血清Th1/Th2论文（精选7篇）
血清Th1/Th2论文 篇1
支气管哮喘(bronchial asthma,简称哮喘)是由多种细胞(如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[1]。Th1/Th2细胞失衡被认为是哮喘发病的基础,而IFN-γ和IL-4分别是Th1和Th2型特征性细胞因子,对哮喘的研究有重要意义。IL-17与Th1和Th2型细胞因子的关系,成为近年来研究的热点,IL-17作为一种前炎症细胞因子,其在哮喘发病过程中的作用日益受到重视。
维药神香草(Hyssopus officinalis L,维语发音音为祖发奇尼)为唇形科(Labiatae)多年生草本植物,最早生长于地中海和黑海附近地区,在我国新疆维吾尔族自治区北部有野生的分布。《维吾尔药志》中记载:药用全草,全株主要含挥发油,常用于镇咳平喘,清热利湿。维吾尔医用于治疗气管炎的咳嗽、气喘、感冒发烧和风湿等病证[2]。近年在新疆维吾尔族自治区人工种植神香草获得成功,为开发和利用神香草的食用价值和药用价值提供了充足的资源。本研究通过检测神香草治疗后的哮喘大鼠血清IL-17、IL-4及IFN-γ的水平及其之间的相关性,以探讨神香草治疗哮喘的作用机理。
1 材料及方法
1.1 药物及试剂
神香草全草由新疆维吾尔自治区维吾尔医院药房提供,新疆医科大学中医学院中药化学教研室制备提取液。卵清白蛋白OVA(Sigma公司,Cat.No.A8040);氢氧化铝干粉(西安化学试剂厂,批号:050912);吸附百白破联合疫苗(成都生物制品研究所,批号:2007126008-3);Rat IL-17 ELISA Kit(美国ADL公司,批号:31192)。Rat IL-4 ELISA Kit(美国Rapid Bio公司,批号:18050522);Rat IFN-γELISA Kit(美国Rapid Bio公司,批号:25050901)。
1.2 动物分组及实验模型制备
雄性健康Wistar大鼠40只,4~6周龄,体重150~170 g,由新疆医科大学实验动物中心提供,随机分为5组,每组8只,分别为正常对照组、哮喘模型组、地塞米松治疗组及神香草水提液高、低剂量治疗组。除正常组外,各组大鼠于实验第1天腹腔注射1 m L抗原液[含10 mg OVA﹑100 mg Al(OH)3﹑5×109个百白破疫苗]初次致敏,实验第8天重复一次以加强致敏。正常对照组以等量生理盐水代替。从实验第15天开始,每天一次将大鼠置于密闭玻璃钟罩,以10%OVA生理盐水雾化吸入20 min以激发引喘(正常对照组以生理盐水代替),待出现烦躁不安、呛咳、呼吸急促腹式呼吸明显和皮肤瘙痒等症状时,表明引喘成功。
1.3 药物治疗
各组大鼠于每次雾化吸入前30 min给予灌胃:(1)正常对照组:给予灌胃生理盐水1 m L;(2)模型组:给予灌胃生理盐水1 m L;(3)地塞米松治疗组:给予灌胃地塞米松0.5 mg/kg;(4)神香草高剂量组:给予灌胃神香草提取液4 g/kg;(5)神香草低剂量组:给予灌胃神香草1 g/kg。
1.4 标本采集
实验第22天,最后一次雾化吸入后24 h内,各组大鼠腹腔注射10%的水合氯醛0.3 m L/100 g以麻醉。麻醉后将大鼠仰面固定于手术台,75%酒精消毒皮肤后,打开腹腔,使用一次性真空采血针行腹主动脉采血,采血针另一端连接非抗凝负压采血管。采血完毕后,将采血管静置1 h后,于4℃,离心力1 000 g条件下,离心10 min,分离得到血清,分装后标记,立即冻存于-80℃冰箱。
1.5 血清IL-17﹑IL-4及IFN-γ水平检测
严格按照ELISA试剂盒说明书操作,分别检测各组大鼠血清IL-17﹑IL-4及IFN-γ的水平。酶标仪450 nm处读吸光度值,根据标准曲线计算IL-17﹑IL-4及IFN-γ的浓度。
1.6 统计学分析
采用SPSS15.0软件进行统计学处理,数据以均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析和多重比较对各组进行比较分析,以P<0.05为差异有显著性;相关性检验采用Pearson直线相关分析。
2 结果
2.1 大鼠一般表现
激发后,大鼠出现烦躁不安、皮肤瘙痒、点头呼吸、张口呼吸、腹式呼吸明显、反应迟钝等症状。连续激发后,大鼠体重减轻,毛色光泽度下降。
2.2 肺组织病理变化
2.2.1 大体观察
哮喘模型组大鼠与正常对照组大鼠肺脏相比,体积明显增大,表面肿胀,有多处形状不规则的暗红色红色充血区。切面有白色泡沫状渗出物。
2.2.2 肺组织学观察
正常对照组:支气管管腔规则;无支气管收缩征像;未见炎症细胞浸润。哮喘模型组:支气管管腔不规则;支气管收缩,气道狭窄,气道上皮多处断裂,基底膜明显增厚,气管及血管周围有炎性细胞浸润,支气管黏膜下层及黏膜外层﹑小血管周围﹑肺间质及肺泡腔等处有大量炎性细胞浸润。尚可见到气道上皮剥脱,肺动脉周围水肿。治疗组:与哮喘模型组相比,炎症现象有所减轻。
2.3 各组血清IL-17水平的比较
模型组及各药物治疗组血清IL-17水平明显高于正常对照组,差异有显著性(P<0.05);各治疗组血清IL-17水平明显低于模型组,差异有显著性(P<0.05);神香草高剂量治疗组血清IL-17水平明显低于低剂量治疗组,差异有显著性,见表1。
注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与哮喘模型组比较,P<0.05;3)与神香草低剂量组比较,P<0.05
2.4 各组血清IFN-γ和IL-4水平的比较
模型组血清IL-4水平明显高于正常对照组(P<0.05),而IFN-γ的水平明显低于正常对照组(P<0.05),各药物组与模型组比较,IL-4水平明显降低,而IFN-γ水平明显升高,其差异有显著性(P<0.05),神香草高剂量治疗组与低剂量治疗组的差异有显著性(P<0.05),见表2。
2.5 相关性分析
注:1)与对照组比较,P<0.05;2)与哮喘模型组比较,P<0.05;3)与神香草低剂量组比较,P<0.05
各组大鼠血清IL-4与IFN-γ水平呈密切负相关(r=-0.997),IL-17水平与IL-4和IFN-γ水平呈负相关关系(r=-0.333,-0.509),均P<0.05。
3 讨论
Th1/Th2细胞失衡是变应性哮喘发生过程中重要的免疫学改变。Th1/Th2失衡表现为哮喘患者体内T细胞趋向于产生高水平的Th2型细胞因子,特别是IL-4、IL-5、IL-13等,而Th1细胞因子如IFN-γ水平相对较低。IL-4是Th2细胞分泌的一种促进B细胞分化、增殖及其活性的细胞因子,基因剔除实验确定了IL-4在Ig E诱导合成中的中心作用[3],在刺激B细胞合成Ig E方面具有重要调节功能。实验证明IL-4通过B7/CD28途径来调节Th亚群的分化[4],促使Th0细胞向Th2类细胞分化[5]。IL-4还可通过下调P-选择素的表达[6],加强IL-10基因表达抑制Th1的功能。IFN-γ是由活化T细胞、NK细胞分泌的一种具有激活巨噬细胞、抗病毒和抑制Th2细胞作用的细胞因子。IFN-γ可促进Th1细胞分化,抑制Th2细胞反应[7];抑制气道黏膜中EOS聚集及血中Ig E产生。本研究结果显示,模型组血清IL-4水平明显高于正常对照组(P<0.05),而IFN-γ的水平明显低于正常对照组(P<0.05),各药物组与模型组比较,IL-4水平明显降低,而IFN-γ水平明显升高,其差异有显著性(P<0.05),神香草高剂量治疗组与低剂量治疗组的差异有显著性(P<0.05),表明神香草可纠正Th1/Th2型细胞因子失衡,且具有一定的剂量依赖性。
