血清细胞（精选10篇）
血清细胞 篇1
乙酰肝素酶(heparanase,Hpa)可特异性降解细胞外基质和基底膜的主要成分——硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,并且协同多种因子直接和间接地促进肿瘤的侵袭和转移。有研究表明在转移性肿瘤的组织中或患者血清中肝素酶含量或基因表达水平升高[1,2]。本研究应用RT-PCR技术检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者血清淋巴细胞肝素酶基因表达水平,以探讨其与患者TNM分期的关系及意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
70例非小细胞肺癌患者的血液标本均取自河北省人民医院2005年9月～2007年12月收治的非小细胞肺癌患者,均经病理学确诊,采集标本前未接受化疗及放疗。其中男42例,女28例;年龄37～78岁(中位年龄58岁);TNM分期(国际UICC 1997分期标准):T,12例,T224例,T3 21例,T413例;N0 14例,N120例,N2 19例;N3 17例;M0 59例,M,11例。另取15例健康献血员血液标本作对照。
1.2 样品处理[2]
抽取外周静脉血5ml。所取血液标本置入预处理的冻存管内,并加40g/L EDTA抗凝,然后加淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞,液氮冻存备用。
1.3 Hpa基因引物
上游序列:5,TTCGATCCCAAGAAGGAATCAAC3’,下游序列:5’GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC3’538;采用β-actin作为内参对照,引物序列上游:5’ATCT GGC ACC AC ACCTTCTAC A ATG AGCTGCG 3’,下游:5’CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACA TCTGC3’。以上引物均由上海生物工程公司合成。凝胶扫描仪(美国α公司)。
1.4 逆转录PCR
加同体积淋巴细胞分离液于血标本中,2 000r/min离心20min;抽取中间层到EP管内,2 000r/min再离心20min;然后采用总RNA提取试剂盒提取总RNA。取2μg总RNA加入总体积20μl的反应体系中,25℃10min,42℃1h,70℃10min进行逆转录;然后94℃5min,94℃30s,57℃30s,72℃40s,循环30次,最后72℃5min至4℃。以无菌双蒸水代替RNA模板扩增为PCR空白对照。取5μL扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳,DNA凝胶成像扫描仪(美国Fotodyne公司)摄像,进行光量子强度分析,Hpa与β-actin比值作为Hpa表达水平的参数。
1.5 统计学处理
使用SPSS 12.0统计软件包,进行χ2检验和t检验。
2 结果
2.1 NSCLC患者血清中淋巴细胞肝素酶基因表达结果
Hpa基因扩增产物为538bp,内参基因β-actin扩增产物为621bp。健康人肝素酶基因无阳性表达。
2.2 NSCLC患者血清淋巴细胞Hpa基因表达水平与病理分期的关系
由于T1与T2,T3与T4,N0与N1肝素酶基因表达水平差异无统计学意义,为统计方便,将其合并。如表1所示,T1～T2(0.676±0.202)与T3～T4(0.896±0.188)肝素酶基因表达水平差异有统计学意义(P<0.01);N0～N1(0.656±0.196)与N2(0.792±0.180)、N3(0.914±0.192)比较,三者之间差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05);M0与M1比较,前者(0.682±0.205)明显低于后者(0.907±0.182),差异有统计学意义(P<0.01)。
*为N0～N1与N3比较;**为N2与N0～N1或N3比较
3 讨论
乙酰肝素酶的作用为降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖的硫酸肝素侧链,进而破坏其转移屏障的作用,引起肿瘤侵袭、转移等[3]。研究表明,在子宫颈癌、骨肿瘤、口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌以及非小细胞肺癌中,均呈Hpa高表达[4,5,6]。同时研究还表明发生转移的恶性肿瘤组织中及患者血清中肝素酶表达水平明显升高[1]。故Hpa被认为是多种肿瘤恶性浸润和转移的重要标志。
本研究发现NSCLC患者血清淋巴细胞中肝素酶基因表达水平明显增高,而正常对照组无阳性表达,这说明肝素酶在促进肿瘤细胞的浸润与转移中起着重要的作用。
本研究结果表明,NSCLC患者血清中肝素酶基因表达水平与NSCLC的TNM分期有关。T3～T4期血清肝素酶基因表达水平明显高于T1～T2,说明其与肿瘤的进展和浸润程度有关;N3期血清肝素酶基因表达水平明显高于N0～N1、N2,支持其与淋巴结转移间的关系[2];M1期血清肝素酶基因表达水平显著高于M0,说明其与NSCLC患者有无远处转移有关。由于TNM分期及有无淋巴结转移是患者预后的关键因素,所以检测NSCLC患者血清中肝素酶基因表达水平可作为预测肺癌淋巴结转移的一个参考指标。
综上所述,Hpa可作为非小细胞肺癌侵袭、转移的重要指标之一,有必要进行进一步研究,从而揭示其作用机制和应用价值。
摘要：目的:探讨非小细胞肺癌患者血清淋巴细胞肝素酶基因的表达及意义。方法:采用逆转录聚合酶链反应技术对70例非小细胞肺癌患者及15例正常人血清淋巴细胞肝素酶基因表达水平进行检测。结果:NSCLC患者血清淋巴细胞中肝素酶基因表达水平明显增高,而正常对照组无阳性表达。T1～T2(0.676±0.202)与T3～T4(0.896±0.188)肝素酶基因表达水平差异有统计学意义(P<0.01);N0～N1(0.656±0.196)与N2(0.792±0.180)、N3(0.914±0.192)比较,三者之间差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05);M0与M1比较,前者(0.682±0.205)明显低于后者(0.907±0.182),差异有统计学意义(P<0.01)。结论:非小细胞肺癌患者血清淋巴细胞肝素酶基因表达水平与非小细胞肺癌TNM分期有关,它可能成为预测非小细胞肺癌侵袭、转移的指标。
关键词：非小细胞肺癌,乙酰肝素酶,淋巴转移,逆转录PCR
参考文献
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血清细胞 篇2
【关键词】 IL25；嗜酸细胞趋化因子
【中国分类号】 R69 【文献标识码】 A【文章编号】 1044-5511（2012）02-0172-01
