特异性抗体

特异性抗体（精选8篇）

特异性抗体 篇1

目前，检测特异性抗体IgE是对过敏原进行筛选的主要方法，但同时过敏原特异性抗体IgG也可以介导Ⅰ型变态反应，IgG在介导吸入物过敏反应时，又通过竞争机制阻断IgE介导的Ⅰ型变态反应，因此对IgG的检测也越来越受到重视[1]。但究竟是哪种作用占据主导作用则需要更多的研究与调查。本文检测了一些过敏性疾病患者血清中的特异性IgE和IgG抗体，报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取我院皮肤科为研究点，收集于2010年9月至2012年2月内入院的患者，并且选取经过临床诊断确定为过敏性疾病的252例患者的血清样本，其中男性占108例，女性占144例，年龄分布于5～69岁，平均年龄为 (37.4±5) 岁，病程最短为2h，最长的有27年。

1.2 检测方法

检测试剂盒是由美国BIOMERICA公司所生产的。采用间接酶联免疫吸附法（ELISA）检测研究对象血清中所包含的14种最常见的过敏原（包括8种食物过敏原以及6种吸入物过敏原）的特异性抗体IgE和IgG。在加入底物P指示剂半小时后观察，如血清样品中含有一种或多种过敏原抗体IgE，则会在管中相应反应部位出现特异性的紫色，即可判为阳性结果。若与两边隔离带的颜色一致，则为阴性。

根据酶标仪上得出的IgG吸光度值，输入计算程序中所设的表格，选好标准曲线，就可以得出血清样品中各种过敏原抗体IgG的浓度。而判定测试结果为阳性的重要依据为IgG4≥0.02pg/m L。

1.3 统计学方法

采用软件SPSS16.0对研究检测的结果进行分析，采用χ2检验进行检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 多种过敏原特异性抗体IgE和IgG的阳性检测统计结果见表1。

从表1结果显示，食物组过敏原特异性抗体IgG的阳性率比吸入物组的阳性率高，且P<0.05，具有统计学意义；食物过敏原特异性抗体IgE的阳性率与吸入物组之间的差异P>0.05，无统计学意义；食物过敏原与吸入物过敏原的特异性抗体IgE与IgG阳性率之间的差异没有统计学意义。同种食物过敏原特异性抗体IgE和IgG同时检出阳性，这两者P<0.05，故有统计学意义，

同时该研究结果也显示出，对于过敏性疾病患者，不论是食物过敏原或者是吸入物过敏原，它们的过敏原特异性抗体IgG都存在一定的阳性率。对于食物过敏原特异性抗体IgG，它的阳性率与过敏原特异性抗体IgE阳性率相比较，不存在显著的差异；但是对于吸入物过敏原特异性抗体lg G与IgE相比，则明显的升高了。

2.2 14种常见过敏原特异性抗体IgE和IgG阳性检测结果见表2。

根据上述数据，在这14种常见的过敏原中，引起特异性抗体IgG升高最多的两种食物是鸡蛋和小麦，而引起特异性抗体IgE升高最多的是虾。在吸入物过敏原中，我们发现粉尘螨和屋尘螨能同时引起特异性抗体IgE与IgG的升高。

检测数据显示鸡蛋、小麦、梧桐、白桦等IgG的阳性率远比IgE的阳性率高；而蟹、鳕鱼及短豚草等的检测结果则呈相反的趋势，IgE的阳性率显著高于IgG的阳性率，

3 讨论

过敏反应是一种特殊的病理性免疫反应，是人体对一种或多种原本无害的物质产生不正当的反应，其主要原因是患者吸入或食入含有过敏性物体刺激机体，触发细胞大量分泌药理活性物质，引起一系列过敏症状，同时产生相当量的E型免疫球蛋白（IgE）；机体免疫系统把食入的某种或多种食物当成有害物质，从而针对这些物质产生过度的保护性免疫反应，产生食物特异性IgG抗体。特异性IgG抗体与食物颗粒形成免疫复合物，可引起所有组织 (包括血管) 发生炎性反应，表现为全身各系统的症状与疾病。引起人类过敏反应的过敏原种类繁多，如能从中查出引起机体过敏的物质，就能很好地预防和治疗过敏反应。在对同一患者血清的检测中发现，血清中不仅能够检出多种过敏原特异性抗体IgE，同时也能检测出多种特异性抗体IgG，又由食物过敏原较吸入物过敏原更容易导致IgE与IgG阳性率的升高。根据以上信息，我们可以推测IgE与IgG也存在迟发过程，当然我们也不能排除所选择研究对象中存在的客观因素。

至今为止诊断变态反应的主要指标是通过对特异性抗体IgE的检测[2]，同时这也是对过敏原进行筛选的主要方法，而过敏原特异性抗体IgG也可能介导I型变态反应，过敏原特异性抗体IgG在介导吸入物过敏反应的同时，又能通过竞争机制来阻断过敏原特异性抗体IgE介导的I型变态反应[3,4]，因此对过敏原的特异性抗体IgG检测的重视程度也正在逐渐加深，但是到目前为止，究竟是何种作用占据了主导作用仍然需要进一步的研究调查。因此，对特异性抗体IgE和IgG进行联合诊断对过敏性疾病的治疗[5,6]，尤其是食物过敏原具有很高的临床意义[7,8]。这也说明了将食物过敏原与吸入物过敏原检测结果相比较，可以发现前者更容易导致特异性抗体IgE和特异性抗体IgG的同时升高。

摘要：目的 探讨过敏性疾病患者的过敏原特异性抗体IgE和IgG的意义。方法 使用间接酶联免疫吸附法 (ELISA) 对研究对象血清中的最常见的过敏原抗体IgE和IgG进行检测分析。结果 通过研究检测可以统计到14种过敏原特异性抗体IgE和IgG的阳性率结果, 而且食物过敏原中检测出的IgG阳性率与IgG和IgE同时存在的阳性率比吸入物过敏原的高。结论 对特异性抗体IgE和IgG进行联合诊断对过敏性疾病的预防以及治疗, 尤其是针对食物过敏原, 可以更清楚地检测出究竟是哪种因素导致的过敏, 对患者能更有针对性的进行治疗, 具有很高的临床治疗意义。

关键词：过敏性疾病,酶联免疫吸附法,特异性抗体,IgE,IgG

参考文献

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特异性抗体 篇2

【关键词】 乙肝HBsAg疫苗 抗-HBs-IgG IgG1 IgG2a

Effect of Superhigh Dose hepatitis B surface antigen Vaccine on the specific antibody induced in mice

Liu Guangze,et al

【Abstract】 Objective:To study the safe and the specific immune responses of anti-HBs-IgG and subclass in mice, after serial Vaccted superhigh dosage of hepatitis B surface antigen.Methods:NIH mice were treated with 600μg.Kg-1.d-1 by hypodermic injection for 21d, then one monthlyconvalesent term. Anti-HBs-IgG and its subclass(IgG1、IgG2a) in mice serawere dectected by ELISA.Results:The superhigh dosage of hepatitis B surface antigen Vaccine still excited body product high levels of anti-HBs-IgG and Its IgG1 in 3th week and convalesent phase, but low levels of IgG2a Could not be deteeted untill Convalesent phase.Conclusion:The results shows that the superhigh dosage of hepatitis B surface antigen Vaccine is safe, may induced high leve specific IgG in 3th week and cell immunity in 8th week, the same with the high dosage Vaccine.