白介素17(Interleukin 17,IL-17即IL-17A)是1995年首先从CD4+T文库中克隆获得,人类IL-17(h IL-17)主要来源于记忆T细胞,外周血CD4+细胞受刺激后可产生高水平h IL-17。IL-17可以通过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应,对中性粒细胞有强大的化学趋化作用,可以显著增加呼吸道内中性粒细胞聚集、活化[8,9]。在一些自身免疫性疾病和炎症性疾病的发病机制中,IL-17及其相关细胞因子对一些趋化因子和细胞因子的释放具有强有力的促进作用,可协同加强其他细胞因子所引起的炎症反应[10]。MOLET等[11]首次发现哮喘发作时嗜酸性粒细胞分泌IL-17增高。IL-17是其他细胞因子强有力的诱导者,IL-17与TNF-α可协同加强炎症调节。本研究显示,与正常对照组相比,哮喘模型组大鼠血清IL-17的水平明显升高,差异有显著性(P<0.05),证明IL-17在哮喘发病过程有重要作用;经过治疗,地塞米松和神香草高、低剂量治疗组组均有减少细胞分泌IL-17的作用(P<0.05);地塞米松治疗组与神香草高、低剂量治疗组比较,差异无显著性;神香草高剂量治疗组与神香草低剂量治疗组比较,差异有显著性(P<0.05),表明神香草对哮喘的治疗有剂量依赖性。
目前,对哮喘尚无有效的治疗方法,主要为控制症状和尽可能保持肺功能正常。而以激素为主的抗炎疗法由于治疗时间长且具有很大的副作用,因此有必要寻找一些新的药物。近年维吾尔药神香草引起了国内外学者的广泛关注,开展了药理学作用研究,证实神香草精油具有痉挛停生物碱样作用,可解除支气管痉挛,发挥镇咳作用;丁剑冰等[14]通过止咳实验、祛痰实验和平喘实验,证实神香草提取液能明显地对抗氨水引起的咳嗽和磷酸组胺造成的哮喘作用,并且具有一定的祛痰作用。王亚男等[15]通过实验证实:神香草水提液可抑制哮喘小鼠IL-4的分泌,纠正Th1/Th2型的细胞因子失衡,并抑制炎症细胞的汇集,对变应性哮喘有明显的干预作用。研究证实,Th1和Th2细胞最具代表性的细胞因子IFN-γ和IL-4,可以抑制Th17细胞的分化[12,13]。IFN-γ和IL-4可分别激活转录因子STAT1和STAT6,而后两者对IL-17的表达具有负性调节作用。
本研究显示,各组大鼠血清IL-4与IFN-γ水平呈密切负相关(r=-0.997),IL-17水平与IL-4和IFN-γ水平呈负相关关系(r=-0.333,-0.509)。说明在哮喘的发病过程中,IL-4与IFN-γ起着相互抑制的作用,且IL-4和IFN-γ都可在一定程度上抑制IL-17的分泌,即Th17的分化[12,13]。本研究揭示了神香草治疗哮喘的部分作用机理,为中药治疗哮喘提供了一定的理论依据,维药神香草的有效成份有待于进一步研究。
血清Th1/Th2论文 篇2
关键词：子痫前期,辅助性T淋巴细胞1/辅助性T淋巴细胞2,相关性
子痫前期 (preeclampsia, PE) 是妊娠期所特有的疾病, 是导致孕产妇及围生儿死亡率升高的主要原因之一, 其病因及发病机制至今未明。近年, Th1/Th2细胞比例的改变与妊娠期高血压疾病的关系引起了学者的注意, 对于子痫前期的大量研究提示, Th1/Th2平衡倾向于Th1型免疫反应[1], 这在我们的前期实验也已经证明[2]。本实验进一步地对Th1/Th2比率平衡与子痫前期相关性进行研究, 以便为子痫前期发病机制的探讨提供一个新思路, 为子痫前期的免疫治疗提供新的方法。
1 资料与方法
1.1 资料来源
对象选择:①实验组:选取2004年2月至2007年2月在河北医科大学附属第二医院及石家庄市第一医院产科剖宫产分娩的子痫前期患者40例 (子痫前期组) , 诊断按乐杰主编《妇产科学》第7版[3] (其中轻度子痫前期20例、重度子痫前期20例) 。②对照组:同期住院选择性剖宫产分娩的正常孕妇15例 (正常妊娠组) 。两组孕妇均为初产妇, 均无近期感染证据, 血糖正常, 无慢性高血压, 无反复流产史, 未经生殖助孕技术治疗, 无免疫性疾病, 未经免疫药物治疗。两组在年龄上差异无统计学意义 (P>0.05) 。子痫前期组分娩孕周、平均动脉压 (MAP) 、新生儿体重与正常妊娠妇女组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
①与正常妊娠组比较, P<0.05;②子痫前期组组间比较, P<0.05
1.2 方法
1.2.1 实验试剂
淋巴细胞分离液购自中国恒信化学试剂有限公司, 刺激剂Phorbor 12-myristate 13-acetate (PMA) 、Lonomycin、Breferdin A (BFA) 由美国Sigma公司提供, 打孔剂FIX&PERM购自美国Caltag公司, PerCP-CD4、FITC-IFN-γ、PE-IL-4、FITC-CD69均购自美国Becton-Dickinson公司。
1.2.2 血标本采集
抽取两组实验对象空腹肘静脉血0.5 ml (均于治疗前抽血) , 注入肝素无菌管中8小时内送流式检验Th1、Th2细胞百分比。
1.2.3 蜕膜取材及单个核细胞的分离[4]
两组孕妇于剖宫产术中, 取子宫蜕膜4 g, 制备单细胞悬液, 细胞活性在95%以上。8小时内送流式检验Th1、Th2细胞百分比。
1.2.4 流式法检测Th1、Th2细胞百分比
取肝素抗凝血0.5 ml加等量RPMI-1640培养液稀释后 (或0.5 ml淋巴细胞悬液) , 加入刺激剂, 孵育4小时。取收获细胞, 加入抗体、打孔剂, 用流式细胞仪测定, 计数10000个CD4+淋巴细胞中, 分泌细胞因子IFN-γ的Th1细胞和分泌细胞因子IL-4的Th2细胞所占的百分比。
1.3 统计学方法
应用SPSS 12.0统计软件进行统计, 结果以undefined表示。外周血及蜕膜组织中的数据行配对设计t检验及Pearson相关分析。
2 结 果
2.1 两组外周血、蜕膜Th1、Th2细胞百分比及Th1/Th2情况比较
在外周血与蜕膜组织中均显示:子痫前期组Th1细胞高于正常妊娠组 (P<0.01) , 子痫前期组间差异有统计学意义 (P <0.05) 。子痫前期组Th2细胞低于正常妊娠组 (P<0.05) , 子痫前期组间差异无统计学意义 (P>0.05) 。子痫前期组Th1/Th2比率高于正常妊娠组 (P<0.01) , 子痫前期组间差异有统计学意义 (P<0.05) 。子痫前期组以及轻度、重度中蜕膜组织的Th1细胞与Th1/Th2比率均高于其在外周血 (P<0.01) 。蜕膜组织中Th1/Th2比率与外周血Th1/Th2比率之间存在着显著正相关关系 (r=0.818, P<0.01) 。其他详见表2。
2.2 两组血小板、肝、肾功能指标
子痫前期组的血小板、肝、肾功能与正常妊娠组相比较, 差异有统计学意义 (P<0.05, P<0.01) ;重度子痫前期组尿素氮、尿酸、尿蛋白均高于轻度子痫前期组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表3。
2.3 Th1、Th2与Th1/Th2细胞比率与血小板计数、肝、肾功能指标相关性分析
外周血Th1细胞与收缩压、舒张压、平均动脉压、肌酐、尿酸、尿蛋白的改变均成正相关, 差异有统计学意义;蜕膜Th1细胞与收缩压、舒张压、平均动脉压、AST、肌酐、尿酸、尿蛋白的改变均成正相关, 差异有统计学意义, 与血小板计数成负相关, 差异有统计学意义。 Th1/Th2除与血小板计数成负相关外, 与其他各项病情指标成正相关, 差异均有统计学意义。见表4。
①与正常妊娠组比较, P<0.01;②与正常妊娠组比较, P<0.05;③子痫前期组组间比较, P<0.05;④与外周血比较, P<0.01
①与正常妊娠组比较, P<0.05;②与正常妊娠组比较, P<0.01;③子痫前期组组间比较, P<0.05
①两者呈显著正相关, P<0.01;②两者呈显著正相关, P<0.05;③两者呈显著负相关P<0.01;④两者呈显著负相关, P<0.05