随着发病机理、免疫学、分子生物学、病理生理、实验学等研究的进展，哮喘防治的研究也取得了飞速发展。已经证实哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，由于这种慢性炎症反应的持续存在，导致气道呈高反应状态，当接触诱因时即会反复出现症状。哮喘发病机理的研究已由痉挛学说，发展到气道慢性炎症学说，现已进入平滑肌功能障碍及气道炎症的平行学说。
细胞因子网络的失衡是其发病的基础，而Th2细胞因子、 Eotaxin共同诱导的嗜酸性粒细胞的募集与浸润，进而引起的气道炎症则可能是发病的关键；笔者检测了不同时期哮喘儿童血清IL25、嗜酸细胞趋化因子水平以探讨其在儿童哮喘中的变化及临床意义。
1.临床资料：
选择2009年1月-2011年12月间在我院接受治疗的哮喘儿童60例的病历资料，男35例，女25例，年龄3-14岁；患儿生命体征：患儿受到变应原、冷空气或其他诱因的刺激时，往往首先表现为上呼吸道过敏的症状，如眼痒、鼻痒、打喷嚏、流清涕等，由于婴幼儿对痒的表达困难，往往仅表现为揉眼、搓鼻等；突然发作的喘息为儿童哮喘的主要特征，患儿可出现高调喘鸣声，呼吸频度加快、呼吸困难，婴幼儿可表现为张口呼吸、鼻翼扇动；严重发作时可表现为烦躁不安、紫绀、面色苍白、出冷汗；查体可见三凹征、心率加快、双肺有哮鸣音，进一步加重可出现心力衰竭的表现如颈静脉怒张、浮肿、肺底中、小水泡音、肝脏肿大。据其病史及临床表现分为两组：哮喘急性发作期组30例, 哮喘缓解期组30例；对照组为我院同期健康体检儿童27例，各组间儿童年龄及性别构成上均无统计学意义, 具有可比性。
2.检测方法：
分别留取健康体检儿童、 哮喘急性发作期及缓解期儿童静脉血4 mL, 室温静置2 h, 以2000 r/min离心10 min留取血清，以-70℃冰箱保存留待一次性检测用。应用美国R&D公司进口分装的人IL25 ELISA定量检测试剂盒及人嗜酸细胞趋化因子ELISA定量检测试剂盒测定IL25、嗜酸细胞趋化因子水平，主要儀器为酶标仪和洗板机；数字显示隔水式电热恒温培养箱。具体实验操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行。各组间不同水平的比较采用方差分析、 t检验, 以P<0.05为有统计学意义；两指标间相关性采用直线相关Pearson分析，检验为双侧，以P<0.01为有统计学意义。
3.结果：
三组间IL25水平的差异有统计学意义哮喘急性发作期组较缓解期组、 正常对照组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），而后两组间比较差异无统计学意义；三组间嗜酸细胞趋化因子水平的差异有统计学意义，哮喘急性发作期组较缓解期组、正常对照组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），而后两组间比较差异无统计学意义。 哮喘儿童血清IL25与嗜酸细胞趋化因子水平之间的相关性：哮喘儿童血清IL25与嗜酸细胞趋化因子水平明显升高，经直线相关Pearson分析发现两者之间呈显著正相关关系( P<0.01,)。
4. 讨论
哮喘是儿童时期最常见的呼吸道慢性疾病之一。哮喘是因肺、脾、肾三脏不足致使津液凝聚成痰，伏藏于肺，成为哮证夙根，遇外感六淫或非时之气、劳倦过度、饮食内伤等因素引触而发，故哮证的病理因素以痰为主。孙氏认为：肺朝百脉，辅以行血，哮喘者肺失肃降，则可产生血瘀；哮喘日久，肺气损耗，气虚血运无力亦可致血瘀；痰瘀互结，互相影响，使哮喘反复发作。张氏认为风为六淫之首，为外邪引发哮喘之先导，且本病起病迅速，病情变化快，具有风的"数变"而"动"的特性，故哮喘发作除痰瘀外，风亦为重要因素。张氏提出痰瘀气壅是哮喘的重要病机，痰瘀的产生与气机不利互为因果，肺气不利则不能布津行血，津停血滞即成痰瘀，痰瘀伏肺则益增肺气之阻滞。周氏指出小儿肺、脾、肾不足致痰饮内生，痰气搏结为哮喘发作的主要病机。2000年调查我国0-14岁城市儿童哮喘的患病率为0.5-3.4%［1］。支气管哮喘是由多种细胞和细胞组分共同参与的气道慢性炎症性疾患。这种慢性炎症导致气道反应性增高，当接触多种危险因素时，气道发生阻塞和气流受限，出现反复发作的哮喘、气促、胸闷或咳嗽等症状，常在夜间和（或）清晨发作或加剧，多数患儿可经治疗缓解或自行缓解。儿童哮喘反复发作的喘息、气促、胸闷或咳嗽，多与接触变应原、冷空气、物理或化学性刺激、病毒性上、下呼吸道感染、运动有关；发作时双肺可闻及散在或弥漫性以呼气相为主的哮鸣音，呼气相延长；支气管舒张剂有显著疗效；除外其他疾病所引起的喘息、气促、胸闷或咳嗽；对于症状不典型的患儿，同时在肺部闻及哮鸣音者，可酌情采用以下任何1项支气管舒张试验协助诊断，若阳性可诊断为哮喘；①速效β2受体激动剂雾化溶液或气雾剂吸入；②以0.1%肾上腺素0.01ml/kg皮下注射（最大不超过0.3ml/次）。在进行以上任何1种试验后的15~30分钟内，如果喘息明显缓解，哮鸣音明显减少者为阳性。5岁以上患儿若有条件可在治疗前后测呼气峰流速（PEF）或第1秒用力呼气容积（FEV1），治疗后上升≥15%者为阳性。如果肺部未闻及哮鸣音，且FEV1>75%者，可做支气管激发试验或运动试验，若阳性可诊断为哮喘。以下情况注意：一些年幼儿其发病的最初症状是反复或持续性咳嗽，或在呼吸道感染时伴有喘息，经常被误诊为支气管炎或肺炎（包括急性呼吸道感染-ARI），并被给予无效的抗生素或镇咳药物治疗。此时给予抗哮喘药物治疗是有益的，并有助于诊断婴幼儿期哮喘，故具有以上特点的婴幼儿还是可以延用婴幼儿哮喘的诊断名称;如果病人的感冒反复地"发展到肺部"，或持续10天以上才恢复，或使用抗哮喘药物治疗后才好转，则应考虑哮喘;如果按照哮喘治疗效果不理想时，应排除支气管异物、支气管淋巴结结核、先天性上下气道畸形、心源性哮喘等可具有喘息、气促或胸闷的疾病。
儿童哮喘是一种以气道高反应性和气道慢性炎症为特征的变态反应性疾病,研究表明在哮喘患儿中存在辅助性T细胞(Th细胞)功能失衡，主要表现为Th1亚群功能低下， Th2亚群功能亢进。IL25是Th2细胞产生的细胞因子，IL25受体择性表达于Th2细胞，且IL25可促进Th2细胞的分化，故IL25可能与哮喘等Th2型免疫反应性疾病有关。本研究显示，哮喘急性发作期组儿童血清IL25含量明显升高，缓解期组降低，且有研究发现IL25在哮喘患者的支气管黏膜下表达上调, 提示IL25含量升高与哮喘发作有关。嗜酸细胞趋化因子是趋化因子C家族成员之一，具有选择性趋化嗜酸性粒细胞的功能，从而趋化嗜酸性粒细胞向炎症部位聚集，引起嗜酸性粒细胞炎症。大量研究表明, 支气管哮喘时气道黏膜嗜酸细胞趋化因子表达显著增强, 其表达强度与支气管壁嗜酸性粒细胞数及与哮喘严重度呈显著正相关。
参考文献
［1］ 中华医学会儿科分会呼吸学组、 中华医学会《中华儿科杂志》编辑委员会. 儿童支气管哮喘防治常规(试行)(2003 年修订) ［J］. 中华儿科杂志, 2004, 42(2): 100 -106.
