不同类型血清对大鼠脂肪干细胞分离培养的影响

不同类型血清对大鼠脂肪干细胞分离培养的影响（共4篇）

不同类型血清对大鼠脂肪干细胞分离培养的影响 篇1

不同类型血清对大鼠脂肪干细胞分离培养的影响

目的 研究不同血清培养基对脂肪干细胞分离培养的影响.方法 用4种不同类型的`血清培养基分离培养大鼠脂肪干细胞,免疫荧光法检测培养细胞CD34、CD90、CD133、Flk-1表面标志;成骨诱导液诱导分化,于14 d进行碱性磷酸酶和钙染色检验各细胞成骨分化特性.结果 (1)新生牛血清组可见贴壁单个核细胞形态单一,呈梭形生长,无重叠现象;胎牛血清组均可见大量多角细胞呈巢状生长,形成铺路石样形态,间或有梭形细胞存在; (2)新生牛血清组梭形贴壁细胞免疫荧光检测可见CD90为阳性,CD34、CD133、Flk-1染色均为阴性;胎牛血清组多角形细胞CD34、Flk-1均为阳性,CD133组部分为阳性,CD90为阴性; (3)新生牛血清组贴壁细胞多数呈碱性磷酸酶阳性;胎牛血清组细胞多角状细胞死亡,形成空白区,梭形细胞呈碱性磷酸酶阳性; (4)新生牛血清组均可见大量红色钙结节影;胎牛血清组细胞多角状细胞死亡,形成空白区,梭形细胞红色钙结节影.结论 (1)新生牛血清培养脂肪干细胞可以得到较纯的细胞; (2)胎牛血清组培养含有大量的血管内皮细胞.

作 者：王福科 赵德萍 代晓明 李逸松 何晓光 刘流 作者单位：王福科,代晓明,李逸松,何晓光,刘流(昆明医学院第一附属医院头颈外科,云南昆明,650031)

赵德萍(昆明医学院第一附属医院实验中心,云南昆明,650031)

刊 名：昆明医学院学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF KUNMING MEDICAL UNIVERSITY年，卷(期)：31(3)分类号：Q813.1关键词：脂肪干细胞 免疫荧光 血清 血管内皮细胞

不同类型血清对大鼠脂肪干细胞分离培养的影响 篇2

1 材料与方法

1.1 主要试剂

胎牛血清(Gibco,美国),磷酸盐缓冲液(Hy Clone,美国),PDGF-AB、TGF-β1、VEGF(Peprotech,美国),CCK-8(Dojindo,日本)。

1.2 大鼠脂肪干细胞的分离培养

无菌切取大鼠腹股沟处的脂肪组织,采用酶消化法原代培养SD大鼠ADSCs,待细胞融合至80%时,按1∶3传代培养,取第3代ADSCs用于实验。

1.3 ADSCs的鉴定

采用多向诱导分化的方法鉴定ADSCs。具体方法参见文献[3]。取第3代ADSCs,按每孔1×104(成骨诱导)或每孔2.1×104(成脂诱导)的密度接种于6孔板中,24 h后换为成骨或成脂诱导培养基。每3 d换液1次,培养3周后茜素红和油红O染色。

1.4 PRF膜的制备

用无菌真空采血管负压抽取志愿者10 ml血液,即刻3 000 r/min离心10 min。具体方法参见文献[3]。用无菌纱布将PRF挤压成膜状,制备成5 mm×5 mm大小待用。

1.5 增殖实验

96孔板中每孔加入2×103个ADSCs,向实验组孔中加入含有PRF膜或不同浓度TGF-β1(0、0.5、1、2、5、10 ng/ml)、PDGF-AB(0、0.1、1、10 ng/ml)、VEGF(0、5、10、20、30、40 ng/ml)的α-MEM培养液,阳性对照组为含10%FBSα-MEM培养基,阴性对照组为不含10%FBSα-MEM培养液。每组设5个重复孔,分别置于培养箱中培养1、3、5、7 d。每次检测时,加入含有10%CCK-8的等量新鲜培养液置于培养箱中培养2h,然后酶标仪450 nm测定吸光度值(A值)。

1.6 黏附实验

预处理24孔板。24孔板中每孔加入1×105个AD-SCs,向实验组孔中加入含有PRF膜或不同浓度三因子的α-MEM培养液,阳性对照组为含10%FBSα-MEM培养基,阴性对照组为含2%FBSα-MEM培养基。放置细胞培养箱中孵育2 h。每组选取2个实验孔,经4%多聚甲醛固定后,1%甲苯胺蓝染色,镜下观察细胞的黏附形态,剩余3孔常规消化后细胞计数。