3 讨 论
在人类细胞免疫系统中, T细胞可以被分为 Th1细胞和Th2细胞。两者区分的依据是其不同的细胞因子分泌谱, 其中Th1细胞主要分泌IL-2 (白细胞介素-2) 、IFN-γ (干扰素-γ) 、TNF-α (肿瘤坏死因子-α) , 诱导细胞毒性反应, 而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13等, 诱导免疫营养或防护[1]。机体处于正常状态时, Th1和Th2 细胞数量及功能处于动态平衡, 维持正常的细胞免疫和体液免疫功能状态。Th1、Th2细胞和细胞因子之间是相互作用、相互调节、又相互抑制的, Th1/Th2比率的平衡决定着机体的免疫状态。对于妊娠而言, 主要是其各自浓度和比率的变化, 而并非哪一类因子的绝对增加或减少。当Th1/Th2细胞比率处于不平衡状态时, 机体功能发生改变, 表现出一系列的病理症状。
3.1 Th1/Th2细胞比率与妊娠
正常妊娠过程中, 母体能通过自身的免疫调节系统进行正常的免疫调节, 实现母儿免疫耐受, 有效制约母体对胎儿产生的排斥反应, 正常妊娠是一种“Th2现象”[5], 即妊娠期母体是趋向于Th2细胞参与的体液免疫, 而避免Th1细胞参与的细胞免疫, 妊娠期Th1/Th2平衡向Th2漂移并建立新的平衡[6], 胚胎通过表达具有胚胎保护作用的Th2型细胞因子并降调对胚胎有害的Th1型细胞因子而保护胚胎自身。蜕膜组织产生的免疫因子有助于胎盘的生长和发育[7], 使整个妊娠过程顺利完成, 若免疫系统发生紊乱, 则导致妊娠失败及某些妊娠并发症的发生。与子痫前期患者比较, 本研究中正常妊娠组的Th1/Th2比率平衡倾向于Th2型免疫反应, 有利于妊娠的维持。这与以前学者[8]的研究相一致。
3.2 Th1/Th2比率与子痫前期
子痫前期时, 胎母间免疫平衡失调, 防护反映减弱, CD4+细胞因子占优势, 母体免疫反应增强, 子痫前期患者出现类似肾移植排斥反应中的纤维素样坏死及急性动脉粥样硬化表现, 由此引起血管内皮损伤, 进而导致子痫前期一系列临床症状[9]。患者蜕膜局部淋巴细胞也存在Th1型优势反应, 而且血清中Th1型细胞因子浓度显著升高, 这将导致蜕膜局部的NK细胞和细胞毒性T细胞大量激活, 激活的NK细胞和细胞毒性T细胞可以攻击浸润的滋养细胞, 导致胎盘血管重铸障碍, 引发子痫前期。本研究结果显示:子痫前期患者外周血中的Th1/Th2比率显著高于正常妊娠组, 表明了在子痫前期患者体内确实存在着Th1/Th2比率失衡, 而且蜕膜组织中Th1/Th2比率明显高于外周血Th1/Th2比率, 二者成正相关, 蜕膜组织中的Th1/Th2比率更为严重的不平衡在一定程度上反映了子痫前期患者的局部细胞免疫功能的变化, 可能是其发病机制的关键之一, 从细胞因子平衡角度来看, 子痫前期是一种免疫调节程序的障碍, 其主导的Th1型免疫反应阻碍了患者对胎儿异己抗原的免疫耐受。
3.3 Th1/Th2比率失衡与子痫前期病情的关系
子痫前期时是一种“Th1偏移现象”, 在体内异常增加的Th1型细胞因子可促使中性粒细胞黏附在血管内皮上, 促进血管内皮细胞损伤, 并通过内皮系统作用进一步增加中性白细胞的活性, 造成血管内皮细胞形态改变, 细胞膜及细胞器损害等, 并增加内皮细胞单层结构通透性, 使内皮细胞间隙增大, 微血管通透性增加致组织水肿。由于内皮细胞功能的紊乱, 释放血管收缩因子, 导致血压升高。由于子痫前期患者肾小球入球小动脉存在着免疫性损伤, 并且这种损伤程度与临床病情轻重相关。本研究结果显示:Th1/Th2比率与平均动脉压、肝、肾功能的损害呈正相关, 与血小板计数成负相关, 表明了子痫前期患者体内的Th1/Th2平衡倾向于Th1, 随着病情严重程度的增加, 这种倾向的程度有增加趋势, 这与魏军等[10]报道相符。尿蛋白的存在就意味着肾脏的损伤, Th1/Th2平衡与此息息相关。可见, 子痫前期患者体内蜕膜组织的Th1型免疫反应, 最终将导致肾小球内皮细胞损伤, 通透性改变等肾功能损害, 严重时甚至发生衰竭。子痫前期患者由于存在着Th1/Th2平衡向Th1型免疫反应的倾向[2], 以及由此引起其他活性因子失控性分泌, 导致血管内皮细胞损伤、肾小球黏附及通透性改变, 肝脏功能受损, 发生高血压、蛋白尿等一系列病理生理改变, 最终发展为各脏器的损伤。因此, 测定Th1/Th2比率对了解子痫前期患者肝、肾功能损害的程度具有一定的临床意义, 或许可作为子痫前期的病情监测指标。
总之, 子痫前期患者体内确实存在着Th1/Th2免疫细胞不平衡, 其向Th1型免疫反应的倾向程度与病情可能成正相关。母胎界面的局部免疫失调, 可能影响了子痫前期孕妇孕晚期蜕膜中的免疫调节。然而, Th1/Th2细胞的变化是与病因学机制有关还是仅仅为其一种副现象, 导致其不平衡的关键是什么, 这些还有待于进一步研究, 以便为子痫前期的病因学研究及其防治提供理论依据。
参考文献
[1]林其德主编.现代生殖免疫学[M], 北京:人民卫生出版社, 2006:180-181.
[2]吕英璞, 张文真, 卢士燕, 等.辅助性T淋巴细胞1和2比率变化与妊娠期高血压疾病发病的关系[J].中华妇产科杂志, 2006, 41 (2) :103-106.
[3]乐杰主编.妇产科学[M].7版.北京:人民卫生出版社, 2008:92-101.
[4]Wilczynski JR, Tchorzewski H, Glowacka E, et al.In vitro cytokine se-cretion by peripheral blood and decidual lymphocytes during the third trimester of normal pregnancy[J].Gynecol Obstet Invest, 2003, 55 (2) :68-72.
[5]Wegmann TG, Lin H, Guilbert L, et al.Bidirectional cytokine interactions in the maternal-fetal relationship:is successful pregnancy a Th2phe-nomenon[J].Immunol Today, 1993, 14 (7) :256-353.
[6]Reinhard G, Noll A, Schlebusch H, et al.Shifts inthe Th1/Th2balance during human pregnancy correlate with apoptotic changes[J].Biochem Biophys Res Commun, 1998, 245 (3) :933-938.
[7]Minchera NL, Baranov V, Yeung MM, et al.Studies on T-lineage cell in human dacidual of the first trimester pregnancies[J].AmJ Reprod Im-munol, 1990, 24 (3) :67-72.
[8]Wilczynski JR, Tchorzewski H, Banasik M, et al.Lymphocyte subset dis-tribution and cytokine secretioninthird trimester decidua in normal preg-nancy and preeclampsia[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2003, 109 (1) :8-15.
[9]郑纪宁, 刘绍晨, 高玉峰.妊高征患者胎盘床蜕膜T淋巴细胞亚群的表达与临床意义[J].中国妇幼保健, 2006, 21 (13) :1828-1829.