【Key words】 Hepatitis B surfade Vaccine anti-HBs-IgG IgG1 IgG2a

近年的研究表明,一些慢性乙型肝炎患者在接种含有HBsAg或其他HBV相关蛋白疫苗后可检测到特异性免疫反应,并取得抗病毒效果[1~4]。因此治疗性疫苗的研制为慢性乙肝治疗提供了一个新的研究方向。

目前对HBsAg疫苗诱导机体产生特异性抗体及亚类的研究已有些报道,但超高剂量HBsAg疫苗诱发机体产生IgG及其亚类抗HBs变化研究还是空白[5~6]。本研究是在对超高剂量(约为人临床拟用量600倍)HBsAg疫苗对小鼠进行长期毒性试验中观察(Ⅰ)协助检测HBsAg疫苗的安全性;(Ⅱ)诱发小鼠产生IgG及其亚型抗HBs水平。

1 材料与方法

1.1 试验材料。HBsAg疫苗由深圳康泰股份有限公司制备,批号:T010702,每支1ml,乙肝疫苗60μg。临用前用铝稀释剂稀释,配成所需的注射溶液。

1.2 小鼠来源、分组及血清采集。SPF级NIH小鼠,雌雄兼半,体重为18~24g,由广州中医药大学实验动物中心提供。实验分为给药组和对照组,给药剂量为600μg/kg(约为人临床拟用量的600倍数),每天给药一次,连续21天,皮下注射,0.2ml/只,对照组注射等体积铝稀释剂,每组10只,于给药3周和末次免疫后一个月后分别从小鼠眼静脉取血,分离血清保存于-20℃待测。

1.3 IgG及IgG亚类抗HBs检测。

抗HBs ELISA检测试剂盒购自上海实业科华生物技术有限公司。HRP标记的羊抗小鼠IgG2a和IgG1为Serotec公司产品,作为第二抗体。

2 结果和小结

2.1 实验小鼠诱生抗HBs的动态。连续给予超高剂量治疗性HBsAg疫苗,3周可诱导全部小鼠产生高水平的抗HBs,末次免疫后一个月,小鼠血清中抗HBsIgG仍保持高水平并有增高趋势(见表Ⅰ),表明超高剂量HBsAg疫苗仍可刺激机体产生高水平特异性抗体,未产生毒性或耐受作用。

表 Ⅰ 超高剂量疫苗诱生小鼠产生抗HBsIgG的结果(x±s)

2.2 特异性IgG亚类抗HBs的变化。结果表明连续给予超高剂量HBsAg疫苗3周时诱导抗体产生抗HBs的IgG的亚类主要为IgG1,产生IgG2a阳性率仅为10%,且滴度很低,到末次免疫一个月后IgG2a类抗HBs水平才有显著增高,阳性率可达到90%,但与IgG1 OD值相比低8倍多。IgG1类抗HBs仍保持高水平,与3周时滴度水平无显著差异(见表Ⅱ),这表明超高剂量HBsAg疫苗对诱导机体产生IgG2a类抗HBs在水平和时间上与高剂量HBsAg疫苗规律基本一致。

表 Ⅱ IgG亚类抗HBs分布情况(x±s)

3 讨 论

本研究对小鼠抗-HBs-IgG及其亚类的测定表明超高剂量乙肝疫苗对小鼠机体免疫无毒性作用,仍可刺激机体产生高水平抗-HBs-IgG1,这一研究填补高剂量治疗性乙肝疫苗诱导机体免疫系统研究的空白,丰富了治疗性乙肝疫苗的研究内容。

目前对治疗性乙肝疫苗对慢性乙型肝炎的治疗作用机制尚未阐明,可能是通过改变增强抗原提呈的方式,诱生淋巴因子和细胞因子来刺激T细胞反应,主要产生特异性CTL而产生治疗效应,Cocillin等[1]对GenHerac B疫苗接种的CHB患者中,抗原特异性PBMC增殖反应率明显高于对照组,41.2%的患者发生强而持久的细胞免疫反应。本课题组用治疗剂量乙肝疫苗对小鼠试验,通过T淋巴试验,特异性CTL试验细胞因子IL-2、IFN-γ及抗-HBs-IgG2a检测,都表明治疗性乙肝疫苗可显著增强机体细胞免疫[7]。治疗性蛋白疫苗和DNA疫苗不同已往预防疫苗的重要区别于其可显著提高了机体细胞免疫,特别是特异性CTL免疫,打破免疫耐受,而达到治疗CHB作用[8~9]。

近十年来对鼠和人研究表明,细胞因子是IgG亚类反应的主要调控因素。在小鼠中,Th1主要分泌IL-1和IFN-γ,促进IgG2a亚类的产生,诱导细胞免疫和激活T杀伤性细胞,而Th2则分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10,促进IgG1亚类的合成与变态反应有关,因此在免疫和疾病中检测IgG亚类变化,可以监测机体抗体变化及免疫反应类型的变化[10~11]。蛋白疫苗和DNA疫苗一些研究已表明,注射治疗性疫苗可刺激抗体产生的IgG2a为主的免疫反应(即Th1型为主),但在本研究中,实验结果表明超高剂量治疗性乙肝疫苗可刺激抗体产生高水平IgG1为主的免疫反应(即Th2型),并持续时间较长,而IgG2a的产生水平很低,出现时间较迟,这表明超高剂量治疗性乙肝疫苗虽对机体免疫系统无毒性作用,可产生高水平抗-HBs-IgG1,但对细胞免疫反应有一定抑制作用,而表现出抗-HBs-IgG2a水平很低,出现较迟。IgG2a与IgG1 OD值差约8倍。从一般免疫理论来说,大剂量蛋白抗原的反复刺激容易诱导特异性T淋巴细胞耐受,抑制免疫反应,而大量的多糖类抗原可以诱导特异性B细胞耐受,从而抑制抗体的产生[12]。本研究结果与上述免疫应答的调节理论相一致。

上述试验结果表明超高剂量HBsAg疫苗对机体不仅无毒性作用,且可诱导机体产生高水平IgG及IgG1类抗HBs,在晚期也诱生细胞免疫相关的IgG2类抗HBs,可能与免疫时间较短有关,从而更加证实我们拟用 60μg/人次高剂量HBsAg作为免疫调解剂应用临床具有很大的安全性。

鸣谢:本试验由广州医药工业研究所全国临床前药品安全性重点研究室具体实施,对本研究帮助表示感谢!