血清细胞 篇3
1 材料与方法
1.1 孕早期绒毛收集
随机选择2008年12月至2009年6月在上海交通大学附属第六人民医院计划生育门诊手术室行人工流产的孕6～8周健康妇女, 年龄20～35 岁, 平素月经规则, 经B超检查证实为宫内早孕并探及原始心管搏动, 术前3月内未服用过甾体激素。孕妇无高血压、心脏病、肝炎、结核等妊娠合并症和并发症史; 患者均知情同意后签署经上海交通大学附属第六人民医院伦理道德委员会批准的同意书。将吸宫术所获得的无菌绒毛组织用于培养细胞滋养细胞。
1.2 血清标本收集及分组
选择住院正常足月妊娠剖宫产孕妇10例 (正常对照组) , 子痫前期患者20例 (子痫前期组) , 并收集两组孕妇外周血各 10 ml, 制备血清。另收集剖宫产孕妇 50例脐静脉血各50 ml, 制备血清用于培养细胞。此剖宫产孕妇和正常对照组孕妇剖宫产原因为骨盆或胎位异常、产程停滞、社会因素等。子痫前期诊断标准参考《妇产科学》第6版。两组病例的年龄、孕周、孕产次比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 所有病例均无肝肾疾病、糖尿病、原发性高血压及其他心血管疾病史。两组患者的临床资料见表1。
①与正常对照组比较: P<0.05
1.3 细胞滋养细胞、人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定
按文献[3]报道的方法, 采用组织块贴壁法培养人孕早期细胞滋养细胞, 细胞在含20%人脐血清、1 ng/ml表皮生长因子 (EGF) 、青霉素和链霉素 (浓度分别为100 U/ml和100 g/ml) 的达尔伯克 (氏) 改良伊格尔 (氏) 培养基 (DMEM) 高糖培养基, 37℃、5% CO2温箱内培养。人脐静脉内皮细胞培养:无菌条件下取正常足月妊娠剖宫产胎儿娩出后脐带10 cm左右, 胰酶消化法行内皮细胞培养, 培养液为含20%人脐血清、青霉素和链霉素 (浓度分别为100 U/ml和100 g/ml) 的 RPMI-1640培养基。DAB显色加免疫组化法鉴定细胞滋养细胞和人脐静脉内皮细胞。
1.4 滋养细胞与脐静脉内皮细胞共培养模型的建立
取传至 3～4代呈对数生长期的内皮细胞 (1×106) 6孔培养板中培养24小时后行饥饿培养24小时 (更换含 1%正常脐静脉血清的培养基 ) , 进行后续实验, 将铺有鼠尾胶原的Transwell小室 (美国 BD公司 ) 放入6孔培养板, 取培养48小时的3～4代滋养细胞悬液于上室 (1×105个) , 或下室为滋养细胞上室加内皮细胞。正常对照组的模型建立:上、下室加入含10%正常对照组孕妇外周血清 ( 10%, 浓度梯度实验得出最佳有效浓度) 的培养基37℃培养24小时;子痫前期组的模型建立:上、下室加入含10%子痫前期组患者外周血清的培养基37℃培养24小时。各组实验均进行时间配对。
1.5 Transwell技术检测细胞滋养细胞的侵袭能力
取分别用正常对照组和子痫前期组孕妇外周血清共培养体系24小时后的Transwell小室, 用棉签拭去上室内未侵袭至底部的细胞, 0.1%结晶紫染色, 室温15分钟, 染色后清水漂洗, 高倍显微镜 (×200) 下每孔随机选择5个视野计数细胞。以侵袭细胞的相对数目来表示细胞滋养细胞的侵袭能力。
1.6 流式细胞仪检测人脐静脉内皮细胞 ( HUVEC) 凋亡
分别收集两组孕妇外周血清处理共培养体系24小时后HUVEC, 参照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 (购于南京凯基生物科技发展有限公司) 说明书进行HUVEC凋亡的检测。
1.7 逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 检测正常孕妇外周血清和子痫前期孕妇外周血清共培养所得细胞滋养细胞MMP-2、MMP-9mRNA及人脐静脉内皮细胞FasmRNA的表达
从PubMed检索MMP-2、MMP-9、Fas基因全序列, 以GAPDH为内参照, 引物序列由上海生物工程公司合成。内参GAPDH引物:上游5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3′, 下游5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′;所用MMP-2引物:上游5′-CACCTACACCAAGAACTTCC-3′, 下游5′-AACACAGCCTTCTCCTCCTG-3′;MMP-9引物:上游5′-CCCTTCTACGGCCACTACTGTG-3′, 下游5′- GCACTGCAGGATGTCATAG-3′;Fas引物:上游5′-TCTGCCATAAGCCCTGTC-3′, 下游5′- TTGGTGTTGCTGGTGAGT-3′。分别收集经两组孕妇外周血清处理24小时后的细胞, Trizol法提取细胞总 RNA, 紫外分光光度计测定其纯度及浓度, 模板 RNA500 ng, 参照TaKaRa RNA PCR Kit (大连宝生物公司) 试剂盒说明进行逆转录。PCR扩增条件:GAPDH、MMP-2、Fas: 94℃预变性 2分钟, 94℃×30秒, 56℃×30秒, 72℃×1分钟, 30个循环 , 72℃延伸5分钟;MMP-9: 94℃预变性 2分钟, 94℃×30秒, 53℃×30秒, 72℃×1分钟, 32个循环 , 72℃延伸 5分钟。 取10 μl PCR产物, 1.5%琼脂糖凝胶电泳, 用 UVIpro凝胶图像分析系统观察并摄像, 用UVIBand软件扫描分析, 以目的基因条带与GAPDH条带的灰度比值为目的基因 mRNA相对表达强度。
1.8 统计学处理
所有实验均用不同批次的标本重复3次。所有数据均采用SPSS 13.0进行处理, 结果用undefined表示, 两组间数据采用两样本均数的t检验, 以P<0.05为差异有高度统计学意义。