血清Th1/Th2论文 篇3
1材料和方法
1.1临床资料原发性肝癌患者38例, 分为槐耳颗粒组和对照组。槐耳颗粒组18例, 男14例, 女4例, 年龄46～63岁, 平均54.6岁;均经手术和病理证实诊断, 其中肝细胞性肝癌16例, 混合细胞性肝癌2例;肿瘤直径4～7cm;4例AFP>400ng/ml, 8例AFP20～400ng/ml, 6例AFP<20ng/ml;抗-HBc (+) 14例, HBsAb (+) 0例, HBeAg (+) 1例, 抗-HBc (+) 6例, HBcAb (+) 12例。对照组20例, 男16例, 女4例, 年龄39～61岁, 平均49.8岁;均经手术和病理证实诊断, 其中肝细胞性肝癌18例, 胆管细胞性肝癌2例;肿瘤直径3.3～10.3cm;12例AFP>400ng/ml, 4例AFP20～400ng/ml, 4例AFP<20ng/ml;抗-HBc (+) 18例, 抗-HBc (+) 2例, 抗-HBc (+) 2例, HBeAb (+) 10例, 抗-HBc (+) 18例。
1.2标本来源所有患者均于手术前和术后40d抽取肘前静脉血4ml, EDTA K 2抗凝。2h内提取PBMC。
1.3 PBMC的提取用淋巴细胞分离液离心分层法分离提取。
1.4异硫氰酸胍法提取PBMC总RNA。
1.5聚合酶链反应 (PCR) 引物4种细胞因子和β-actin的引物序列见表1。
1.6反转录反应M-MLV反转录酶购自美国GIB-CO。5～10μg总RNA加入5×buffer 4μl, 0.1mol/LDTT 2μl, M-MLV 1μl (200U) , 4×dNTP (10mmol/L, 每种) 1μl, 下游引物P2 0.5μl (50pmol/L) , 总反应体积20μl。37℃作用1h后, 95℃10min灭活M-MLV。
1.7 PCR反应在20μlRT反应产物中, 加入10×buffer 10μl, 25mmol/LMgCl28μl, 4×dN TP 1μl, 上游引物P1 0.5μl (50pmol/L) , 100μl液体石蜡, 95℃5min, 加入TaqDNA聚合酶2μl (1U/μl) 。循环条件:94℃1min, 58℃1min, 72℃1min, 35个循环, 72℃延长7min。
1.8 PCR产物琼脂糖凝胶电泳及其图像分析PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶, 在75V恒压下, 电泳20～30min。紫外灯下观察并拍照。用美国Kodak凝胶分析系统, 以β-actin为内参照, 表达强度=细胞因子A值/β-actinA值。按表达强度的大小将结果分为:≥0.75 (++++) 、0.74～0.5 (+++) 、0.49～0.25 (++) 、≤0.24 (+) 、无表达 (-) 。
1.9 Th1/Th2平衡状况的判断以IFN-γ和IL-2代表Th1类细胞因子, 以IL-10和IL-4代表Th2类细胞因子。如果仅IFN-γ和 (或) IL-2表达, 或者其表达强度高, 则为Th1状态;如果仅IL-10和 (或) IL-4表达, 或者其表达强度高, 则为Th2状态。如果4种细胞因子均未表达或表达强度一致或类似, 则为Th0型表达。
1.10统计学处理方法χ2检验。
2结果
两组患者Th1/Th2状态见表2。槐耳颗粒组与对照组术前Th1、Th2差异均无统计学意义 (P>0.05) 。槐耳颗粒组术后第40天14例为Th1状态, 对照组术后第40天8例为Th1状态, 前者比后者明显增高, 差异有统计学意义 (P=0.025) 。两组术后第40天Th2、Th0状态差异无统计学意义 (P>0.05) 。
注:*χ2=5.550, P=0.025
3讨论
槐耳颗粒主要活性成分是一种多糖蛋白 (PS-T) , 具有较好的免疫增强调节作用。可诱导人体产生IFN-α、γ, 达到对肿瘤细胞抑制及识别, 促使T淋巴细胞分裂、繁殖、成熟、分化、调整抑制性与辅助性T细胞的比例, 产生某些细胞因子, 如IL-2对NK细胞激活有协同作用, 是一种极佳的免疫调节剂[1]。槐耳颗粒广泛应用于各种肿瘤的治疗, 对其抗肿瘤的原理的研究也逐步深入。实验室研究方面, 陈效平等[2]用槐耳清膏联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导 (TRAIL) 作用于体外肝癌细胞株HepG 2-AMD及肝细胞株LO 2, 结果显示对前者增殖有明显抑制作用, 对后者无明显作用。另外张巨波等[3]利用裸鼠人肝癌转移模型LCI-D 20[4]进行槐耳清膏联合氟尿嘧啶抑制肝癌生长和转移的研究, 结果表明应用槐耳清膏可抑制肿瘤生长以及局部和肺转移, 并与剂量相关, 而与传统化疗药物5-FU联用, 效果更为明显。与槐耳清膏联用, 荷肝癌裸鼠对5-FU不良反应的耐受性得到提高, 可加大5-FU应用剂量, 进一步提高对肝癌生长转移的抑制效果。临床研究方面, 蒋梅和周岱翰[5]观察98例中晚期原发性肝癌服用槐耳颗粒治疗效果, 认为可使Ⅱ期患者获得一定的3年生存率, Ⅲ期6个月生存率接近70%, 表明槐耳可使原发性肝癌患者在一定程度上获得带瘤生存, 从而延长总生存时间。赵建军等[6]观察槐耳颗粒对肝癌术后复发的影响, 认为槐耳颗粒可能通过下调HCC患者血清VEGF表达, 降低肝癌复发转移的可能。
以前的研究都未明确槐耳颗粒的作用机理, 而本实验亦能在探讨其可能的作用机理。辅助性T细胞Th1/Th2亚群提出以来, 人们对其在机体免疫反应中的作用和疾病时Th1/Th2状态进行了大量的研究。正常机体的Th1/Th2型细胞因子处于动态平衡, 当这个平衡失调并向Th1或Th2转化时, 称为Th1/Th2的偏移。病理状态下, 如外伤、手术、感染和肿瘤等, 均存在向Th2的偏移, 患者处于Th2细胞因子优势状态不利于创伤恢复和抗肿瘤免疫。细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要方式, IFN-γ、IL-2和TNF-β等细胞因子在机体的抗肿瘤免疫中发挥重要作用, IL-2可刺激NK细胞和CTL细胞的杀瘤活性, 而IFN-γ具有较强的抗肿瘤和免疫调节作用, TNF-β可直接造成肿瘤细胞的凋亡。以上细胞因子由Th1细胞直接分泌, 因此机体要处于良好的抗肿瘤状态, Th1细胞应占优势。本实验结果证明槐耳颗粒组比单纯切除组术后40dTh1型细胞因子表达明显增高, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。这说明肝癌患者肿瘤切除后口服槐耳颗粒1个月可促使Th1型细胞因子表达, 使Th1/Th2偏向Th1状态, 有利于肿瘤的治疗。所以促使原发性肝癌术后机体Th1型细胞因子增多, 可能是槐耳颗粒抗肿瘤的作用机理之一。
摘要：目的研究槐耳颗粒对原发性肝癌 (PHC) 手术切除后病人Th1/Th2漂移的影响。方法以IFN-γ和IL-2代表Th1类细胞因子, IL-4和IL-10代表Th2类细胞因子, 以反转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 检测18例原发性肝癌患者术前和术后40d即服用槐耳颗粒1个月后外周血单个核细胞 (PBMC) Th1/Th2类细胞因子mRNA的表达, 以20例原发性肝癌单纯手术切除患者作为对照。结果槐耳颗粒组与单纯手术切除组比较术前Th1型细胞因子表达无显著差异, 术后40dTh1型细胞因子表达明显增高, 有差异有统计学意义 (P=0.025) 。结论服用槐耳颗粒促使PHC手术切除后患者转向Th1状态。
关键词：肝癌,槐耳颗粒,Th1,Th2,细胞因子,逆转录聚合酶链反应
参考文献
[1]郑有合, 刘英杰.槐耳颗粒对晚期原发性肝癌疗效分析.医学信息, 2006, 19 (10) :1815.
[2]陈效平, 何松青, 赵旭.槐耳清膏联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对肝癌细胞生长的影响.中华外科杂志, 2007, 45 (9) :1524.
[3]张巨波, 孙惠川, 薛琼.槐耳清膏联合氟尿嘧啶抑制肝癌生长转移的实验研究.中华外科杂志, 2007, 45 (9) :632.
[4]Sun FX, TangZY, Lui KD, etal.Establishimentof metastatic model of human hepatocellular carcinoma in nude mice viaorthotopic implanta-tion of histologically intact tissues.Int J Cancer, 1196, 66:239-243.
[5]蒋梅, 周岱翰.槐耳颗粒治疗中晚期原发性肝癌98例.上海中医药杂志, 2004, 38 (6) :21.