参考文献

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11 Kawano Y,et al.Regulation of human IgG subclass production by cytokines:human IgG subclass production enhanced differentially by interleukin-6 Immunology,1995;84:278~84

特异性抗体 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 重组质粒、细胞和试验动物

重组牛IFN-γ质粒, 东北农业大学李广兴教授惠赠;SP2/0细胞, 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所细菌病研究室保存;Balb/c小鼠, 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.1.2 试剂

二甲基联苯胺 (DAB) 、四甲基联苯胺 (TMB) , 购自上海华舜生物工程有限公司;Ni-NTA His Bind Purification Kit, 购自Novagen生物工程公司;聚乙二醇 (PEG3350) 、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 、辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的兔抗牛酶标二抗, 购自Sigma公司;HAT选择培养基、HT选择培养基、胎牛血清, 购自Gibco公司;DMEM, 购自Hyclone公司;HRP标记的羊抗鼠酶标二抗, 购自北京中杉金桥公司;鼠源McAb亚类试剂盒, Invitrogen公司产品。

1.2 方法

1.2.1 IFN-γ基因的表达及蛋白纯化

将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) , 生长至对数生长期时用IPTG诱导表达。IPTG终浓度为1.0 mmol/L, 诱导时间为6 h。参照参考文献[1]对重组蛋白的表达与纯度进行鉴定。溶解蛋白进一步用Ni-NTA His Bind Purification Kit纯化。

1.2.2 免疫动物

制备rBovIFN-γ融合蛋白, 并调整其浓度为2.4 μg/μL, 与弗氏完全佐剂以1∶1比例混合, 充分乳化后以每只注射100 μL的剂量免疫小鼠, 每隔2周再用弗氏不完全佐剂重组抗原以相同的剂量进行二免和三免, 三免后采血清100倍稀释后测定抗体效价, 选取效价高的小鼠再加强免疫。

1.2.3 细胞融合

加强免疫3 d后, 取小鼠眼球血液并分离血清作为阳性对照。取小鼠脾细胞按照参考文献[2]中的方法与SP2/0细胞进行融合。

1.2.4 筛选方法的建立

稀释rBovIFN-γ抗原至终浓度为5 μg/mL, 然后包被酶标板, 加入杂交瘤分泌上清液和HRP标记的羊抗鼠酶标二抗作用, 用四甲基联苯胺底物显色, 以450 nm单波长测定各孔OD值。

1.2.5 阳性孔的筛选及亚克隆

以与阴性对照孔OD值的比值 (P/N) 大于2.1作为判断阳性或确定效价的临界点。将阳性孔通过有限稀释法进行多次亚克隆后扩大培养, 建株冻存。

1.2.6 腹水的制备及效价测定

给小鼠腹腔注射灭菌石蜡油500 μL/只, 7～10 d后腹腔注射5×105～5×106个杂交瘤细胞, 再经7～10 d后抽取腹水, 离心, 取上清液加入50%甘油, -20 ℃冻存。

1.2.7 杂交瘤与其他蛋白的特异性反应

用rBovIFN-γ融合蛋白、胎儿弯杆菌表面蛋白 (rSapA-N) [2]、牛分枝杆菌rMPB64蛋白[3]及猪胸膜肺炎放线杆菌rOMP蛋白[4]分别包被酶标板, 进行ELISA检测 (步骤同1.2.4) , 检测5株单克隆抗体的特异性。

1.2.8 SDS-PAGE电泳和Western-blot分析

参照《分子克隆实验指南》用纯化的rBovIFN-γ融合蛋白进行SDS-PAGE, 再电转至NC膜上, 用5%脱脂乳封闭, 加入杂交瘤细胞培养上清液, 作用后加2 000倍稀释的HRP标记的山羊抗鼠IgG, 用DAB显色15 min观察结果。

1.2.9 单抗的亚类鉴定

按照Sigma公司的McAb亚类鉴定试剂盒说明书进行。

1.2.10 腹水效价的测定

采用间接ELISA法测定。在用rBovIFN-γ融合蛋白包被的酶标板内分别加入2倍比稀释的杂交瘤上清液和腹水, 其余步骤按照常规ELISA方法进行。

2 结果

2.1 单克隆抗体细胞株的建立及其稳定性测定结果

经3次亚克隆后, 最终获得5株能稳定分泌抗体的单克隆细胞株, 体外连续培养数代, 并经Balb/c小鼠体内传3代, 其分泌单克隆抗体的能力不变。将获得的5株单克隆抗体分别命名为A1C3、B1C5、D1F4、B2E6和C2H3。

2.2 单克隆抗体亚类的鉴定结果

经鉴定, 5株单克隆抗体均为IgG1型, 其轻链为κ链。

2.3 杂交瘤细胞上清液和腹水抗体效价的测定结果

采用间接ELISA法测定5株细胞株培养上清液及其腹水的抗体效价, 结果见表1。

2.4 单克隆抗体的Western-blot分析结果

5株单克隆抗体均能与rBovIFN-γ融合蛋白反应, 在转印膜上约25 ku处可见到反应条带, 而与其他蛋白无反应, 说明筛选得到的单克隆抗体可特异性地识别rBovIFN-γ融合蛋白 (见图1) 。

M.蛋白预染Marker;1～5.A1C3、B1C5、D1F4、B2E6和C2H3与BovIFN-γ蛋白的反应结果; 6～10.A1C3、B1C5、D1F4、B2E6 和C2H3与rSapA-N的反应结果。

2.5 杂交瘤细胞与其他蛋白的特异性反应结果 (见表2)

(OD值)

由表2可知, 5株单克隆抗体均能特异识别并结合rBovIFN-γ , 而与其他蛋白不产生交叉反应。

3 讨论

IFN-γ在抗感染、调节免疫功能等方面具有重要意义。Wood P R等[5]最先将抗原特异性IFN-γ试验用于牛结核病的检测。与传统检测相比, 抗原特异性IFN-γ试验简单、快速、灵敏、特异。基于抗原特异性的IFN-γ反应可用于评价机体特异性细胞免疫状态。特异性抗原刺激的外周血淋巴细胞IFN-γ体外释放试验已被广泛用于抗感染诊断。国外已有学者将基因rBovIFN-γ及其McAb用于牛病的研究, BovIFN-γ特异性抗原已被用于多种牛病的特异性检测, 尤以在牛结核病诊断中的应用最为广泛。