2 结 果
2.1 两组滋养细胞浸润结果
正常对照组细胞滋养细胞穿透 Transwell基底膜的数量为105.7±7.3, 子痫前期组为 57.5±4.4, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。子痫前期组血清明显抑制细胞滋养细胞的侵袭能力。
2.2 流式细胞仪检测
HUVEC凋亡的结果 子痫前期血清共培养体系的人脐静脉内皮细胞凋亡率明显低于正常对照组 (P<0.05) , 见表2。
①与正常对照组比较:P<0.05 ②与同组MMP-9比较:P<0.05
2.3 RT-PCR检测细胞滋养细胞MMP-2、MMP-9和内皮细胞FasmRNA的表达结果
由表2可见:子痫前期组MMP-2、MMP-9和FasmRNA的表达明显低于正常对照组 ( P<0.05) 。结果还显示, 在孕早期6～8周细胞滋养细胞中MMP-2 mRNA的表达强度高于MMP-9 (P<0.05) 。琼脂糖凝胶电泳扩增结果见图1。
3 讨 论
1967年Robertson首次提出子宫螺旋动脉重铸 (remodel) 概念, 认为绒毛滋养细胞于妊娠的第10周开始沿着螺旋小动脉侵入蜕膜、肌层及血管, 逐步取代螺旋动脉血管内皮细胞, 深入血管壁, 降解血管平滑肌及弹力纤维从而使血管腔扩大, 血流阻力下降, 血流量增加。子宫螺旋动脉重铸障碍, 是导致病理妊娠如子痫前期的重要原因。因此正常妊娠的建立、维持有赖于胎盘滋养细胞正常侵入和子宫螺旋动脉成功重铸。滋养层细胞浸润能力的降低与子痫前期的发生密切相关。滋养细胞具有浸润性是由于自身能分泌 MMPs, MMPs是一类锌离子依赖性蛋白水解酶, 可降解细胞外基质, 在滋养细胞对母体子宫内膜侵袭过程中发挥着主要作用, 其中MMP-2与 MMP-9在细胞浸润过程中起了关键作用[4]。Staun Ram等[5]研究发现在妊娠 6～8周阶段 , MMP-2是滋养细胞浸润的关键水解酶 , 而妊娠 9～12周 , MMP-2与MMP-9共同参与了对滋养细胞浸润的调节。本研究采用的细胞均来自妊娠 6～8周, 结果显示, MMP-2 mRNA的表达强度高于MMP-9 (P<0.05) , 提示MMP-2调节滋养细胞的侵袭力可能比 MMP-9起了更关键的作用。
Fas属于肿瘤坏死因子 (TNF) 受体和神经生长因子 (NGF) 受体超家族。Fas广泛存在于多种组织细胞中, 如不成熟的胸腺细胞和活化的淋巴细胞 (包括活化的T、B细胞) 等。FasL是Fas 的配体, 分布较为局限, 仅表达于活化的T细胞、自然杀伤细胞 (NK) 、胎盘滋养细胞等处。FasL与Fas 分子交联, 结合Fas相关的死亡结构域 (fas-assosiated death domain, FADD) , FADD 与caspase-8相互作用, 形成死亡诱导信号复合体 (death-inducing signaling complex, DISC) , 活化的caspase-8 进一步活化效应caspases, 如caspase-3 等, 细胞发生凋亡, Fas/FasL 还可以通过线粒体途径引起细胞凋亡。Fas/FasL凋亡系统涉及正常血管形成和许多血管病变的发生, 包括:高血压、动脉硬化等[6]。而Fas/FasL与子宫螺旋动脉重铸的研究却少有报道。已有研究表明子宫螺旋动脉的内皮、平滑肌细胞表达Fas, 妊娠早期的滋养细胞能分泌FasL, 引起母体免疫细胞的凋亡, 在母胎界面的免疫耐受中发挥作用[7]。Ashton等[8]研究发现滋养细胞能通过Fas/FasL凋亡途径诱导子宫螺旋动脉内皮细胞凋亡, 使滋养细胞正常侵入子宫螺旋动脉取代内皮细胞保证子宫螺旋动脉成功重铸。除了线粒体内途径, 膜结合型Fas (mFas) 还主要通过自分泌/旁分泌或外部途径引起细胞凋亡。滋养细胞可能通过相邻的内皮、平滑肌细胞触发FasL的表达, 可见子宫螺旋动脉内皮、平滑肌细胞的凋亡很可能通过一种旁分泌形式实现的。Fas/FasL不是唯一涉及子宫螺旋动脉重铸中滋养细胞-内皮细胞作用的机制。最近证明, 组织相容性白细胞抗原-G1 (histocompatibility leukocyte antigen, HLA-G1) 复合物能直接与活化的内皮细胞表达的CD160受体结合, 通过一种凋亡途径抑制血管形成。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (tumor necrosis factor (TNF) -a-related, apoptosisinducing ligand, TRAIL) 是新发现的肿瘤坏死因子超家族成员, 与FasL和TNF一样可诱导细胞凋亡。Keogh等[9]研究发现妊娠前3个月的滋养细胞也表达TRAIL, 滋养细胞通过TRAIL依赖的机制引起子宫螺旋动脉内皮、平滑肌细胞凋亡。Roberta等[10]研究表明血管内皮钙黏蛋白 (vascular-endothelial cadherin) 通过细胞间接触机制而非凋亡程序促进滋养细胞侵入子宫螺旋动脉替代内皮细胞。Fas敲击小鼠表现正常的生育, 很可能是子宫自然杀伤细胞 (uterine natural killer cells, uNK) 而非滋养细胞调节子宫螺旋动脉的重铸[11]。
本研究通过建立滋养细胞与脐静脉内皮细胞共培养模型, 用子痫前期血清进行培养, 并用正常血清作对照, 结果表明, 子痫前期血清培养组滋养细胞侵蚀能力、MMP-2 mRNA、 MMP-9 mRNA、脐静脉内皮细胞Fas mRNA表达明显低于正常对照组, 脐静脉内皮细胞凋亡率明显下降, 提示子痫前期血清可降调滋养细胞MMP-2 mRNA、 MMP-9 mRNA表达, 进而影响脐静脉内皮细胞发生程序性死亡, 滋养细胞取代子宫螺旋动脉内皮细胞过程受阻, 子宫螺旋动脉重铸障碍, 胎盘缺血、缺氧, 将导致病理妊娠如子痫前期与FGR的发生。本研究为进一步探讨因滋养层细胞侵袭能力降低, 内皮细胞凋亡异常导致子宫螺旋动脉重铸障碍而引起的子痫前期等疾病的防治提供更有效的理论依据。当然, 除了凋亡还有其他的机制也在子宫螺旋动脉重铸过程中发挥了作用, 对子痫前期子宫螺旋动脉重铸障碍的分子机制及具体的调控路径的阐明仍需进一步的研究