血清Th1/Th2论文 篇4
关键词：哮喘,儿童,Th1/Th2细胞因子
哮喘是由多类细胞及活性因子参与的慢性气道炎症,是儿童常见的慢性疾病。近年来儿童哮喘的发病率呈上升趋势,已成为威胁儿童健康和影响儿童生活质量的慢性病之一。对哮喘患儿Th1/Th2细胞的研究愈来愈受到临床医师的关注,按所分泌细胞因子不同,Th细胞分为Th1和Th2型。哮喘的炎症迟发阶段是由Th细胞调节的,Th1/Th2平衡失调是变态性哮喘发病的重要基础。Th1细胞以分泌IFN-γ、IL-12为特征,Th2细胞以分泌IL-4、IL-10为特征[1,2]。我们检测哮喘发作期患儿诱导痰Th1型细胞因子IL-12、IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4、IL-10以及Ig E、嗜酸细胞计数(EOS%),探讨哮喘患儿Th1和Th2的漂移。
1 对象与方法
1.1 对象
哮喘患儿组:诊断标准按照儿童哮喘防治常规(试行)[3],均为我院住院或门、急诊哮喘急性发作期患儿72例,男48例,女24例,年龄3岁～6岁。受检者于试验前12 h未用过糖皮质激素。对照组:在幼儿园采用全国哮喘流行病学调查问卷筛出健康儿童30例作为正常对照组,男17例,女13例,年龄4岁～6岁。哮喘组与正常对照组年龄、身高、体重差异无显著性(P>0.05)。
1.2 方法
1.2.1 标本采集
诱导前先进行肺功能测试。对病情较重的部分患儿于试验前15 min吸入沙丁胺醇200μg,预防吸入高张盐水后可能加重病情。超声雾化吸入5%高张盐水15 min～20 min,每5 min嘱患儿清洁口腔和咽部,然后用力深咳,将咳出的痰液用无菌痰液收集器经口咽部吸取,直至痰量达到约1 ml。同时观测小儿呼吸频率、喘息情况。为防止混入唾液,采用肉眼和倒置显微镜观察的方法去除唾液。加等量生理盐水于合格痰样中,漩涡振荡5 min,3 000转/min离心10 min,取上清液于-30℃冻存待测。
1.2.2 IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ的检测
取处理后的诱导痰上清液,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定。试剂盒购自晶美公司。
1.2.3 细胞计数及分类
用双盲法对诱导痰进行细胞计数、分类。新鲜痰标本取痰栓压涂片2张,痰样镜检见鳞状上皮细胞/有核细胞<20%,为样本合格。经White Giemsa染色,计数200个非上皮细胞并进行细胞分类,结果以×106/ml表示,计算嗜酸性细胞百分比。
1.3 统计学方法
所有数据均以表示,采用SPSS11.0软件进行处理,组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 正常组和哮喘患儿组Ig E测定有显著差别(P<0.01),EOS%测定2组结果P<0.01,Ig E和EOS%呈正相关变化,见表1。
2.2 哮喘患儿组IL-4、IL-10的变化呈正相关,均高于正常组(P<0.01),患儿组和正常组IFN-γ、IL-12测定差异无显著意义(P>0.05)呈正相关。IFN-γ和IL-4呈负相关变化,见表2。
3 讨论
支气管哮喘是以嗜酸粒细胞和T细胞浸润引起的慢性气道炎症、气道高反应性为特征。Th1/Th2免疫失衡参与哮喘的发生发展需要Th1/Th2细胞因子的功能活性来实现[4]。研究表明,辅助性T淋巴细胞亚群Th1和Th2淋巴细胞通过所分泌的细胞因子相互调节,以维持机体免疫功能的平衡。Th1细胞分泌IFN-γ、IL-12等,Th2细胞分泌IL-4、IL-10等。资料显示:对IL-4、IFN-γ在成人哮喘中的研究较多,两者都参与机体Ig E的产生,与哮喘密切相关,其中IL-4在Ig E依赖哮喘炎症过程中是起主导重要作用的Th2淋巴细胞因子,是B细胞转换为Ig E抗体的重要因子,也是Th细胞向Th2表型成熟的重要细胞因子。而IFN-γ则被认为是一种非常重要的抗支气管哮喘的Th1淋巴细胞因子[5]。
Th1/Th2细胞效应在通常情况下保持着相对的平衡,这一平衡的维持是相当错综复杂的。在疾病状态下,Th1/Th2功能的消长也不完全取决于Th细胞本身的功能及所产生的细胞因子,作用于靶器官的细胞因子反馈Th1/Th2之间的平衡。本研究直接检测诱导痰中的Th细胞因子,结果显示:(1)Th1类细胞因子(IFN-γ、IL-12)在变态反应哮喘患儿组与正常对照组无显著性差异;(2)哮喘组Th2类细胞因子(IL-4、IL-10)高于正常组,有显著性变化;(3)EOS%和Ig E哮喘组高于正常组。从以上结果可以看出哮喘的免疫反应主要以Th2型免疫应答为主,诱导痰中的EOS%和Ig E显著升高也和Th2型免疫应答相一致。Th2细胞通过分泌的细胞因子作用气道,引起气道高反应性炎症。气道炎症导致气道损伤,造成上皮脱落、神经末梢暴露、微血管渗漏和平滑肌收缩等多种因素均使气道对刺激的反应性增强。如果能通过抑制Th2功能减少细胞因子的合成和释放,或者应用克隆抗体阻断细胞因子活性等方法促进Th2亚群向Th1亚群转换,而阻止哮喘临床发作,可为临床提供一种治疗思路。
参考文献
[1]刘俊铎,刘志红.Th1/Th2细胞与自身免疫性疾病[J].肾脏病与透析肾移植杂志,1997,6(6):555
[2]Sszabo SJ,DIghe AS,Gubler U,et al.Regulation of the interleukin-12R-β2subunit expression in developingThelper l and Th2cells[J].J Exp Med,1997,185(8):817～825
[3]全国儿科哮喘防治协作组.儿童哮喘防治常规(试行)[J].中华儿科杂志,1998,36(12):747～751
[4]Ngoc PL,Gold DR,Tzianabos AO,et al.Cytokines,allergy,and asthma[J].Curr Opin lmmunol,2005,5(2):161～166
血清Th1/Th2论文 篇5
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枸橼酸舒芬太尼注射液5 m L(375μg),宜昌人福药业有限责任公司提供;IFN-γELISA试剂盒、IL-2 ELISA试剂盒、IL-4 ELISA试剂盒和IL-10ELISA试剂盒由尚柏生物医学技术有限公司提供。
1.2 仪器与设备
ATL 60 TCI泵购自济南大诺科技有限公司;TGL-16 G台式离心机购自上海医用分析仪器厂;Model 680酶标仪购自美国伯乐公司。
1.3 临床资料
1.3.1 一般资料
择期行直肠癌根治术患者40例,年龄49~69岁;体重45~73 kg;男性32例,女性8例;ASAⅠ或Ⅱ级。排除病例:(1)有阿片药物滥用史及过敏史,酗酒史;(2)低血压及低血容量者;(3)肝肾功能异常;(4)2周前用过单氨氧化酶抑制剂者;(5)患有呼吸抑制疾病的患者。随机分为两组,舒芬太尼组(SF组)和芬太尼组(F组),每组20例。
1.3.2 麻醉方法
两组均术前30 min肌内注射阿托品0.5 mg。患者入手术室后监测血压、脉搏及血氧饱和度。同时开放静脉,麻醉诱导为咪达唑仑0.05mg/kg、得普利麻2 mg/kg及维库溴铵0.1 mg/kg。SF组舒芬太尼血浆靶浓度为0.5 ng/mL;F组芬太尼血浆靶浓度为5 ng/m L。气管内插管成功后连接麻醉机行机械通气控制呼吸,调整呼吸参数,设定潮气量8~10 m L/mg,呼吸频率10~12次/min,吸呼比1∶2,维持PETCO235~45 mm Hg,术中用多功能监测仪连续监测ECG、NIBP、SpO2及PETCO2,维持呼吸、循环参数稳定;术中用药均为靶控输注(TCI),得普利麻靶浓度4~6μg/m L,维库溴铵1.0~1.5μg/(kg·min)维持肌松,SF组舒芬太尼血浆靶浓度为0.5 ng/mL,F组芬太尼血浆靶浓度为0.5 ng/mL维持不变。手术结束前30 min停止输入舒芬太尼和芬太尼。术毕患者生命体征平稳,拔出气管导管,安全返回病房。患者术中输液为复方乳酸钠液、6%羟乙基淀粉。
1.3.3 术后镇痛
