床产后缺钙。血清钙参考值2.00~2.60mmol/L, 磷0.70~1.50mmol/L, 碱性磷酸酶 (ALP) 40~135U/L。

3 结果

3.1 产妇产后B A L P检测结果BALP>2 5 0 U/L

3 6 1例, 检出阳性者占46.1%;200~250U/L 402例, 占5 1.3%, <2 0 0 U/L仅2 1例, 占2.6%。因此, 认为可疑产后缺钙402例, 临床产后缺钙361例。大多数乳母都存在不同程度的缺钙。

3.2 治疗

根据产后缺钙程度不同采取不同治疗方案。361例B A L P异常诊断为临床产后缺钙和伴有小腿抽筋、多汗、腰酸、手脚发麻的产妇采用维生素D和钙剂, 服用钙尔奇D片1.2g每日1次, 乳白鱼肝油10ml每日1次服用。4 0 2例B A L P在2 0 0~2 5 0 U/L的产妇进行预防性治疗, 服用钙尔奇D片0.6 g每日1次。两组均加上饮食疗法用猪脊骨或腿骨1 5 0 g, 胡萝卜2 0 0 g, 将二者洗净煲汤服食。21例B A L P在正常范围的产妇, 嘱多喝牛奶和多吃含钙较高的食物外, 需要多晒太阳。治疗1个月后复查B A L P, 3 6 1例临床产后缺钙者中3 2 0例恢复正常, 占88.6%, 未恢复正常的41例, 占11.4%;再按上法处理1个月, 复查B A L P全部<2 0 0 U/L。

4 讨论

维生素D和钙的缺乏导致钙、磷的代谢功能障碍, 同时还可影响神经、肌肉、造血等器官的功能, 严重危害产妇的产后健康。由于哺乳期缺钙还可能影响到下一代的健康, 增加新生儿维生素D缺乏性佝偻病的发生, 因此及时正确地诊断哺乳期缺钙非常关键。BALP由成骨细胞合成, 当成骨细胞转化为骨细胞时, 其活性下降并消失, 如骨钙化一旦不足, 成骨细胞不能钙化, 失去活性, 使成骨细胞代偿性增加, B A L P相应增多, 血液中B A L P的活性增高, 这时检测BALP的活性可较准确的反应骨改变的情况, 血清钙、磷和A L P只能反映人体近期维生素D3的营养水平, 不能反映人体长期钙营养状况, 且检出率低, 故B A L P的测定应作为早期诊断的特异性指标。同时, 对于使用钙剂的产妇具有明确的疗效判定指标, 能避免上述药物的滥用, 减少医源性损害发生, 指导临床合理用药, 对于BALP>200U/L的产妇, 均应在治疗后逐月复查, 动态观察, 直到B A L P<2 0 0 U/L为止。产妇产后哺乳期B A L P异常率9 7.3% (7 6 3/784) , 血清BALP的测定对产后哺乳期诊断缺钙中早期诊断特异性强, 方法简单, 有利于产后缺钙的早期诊断, 早期发现、早期治疗和预防新生儿维生素D缺乏性佝偻病的发生, 预防以后的老年性骨质疏松症的发生。

骨特异性碱性磷酸酶 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年7月至2011年6月间我院儿保中心和儿科接诊的5364名儿童, 其中男童3024名, 女童2340名, 采集新鲜静脉血4m L。

1.2 样本采集

所有儿童采集静脉血4mL, 取2mL注入预先加有肝素的经驱铅处理的离心管内, 颠倒混匀, 放入-20℃, 另外2mL不做抗凝处理, 室温静置2h, 离心后取上清液, 测骨碱性磷酸酶活性。用全血干化学免疫浓缩法测定骨碱性磷酸酶 (BALP) 的活性, 用石墨炉原子吸收光谱法测定血铅含量, 测量全程进行内部质量控制。

1.3 铅中毒诊断标准

参照美国CDC的诊断标准, 无论是否有相应的血液生化变化和临床症状、体征, 只要血铅浓度≥100μg/L, 即诊断为铅中毒。

1.4 统计学处理

使用SPPS10.0统计软件对所测数据进行统计分析, 并对上述儿童骨碱性磷酸酶活性 (x) 与血铅水平之间进行相关性分析, 检验标准α=0.05。

2 结果

在本研究所涉及的5364名儿童中, BALP活性≤200U/L1296例, BALP活性在200～250U/L的 (临界佝偻病) 2592例, BALP活性≥250U/L (佝偻病活动期) 1476例。按照血铅≥100μg/L为铅中毒的标准, 对应的例数分别为21例、106例、161例, 表1为计量统计结果。