研究所得到的5株单克隆抗体特异性好, 效价高, 间接ELISA腹水效价可达1∶5×104以上。下一步将利用这5株单克隆抗体建立一种ELISA方法来检测牛结核病。

参考文献

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特异性抗体 篇4

研究人员对自身免疫性甲状腺疾病患者开展了一项2期研究以确定各种非器官特异性抗体的阳性率并试图阐明抗体和风湿性疾病事件之间的相关性。

研究人员对61例抗甲状腺抗体阳性的自身免疫性甲状腺疾病患者 (65.6%>18岁, 83.6%为女性) 和对照组61例年龄、性别相匹配的非自身免疫性甲状腺疾病的参与者[平均年龄 (27.0±14.9) 岁]数据进行了对比分析。

在病例对照研究的第1阶段, 研究人员对61例患者的抗核抗体 (ANA) 、抗双链DNA (ds DNA) 、类风湿因子 (RF) 、抗环瓜氨酸肽 (anti-CCP) 及抗核提取物抗体 (anti-ENA) 进行了测定。在2年的2期纵向临床随访期间, 研究人员对所有患者的自身免疫性疾病患病风险进行了评估。

自身免疫性甲状腺疾病组中, ANA的比例最高 (50.8%) , 其次为RF (34.4%) 、anti-ENA (21.3%) 和anti-CCP (19.7%) 。在2年的随访期间, 近1/3的患者 (32.8%) 出现一种风湿性疾病:45%为类风湿性关节炎、20%为系统性红斑狼疮 (SLE) 、10%为Sjgren综合征 (SS) , 其他25%为白塞氏病、纤维肌痛、混合性结缔组织病和Rhupus综合征。

研究人员同时发现, 与对照组相比, 自身免疫甲状腺疾病组患者抗体阳性率更高。此外, 风湿性疾病患者中绝大多数为女性 (85%) 且年龄>18岁及ANA抗体比例 (55%) 最高。

ANA (最常见的非器官特异性抗体) 可见于多种自身免疫性疾病, 包括系统性红斑狼疮、系统性硬化症、幼年特发性关节炎和自身免疫性肝炎。

本次前瞻性研究首次利用非器官特异性抗体来检测自身免疫性疾病患病风险。对比结果显示, 自身免疫性甲状腺疾病和anti-ds DNA阳性的患者风湿性疾病患病风险高2.45倍。

特异性抗体 篇5

关键词：哺乳动物细胞表面展示,全长抗体库,人源抗体,稳定展示

当前,基因工程抗体药物在全球范围内得到了广泛应用[1,2,3,4],在治疗心血管疾病、自身免疫疾病及肿瘤等领域发挥了重要作用。抗体库技术和抗体展示技术是应用于抗体药物制备的常用基础技术[5,6]。但传统的抗体库和抗体筛选技术仅能筛选Fab或scFv等小分子抗体,无法进行全长抗体的直接筛选。近几年出现的哺乳动物细胞表面展示技术[7,8,9]可用于全长抗体的筛选,已得到越来越多的重视。本课题组在前期研究中已经成功构建了可直接表达全长抗体的哺乳动物细胞表达载体pDGB4[7];在本研究中,我们以来自于HIV患者外周血淋巴细胞的RNA为模板,用RT-PCR扩增抗体基因,插入载体pDGB4构建了一个可在哺乳动物细胞表面展示全长抗体的基因库,并建立了可稳定表达全长抗体的哺乳动物细胞库,为筛选获得特异性抗HIV抗体奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司,质粒DNA中提试剂盒购自Invitrogen公司,逆转录(RT)酶、RT试剂盒和Taq DNA聚合酶购自Promega公司,DNA凝胶纯化回收试剂盒购自AXYGEN公司,限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Fermentas Life Sciences公司。大肠杆菌TOPO-10由本实验室保存。细胞转染试剂由香港Dgen公司提供。含有Flp-in定点整合位点的中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary)细胞(FCHO细胞)和可表达Flp-in定点整合催化酶的载体pOG44购自Invitrogen公司。荧光标记的抗体购自BD Pharmingen公司。细胞培养用Hanm's-F12和血清购自Hyclon公司。潮霉素B溶液(Hygromycin B)购自展晨生物技术有限公司。

1.2 载体

哺乳动物细胞表达载体pDGB4由本课题组构建[7],其结构如图1所示。其中抗体重链基因表达结构包括CMV启动子、带有PDGFR跨膜序列(TM)的人抗体全长IgG1重链基因(HC-TM);抗体轻链基因表达结构包括CMV启动子、人抗体全长IgG1 Kappa型轻链基因(LC)。当同时使用BsmBI和SfiI对载体进行双酶切时,可用于插入抗体重链可变区基因和抗体轻链全长基因,构建可直接表达全长抗体的基因库。

1.3 方法

(1)总RNA的提取:HIV感染者为安徽既往献血员,未接受过抗病毒治疗,经中国疾控中心伦理委员会批准和患者知情同意后,于静脉采血,EDTA抗凝,并采用密度梯度离心法分离HIV患者的外周血淋巴细胞。按RNA提取试剂盒说明书提供的方法从外周血淋巴细胞中提取总RNA,用Nano Drop微量核酸蛋白定量仪测定总RNA的浓度。(2)抗体重链基因的PCR扩增:以约20ng总RNA为模板,用RT试剂盒逆转录合成抗体基因的cDNA第一链;RT产物直接用于cDNA的扩增。将课题组前期设计合成的26对重链引物分别按照所对应的抗体亚型的数量进行混合,获得三组重链引物(PH1、PH2、PH3)。PCR反应条件如下:94℃预变性5min;94℃变性30sec,55℃退火30s,72℃延伸1min,重复循环35次;最后以72℃延伸7min。用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物并测定其浓度,按实验需要可取少量电泳回收的PCR产物作为模板,按相同的PCR条件,再进行一次PCR扩增,以增加所获得的抗体基因的量。(3)构建全长抗体基因库:用BsmBI对载体pDGB4和扩增到的抗体重链基因分别进行酶切,随后按照本课题组前期建立的方法[10],用1%或2%的琼脂糖凝胶电泳分离纯化目的片段。载体片段和重链基因片段按1∶1的比例混合,在16℃条件下连接过夜;然后取1μL连接产物,在电脉冲为25μF、电压为2.5kV、电阻为200Ω条件下,电击转化感受态大肠杆菌TOPO-10。将转化后的细菌涂于含有氨苄青霉素的LB平皿,37℃培养过夜,根据生长出的细菌克隆数量计算抗体库的库容量。收集平皿上所有的菌落,即为全长抗体基因库。(4)构建可稳定展示全长抗体的哺乳动物细胞库:在T-75细胞培养瓶中常规培养FCHO细胞,至对数生长期进行抗体库的转染。用质粒提试剂盒提取全长抗体库的质粒DNA,取4μg抗体库的质粒与36μg pOG44共同溶于2mL Hanm's-F12;将100μL转染试剂溶于2mL Hanm's-F12。上述两种液体在室温条件下放置2～3min后,将DNA溶液加入转染试剂溶液中,混合后室温放置20～30min。然后将此混合液加入T-75细胞培养瓶中,37℃继续培养。细胞经转染后24h,将细胞消化,按1∶4传代培养。转染后48h,将细胞的培养基更换为含有潮霉素B的细胞培养基,继续培养12～15d;将细胞回收,按1.3×107个/管的细胞浓度进行细胞冻存,即获得可稳定展示全长抗体的细胞库。(5)流式细胞仪检测全长抗体在FCHO细胞表面的展示:将细胞库中对数生长期的细胞用不含胰酶的消化液消化回收,与PE荧光标记的鼠抗人Kappa链抗体进行反应,每50μL反应体系中含有5×105个细胞和3μL荧光标记的抗体;反应混合物混匀后在冰上放置30min,用染色缓冲液(含2%FBS的1×PBS)洗涤细胞1次,然后将细胞重悬于400μL的染色缓冲液中,用流式细胞仪检测抗体在FCHO细胞表面的表达,采用FCS Express V3软件对流式细胞数据进行分析。