参考文献
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血清细胞 篇4
[关键词] 通心络；2型糖尿病；单核细胞趋化蛋白-1
[中图分类号] R587.1 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2012）02-90-02
炎症标志物-单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）与冠心病的发生密切相关[1]；与非糖尿病人群比较，2型糖尿病患者的血清MCP-1显著升高[2]，提示MCP-1可能参与糖尿病患者心血管并发症的发生。通心络胶囊是由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等组成的中成药，研究发现其在冠心病患者中具有减轻血管炎症反应、改善心肌缺血的作用[3]，目前未见研究观察通心络能否减轻2型糖尿病患者的炎症反应。因此本研究在2型糖尿病患者中观察通心络干预前后的血清MCP-1变化。
1 对象与方法
1.1 研究对象
选择2010年8月～2011年6月在笔者所在医院就诊的2型糖尿病患者60例，符合1999 年WHO糖尿病诊断标准，其中男40例，女20例，平均年龄（58.3±7.2）岁，平均病程（6.5±1.48） 年，平均体重指数（26.6±4.8） kg/m2 ，所有患者均无明显的肝肾功能损害、心功能不全及急性并发症。所有受试者随机（抽签法）分为常规治疗组及通心络组，各30例，两组患者在年龄、性别及病程、并发症方面差异无统计学意义（P＞0.05）。常规治疗组采用常规药物控制血糖等治疗，通心络组在常规治疗基础上给予通心络治疗（2粒/次，3次/d）。疗程为12周。
1.2 检测指标
所有患者在观察前后于空腹8 h以上抽血留取血清，采用全自动生化分析仪测定空腹血糖（ FBG） 、糖化血红蛋白（HbA1C）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。MCP-1测定使用酶联免疫试剂盒（BioSource International， Inc， USA；批内差异＜10％）。
1.3 统计学处理
统计分析采用SPSS13.0软件，计量资料以（）表示，两组间及组内治疗前后的比较采用t检验， P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
由表1可以看出，两组患者干预前的FBG、HbA1C、TC、LDL-C及MCP-1无显著差别；干预后的组内及组间FBG、HbA1C、TC、LDL-C无显著变化，常规治疗组的MCP-1在治疗前后无显著变化，而通心络组治疗后的MCP－1较治疗前显著下降，亦显著低于常规治疗组的治疗后MCP-1水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。
注：与治疗前比较，★P＜0.05；与常规治疗组比较，△P＜0.05
3 讨论
大血管病变是2型糖尿病患者的主要致死原因。糖尿病大血管病变的发生机制复杂，临床治疗效果不理想。慢性炎症反应是目前公认的2型糖尿病大血管病变发生机制之一。近年来公布的大型临床研究结果显示，单纯强化降糖对糖尿病心血管死亡率无显著降低作用[4]，而具有抗炎作用的他汀类药物能降低糖尿病患者的心血管死亡率，提示减轻血管炎症反应可能使2型糖尿病患者得到更大的心血管受益。MCP-1是作用于单核细胞趋化过程的主要细胞因子， 可促使单核细胞进入动脉血管内膜，摄取已进入内膜并已发生修饰的脂蛋白形成单核细胞源泡沫细胞， 参与动脉粥样硬化的形成，是反映糖尿病患者体内炎症反应程度的指标之一，促进糖尿病大血管病变的发生和发展 [5]。
通心络胶囊是应用治疗心脑血管疾病的中成药，具有化瘀通络、搜风解痉的功效。研究发现，通心络胶囊具有促进内皮细胞NO分泌、抑制内皮素生成、提高冠心病患者的动脉舒张功能、 降低血清血管细胞黏附分子及细胞间黏附分子等途径改善血管功能、降低血黏度、减轻炎症反应，发挥临床疗效[6-7]。本研究观察通心络胶囊治疗前后2型糖尿病患者血清MCP-1的变化，以探讨其对致动脉粥样硬化相关炎症因子的影响。结果显示，两组患者的血糖及血脂改善情况无显著差别，常规治疗后血清MCP-1水平无显著变化，而加用通心络胶囊干预后血清MCP-1水平较干预前及对照组均显著下降，提示通心络胶囊具有良好的抗炎及血管保护作用，可作为预防糖尿病动脉粥样硬化发生的临床用药之一。
总之，本研究结果显示，对糖尿病患者加用通心絡胶囊治疗后，血清MCP-1水平显著下降，提示通心络胶囊能减轻2型糖尿病患者的血管炎症反应，为临床应用这一中成药预防糖尿病动脉粥样硬化的发生提供依据。
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血清细胞 篇5
1 材料与方法
1.1 中药川芎含药血清的制备
选取健康未交配过的SD雄鼠30只[许可证编号:syxk (粤) 2013-0085, 广州中医药大学实验动物中心], 个体质量 (200±10) g, 适应性饲养3 d后进行实验。将其随机分为空白对照组、低剂量组及高剂量组, 每组10只。给予大白鼠川芎水煎液灌胃 (取一定量川芎饮片置容器中, 加水没过药面, 浸泡30 min后, 煎煮3次, 60 min/次, 合并水煎液, 过滤, 浓缩至含生药1 g/m L备用) , 低剂量组的剂量约为正常用量 (0.8 g/kg) 的5倍, 为4 g/kg, 2次/d, 连续3 d;而高剂量组则为正常用量的30倍, 为24 g/kg, 2次/d, 连续3 d, 空白对照组灌生理盐水 (4 m L/kg) 。人与大鼠动物等效剂量系数由《实验动物学》可知为6.3。每次给药10 min后, 对其进行取血, 将血液静置2 h后离心 (离心条件:3000 r/min, 离心10 min) , 离心后取上清液56℃加热30 min, 过滤, 保存于-20℃。体外含药血清按20%计算[7,8,9,10]。