1.7 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析。数据用±s表示,采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADSCs的鉴定结果

第3代的ADSCs经成骨诱导21 d后茜素红染色,可见明显的红色团块形成即钙结节形成(图1A);成脂诱导21 d后油红O染色,胞质内出现大量红染的脂滴(图1B)。

A:成骨诱导(茜素红染色);B:成脂诱导(油红O染色)A:Osteogenic induction(alizarin red staining);B:Adipogenic induction(oil red O staining)

2.2 PRF对ADSCs的增殖的影响

CCK8结果显示,第1、3、5、7天PRF组递增的A值均显著高于阴性对照组(P<0.05),与阳性对照组递增的A值相近(图2)。

2.3 PRF所含因子TGF-β1、PDGF-AB、VEGF对AD-SCs增殖的影响

CCK8实验结果显示,ADSCs在不同浓度PDGF-AB的作用下,各浓度组随着时间的递增,浓度的增加,A值均显著增高,其中10 ng/ml PDGF-AB A值明显高于阴性对照组(P<0.05);ADSCs在不同浓度VEGF的作用下,在不同的时间点(1、3、5、7 d)各浓度组的A值均高于阴性对照组,其中10 ng/ml VEGF明显高于阴性对照组(P<0.05);ADSCs在不同浓度TGF-β1的作用下,各浓度组随时间的递增,A值均低于阴性对照组;AD-SCs分别在2 ng/ml TGF-β1、10 ng/ml PDGF-AB、10 ng/ml VEGF的作用下,在不同的时间点(1、3、5、7 d),10ng/ml PDGF-AB的A值均高于10 ng/ml VEGF,2 ng/ml TGF-β1 A值均低于阴性对照组,组间差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

2.4 PRF对ADSCs黏附的影响

镜下可见阴性对照组的黏附细胞较少,细胞大多皱缩似球形,有少量的细胞呈伸展状态,伸出的伪足少而短(图3A)。PRF组ADSCs黏附呈密集状且伸展状态较好,大多呈梭形或倒三角形,少量状似球形,ADSCs伸出了大量的伪足与邻近的ADSCs呈拉网样接触(图3B)。镜下计数可见,PRF组黏附细胞数显著高于阴性对照组(P<0.05);与阳性对照组黏附细胞数相近(图3C)。

2.5 PRF所含因子TGF-β1、PDGF-AB、VEGF对AD-SCs黏附的影响

在不同浓度TGF-β1的作用下,随着浓度的增加细胞黏附形态逐渐由球形向梭形过渡,ADSCs伸出的伪足数量逐渐增多并与邻近的ADSCs逐渐呈拉网样接触(图3D);黏附细胞的数目亦不同,与阴性对照组相比TGF-β1各浓度组的黏附细胞数均高于此对照组且随着浓度的增加黏附细胞数增多,组内差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。在不同浓度PDGF-AB的作用下,ADSCs大多皱缩似球形,有少量的细胞呈伸展状态且伸出的伪足短而少(图3E);与阴性对照组相比PDGF-AB各浓度组的黏附细胞数均显著低于对照组,组内差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。在不同浓度VEGF的作用下,细胞黏附形态与PRF组最为接近(图3F);黏附细胞的数目亦不同,与阴性对照组相比VEGF各浓度组的黏附细胞数均高于对照组且在10 ng/ml VEGF组作用下,黏附细胞数最多,组内差异有统计学意义(P<0.05)(表3)。ADSCs分别在2 ng/ml TGF-β1组、10 ng/ml PDGF-AB组、10 ng/ml VEGF组的作用下,10 ng/ml VEGF组黏附细胞数高于2 ng/ml TGF-β1组,显著高于10 ng/ml PDGF-AB组,组间差异有统计学意义(P<0.05)。

A:阴性对照组;B:PRF组;C:阳性组对照组;D:2 ng/ml TGF-β1组;E:10 ng/ml PDGF-AB组;F:10 ng/ml VEGF组A:Negative control group;B:PRF group;C:Positive control group;D:2 ng/ml TGF-β1 group;E:10 ng/ml PDGF-AB group;F:10 ng/ml VEGF group