2 结果

2.1 抗体基因的PCR扩增

2.1.1 抗体重链可变区基因的初次PCR扩增

以总RNA为模板,分别使用三组重链引物(PH1、PH2、PH3)进行RT-PCR扩增。结果如图2,可见三组重链可变区基因的大小均为0.45kb;其中,用引物PH3扩增的产物较多、PH1扩增的产物较少、PH2扩展的产物最少。

图2重链可变区基因PCR扩增图M:Marker;1～4:PH1扩增产物;5～8:PH2扩增产物;9～12:PH3扩增产物

2.1.2 抗体重链可变区基因的二次PCR扩增

纯化回收初次PCR扩增的产物,将其作为模板,分别使用三组重链引物(PH1、PH2、PH3)进行二次PCR扩增。结果如图3,可见三组重链可变区基因的二次PCR产物的量均得以增加;经纯化回收时,由于PH2扩增产物的量仍较少,故只成功回收了PH1和PH3的PCR产物。

图3重链可变区基因二次PCR扩增图M:Marker;1～2:PH1扩增产物;3～4:PH2扩增产物;5～6:PH3扩增产物

2.2 载体及抗体基因的酶切

2.2.1 载体p DGB4的酶切

使用BsmBI对载体pDGB4进行酶切,随后进行凝胶电泳,纯化回收8.65kb的条带(图4)用于克隆抗体的重链可变区基因片段。

图4载体pDGB4经BsmBI酶切后的电泳图M:Marker;1～3:经BsmBI酶切的pDGB4

2.2.2 重链可变区基因的酶切

使用BsmBI对抗体的重链可变区基因进行酶切,随后进行凝胶电泳,纯化回收0.45kb的条带(图5)用于构建抗体基因库。

图5重链可变区基因经BsmBI酶切后的电泳图M:Marker;1～2:PH3扩增产物经BsmBI酶切;3～4:PH1扩增产物经BsmBI酶切

2.3 抗体基因库的构建

将酶切并纯化后的抗体重链可变区基因与载体pDGB4进行连接、转化,根据所生长的细菌克隆数量推算抗体库的库容量。其中,用PH1扩增产物所构建的抗体库的库容量为1.33×104,用PH3扩增产物所构建的抗体库的库容量为6.44×104;两库合用,相当于抗体库的库容量为7.77×104。

2.4 构建可稳定展示全长抗体的哺乳动物细胞库

提取抗体库的质粒DNA,稳定转染FCHO细胞,获得可稳定展示全长抗体的FCHO细胞库。随后,用流式细胞仪分析全长抗体在FCHO细胞表面的展示;可见,有67%的细胞表面可展示能够被检测到的抗体(图6C)。

A:未转染的FCHO细胞经PE标鼠抗人kappa链抗体染色;B:稳定转染抗体库的FCHO细胞,未染色;C:稳定转染抗体库的FCHO细胞经PE标鼠抗人kappa链抗体染色

3 讨论

当前,应用最为广泛、发展也较成熟的抗体库技术和抗体展示技术是噬菌体抗体库及噬菌体展示技术[5];但该技术无法用于全长抗体的直接筛选,且作为原核生物的噬菌体在表达真核蛋白的过程中存在不可预见的表达偏差。酵母展示技术是近年来发展起来的真核展示技术[11],其可表达经翻译后修饰的、接近天然状态的抗体分子;但酵母表面也仅能展示Fab或scFv等小分子抗体。经噬菌体展示或酵母展示所筛选到的小分子抗体需转换为全长抗体,再导入哺乳动物细胞中进行大量生产并纯化,从而进入后续的研究及临床使用[12]。但抗体转换过程通常费时、费力,成功率低,因此,需要开发一种可直接筛选全长抗体的技术。

哺乳动物细胞表面展示技术是一种可用于全长抗体的直接筛选的新技术[7,8,9],已得到越来越多的重视。本课题组在前期研究中已经成功构建了可直接表达全长抗体的哺乳动物细胞表达载体pDGB4[7];在本研究中,我们以来自于HIV患者外周血淋巴细胞的RNA为模板,用RT-PCR扩增抗体基因,插入载体pDGB4构建了一个可在哺乳动物细胞表面展示全长抗体的基因库,并建立了可稳定表达全长抗体的哺乳动物细胞库。

由于HIV患者的外周血淋巴细胞来源有限,故所获得的RNA较少,在进行PCR扩增过程中,仅成功扩增了抗体的重链可变区基因,未能获得抗体的轻链基因。由于抗体的特异性主要决定于抗体的重链,因此,我们利用所获得的抗体重链可变区基因与载体pDGB4中原有的轻链基因进行匹配,构建了可展示全长抗体的基因库;在后续筛选获得特异性的抗体后,可考虑将特异性抗体的重链基因信息与不同的轻链进行匹配,以提高抗体的亲和力。