我们同时对研究中儿童骨碱性磷酸酶活性及其相对应的血铅水平进行的测定结果见表2。通过对本研究中儿童骨碱性磷酸酶活性 (x) 与血铅水平之间进行相关性分析, 发现BALP活性与其血铅之间存在着显著的正相关关系, 回归方程为, 得出相关系数为r=0.4772, P<0.01, 有显著性意义。

3 结论

从我们的研究结果可以看出, 儿童骨碱性磷酸酶与血铅水平之间存在明显的正相关关系, 血铅水平的高低将显著影响骨碱性磷酸酶的活性。碱性磷酸酶活性是反映骨代谢水平的重要指标, 它的升高往往反映骨钙化不足, 骨营养不良。有研究显示血铅影响骨代谢的可能机制在于血铅与血钙的竞争机制, 血铅升高使血钙降低, 影响了骨的钙化。同时, 骨碱性磷酸酶活性>200U/L也是临床上诊断佝偻病的标准, 也有文献指出临床上一些难治的佝偻病可能的就是因为血铅过高引起, 排铅治疗往往可以起到意想不到的效果[2]。

由于处于快速发育中的儿童对铅的毒性十分敏感[3], 儿童期的铅暴露无疑会对其生长发育产生严重的负面影响, 骨骼是铅毒性作用的重要靶器官, 储存在骨中的铅可对骨骼产生多种有害影响, 不仅如此, 铅作为一种重金属排出极为困难, 且新的研究发现铅也有着严重的神经毒性, 因此认识铅中毒的危害, 以及做好对儿童的保护和对儿童父母健康教育对预防铅中毒, 保护儿童的身体健康有着重要的意义。

参考文献

[1]岑赛宁, 区腾飞, 吴清.生长迟缓儿血铅水平与环境因素的相关性研究[J].临床儿科杂志, 2004, 22 (7) :464-466.

[2]沈丹, 朱中平, 俞翠莲, 等.铅暴露对婴儿幼儿发育商数影响的队列研究[J].中国公共卫生, 2006, 22 (8) :906-908.

骨特异性碱性磷酸酶 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2011年5月~2013年4月在我院就诊的68例佝偻病患儿作为研究组, 同时选择同期儿保科的62例正常儿童作为对照组。研究组中男38例, 女30例;年龄8个月~6岁, 平均3.95±0.99岁。对照组中男28例, 女24例;年龄6个月~6岁, 平均4.02±0.83岁。研究组患儿依据《全国佝偻病防治方案》中的诊断标准而确诊, 排除经维生素D及其相关制剂治疗、肝肾功能异常者。对照组为儿保正常儿童, 排除佝偻病家族史、近3个月使用维生素及其制剂者。

1.2 方法

对两组都进行25 (OH) D3和BALP的检测:采集受试者的外周血液2ml, 并将其置于抗凝真空管中, 以3000r/min的速度离心10min, 取血清置于-20℃的冰箱中保存, 采用IDS公司生产的25-羟维生素D酶试剂盒, 测定血清中的25 (OH) D3水平;同时采用高山药业公司提供的骨碱性磷酸酶试剂盒测定骨碱性磷酸酶活性。

1.3 正常值[2]

25 (OH) D3:25-150ng/ml。BALP:<200U/L。

1.4统计学处理

数据均由SPSS13.0软件处理, 计量资料用±s表示, 采用t检验, 计数资料比较用χ2检验, P<0.05示差异具有统计学意义。

2 结果

经检测, 研究组的25 (OH) D3低于正常值, 为8~22ng/ml;BALP为高于正常值, 为201~488UL。对照组的25 (OH) D3在正常范围内, 为28~102ng/ml;BALP也在正常范围内, 为57~173U/L。两组25 (OH) D3、BALP平均水平, 见附表。

3 讨论

佝偻病是目前小儿的常见病之一, 在新生儿期主要以颅骨的异常生长为特征, 若病情较重患儿可出现颅骨软化、四肢骨骼弯曲等畸形改变, 部分甚至可出现惊厥。X光对早期骨骼该病的检出情况不理想, 导致许多有临床症状的患儿的病情延误, 给家庭和社会都带去一定的负担。