1.2 胚胎干细胞培养
1.2.1 来源与试剂
小鼠胚胎干细胞选自中科院生化细胞研究所[11,12];DMEM高糖培养基、胎牛血清 (FBS) 、胰蛋白酶、明胶、β-巯基乙醇 (β-ME) 、丝裂霉素C、非必需氨基酸 (NEAA) 购自美国GIBCO公司, 白血病抑制因子 (LIF) 购自法国Millipore公司。
1.2.2 胚胎干细胞培养与诱导分化
将冻存在液氮罐中的胚胎干细胞取出, 于37℃水浴锅中迅速融化, 将细胞立即转移至10 m L的ep管中, 加入适量的培养基, 采用300 rcf, 10 min离心, 去除上清液, 加入1 m L培养基吹打, 转移细胞并进行培养, 当细胞生长至70%左右时, 对细胞进行传代。培养液分四组, 即:川芎血清低剂量组、川芎血清高剂量组、大鼠血清组、胎牛血清组, 将收集到的川芎含药血清和大鼠血清、胎牛血清, 配制成10 m L备用, 各组培养液终浓度为20%。 (1) 悬滴培养:ES细胞中加入20%川芎含药血清 (低剂量组和高剂量组) 的分化培养液, 将细胞密度设置为3.75×104/m L。细胞培养在6 cm培养皿中, 取1.6 m L细胞置于10 cm的培养皿内盖上, 将内盖翻转使其生长, 加入5 m L PBS, 孵育1 h。 (2) 悬浮培养:细胞孵育后对细胞进行观察, 控制细胞悬滴液中细胞个数为1, 第2天于倒置显微镜下观察, 每个悬滴内均含有1个, 吸去PBS, 加入分化培养基, 移至6 cm中培养, 孵育2 h。 (3) 贴壁培养:细胞培养2 d后, 观察细胞个数, 大约为10个, 接种至4孔板, 第3天时肉眼观察每个培养皿中均可见数十个EBs。分别接种至事先用明胶包被的24孔板内, 每孔中加入2 m L分化培养液。
1.3 实时定量PCR检测心肌细胞特异基因β-MHC的表达
实验细胞分四组, 即川芎血清低剂量组, 川芎血清高剂量组, 大鼠血清组和胎牛血清组, 每组6孔。提取总RNA并测定浓度, 分析其完整性, 进而合成c DNA, β-MHC Forward:5’-AGAGCTCATCCTTTCTGGTCAT-3’, Reverse:5’-ACCATCTGACATTCTACAGTCT-3’;GAPDH Forward:5’-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’Reverse:5’-ATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3’[4,5]。PCR体系为:12.5μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix, 2.5μL样品溶液, 1.0μL引物加水至25μL。反应条件:95℃下加热60 s, 进行预变性;95℃变性15 s, 60℃退火15 s, 72℃延伸30 s, 如此循环40次。扩增后的产物主要是采用荧光检测, 用ABI 7500 Software v2.0软件对其进行分析, 绘制曲线表, 计算Ct值, 对系统数据处理后可以得出不同浓度对于细胞分化的影响。
1.4 统计学处理
使用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计学分析, 计量资料以表示, 比较采用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 比较采用字2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 川芎诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化
细胞培养2 d后呈密集状态, 一般为圆形, 细胞界限和形态不明显 (图1) ;体外细胞个头小, 但生长速度快 (图1~2) 。川芎分化液培养3 d的胚胎干细胞会收缩配体, 导致培养时间增加, 收缩越明显, 则时间越长。自发节律性收缩区域较大, 且细胞形态较单一 (图3~4) 。于细胞培养的第3 d可见零星EB球发生自发性节律性跳动, 5 d时约有70%的EB球出现节律性跳动, 低、高剂量川芎血清组 (图3~4) EB球发生自发性节律性跳动的细胞数量明显多于胎牛血清 (图1) 和大鼠血清组 (图2) 。
2.2 实时定量PCR检测心肌细胞特异基因β-MHC的表达
川芎低、高剂量含药血清组β-MHC表达量均明显高于胎牛血清组和大鼠血清组, 比较差异均有统计学意义 (P<0.05) ;川芎低剂量组β-MHC分化率明显高于高剂量组, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
* 与胎牛血清组和大鼠血清组比较，P<0.05；△与川芎高剂量组比较，P<0.05
3 讨论