所有患者术后行自控静脉镇痛(PCIA)。SF组:舒芬太尼0.002 mg/kg+格拉司琼3mg+生理盐水至100 m L;F组:芬太尼0.02 mg/kg+格拉司琼3 mg+生理盐水至100 m L。镇痛泵参数设置:输注速率为2 m L/h,单次追加剂量为0.5 m L,锁定时间为15 min,镇痛时间48 h。
1.3.4 标本采集及观察指标
分别于麻醉诱导前(T0)、术后6 h(T1)、12 h(T2)、24 h(T3)抽取外周静脉血3 m L注入抗凝管中,以3 000 r/min的速度离心10 min,取上层血浆于-20℃保存。检测Thl类细胞因子IFN-γ、IL-2、Th2类细胞因子IL-4、IL-10。
1.4 统计学分析
所有数据采用SPSS 13.0软件包进行分析。计数资料用χ2检验。计量数据以均数±标准差表示,分别采用方差分析和t检验。检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 两组患者一般情况比较
两组患者在年龄、体重、ASA分级、手术时间等方面差异无统计学意义(P>0.05),见表1。
注:覮与F组比较,P>0.05
2.2 两组各时点细胞因子水平
SF组TI、T2、T3时点IFN-γ、IL-2水平均降低,IL-4、IL-10水平升高,与T0比较差异有统计学意义(P<0.05),T4时点IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平与T0比较无统计学意义(P>0.05)。F组TI、T2、T3、T4各时相点IFN-γ、IL-2水平降低,IL-4、IL-10水升高,与T0差异有统计学意义(P<0.05);SF组与F组比较:T0时相点差异无统计学意义(P>0.05),TI、T2、T3、T4时相点细胞因子水平差异有统计学意义(P<0.05),F组IFN-γ、IL-2水平降低显著,IL-4、IL-10水平升高显著。舒芬太尼和芬太尼通过影响IFN-γ、IL-2和IL-4、IL-10的水平,影响了直肠癌根治术患者的Th1/Th2平衡,使Th1细胞因子水平降低,Th2细胞因子水平增高。但舒芬太尼对Th1/Th2平衡的影响程度相对较小,时间较短。见表2。
3 讨论
机体的抗肿瘤作用,存在以Thl介导的细胞免疫为主,一旦由Thl向Th2漂移,造成免疫抑制状态,机体的抗肿瘤免疫将受到严重干扰。Thl和Th2是初始CD4+T辅助淋巴细胞(Th)两个功能亚群,Th1、Th2细胞分泌的细胞因子迥然不同,Th1细胞可分泌TNF-α、IL-1β、IL-2、IFN-γ等细胞因子,主导细胞免疫;而Th2细胞可产生IL-10、IL-4等细胞因子,参与体液免疫,可藉此区别Th1、Th2细胞。YAMAMURA等[2]首次发现肿瘤患者体内存在Th2型细胞因子优势表达,Th2型细胞因子的优势表达不利于机体以细胞免疫为主的抗肿瘤免疫。现已发现,非小细胞肺癌、直肠癌、卵巢癌、绒癌、黑色素瘤、胃癌、胃肉瘤、淋巴瘤及鼻咽癌等多种肿瘤患者体内Th2型细胞因子占优势[3]。
有文献报道,应激反应和麻醉药物可使Th1和Th2细胞平衡向Th2型免疫反应改变,这对肿瘤患者术后转归显然是不利的[4,5,6]。因此,选择对Th细胞分化影响小的麻醉药物对肿瘤患者细胞免疫功能有利。以往的研究证实选择合适的麻醉和(或)镇痛方法对T淋巴细胞亚群比值的改善有所裨益[7]。
舒芬太尼是芬太尼的衍生物,在阿片类制剂中舒芬太尼的镇痛效应最强。随着对舒芬太尼的药理特性和临床应用认识的不断深入,已证实舒芬太尼具有分布容积小、消除半衰期短、清除率高、苏醒时间短于芬太尼等优点,舒芬太尼起效比芬太尼快,镇痛强度和作用时间比芬太尼长,且对呼吸和血流动力学的影响小[8]。LI等[9]证实了芬太尼对机体免疫功能有抑制作用,陈平等[10,11]的体外实验也发现舒芬太尼可不同程度地介导Th0细胞向Th2细胞分化,使Thl/Th2的平衡向Th2偏移。舒芬太尼应用于直肠癌根治术患者中对Th1/Th2平衡的影响未见报道,笔者研究舒芬太尼和芬太尼对直肠癌患者IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的影响,显示麻醉诱导和维持中无论应用舒芬太尼还是应用芬太尼都可介导Th0细胞向Th2细胞分化,研究结果与报道一致,但舒芬太尼在一定时间内抑制了IFN-γ、IL-2的降低,亦抑制IL-4、IL-10水平的升高,且恢复时间较短。舒芬太尼比芬太尼对Th1/Th2平衡影响程度相对较小,时间较短,可以相对纠正失衡的Th1/Th2细胞因子网络,逆转肿瘤细胞或其宿主机体的Th1/Th2的异常漂移,有利于以细胞免疫为主的抗肿瘤免疫能力的恢复,有利于直肠癌患者的预后。
已有实验证实经典的阿片类镇痛药物———吗啡可以介导Th0细胞向Th2分化,并认为这种作用是通过μ-阿片受体介导的[6],舒芬太尼是高选择性的μ-受体激动剂,舒芬太尼对m1-受体(镇痛)较m2-受体(呼吸抑制)有更高的选择性[12],其镇痛作用是吗啡的2 000~4 000倍[13],笔者实验结果显示舒芬太尼对Th0细胞分化的影响与吗啡一致,推测其对Th1/Th2平衡的影响也是通过μ-阿片受体介导的。舒芬太尼影响Th1/Th2平衡的机制有待于进一步探讨和研究。
血清Th1/Th2论文 篇6
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取2010年5月—2011年2月住院行冠状动脉介入治疗的ACS患者60例,包括不稳定型心绞痛35例,急性ST段抬高型心肌梗死6例,急性非ST段抬高型心肌梗死9例;男39例,女21例;年龄(66.3±7.4)岁。急性心肌梗死诊断依据WHO标准:持续典型的胸痛>30 min,典型心电图动态变化,心肌酶(肌酸磷酸激酶同工酶或肌钙蛋白)动态变化,具有以上中任何2项确诊。根据随机数字表法,分为两组。A组30例,常规西药治疗组。B组30例,常规西药基础上加参芪扶正注射液(丽珠集团利民制药厂,每日250 mL),术前1 d开始,共10 d。根据脉象舌象等将急性冠脉综合征患者分为实证和虚证组,参照《中华人民共和国中医药行业标准病证诊断疗效标准(ZY/T001.1-94)》中胸痹心痛证候诊断标准,将诊为血瘀、寒凝、痰浊者归为胸痹实证,诊为气虚、阴虚、阳虚者归为胸痹虚证。辨证分型由两名副主任以上中西医结合心血管医师确认。排除标准:伴其他心脏病者;肝肾功能不全者;并发感染、肿瘤或免疫系统疾病;伴脑血管疾病;各种凝血功能异常性疾病;应用炎症抑制药物,如非甾体类抗炎药、类固醇及鸦片类药物。两组年龄、性别、吸烟史、饮酒、高血压病、糖尿病、体重指数(BMI)、血糖及血脂无统计学意义。
1.2 研究方法
1.2.1 标本收集
两组患者冠脉介入术前1 d、术后1 d、术后3 d,术后10 d清晨空腹肘静脉抽血,30 min后1 000 r/min离心10 min,-20 ℃保存待测干扰素γ(INF-γ)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素10( IL-10)浓度。
1.2.2 INF-γ、IL-2、IL-4、 IL-10测定
采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA),试剂盒由济南雨同生物工程有限公司提供。抗人INF-γ(或IL-2、IL-4、 IL-10)单抗包被于酶标板上,加入标本/标准品与之结合,再加入生物素化检测抗体,两抗体与标准品/标本中的INF-γ(或IL-2、IL-4、 IL-10)形成免疫复合物,再加入辣根过氧化物酶标记的亲合素,生物素与亲合素特异性结合,加入显色剂,产生的颜色与INF-γ(或IL-2、IL-4、 IL-10)浓度有关,通过绘制标准曲线求出标本中INF-γ(或IL-2、IL-4、 IL-10)浓度。
1.3 统计学处理
计量资料以均数±标准差
2 结 果
2.1 两组临床基本资料对比(见表1)
注:两组各项比较,P>0.05。FBG为空腹血糖;TC为总胆固醇;TG为三酰甘油;LDL-C为低密度脂蛋白;HDL-C为高密度脂蛋白。
2.2 两组INF-γ、IL-2、IL-4、 IL-10的变化
两组术前各项无统计学意义。两组术后1 d、3 d、10 d血清中IFN-γ、IL-2水平均较术前降低(P<0.05),相同时段治疗组IFN-γ、IL-2水平低于对照组(P<0.05)。详见表2。
与本组术前比较,1)P<0.05;与对照组同时段比较,2)P<0.05