特异性抗体 篇6

1 资料与方法

1.1 临床资料

2009年3月—2011年3月在我院门诊或住院患儿选取经消化道钡餐、胃镜、腹部B超等检查排除器质性疾病后确诊为再发性腹痛[3]患儿100例, 随机分成腹痛1组60例和腹痛2组40例。腹痛1组患儿中男28例, 女32例;年龄3～14岁, 平均年龄7.6岁;发作时合并头晕、头痛10例, 合并呕吐6例。腹痛2组患儿中男19例, 女21例;年龄3岁～14岁, 平均年龄7.3岁。对照组20例, 其中男10例, 女10例;年龄4～14岁, 平均年龄7.4岁。3组年龄、性别具有均衡性。

1.2 方法

抽取所有研究对象的静脉血清2～3ml, 分离血清, 进行食物过敏原特异性IgG抗体检测, 使用北京海奥基业生物技术有限公司提供的14种食物过敏原特异性IgG抗体, 这些抗体依次是:牛肉、鸡肉、鳕鱼、玉米、蟹、蛋清/蛋黄、蘑菇、牛奶、猪肉、大米、虾、大豆、西红柿和小麦 (生产商为美国Biomerica公司) 。采用ELISA法检测, 严格按试剂盒说明进行操作。食物过敏原特异性IgG抗体浓度分为4级:0级 (IgG 0～50U/ml) 为阴性, +1级 (IgG 50～100U/ml) 为轻度敏感, +2 级 (IgG100～200U/ml) 为中度敏感, +3级 (IgG>200U/ml) 为高度敏感。统计计数资料, 求每种食物过敏原特异性IgG抗体阳性数, 比较分析腹痛1、2组及对照组食物过敏原特异性IgG的阳性率是否有明显差异, 通过调整饮食结构, 分析避食对再发性腹痛的治疗效果。

1.3 治疗方法

腹痛1组根据检测结果进行膳食回避治疗, 如:牛奶食物特异性IgG抗体升高, 则饮食中回避牛奶及其制品, 如此类推;腹痛两组继续原饮食方案。两组对症治疗相同。

1.4 症状评分标准

依据食物过敏原特异性IgG测定结果, 进行膳食回避, 每周随访1次, 连续2周, 对患儿的症状进行评分:症状消失或明显改善[腹痛发作次数较治疗前减半和 (或) 疼痛程度明显减轻], 症状评分为0分;症状有改善[腹痛发作次数较治疗前减少1/3和 (或) 疼痛程度减轻]为1分;症状无改善或加重为3分, 视为无效。总有效率= (明显改善+有效) /总例数×100%。

1.5 统计学方法

计量资料采用$(\overline{x}\pm \text{s})$表示, 采用方差分析;计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

腹痛1组各种抗原的阳性例数依次为鸡蛋49例、牛奶41例、鳕鱼7例、大豆2例、鸡肉2例、玉米1例;总阳性率90%。1种食物过敏原特异性IgG升高者16例, 2种食物过敏原特异性IgG升高者30例, 3种食物过敏原特异性IgG升高者6例, 4种食物过敏原特异性IgG升高者2例。腹痛2组各种抗原的阳性例数依次为鸡蛋30例、牛奶29例、鳕鱼3例、玉米1例;总阳性率87.5%。1种食物过敏原特异性IgG升高者9例, 2种食物过敏原特异性IgG升高者23例, 3种食物过敏原特异性IgG升高者3例。对照组各种抗原的阳性例数依次为鸡蛋14例、牛奶14例, 鳕鱼2例, 玉米1例, 总阳性率85%。3组食物过敏原特异性IgG升高差异无统计学意义 (P>0.05) 。腹痛1组根据检验结果, 对相关食物进行回避治疗2周后复诊:症状消失或明显改善35例, 症状有改善9例, 症状无改善或加重16例, 总有效率73.33%;腹痛2组总有效率20%, 两组比较, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。

3 讨论

食物过敏是一种复杂的变态反应性疾病, 其发生是由于免疫系统将进人体内的某种或多种食物识别为有害物质, 从而针对这些物质产生过度的保护性免疫反应, 产生食物抗原特异性IgG抗体。IgG抗体与食物颗粒形成免疫复合物, 可能引起组织炎症反应, 可表现为全身各器官或系统的症状和疾病, 涉及消化系统、呼吸系统、皮肤、心血管系统等。食物过敏如发生于胃肠道, 可累及从口腔至肛门的所有消化器官, 常见症状为腹胀、消化不良、腹泻、腹痛等, 病情迁延, 常因缺乏有效检测方法而延误诊断[4,5]。目前研究证实, 许多因诊断不明而被归类为“功能性”的疾病实际系由食物过敏所致[6,7]。本研究结果显示:腹痛1、2组儿童患儿血清中鸡蛋、牛奶、鳕鱼、大豆、玉米、鸡肉抗原特异性IgG水平显著升高, 腹痛1组患儿通过针对性膳食回避治疗, 总有效率73.33%, 而腹痛2组总有效率仅20%, 2组比较差异明显, 说明膳食回避治疗再发性腹痛患儿有明显效果, 避免再发性腹痛患儿过多应用不必要的药物治疗, 提示食物不耐受可能为再发性腹痛原因之一, 食物过敏可能参与了儿童再发性腹痛的发病机制, 因此反复慢性功能性腹痛患儿有必要进行血清食物不耐受特异性IgG抗体测定并进行膳食回避治疗。

本研究结果显示, 对照组儿童食物过敏原特异性IgG升高总阳性率与腹痛1、2组总阳性率比较无差异。但对照组儿童无慢性消化系统疾病, 考虑功能性再发性腹痛小儿的痛觉阈值较正常人低, 故对疼痛刺激的敏感性高有关[8]。

摘要：目的 探讨儿童再发性腹痛与食物过敏原特异性IgG的关系, 指导其临床防治。方法 选取2009年3月—2011年3月在佛山市第一人民医院儿科住院或门诊治疗的再发性腹痛患儿, 经消化道钡餐、胃镜、腹部B超未发现器质性病变的患儿100例, 随机分成腹痛1组和腹痛2组, 分别60例和40例;同时选择20例健康体检者作为对照组。应用酶联免疫法检测血清中14种食物特异性IgG水平。结果 腹痛1组食物过敏原特异性IgG抗体阳性54例, 占90%, 其中蛋清/蛋黄49例、牛奶41例;腹痛2组食物过敏原特异性IgG抗体阳性35例, 占87.5%, 其中蛋清/蛋黄30例、牛奶29例;对照组食物过敏原特异性IgG抗体阳性17例, 其中蛋清/蛋黄15例, 牛奶14例。3组比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。腹痛1组根据检验结果, 对相关食物进行回避治疗2周后, 症状消失或明显改善35例, 症状有改善9例, 症状无改善或加重16例, 总有效率73.33%;腹痛2组总有效率20%, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。结论 食物不耐受可能是再发性腹痛的原因之一, 再发性腹痛患儿有必要进行血清食物过敏原特异性IgG抗体检测, 并进行食物回避治疗。