随着人们生活水平的进步, 大部分人均处于亚健康状态, 心血管疾病是临床上常见的疾病。心血管疾病的临床突破主要来自胚胎干细胞的发展, 胚胎干细胞会根据诱导自发分化成多种细胞, 如心肌细胞和血管内皮细胞等[13,14,15]。心肌细胞对于恢复正常供血、免疫功能均有重要的意义[16,17]。一般情况下, 胚胎干细胞能够自然分化, 但分化率低, 因此提高分化率显得至关重要。临床上对于胚胎干细胞的研究较为广泛, 但是研究方向各不相同, 关于中药的研究更是凤毛麟角, 因为涉及人体、细胞、动物等各个方面, 给研究工作带来了一定的困难, 但也有部分学者取得了可喜的成果[18,19]。有研究方向为将细胞采用不同密度制成悬浮液, 采用不同的方法和改变环境进行培养, 分析其分化成心肌细胞的分化率。最后对具有促进分化功能的中药进行相关的安全性评价, 致力应用于临床。川芎是伞形科藁本属植物, 经研究表明, 其具有多种临床功效, 如使血管扩张、增加脑部血流量、改善供血、降低血液黏稠度及改善心肌缺血[20]。本课题组在研究川芎含药血清的胚胎毒性时发现川芎含药血清对胚胎干细胞转化为心肌细胞有促进作用 (P<0.05) , 而且尤以低剂量组为明显, 遂建立川芎诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化方法, 可以提高胚胎干细胞的分化率, 有利于体外获得相关的大量心肌细胞, 将其应用于临床研究以及药物的研发和筛选。
摘要：目的:探讨川芎含药血清诱导小鼠胚胎干细胞 (ES) 分化为心肌细胞的特征, 建立简便、高效的定向诱导ES细胞向心肌细胞分化的体系。方法:观察川芎含药血清作用下ES细胞活性, 诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的类胚体出现, 第5天达到高峰, 约有70%的拟胚体产生跳动。用RT-PCR法在跳动的拟胚体中检测心肌细胞特异性标志物β-MHC的表达。结果:川芎含药血清培养下的细胞β-MHC的表达水平和分化率均明显升高, 与大鼠血清组和胎牛血清组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。结论:川芎含药血清可明显提高体外诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化的效率。
血清细胞 篇6
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
脂多糖及戊巴比妥钠购于美国Sigma公司;大前门香烟(烤烟型,焦油量12 mg,烟气一氧化碳14mg)属于上海卷烟厂出品;大鼠抗内皮细胞抗体(AECA)酶联免疫检测试剂盒购自GBD公司。主要仪器:Olympus BX-51显微镜,6420多导生理监测仪和切片机,雷博MK3酶标仪。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及模型建立
健康12周龄SD大鼠共18只(上海斯莱克实验动物有限公司,许可证号:SCXK(沪2008-0016),体重(220±25)g,雌雄各9只,分笼饲养。在东南大学SPF级动物中心适应性饲养一周后,雌雄分别随机分成正常对照组、单纯吸烟组、COPD模型组三组,每组6只,雌雄各半,采用宋一平等[5]人两次脂多糖气管滴注联合被动吸烟法复制COPD动物模型,模型建立周期28 d。具体方法如下:(1)COPD模型组:于实验第1天、第14天气管内滴注脂多糖200μL(浓度为1 g/L),第2～13天和第15～28天上午置于自制染毒箱内被动吸烟10支(烟雾浓度约5%V1/V)半小时后回笼中饲养;(2)单纯吸烟组:于实验第1天、第14天气管内滴注生理盐水200μL,第2～13天,第15～28天上午置于自制染毒箱内被动吸烟(烟雾浓度约5%V1/V)半小时后回笼中饲养;(3)正常对照组于实验第1天、第14天气管内滴注生理盐水200μL,余每日正常饲养。所有实验用的大鼠饲养条件相同,饲养温度(22±3)℃,湿度为(55±5)%,日光灯光照时间12 h/d模拟昼夜规律,自由饮水和摄食。
1.2.2 大鼠呼吸力学指标测定
各组大鼠经腹腔注射0.4%戊巴比妥钠麻醉,仰卧固定于操作台上,纵行切开颈部皮肤暴露颈部和舌骨下肌群,分离出气管和食管。在环状软骨下2个气管环处作一“T”形切口,行气管插管并固定;在大鼠食管上部剪一个横行切口,行食管插管并固定。采用RM6240系列多导生理信号采集处理分析系统,测定其潮气量、气道流速、跨肺压,换算成气道阻力和肺顺应性:气道阻力=跨肺压/气道流速,动态肺顺应性=潮气量/跨肺压(用食管内压代替跨肺压)。
1.2.3 标本制备
造模成功后,经股动脉采集大鼠血标本3 m L后放血处死,血标本常温静置2 h后3 000 r/min离心,5 min后取血清放置-70℃冰箱保存。剪开大鼠胸腔,迅速分离肺组织,取右肺中叶置于10%中性福尔马林中固定24 h以上脱水制备常规石蜡包埋,切片(厚约5 mm)行苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察其病理形态学改变。
1.2.4 双抗原夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清AECA水平
将待测血清解冻,加样品稀释液按1∶5稀释。按试剂盒说明书向预先包被了大鼠内皮细胞抗原的48孔酶标孔中加入稀释后的梯度标准品AECA5份、空白对照一份及待测样品,37℃温育30 min;洗涤液至少0.35 m L注入孔内,振荡30s,甩去洗涤液,用吸水纸拍干,如此重复5次后拍干;加入辣根过氧化物酶标记过的内皮细胞抗原50μL,37℃温育30 min,同法再度洗涤5次后,先后加入显色剂A、B各50μL,震荡混匀,37℃避光显色10 min后终止并判定结果。以空白孔调零,酶联免疫检测仪在450 nm波长下测量各孔的吸光度值(OD值)。根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程,依据样品的OD值计算出对应的样品浓度。
1.3 统计学处理
使用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,结果以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较用q检验,以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 大鼠肺功能变化