3 讨论

内源性骨组织的再生依赖于成体干细胞在局部特有的微环境的下发生归巢、黏附、增殖和分化,进而促进组织的再生修复。Dohan等[4]的研究发现PRF膜经制备后的血小板缓慢地被激活,α-颗粒亦非集中的脱颗粒,PRF所含因子一部分被包绕于纤维蛋白支架,另一部分与纤维蛋白多聚体形成稳定的化学结合,其可持续释放至少达1周的时间。研究显示,作为因子综合体的PRF能够促进骨髓间充质干细胞、牙髓干细胞和牙周膜干细胞的增殖。故PRF膜及其所含的因子可均衡而又持久的贯穿细胞增殖的整个过程。然而在大鼠ADSCs的增殖过程中PRF所含三因子的作用尚未明确,故本实验采用CCK8法检测PRF及其所含因子TGF-β1、PDGF-AB、VEGF对ADSCs增殖的影响。结果显示PRF组中ADSCs的增殖活性随着时间的延长逐渐增高。PDGF-AB各浓度组在同一时间点以及组内的不同时间点(P<0.05),PDGF-AB组中ADSCs的增殖活性随着时间的递增、浓度的增加而逐渐增加,尤以10 ng/ml PDGF-AB对ADSCs的增殖活性的影响最为突出。此结果的出现可能与血小板源性生长因子能够促使细胞周期从G0/G1期向S期的转换,上调cyclin D1的表达和Rb的磷酸化有关[5]。TGF-β1各浓度组在同一时间点以及组内的不同时间点,A值均低于阴性对照组,提示TGF-β1可能抑制ADSCs的增殖。这恰与Lee等[6]认为TGF-β1抑制细胞的生长的结论一致。VEGF各浓度组在同一时间点以及组内的不同时间点(P<0.05),低浓度组的增殖活性不断提高待浓度达10 ng/ml时的增殖活性达顶峰,再增加其浓度增殖活性不再增加。以10ng/ml PDGF-AB,10 ng/ml VEGF进行比较(P<0.05),PDGF-AB促增殖活性作用优于VEGF。

脂肪间充质干细胞作为骨组织工程的种子细胞,其与载体的黏附是基础,决定性的影响了后续发生的增殖和成骨分化。黏附实验除了比较同一时间内黏附细胞数目上的差异,细胞于材料表面铺展的形态学差异亦是反映细胞早期黏附能力的强弱的重要指标。结果显示PRF组黏附细胞数与阴性对照组相比(P<0.05)和结合形态学观察,提示PRF能够显著促进ADSCs的黏附。不同浓度的PDGF-AB组黏附细胞数均低于阴性对照组,组内比较(P>0.05)和结合形态学观察,提示PDGF-AB不能够促进ADSCs的黏附。该结果的出现与PDGF通过减慢黏着斑的组装进程和抑制应力纤维带形成,抑制了paxillin的酪氨酸磷酸化,从而抑制了平滑肌细胞的黏附这理论一致[7]。不同浓度的TGF-β1组黏附细胞数随着浓度的升高而不断增加,组内比较(P<0.05)和结合形态学观察,提示TGF-β1能够促进ADSCs的黏附。有研究表明,TGF-β1通过刺激整合素连接激酶、PINCH蛋白以及桩蛋白等的表达来增加整合素β1及黏着斑激酶活性,来促进细胞的黏附[8]。不同浓度的VEGF组黏附细胞数与阴性对照组相比(P<0.05)结合形态学观察,提示VEGF促进了ADSCs的黏附。这可能与VEGF能够促进FAK和paxillin的酪氨酸磷酸化,募集磷酸化的黏着斑蛋白至新生的黏着斑处,促进黏着斑的组装,加快了细胞黏附的进程有关[9]。以2 ng/ml TGF-β1组,10ng/ml VEGF组进行组间比较(P<0.05)和结合形态学观察,提示VEGF促黏附作用优于TGF-β1。

综上所述,PRF所含因子TGF-β1、VEGF在AD-SCs的黏附过程中发挥重要作用,而PRF所含因子PDGF-AB、VEGF在ADSCs的增殖过程中发挥重要作用,由此可见作为因子综合体的PRF有潜在的临床应用价值,但对于PRF所含因子所参与的ADSCs黏附和增殖的信号通路有待进一步的研究。