关键词：腹痛,食物不耐受,儿童

参考文献

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特异性抗体 篇7

急性脑膜炎/脑炎症候群 (AMES) 是一组严重危害人类健康、引起急性中枢神经系统损害的感染性疾病。起病急, 病程凶险, 病死率高, 常留有严重后遗症, 多发生于<15岁儿童。引起AMES的病原种类繁多, 以病毒性感染最为常见, 约有100余种[1、2]。临床上多根据病史、临床症状与体征及相关辅助检查作出诊断, 缺乏准确的实验室病原学检测依据, 易于误诊或漏诊, 给社会和病人家庭带来很大的疾病负担。自2006年9月起, 济南市建立AMES病例监测系统, 选取辖区内省、市、县级医院各2所作为哨点监测医院开展AMES病例监测, 以了解AMES病例感染的流行特征和病原构成, 以便为疾病防控和临床诊治提供依据。现将2010-2011年AMES病例相关病毒Ig M抗体检测结果进行分析。

1 材料与方法

1.1 对象

按照AMES监测方案选取符合监测病例定义者作为AMES监测病例。选取济南市辖区内省、市、县级医院各2所作为哨点监测医院, 收集2010-2011年AMES病例血清和脑脊液标本。

1.2 方法

采用酶联免疫吸附试验检测相关病毒特异性Ig M抗体。根据监测方案要求, 对所有病例的血清和脑脊液标本进行乙型脑炎病毒 (JEV) Ig M抗体检测, 所用试剂盒为上海贝西公司生产。JEV-Ig M抗体阴性的血清标本, 再采用德国维润公司试剂盒检测人类肠道病毒 (HEV) 、单纯疱疹病毒 (HSV) 和流行性腮腺炎病毒 (Mu V) Ig M抗体。以上试剂盒均在有效期内使用, 严格按试剂盒说明书进行操作。

1.3 资料录入与分析

将病例相关信息及实验室检测结果等数据录入Epi Data数据库, 并应用Epi Info2003和Excel 2003软件对数据进行分析。率的比较采用χ2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AMES病例标本检测情况

2010-2011年共检测1 132例病例标本, 男性742例, 女性390例, 男女比例为1.9∶1。济南本地病例562例, 占病例总数的49.56%;外地病例570例, 占病例总数的50.35%。其中血清标本957份, 脑脊液标本766份。病例年龄最小2月龄, 最大86岁, 69.52% (787/1 132) 的病例<15岁。采集的标本全部进行JEV-Ig M抗体检测, 对JEV-Ig M抗体阴性血清标本844份进行相关病毒 (HEV、HSV和Mu V) 特异性抗体检测。

2.2 实验室检测结果

2.2.1 AMES病例JEV-Ig M抗体检测结果

2010-2011年共收集1 132例病例的血清和脑脊液标本, 其中血清标本957份, 脑脊液标本766份, 血清和脑脊液标本抗体阳性检出率分别为11.81% (113/957) 和10.18% (78/766) , 血清、脑脊液双阳性者42份。而血清标本JEV-Ig M抗体阳性病例, 男、女性别比为1.57∶1 (69/44) ;<15岁与≥15岁病例分别占65.49% (74/113) 和34.51% (39/113) , 差异无统计学意义 (χ2=0.04, P>0.05) 。

2.2.2 JEV-Ig M抗体阴性AMES病例相关病毒抗体检测情况

对1 132例AMES病例中的844份JEV-Ig M抗体阴性血清标本进行相关病毒特异性Ig M抗体检测, HEV、HSV和Mu V阳性率分别为22.51% (190/844) 、17.18% (145/844) 和11.37% (96/844) , 其中108例为2种以上病毒合并感染。

2.2.3 HEV、HSV和Mu V特异性Ig M抗体阳性AMES病例的流行特征

2.2.3. 1 地区分布

共检测病例844例, 济南本地病例421例, 占病例总数的49.88%;外地病例423例, 占病例总数的50.12%。2010-2011年HEV、HSV和Mu V阳性感染率经统计学分析, HEV、HSV阳性感染率本地明显高于外地, 差异有统计学意义 (HEVχ2=6.81, P<0.05;HSVχ2=9.71, P<0.05) ;Mu V阳性感染率本地与外地病例之间差异无统计学意义 (χ2=2.88, P>0.05) 。2010-2011年HEV、HSV和Mu V感染所致AMES病例构成比见表1。

2.2.3. 2 月份分布

HEV、HSV和Mu V Ig M阳性病例全年均有发生, 发病以4-10月为主, 5-9月的发病数占病例总数的66.47%, 其中HEV、HSV和Mu V感染高峰分别为5-9月、4-10月和5-9月。HEV和HSV在7-9月病例较多, Mu V在5月、9月呈现两个发病小高峰。

2.2.3. 3 性别及年龄分布

HEV、HSV和Mu V Ig M阳性病例中, 男性均多于女性, 男、女性别比分别为2.22∶1 (131/59) 、1.74∶1 (92/53) 和2∶1 (64/32) , 男女阳性发病差异无统计学意义 (HEVχ2=1.36, P>0.05;HSVχ2=0.30, P>0.05;Mu Vχ2=0.08, P>0.05) 。HEV、HSV和Mu V Ig M阳性病例, 年龄在0~74岁之间, <15岁病例居多, <10岁病例分别占86.84%、71.04%和63.54%, <15岁病例与≥15岁病例间阳性发病构成差异有统计学意义 (HEVχ2=5.22, P<0.05;HSVχ2=5.67, P<0.05) 。

3 讨论

调查结果显示, HEV、HSV、Mu V和JEV是2010-2011年济南市报告的AMES监测病例的主要病原, 标本检测的阳性率分别是22.51%、17.18%、11.37%和11.81%, 这与国内其他省市研究基本一致[3,4,5], 与山东省先前报道的结果一致[6、7]。HEV和HSV Ig M阳性率2010年明显高于2011年, 阳性病例本地明显高于外地, 这可能与地理环境、气候等各种因素的影响, 在不同地区以及不同监测年代主要病原有所不同有关[8、9]。部分病例还存在2种及以上病毒合并感染现象[3、6]。全年均有发生, 发病以4-10月为主, HEV、HSV发病高峰集中在6-9月, Mu V发病则在5月、9月呈现两个小高峰。阳性病例中, 男性均多于女性。HEV、HSV、Mu V和JEV Ig M阳性病例均以<15岁儿童为主, 86.84%的HEV感染所致的AMES病例发生于<10岁儿童, 进一步证实AMES主要危害低龄人群[1、2], 并支持HEV是小儿中枢神经系统感染常见病原的观点[10]。HEV、HSV阳性发病<15岁与≥15岁病例间阳性发病构成有差异, Mu V阳性发病<15岁与≥15岁病例间阳性发病构成无差异。