单从佝偻病的发生机制而言, 主要在于维生素D的缺乏, 而25 (OH) D3主要依赖于维生素D的代谢, 在血液中的浓度较高, 稳定性最强, 故是体内维生素D含量的直接反应性指标。BALP主要由成骨细胞分泌, 是临床判断成骨细胞功能的有效标志。当维生素D缺乏时, 骨钙化不足, 成骨细胞活跃, BALP则显著增加;若成骨细胞继续生长并转变为骨细胞时, BALP则明显降低。根据临床资料显示[3], 在佝偻病患儿中, BALP增加比X光检出异常的时间明显较早。本次我们选择已经确诊而未经治疗的68例佝偻病患儿和62例正常儿童, 分别对其的25 (OH) D3和BALP进行测定, 结果显示:与正常组儿童比较, 佝偻病患儿的25 (OH) D3较低, 而BALP则明显较高, 且都不在正常范围内。

总之, 佝偻病给儿童造成的影响较大, 其在早期缺乏有效的检测方式。而25 (OH) D3和BALP在佝偻病患儿的血液中的浓度及活性都有一定的改变, 临床可结合症状及其他辅助检查方式在早期对该病进行诊断, 从而提高儿童的生活治疗。

参考文献

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骨特异性碱性磷酸酶 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料:

选取2010年9月至2013年9月我院收治的150例佝偻病患儿作为研究对象。所有患儿均经常规体检和询问疾病史及家族史确诊, 排除其他骨代谢病引起的骨密度下降或骨碱性磷酸酶水平异常以及合并其他急性疾病者。其中男性患儿97例, 女性患儿53例, 患儿年龄为45 d~6岁, 平均年龄为 (3.38±1.17) 岁。

1.2 方法:

使用Sunlight Omnisense 7000/8000超声骨强度仪检测骨密度, <2岁者测定左胫骨中段传播速度, >2岁者测定左桡骨末梢1/3处左胫骨中段传播速度;所有患儿均由同一组检验员采用亲和渗滤法检测患儿外周血骨碱性磷酸酶水平。

1.3 观察指标:

观察不同年龄段患儿骨密度和骨碱性磷酸酶检测结果, 比较两种检测结果是否相符。骨密度界定标准:≥75%为骨密度正常, 25%~75%为预防水平, ≤25%为骨密度异常。骨碱性磷酸酶水平界定标准:≤200 U/L为骨碱性磷酸酶正常, 200~250 U/L为预防水平, ≥250 U/L为骨碱性磷酸酶异常[3]。

1.4 统计学分析:

使用SPSS17.0统计分析, 用 (±s) 表示计量资料, 采用t检验, 用百分比表示计数资料, 采用χ2检验, P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨碱性磷酸酶和骨密度检测结果:

所有患儿骨碱性磷酸酶和骨密度检测不同年龄分布结果见表1。<1岁患儿骨密度异常和骨碱性磷酸酶异常均检出率最高, 与其他年龄段比较, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。

2.2 骨碱性磷酸酶检测结果与骨密度检测结果相符情况:

见表2。两种检测结果相符度不高, 骨密度检测异常率高于骨碱性磷酸酶。

3 讨论

骨碱性磷酸酶由骨细胞合成, 活性受小儿体内维生素D水平影响, 佝偻病患儿缺乏维生素D导致骨钙化不足时, 成骨细胞活跃度增加导致骨碱性磷酸酶活性增强, 其活性特异性影响与骨密度检测的符合率。临床研究表明, 骨碱性磷酸酶在佝偻病诊断中有较高敏感性, 但特异性不高[4], 与本研究结果相似。分析原因主要为骨碱性磷酸酶活性不仅受患儿体内维生素D水平影响, 也受到其他多种因素影响, 如锌元素水平。骨碱性磷酸酶是含锌酶, 锌元素缺乏可导致骨碱性磷酸酶基因转录发生抑制, 同时也可导致骨矿化障碍。本研究中<1岁患儿骨碱性磷酸酶与骨密度检测符合率最高可能与这一年龄段患儿较少发生缺锌有关。