2.3 虚实证候间术前INF-γ、IL-2、IL-4、 IL-10比较
虚实证候间术前IFN-γ水平、IL-2水平有统计学意义(P<0.05),均为虚证组大于实证组;IL-4水平、IL-10水平虚实证候间无统计学意义。详见表3。
ng/L
与实证组比较,1)P<0.05
2.4 ACS患者中医证型分布情况
ACS介入治疗前中医证候分布以血瘀证38例(63.3%)、痰浊证26例(43.3%)、气虚证22例(36.7%)最为常见。证候频次由多到少排列为:血瘀证>痰浊证>气虚证>阴虚证>阳虚证>寒凝证。ACS介入治疗后10 d中医证候分布以血瘀证35例(58.3%)、气虚证27例(45.0%)、痰浊证25例(41.7%)最为常见。由多到少排列为:血瘀证>气虚证>痰浊证>阴虚证>阳虚证>寒凝证。经卡方检验,证型虚实差异有统计学意义,表明术前、术后证型虚实分布存在差异,即术前实证较多,术后实证减少,虚证有所增加。详见表4。
例(%)
3 讨 论
在炎症反应过程中,免疫反应在诱发、加剧炎症反应时亦起到一定作用。T淋巴细胞参与ACS患者斑块的破裂[1],亦有证据表明Th1在冠心病发病机制中起重要作用[2]。以表达IL-2和INF-γ为主的Th1型细胞,可以增强杀伤细胞的细胞毒性作用,激发迟发型超敏反应,介导细胞免疫应答;以表达IL-4、IL-5、IL-10为主的Th2型细胞,可以促进抗体的产生,介导体液免疫应答。正常情况下,Th1、Th2细胞处于平衡状态,如Th1/Th2平衡失调,并向Th1或Th2状态转化的趋势称为Th1/Th2的漂移。研究发现,ACS患者中存在Th1/Th2漂移,主要表现为Th1细胞功能亢进,且Th1/Th2失衡程度与ACS严重程度及ACS患者预后均相关[3,4,5]。INF-γ、IL-2是Th1细胞分泌的主要细胞因子之一,IFN-γ可激活巨噬细胞,一方面可释放多种蛋白水解酶如金属蛋白酶和组织蛋白酶,消化纤维帽的基质成分,使其变薄;另一方面,IFN-γ作用于平滑肌细胞,抑制间质胶原基因的表达,使胶原的合成减少,斑块的稳定性下降,严重时引起斑块破裂,进而在斑块表面形成血栓,出现动脉粥样硬化的临床事件。实验表明,在人类AS斑块中,均有INF-γ、IL-2的表达,从而证明INF-γ、IL-2为致AS物质[6,7,8]。IL-10、IL-4是Th2细胞分泌的主要细胞因子之一,IL-10可以阻止斑块变大,并且可以促进斑块稳定[9,10,11]。IL-4通常被认为是一种抗炎细胞因子,可延缓动脉粥样硬化的进展,在一定程度上起到保护作用。
对机体的免疫调节作用是中医药的重要特点和优势。中医药治疗是双向、多向、多靶点治疗,许多中医药在调节逆转Th1/Th2漂移方面发挥较强的作用。参芪扶正注射液是从党参和黄芪中提取的纯中药制剂,中医学认为党参有益气、养津、补血作用,黄芪有补气升阳、卫中固表作用。现代药理研究表明,党参具有增强机体免疫功能,增强造血功能,抗应激,强心,抗休克,调节血压,抗心肌缺血和抑制血小板聚集等作用[12]。 黄芪具有明显强心作用,通过抑制磷酸二酯酶活性,抑制钠-钾ATP酶活性,增加心肌β受体数目,提高SOD活性,维持一氧化氮浓度等药理作用保护心肌[13]。党参和黄芪均有抗凝、降低血小板黏附性、增强细胞抗缺氧能力和抗氧自由基、减少心肌缺血-再灌注损伤的作用[14]。
本研究显示,常规西药治疗组和参芪扶正注射液组术后Th1 ( IFN-γ和IL-2)细胞因子分泌均减少(P<0.05);介入治疗可抑制ACS患者体内的炎症和免疫反应,与常规西药治疗组相比,联合参芪扶正注射液干预治疗后,ACS患者血浆Th1细胞因子水平与对照组相比明显降低,说明Th1因子的降低与参芪扶正注射液的免疫调节作用有关,血浆Th1细胞因子下降与参芪扶正注射液对ACS患者外周血Th1 /Th2淋巴细胞失衡的调节效应有关。进一步说明联合参芪扶正注射液干预治疗能明显降低ACS患者炎症因子IFN-γ、IL-2水平,使Th1/Th2细胞恢复至相对平衡状态,优于单纯西药组,有效改善了机体内的炎症状态。
虽然目前有关冠心病患者Th1/Th2漂移与中医辨证的相关性研究仍有限,但已经出现了冠心病患者免疫功能紊乱与中医辨证的相关性研究。廖奕华等[15]对冠心病患者血瘀证免疫功能的研究,发现血瘀证与体液免疫功能增强而细胞免疫功能低下相关。本研究发现,虚证患者IFN-γ水平、IL-2水平均较实证患者高,提示Th1/Th2向Th1方向的漂移与中医虚证相关。
急性冠脉综合征属于中医“胸痹”、“心痛”、“真心痛”的范畴。病位在心,其发病多与寒邪内侵、饮食失调、情志失节、劳倦内伤、年迈体虚等因素有关。病机以本虚标实为主,虚实夹杂。本虚以脏腑气血阴阳亏损、功能失调为主;标实则以痰浊、血瘀、寒凝等痹遏胸阳、阻滞心脉为主。已有研究表明,气虚证、血瘀证是冠心病发病的证候危险因素,出现气虚证、血瘀证的患者易于患冠心病[16],陈可冀等[17]认为冠心病患者施用介入治疗手术,从中医学角度看属于外源性创伤,其病理过程,与中医学的“心脉痹阻 ”、“心脉不通” 有雷同之处,属于“血瘀证” 范畴。
本研究发现,冠脉介入术后与术前比较,气虚证加重,血瘀证、寒凝证减轻,阳虚证、阴虚证、痰浊证变化不大。冠心病介入治疗术后以本虚为主,手术的“破血”作用,易耗伤正气,故本虚症状加重。正气不足,邪必所凑,气血不能调和,瘀血、痰浊内生,再次瘀阻脉络,发为胸痛。因而冠脉介入治疗术后的病机特点是本虚为主,兼有实邪。介入治疗虽然暂时解决了冠状动脉的狭窄状态,但是患者整体的病理状态并未改变,患者本虚标实的病机本质仍然存在。通过对ACS介入术前后中医证型的变化,发现气虚、血瘀是冠心病的主要病机,冠脉介入治疗开通闭塞血管,使狭窄或闭塞的冠脉得到再通,即“祛瘀”,恢复了缺血心肌的血供,所以血瘀证所占比例于术后减少,提示介入治疗对血瘀证有一定的改善作用,但对气虚证无改善作用,考虑患者本身脏腑功能虚衰日久,本虚仍在,动则耗气,加之瘀血亦在,血瘀可反作用于气,致气虚证加重,故冠心病介入术后患者的中医辨证施治方案应以“益气活血,祛瘀通脉”为主。
摘要：目的 探讨参芪扶正注射液对急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)患者冠脉介入治疗术后外周血Th1/Th2漂移的影响及胸痹虚实证候的相关性。方法 选取60例行经皮冠状动脉介入治疗的ACS患者,随机分为参芪扶正注射液组和常规治疗组。参芪扶正治疗组30例,在常规治疗组的基础上加用参芪扶正注射液,术前1d开始连续用药10d。两组于术前1d、术后1d、术后3d,术后10d抽取外周静脉血,应用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测干扰素γ(inter-feron-γ,IFN-γ)、白介素2(interleukin-2,IL-2)、白介素4(interleukin-4,IL-4)、白介素10(interleukin-10),并进行中医胸痹辨证分型。结果 两组术前血清中INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平差异无统计学意义。两组术后1d、3d、10d血清IFN-γ、IL-2水平均较术前降低(P<0.05),相同时段治疗组IFN-γ、IL-2水平明显低于对照组(P<0.05),IL-4、IL-10在术前、术后无显著性改变。虚证组IL-2、IFN-γ水平均较实证组明显增高(P<0.05)。冠脉介入术前、术后证型虚实分布存在差异,介入治疗后气虚证增加,血瘀证、寒凝证减少。结论 参芪扶正注射液能明显降低ACS患者介入术后Th1细胞因子水平,使Th1/Th2细胞恢复至相对平衡状态。
血清Th1/Th2论文 篇7
1材料
1.1 实验动物
健康雄性Wistar大鼠90只, 体重 (110±10) g, SPF级, 由浙江中医药大学动物实验中心提供。
1.2 实验药品、试剂与仪器
温化蠲痹方 (防风、威灵仙、蜈蚣、白芥子、全蝎、白芷、忍冬藤、薏苡仁、炒白术) 由浙江省中西医结合医院制剂室煎药完成 (含生药1g/ml) ;甲氨喋呤 (methotrexate, MTX) :上海信谊制药有限公司, 批号:080907。牛Ⅱ型胶原 (type Ⅱ collegan of bovine, BCⅡ) :Chondrex公司;不完全弗氏佐剂 (Incomplete Freund’s Adjuvant, IFA) :Chondrex公司;冰醋酸:杭州化学试剂有限公司;IL-4 ELISA试剂盒:上海森雄科技实业有限公司;IFN-γ ELISA试剂盒:上海森雄科技实业有限公司。足趾容积测量仪:山东医学科学院设备厂。