摘要：目的:研究富血小板纤维蛋白(PRF)及其所含三因子TGF-β1、PDGF-AB、VEGF分别对大鼠脂肪干细胞(ADSCs)增殖和黏附的影响。方法:将ADSCs培养在含有PRF膜和不同浓度的PDFG-AB、TGF-β1、BEGF中,细胞黏附实验检测培养2 h后细胞黏附能力,CCK-8法检测培养1~7 d细胞增殖。结果:黏附实验显示,PRF组的黏附细胞数显著高于阴性对照组(P<0.05);不同浓度的PDGF-AB组内黏附细胞数的差异无统计学意义(P>0.05);不同浓度的TGF-β1、VEGF组内黏附细胞数的差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8实验表明,PRF组的细胞增殖在各个时间点(1、3、5、7 d)显著高于阴性对照组(P<0.05);不同浓度的PDGF-AB、VEGF组内细胞的增殖差异有显著性(P<0.05);不同浓度的TGF-β1组细胞增殖的差异无显著性(P>0.05)。结论:PRF能提高ADSCs的增殖和黏附的能力。PDGF-AB和VEGF可促进ADSCs的增殖;TGF-β1和VEGF均可促进ADSCs的黏附,并呈一定的量效正相关。

关键词：富血小板纤维蛋白(PRF),脂肪干细胞(ADSCs),细胞增殖,细胞黏附,转化生长因子(TGF-β1),血小板源性生长因子-AB(PDGF-AB),血管内皮生长因子(BEGF)

参考文献

[1]Lee CH,Cook JL,Mendelson A,et al.Regeneration of the articular surface of the rabbit synovial joint by cell homing:A proof of concept study[J].Lancet,2010,376(9739):440-448.

[2]Mendelson A,Frank E,Allred C,et al.Chondrogenesis by chemotactic homing of synovium,bone marrow,and adipose stem cells in vitro[J].FASEB J,2011,25(10):3496-3504.

[3]杨世茂,王明国,李静.富血小板纤维蛋白与富血小板血浆体外释放生长因子的比较及其对脂肪干细胞增殖分化的影响[J].华西口腔医学杂志,2012,30(6):641-644.

[4]Dohan Ehrenfest DM,de Peppo GM,Doglioli P,et al.Slow release of growth factors and thrombospondin-1 in Choukroun's platelet-rich fibrin(PRF):A gold standard to achieve for all surgical platelet concentrates technologies[J].Growth Factors,2009,27(1):63-69.

[5]Kang YJ,Jeon ES,Song HY,et al.Role of c-Jun N-terminal kinase in the PDGF-induced proliferation and migration of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells[J].J Cell Biochem,2005,95(6):1135-1145.

[6]Lee MS,Kim YB,Lee SY,et al.Integrin signaling and cell spreading mediated by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment[J].J Cell Biochem,2006,99(1):88-95.

[7]Berrou E,Bryckaert M.Platelet-derived growth factor inhibits smooth muscle cell adhesion to fibronectin by ERK-dependent and ERK-independent pathways[J].J Biol Chem,2001,276(42):39303-39309.

[8]Hallab NJ,Bundy KJ,O'Connor K,et al.Evaluation of metallic and polymeric biomaterial surface energy and surface roughness characteristics for directed cell adhesion[J].Tissue Eng,2001,7(1):55-71.

不同类型血清对大鼠脂肪干细胞分离培养的影响 篇3

【关键词】间充质干细胞；脂肪组织；细胞培养；SUI模型

【中图分类号】R691【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0125-01

压力性尿失禁(SUI)为女性的常见病和多发病，其发病率约为1 S%-6O%，多发生于老年人，因受经济、宗教、教育程度等因素的影响，其实际发生率比统计发病率更高。SVl的症状严重与否都不自接危及生命，但它给患者的日常上作、生活及社交活动造成一定程度的影响，甚至会严重影响患者的生活质量乃至家庭和睦。

1临床资料

注射疗法是将药物、化学制剂或自体组织等注入后尿道或膀肌颈内口粘膜下，使尿道腔变窄、拉长，延长功能性尿道的长度，提高尿道阻力，起到关闭尿道内口和后尿道的作用，从而达到有效控制排尿的口的。这一治疗方法对尿道内括约肌功能障碍、尿道内压降低同时尿道、膀肌无其他病变等压力性尿失禁患者有较好的效果。注射疗法主要优点在于.以在局部浸润麻醉下进行操作，大多数患者的手术均.IJ.以在门诊进行，适用于老年及不能耐一受大手术的患者。口前注射疗法的研究主要集中在选择不同的注射材料上，理想的注射材料应该在结构上完整，无毒、无免疫原性、无变应原性，近期内不会被分解，能长时间保持其支撑作用。口前使用的材料尚难达到上述要求，因此寻找一种取材方便、生物相容性好、安全无毒、疗效满意的注射材料十分必要。