另外, 影响骨密度的相关因素, 也会影响骨碱性磷酸酶与骨密度检测符合率。骨密度超声检测时测量沿骨骼传播的超声波波速, 检测结果与骨矿含量及质量呈正相关。临床研究表明维生素D及小儿体内钙、磷营养情况是影响小儿骨密度的主要因素, 锌、铁、硒、铅等元素也可对骨密度产生影响[5]。当患儿缺乏锌、铁、硒元素或铅元素偏高时骨密度检测结果下降, 而骨碱性磷酸酶检测结果不受影响, 从而导致二者检测结果不符。此外, 由于骨碱性磷酸酶活性特异性, 患儿缺乏维生素D时骨代谢首先发生的是成骨细胞活跃度增加, 而后才是骨结构改变, 因此先发生骨碱性磷酸酶活性升高, 后发生骨密度改变, 因此佝偻病早期可出现碱性磷酸酶与骨密度检测不符的情况[6,7,8,9,10]。本研究中大概有10%的患儿处于这一时期。

总之, 骨碱性磷酸酶与超声骨密度均为诊断婴幼儿佝偻病的重要指标, 但二者可出现不相符的情况, 需进分析影响因素, 可进一步进行血铅及其他微量元素测定, 以免漏诊或造成佝偻病过度治疗。

参考文献

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骨特异性碱性磷酸酶 篇7

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级新生SD乳大鼠,1日龄,购自南方医科大学动物实验中心,动物许可证号:SYXK(粤)2010-0106。

1.2 药品与试剂

阿魏酸:中国药品生物制品检定所。DMEM培养基:Gibco公司;胎牛血清:杭州四季青生物公司;Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶:Sigma公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO):南京建成生物工程研究所;碱性磷酸酶试剂盒:南京建成生物工程研究所;RT反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、总RNA提取试剂盒:MBI公司产品;骨活素(OA)mRNA聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂:富酶泰斯生物技术有限公司产品;骨保护素(OPG)逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)试剂盒:Fermentas公司。

1.3 实验仪器

超净工作台:北京半导体设备厂;BB16BB5060型CO2培养箱:德国Heraus公司;倒置显微镜:日本Olympus;96孔培养板:美国Costar公司;3K30高速冷冻离心机:Sigma公司;紫外分光光度计:德国Eppendorf公司产品;DYY-III-7B稳压稳流型电泳仪:北京六一仪器厂;定量PCR仪:美国ABI公司;BIO-RAD 680伯乐酶标仪:美国伯乐公司。

1.4 方法

1.4.1 成骨细胞的原代培养

取24 h内新生SD大鼠,75%乙醇浸泡消毒5 min。无菌取出颅骨,置于PBS液中,彻底清除结缔组织和血管,PBS清洗2次,再将骨块剪碎至肉糜状。用0.25%胰蛋白酶37℃预消化15~20 min,去除消化液以清除成纤维细胞,再用10倍体积的0.1%Ⅱ型胶原酶和0.1%透明质酸酶37℃恒温振荡消化,每次30 min,取第3、4、5、6次消化的细胞悬液,300 r/min离心10 min,弃上清,沉淀的细胞用不含血清的DMEM培养液洗涤离心1次,最后用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬,吹打均匀后以1×105·m L-1接种到培养瓶中,培养瓶置37℃5%CO2培养箱培养,隔日换液,以后每3 d换液1次,细胞融合后,用0.25%胰蛋白酶消化,传代倒置显微镜下观察成骨细胞形态。

1.4.2 阿魏酸对体外培养成骨细胞增殖的影响

取第3次代细胞,以5×104·m L-1细胞接种于96孔培养板中,随机分为组空白组(0μg/L)、阿魏酸高剂量组(200μg/L)、阿魏酸中剂量组(20μg/L)、阿魏酸低剂量组(2μg/L),24孔每组,每d更换新的含药培养基1次,分别在加药后第1、2、3、4、5、6 d每组各取4个复孔,加入5 g/L 20μL的MTT,37℃孵育4 h,将孔中液体吸弃然后加入150μL二甲基亚砜(DMSO),置震荡器上震荡10 min,酶标仪570 nm波长处检测吸光度(OD)值。

1.4.3 阿魏酸对体外培养细胞上清液ALP活性、OPG和OA mRNA表达的影响

取第3次代细胞,以5×104·m L-1细胞接种于48孔培养板中,随机分为空白组(0μg/L)、阿魏酸高剂量组(200μg/L)、阿魏酸中剂量组(20μg/L)、阿魏酸低剂量组(2μg/L),每组24孔,然后每瓶分别加入不同浓度0(空白对照)、2、20、200μg/L阿魏酸的条件培养液,每浓度8孔。每d更换新培养基1次,分别在加药第6 d每组各取16个复孔,取上清液ELISA法测定ALP活性。剩余细胞提取总RNA后RT-PCR测定成骨细胞OPG mRNA和OA mRNA的表达,扩增产物凝胶电泳后摄片,然后进行光密度扫描,并以吸光度的比值表示。