2研究方法
2.1 模型建立与分组
在无菌条件下, 用0.1mol/L冰醋酸在冰浴中充分溶解牛Ⅱ型胶原, 浓度为4mg/ml, 置于4℃冰箱过夜后, 与IFA等体积混合、振荡乳化, 制成BCⅡ乳剂, 浓度为2mg/ml, 置4℃冰箱保存备用。造模参照《药理学实验指南-新药发现和药理学评价》[3]及相关文献[5]的造模方法 (稍有改良) , 于造模组大鼠颈、背部5个部位进行皮内注射, 总量0.5ml, 含1mg BCⅡ型胶原。正常组注射0.5ml生理盐水。致炎前, 用足趾容积测量仪测量每只大鼠左后足足趾容积, 作为致炎前足趾基础容积。每周进行关节炎指数 (arthritis index, AI) 评分。于首次注射BCⅡ乳剂后18天, 根据AI评分进行模型成功评判[6]。AI标准分级如下:0分:无红肿;1分:趾关节稍肿, 足爪或足垫单个区域炎症;2分:关节轻度红肿, 足爪和足垫或踝关节2个区域以上的炎症;3分:关节中度红肿, 轻度功能障碍;4分:关节重度红肿, 僵直甚至畸形, 严重功能障碍。关节炎指数评分>4分, 单侧左足外踝以下隆起的体积>1.6ml为造模成功。
40只Wistar大鼠随机分为正常对照组10只 (简称正常组) 和造模组, 造模组大鼠建立CIA模型。造模成功后, 随机分为3组:模型组10只、温化蠲痹方组10只 (简称中药组) 、MTX组10只。
2.2 给药方法
于造模成功后开始给药, 中药组大鼠按22.9g/kg·d-1剂量灌胃中药温化蠲痹方, 正常组、模型组灌胃等量生理盐水, 均每日1次;MTX组大鼠按0.78mg/kg·W-1剂量灌胃MTX混悬液, 每周1次。均连续用药30天。
2.3 观测指标及测定
2.3.1 关节炎指数 (AI) 评分
于第18天造模成功后及用药结束后进行AI评分 (评分标准如前述) 。
2.3.2 外周血Th1/Th2细胞检测
眼眶取血2ml于试管中, 静置2小时, 2000r/min离心4分钟, 然后提取血浆, -20℃保存备用。IL-4、IFN-γ采用双抗体夹心ELISA法测定, 具体操作按试剂盒说明书要求进行, 于酶标仪450nm处读数。
2.4 统计学方法
数据采用SPSS12.0统计软件进行处理, 计量资料以均数±标准差undefined表示, 组间比较使用单因素方差分析, 组内比较使用配对t检验。
3结果
3.1 各组大鼠AI评分的比较
见表1。
与正常组比较*P<0.05, **P<0.01;与模型组比较△P<0.05, △△P<0.01;与治疗前比较▲P<0.05, ▲▲P<0.01
3.2 各组大鼠外周血Th1/Th2细胞平衡的比较
见表2。
与正常组比较*P<0.05, **P<0.01;与模型组比较△P<0.05, △△P<0.01
4讨论
Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型是DE Trentham等于1977年创立。尽管CIA是一种实验诱发的疾病, 不出现病情的波动和复发情况, 也没有RA的皮下结节、浆膜炎、血管炎等表现, 不出现类风湿因子及抗核抗体。但是, 这种动物病理模型在症状学、病理学、免疫学改变和病理机制等方面与人类RA有许多相似特征, 到目前为止仍是研究治疗RA的理想动物模型[7]。在我们的实验中, 造模后第18天, 造模组大鼠关节肿胀明显, AI评分>4分, 以及左后足足趾容积>1.6ml, 这与国外文献报道一致, 提示本实验CIA模型制备成功。
RA属于中医学“痹证”范畴。我们通过长期临床观察, 认为RA的基本病因病机为本虚标实、寒热错杂、痰瘀痹阻。素体阳虚、或阳盛、或阴虚阳亢、或失治误治等因素, 风寒湿邪侵袭, 出现热痹及阴虚内热, 或湿热, 伴有畏寒肢冷的症状, 呈现寒热错杂之征;外邪痹阻肌肤、筋脉、关节, 致水湿不运聚而为痰, 血行不畅滞而为瘀, 痰瘀胶结, 病情难愈。据此确立温化蠲痹法, 包括了温阳、化热、化湿、化痰及化瘀治法, 拟温化蠲痹方, 方中防风、白芷、威灵仙、全蝎、蜈蚣均为辛温之品, 具有温经通络、祛风除湿、消肿止痛之功;全蝎、蜈蚣配伍, 剔络搜邪;僵蚕与白芥子相伍, 具有化痰消肿散结、通络止痛之功;忍冬藤、丹参、薏苡仁性寒, 既能清热除痹、活血化瘀, 又能健脾而保护脾胃。全方配伍寒温并用, 痰瘀并治, 具有温通经络、化湿、化热 (毒) 、化痰、化瘀的功效, 使寒散、湿化、热除、痰消、瘀祛而治疗RA。
致炎性的Th1细胞及其细胞因子IFN-γ和抗炎性的Th2细胞及其细胞因子IL-4的失衡在RA的发病机制中起重要作用[8]。IL-4能下调Th1应答, 而IFN-γ可抑制Th2细胞增殖。这种动态平衡一旦被打破, 机体则处于Th1占优势或Th2占优势的Th1/Th2的漂移现象, 并由此而发病。T细胞在CIA的起始过程中发挥主导作用, 其中T淋巴细胞表达Th1表型是起始疾病的关键步骤。在确定CIA中CⅡ特异的T细胞的研究中, Doncarli等[9]研究表明, 在诱发CIA的连锁反应中, CD+4Th1克隆属于针对CⅡ主要免疫优势抗原决定簇反应的公共臂。
IL-4是Th2细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞分泌的20kD的单体。它上调自身受体表达, 诱导Th1转变为Th2细胞[10], 但IL-4并不能改变RA中滑膜T细胞的分化模式。IL-4在RA滑膜液、滑膜或滑膜细胞培养上清液含量都很低。可见, RA中IL-4分泌不足也导致Th1细胞占优势。IL-4可通过抑制Th1细胞介导的免疫应答, 并抑制IL-6、TNF-α等炎性细胞因子的功能和生成[11], 从而达到抗炎目的。许多纵向研究提示细胞因子的产生在RA疾病的早期和晚期是有差别的[12]。Kanik等[13]观察到, 在早期RA的外周血中, 同慢性患者相比, IL-2和IFN-γ明显增多, 随着关节炎的进展, Th1细胞逐渐减少, Th2细胞占优势。我们的实验结果显示, 各组大鼠IL-4水平相当, 表明此期可能尚处于CIA的进展期, 主要表现为以IFN-γ水平升高的Th1类细胞增多为主。
控制Th1型细胞因子的产生或补充Th2型细胞因子如IL-4、IL-10, 调节它们的平衡可能有治疗意义[14]。本文的实验结果显示, 模型组大鼠外周血IFN-γ水平、IFN-γ/IL-4比值较正常组大鼠显著升高, 说明CIA以Th1类细胞升高为主, 表明了T淋巴细胞表达Th1表型可能是CIA起始疾病的关键步骤, 也提示IFN-γ表达升高可能与疾病的严重性相关, 说明CIA存在Th1/Th2类细胞失衡。经过中药温化蠲痹方及MTX治疗后, 中药组及MTX组大鼠外周血IFN-γ、IFN-γ/IL-4比值均明显降低, 与正常组大鼠外周血IFN-γ、IFN-γ/IL-4比值相近, 这表明Th1/Th2细胞亚群逐渐趋向平衡。中药温化蠲痹方和MTX对CIA大鼠恢复外周血Th1/Th2细胞因子平衡的作用相近。实验结果提示中药温化蠲痹方可能通过下调Th1免疫应答, 使Th1/Th2细胞趋向平衡达到治疗CIA的作用。
摘要：目的:观察中药温化蠲痹方对胶原诱导性关节炎 (CIA) 大鼠外周血Th1/Th2细胞平衡的影响, 探讨温化蠲痹方治疗CIA的作用机制。方法:采用牛Ⅱ型胶原乳剂于大鼠尾根部注射, 建立CIA模型。随机分为模型组、MTX组、温化蠲痹方组, 另设正常对照组, 各组分别给药30天后, 运用ELISA法检测各组大鼠外周血Th1/Th2细胞水平。结果:与模型组比较, 中药组和MTX组大鼠关节炎指数 (AI) 评分明显降低 (P=0.000) ;与治疗前比较, 中药组和MTX组大鼠AI评分均明显降低 (P=0.006;P=0.009) 。与正常组比较, 模型组大鼠外周血IFN-γ/IL-4比值明显升高 (P=0.000) ;与模型组比较, 中药组和MTX组大鼠外周血IFN-γ/IL-4比值明显降低 (P值均为0.000) , 两组之间比较差异无显著性 (P=0.642) 。结论:CIA大鼠外周血Th1/Th2细胞亚群失衡, 恢复CIA大鼠外周血Th1/Th2细胞平衡可能是中药温化蠲痹方治疗CIA的作用机制之一。