方法：无菌技术下获取SD大鼠双侧腹股沟区脂肪垫，消化离心，长期培养的方法获取脂肪源性间充质干细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态变化，对培养细胞进行免疫细胞化学染色，鉴定其表面分子标志。SD大鼠24只分为3组，实验组（6只），对照组一（3只），对照组二（3只）。分别获取自体ADSCs，实验组进行荧光标记。然后实验组将荧光标记的ADSCs自体移植至尿道周围，对照组移植未并取尿道组织进行HE染色组织学分析。

2结果

原代培养显示培养的脂肪源性间充质干细胞2d左右开始壁,10d-14d左右可达90%融合,基本上为梭形成纤维样细胞形态,免疫细胞化学示 CD29阳性，CD34阴性。阴部神经切断术后10天，除模型组和对照组一各有1只大鼠死亡外，均进行尿流动力学检测，三组手术前后ALLP分别为：对照组一为27.1±5.1和29.1±3.2cmH₂O，对照二为29.5±4.9和27.4±72.3,模型组为24.8±3.8和14.7±3.0。模型组手术后ALLP明显降低，且组织学检查亦证明模型组大鼠尿道周围括约肌明显萎缩。

3讨论

本实验将荧光金标记的脂肪源性干细胞自体移植至大鼠的近端尿道周围，行冰冻切片，组织化学染色，荧光显微镜下观察.见荧光标记的细胞呈金黄色:后取组抗体免疫移植部位有较多的Desmin阳性的细胞，棕黄色，部分出现一定的方向性，未见明显炎症细胞浸润，说明己有细胞在局部存活并生长，提示能成为压力性尿失禁注射治疗的一种理想的注射材料，为将来进行细胞移植治疗压力性尿失禁提供了实验依据。

结论：①大鼠脂肪组织中含有丰富的多能干细胞。利用消化离心，长期培养的方法可获取大量的干细胞。②移植后大鼠的ADSCs，可以在尿道周围成活并生长分化。

参考文献

[1]梁月有.诊断女性压力性尿失禁的相关检查[J].新医学.2006,37（10）:687-689.

[2]王萌.尿道周围注射治疗女性压力性尿失禁的研究进展[J].国际泌尿系统杂志,2006,26（6）：798-802.

[3]姚启盛，叶章群，陈从波,等.骨胳肌肌源细胞自体移植在压力性尿失禁治疗中的价值[J].中华泌尿外科杂志，2006，26（12）:841-843.

[4]Strasser H,Marksteiner R,Margreiter E,et al.Stem cell therapy in treatment of urinary incontinence[J].first clinical results.J Urol,2004,171(suppl):130-133

不同类型血清对大鼠脂肪干细胞分离培养的影响 篇4

采用密度梯度离心法分离骨髓间质干细胞,差速贴壁法进行纯化,应用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等对纯化细胞进行鉴定,结果细胞表面抗原CD29,CD44,CD105,CD166 表达呈阳性,而 CD14,CD34,CD45表达呈阴性.采用RT-PCR鉴定了三个基因:nestin,NST,Oct-4,前两者呈阳性表达,后者弱阳性表达.这些细胞特异抗原与基因表达综合起来,表明得到的细胞具备骨髓间质干细胞的特性.密度梯度分离与差速贴壁相结合,可获得较好均一性的`骨髓间质干细胞,是一种简单可靠、易于推广的骨髓干细胞获取方法,可为细胞与组织工程研究提供种子细胞.

作 者：张荣利 冯雪 张会亮 罗国安 李连达 王义明 Zhang Rongli Feng Xue Zhang Huiliang Luo Guoan Li Lianda Wang Yiming 作者单位：张荣利,冯雪,罗国安,王义明,Zhang Rongli,Feng Xue,Luo Guoan,Wang Yiming(清华大学生命科学与医学研究院,北京,100084)

张会亮,Zhang Huiliang(清华大学生命科学与医学研究院,北京,100084;山东师范大学生命科学学院,济南,250014)

李连达,Li Lianda(中国中医科学院西苑医院,北京,100091)