HSV感染所致AMES病例在5月及9月出现发病高峰, 与既往研究发现的HSV引起的脑炎发病率在夏季较高的结果一致[7]。Mu V和JEV的Ig M阳性病例中, ≥15岁病例所占比重较大, 提示近年来随着儿童免疫预防的实施, 发病年龄有向大年龄推移的现象[11]。

急性脑膜炎/脑炎症候群是由细菌、病毒和真菌等多种生物病原体感染引起的以中枢神经系统损害为主的疾病, 主要引起病人脑实质受损, 导致瘫痪、痴呆等疾患, 其预后取决于早期诊断和早期治疗[3]。通过建立急性脑膜炎/脑炎症候群监测可以高效捕获疑似病例, 从实验室诊断及流行病学分析, 摸清本地病原谱构成及流行特征, 及时进行多病原检测, 早期提供实验室诊断, 为临床正确治疗和疾病防控提供可靠依据。在病例个体上可以改善预后, 群体上能达到症候群预警的效果。鉴于AMES病例所带来的疾病负担, 今后应加强AMES病例的监测, 特别是实验室病原学诊断。

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特异性抗体 篇8

关键词：血小板特异性抗体,特发性血小板减少性紫癜,检测,价值

特发性血小板减少性紫癜 (ITP) , 又称之为免疫性血小板减少性紫癜, 属于临床上的一种比较常见的出血性疾病, 发病与免疫功能异常密切相关。患者机体免疫系统异常诱发产生抗血小板抗体, 破坏血小板, 减少血小板。而对于血小板抗体的检测, 在诊断特发性血小板减少性紫癜上具有重要的临床价值。本研究纳入60例患者, 探讨通过检测抗血小板膜糖蛋白 (GP) 特异性自身抗体及血小板相关抗体 (PAIg) 。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年10月~2013年10月我院收治的特发性血小板减少性紫癜患者30例, 均符合ITP诊断标准。其中男性14例, 女性16例;年龄15~76 (38.7±2.1) 岁。同期非免疫性血小板减少症患者30例。其中男19例, 女11例;年龄14~78 (39.3±2.3) 岁。对患者静脉缺血时, 血小板计数低于100×109/L, 且近30d未曾接受血小板输注。两组患者在性别、年龄及临床症状上比较无显著差异 (P>0.05) , 存在可比性。

1.2 仪器与试剂

血小板膜糖蛋白GPIIb单抗 (SZ-22) 采用苏州医科大学附属研究院血液研究所研制, 血小板膜糖蛋白GPIb/IX单抗 (SZ-1) 也由该研究所提供, 而羊抗鼠Ig G (H+L) 免疫球蛋白为美国SIGMA公司生产的产品[1]。

1.3 方法

1.3.1 测定GP抗体采用MAIPA法

多孔板抗体包被:浓度3ug/ml的羊抗鼠Ig G包被100ug/孔, 储存于温度4℃冰箱内过夜, 并0.05%吐温-tris缓冲液作为洗脱液, 洗涤3次, 封闭采用2%的牛血清蛋白备用;单抗俘获:缓冲液为0.5%的PBS, 将单克隆抗体GPIb/IX、GPIIIa/GPIIb稀释至5ug/ml, 并置于37℃环境中孵育1h, 洗涤3次, 备用;血小板检测:取正常O型全血10ml, 离心15min, 并分离富含PRP, 制备血小板悬液, 与正常血小板悬液孵育37℃1h, 洗涤后加入1%TWEEN/PBS, 高速离心取上清液, 并加入浓度为0.5%的TWEEN￣PBS稀释, 稀释后保存备用, 并将高出正常对照均数的3个标准差为阳性[2]。

1.3.2 检测PAIg

取患者空腹静脉血3L, 用EDTA￣Na抗凝, 并用10ul荧光标记抗体, 然后放入样品管中, 与10u L抗体同型对照, 均匀混合, 温室孵育15min, 然后加入2~6ml终止反应, 并分析上流式细胞仪检测的结果[3]。按照前向散光与侧向散光合理设定血小板门, 单项PAIg大于标准值, 视为阳性。

1.4 统计学处理

数据采用SPSS 13.0统计学软件进行处理。计量资料采用±s表示, 行t检验;计数资料采用例表示, 行χ2检验。P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MAIPA法检测结果

本研究纳入的30例患者, 经MAIPA法检测, ITP组抗GPIIb/IIIa抗体阴性率为68.2%, 抗GPIb/IX抗体阴性率是90%, 抗GPIb/IX抗体的阴性率明显高于抗GPIIb/IIIa抗体 (P<0.05) , 具有统计学意义。抗GPIIb/IIIa抗体的特异性、阳性率以及总有效率都明显高于抗GPIb/IX抗体 (P<0.05) , 具有统计学意义。见表1。

2.2 Pa Ig检测结果分析

ITP组呈阳性患者24例, 阳性率为80%, 非免疫性血小板减少组患者的PAIg呈阳性为19例, 阳性率为63.3%, 组间比较差异明显 (P<0.05) , 具有统计学意义。

2.3 血小板特异抗体及PAIg诊断价值对比分析

MAIPA检测的敏感性明显低于PAIg (P<0.05) , 具有统计学意义。MAIPA检测的特异性、阳性预测值以及总有效率都明显高于PAIg (P<0.05) , 具有统计学意义。见表2。

3 讨论

目前, 在临床诊断上, 特发性血小板减少性紫癜的检测主要是骨髓穿刺检查, 且需要将其他的影响因素彻底排除, 误诊率较高[5~7]。采用相关性药物治疗, 对患者身心的危害比较大, 所以需要通过特异性强的指标提高该病的诊断符合率。在过去, PAIg为ITP诊断的实验室指标之一, 本研究纳入的30例患者, PAIg检查, ITP阳性率为80%, 为非免疫性血小板减少患者抗体阳性率63.3%, 差异不明显 (P>0.05) , 不具有统计学意义, 这就表明PAIg检测对ITP的敏感度较高, 与相关文献的报道具有一致性[8~10]。

当前, 检测GP特异性抗体的方法常采用MAIPA法, 是目前最为先进的检测方法, 临床应用价值比较高。该方法在检测蛋白特异性、敏感度、血小板抗原数量等方面, 具有良好的效果[11~13]。利用这一方法检测, 最大的优点是在血小板溶解前, 使其与抗原结合, 所以抗原决定簇结构, 稳定性和特异性均比较强, 但是在单克隆抗体覆盖面窄的情况下, 抗原的检出受到一定的限制。