1.4.4 统计学方法

计量资料以均值±标准差(±s)表示,多组间均数的比较采用单因素方差分析,若方差齐,组间均值两两比较采用SNK法,若方差不齐,组间均值两两比较采用Dunnett T3法,均由SPSS15.0进行统计;α=0.05。

2 结果

2.1 阿魏酸对大鼠成骨细胞体外增殖的影响

见表1。

由表1可知,体外培养的大鼠成骨细胞1~6 d内呈“S”型曲线增殖,阿魏酸高、中、低3个剂量组均可明显促进成骨细胞的增殖。与空白组相比,除阿魏酸低剂量组给药后第1d细胞吸光度均值与空白组无显著性差异(P>0.05)外,中、高剂量组药后第1 d细胞吸光度均显著增加(P<0.05,0.01),阿魏酸高、中、低剂量组药后2~6 d细胞吸光度均有显著性增加(P<0.01)。

与空白组比较*P<0.05,**P<0.01

2.2 阿魏酸对成骨细胞碱性磷酸酶活性、OPG和OAmRNA表达的影响

见表2。

由表2可知,与空白组比较,阿魏酸高、中、低3剂量组均可不同程度增强体外培养大鼠成骨细胞的ALP活性,促进OPG和OA mRNA的表达(P<0.05)。

与空白组比较*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

成骨细胞位于骨组织表面,由间叶质干细胞分化而来,是骨新生以及损伤后修复重建过程中骨生成的唯一效应细胞,可产生胶原、非胶原性骨基质蛋白(如骨钙素等)和细胞因子如骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)等,还可以通过线粒体将钙和敷料运送到钙化部位,促进钙化发生,是参与骨代谢的主要细胞[4]。ALP是主要分布于细胞膜的钙结合转运蛋白,可促进细胞成熟、钙化[5],是成骨细胞早期和中期分化的标志物。成骨细胞不仅参与骨形成,而且通过产生核因子κB受体激动剂配体(ligand of receptor-activator of nuclear factor-kappa B,RANKL)、骨保护素(OPG)等多种信号分子,其中OPG通过与RANKL结合,竞争性抑制了RANKL与破骨前体细胞膜上核因子κB受体活化因子(receptor-activator of nuclear factor-kappa B,RANK)分子的结合,抑制破骨细胞的分化、成熟,阻止骨吸收[6],骨细胞树突表达的膜结合的RANKL和破骨前体细胞表达的RANK的直接接触被认为是破骨细胞分化所需要的[7]。骨活素(OA)mRNA和蛋白表达于成骨细胞[8],是成骨细胞的分化所必需,可诱导成骨细胞生长及破骨细胞分化[9],OA表达增加可促进颅骨缺损模型大鼠的骨再生[10]和骨折愈合[11],OA下调则可降低成骨细胞分化和功能[12]。体外培养成骨细胞在骨代谢研究中的作用非常重要,常用于研究骨代谢机制及药物筛选[13]。

阿魏酸钠是我国自行研发的一类新的啡肽类内皮素受体拮抗剂,普遍存在于当归、川芎、蜂胶、酸枣仁等中药中[14]。本研究证实阿魏酸可促进体外培养大鼠成骨细胞的增殖,增强成骨细胞ALP活性,并诱导OPG mRNA和OAmRNA的表达,提示阿魏酸能通过促进成骨细胞增殖与分化,并刺激成骨细胞骨代谢,促进骨蛋白质合成和钙沉积,促进骨形成。这与阿魏酸钠关节腔注射可促进关节炎模型大鼠退变软骨修复[15],以及与成骨诱导剂合用促进骨髓基质干细胞的成骨分化与增殖、提高骨髓基质干细胞ALP活性和细胞内骨钙素含量[16]的结果相符,也有研究证实阿魏酸可作用于成骨细胞和破骨细胞的骨吸收阶段,增加去卵巢骨质疏松大鼠的骨密度和ALP活性,促进骨生成和骨重塑[17]。