单纯吸烟组与COPD模型组肺顺应性明显低于正常组(P<0.05),单纯吸烟组和COPD模型组间肺顺应性差异无显著性(P>0.05);COPD模型组肺阻力明显高于单纯吸烟组和正常对照组(P<0.05);单纯吸烟组肺阻力和正常对照组相比,差异无显著性(P>0.05)。(见表1)
注:1)与正常组对比,P<0.05;2)与吸烟组相比,P<0.05
2.2 大鼠肺组织的病理学变化
正常对照组大鼠支气管、肺组织结构正常,支气管黏膜及肺泡壁未见明显炎细胞浸润(如图1)。单纯吸烟组大鼠可见气道壁明显炎性细胞浸润及杯状细胞增生,纤毛倒伏、脱落,管壁轻度增厚,细支气管及间质内有淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等炎症细胞浸润,肺泡间隔增厚,肺泡结构未见明显破坏,未见肺泡腔增大及肺大泡形成(如图2)。COPD模型组大鼠支气管管壁明显增厚,黏液腺及杯状细胞增生,黏膜上皮变性坏死脱落,大量炎性细胞浸润,管腔狭窄,肺泡明显扩大,肺泡间隔变薄,肺泡壁多处断裂,部分肺泡融合形成肺大泡,符合COPD病理学改变(如图3)。
2.3 AECA的检测结果
单纯吸烟组血清AECA水平高于正常对照组(P<0.05);COPD组血清AECA水平高于正常对照组(P<0.05);COPD组AECA水平与单纯吸烟组相比,差异无显著性。(见表2)
注:1)与正常组对比,P<0.05;2)与单纯吸烟组相比,P>0.05
3 讨论
COPD的发病机制目前尚不十分明确,近年来研究发现COPD具有一定的自身免疫性疾病的特性[6,7,8]。研究结果提示内皮细胞损害相关的自身免疫组分可能参与COPD的发病,但具体机制尚不完全明了,内皮细胞损伤的重要机制之一可能与抗内皮细胞的自身抗体有关。AECA具有高度的异质性,其抗原为位于血管内皮细胞表面的一簇异质性蛋白,可引起血管内皮细胞损伤和诱导内皮细胞凋亡[9]。AECA在免疫性疾病和免疫相关性疾病中的作用逐渐被认可和接受[10,11],在COPD中的作用鲜有研究。
TATASEVICIENE-STEWART等[4]利用腹腔注射异种内皮细胞方法成功建立成年大鼠肺气肿模型,大鼠肺内可见CD4+T淋巴细胞聚集,并可检测到抗内皮细胞抗体;将模型鼠脾脏CD4+T细胞转移给免疫功能正常的大鼠,同样可以观察到肺气肿样改变。KARAYAMA等人[12]最近研究也发现116名COPD患者中31%的患者血清AECA水平明显高于正常对照组,而具有相同吸烟指数的非COPD人群中AECA为阴性,因而认为内皮损伤的免疫途径可能是除烟雾以外的另一重要致病因素。
鉴于吸烟和感染是引起COPD的两大主要诱因,故本研究通过采用两次脂多糖气管滴注联合被动吸烟法复制COPD动物模型,结果显示COPD模型组呼吸力学指标及病理学改变均符合人类COPD病理生理改变,提示COPD动物模型复制成功。实验发现COPD模型组及单纯吸烟组大鼠血清的AECA水平均较正常对照组明显增高,而COPD模型组与单纯吸烟组之间无明显差异,与KARAYAMA等人的人体研究结果不符。提示吸烟及吸烟联合脂多糖气管内滴注均可导致大鼠血清AECA的表达明显增加。
吸烟作为COPD的主要发病因素,通过诱导肺实质发生广泛性的炎症及直接抑制弹力蛋白再合成,从而破坏肺泡壁,形成肺气肿。以往研究中有学者曾提出COPD和肺气肿可能是一种由吸烟引起的自身免疫性疾病[1],吸烟可导致自身抗原和自身抗体的出现及细胞凋亡,参与了吸烟所致COPD和肺气肿的发生和发展。另外研究也发现香烟烟雾中的部分成分有一定的免疫源性,可能在肺部引起一定的免疫反应包括诱导抗体的产生[7,13,14]。AGUSTI[15]等人提出吸烟可以直接损伤气道上皮细胞及诱导自身抗原,触发免疫及炎症反应。国内杨敏[16]等人也发现COPD患者及肺功能正常的吸烟者均存在明显的肺血管内皮细胞凋亡,认为在吸烟所致COPD的早期即存在细胞凋亡。因此AECA作为导致内皮细胞损伤相关的自身免疫组分可能是烟雾刺激致病的途径之一,但究竟其是导致COPD的独立致病因素还是部分或完全通过吸烟途径致病尚不清除。
血清细胞 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
选用SD成年雄性健康大鼠,体重180～200 g,由江苏大学动物中心提供。用敞箱实验进行行为学评分,选择得分相近的30只,随机分为2组,即对照组15只,每笼5只;抑郁组15只,每笼1只。
1.2 建立抑郁模型
采用慢性不可预知应激与孤养模式相结合的方式,对抑郁组大鼠随机采用冰水游泳5 min,40℃环境3 min,禁水禁食24 h,夹尾1 min,悬吊1 min,行为限制120 min,电击足底1 min、昼夜颠倒24 h及潮湿鼠笼24 h等9种不同刺激,持续共8周。实验开始前,两组大鼠进行适应性饲养1周,自由进食水,并测量基础指标(体重、液体消耗及水迷宫试验)。
1.3 模型观察指标
(1)体重:每两周末上午8∶00喂食前测量。(2)液体消耗实验[1]每两周末上午9∶00禁水禁食后进行,计算代表抑郁症快感消失的糖水偏爱百分比(糖水偏爱百分比=糖水消耗/总液体消耗×100%)。(3)Morris水迷宫试验Morris水迷宫[2]是目前行为学检测最先进的系统之一,既客观又准确,主要是测试动物的空间立体记忆能力。本试验采用目前最先进的影像行为轨迹分析系统之一的EthoVision(Version2.3,荷兰Noldus公司),测定平均潜伏期以反映大鼠的空间立体记忆能力。
1.4 大鼠血清细胞因子检测
(1)取材:固定大鼠后,在未麻醉的情况下,尾静脉抽血约0.8～1.0 m L,37℃水浴45 min左右,3 000r/min离心15 min后,取上层血清,-70℃低温保存,以供集中一次检测。(2)检测方法:采用酶联免疫吸附法(ELISA),严格按照试剂盒说明测定大鼠血清中炎症细胞因子IL-2、IL-6及IL-10的值。试剂盒由上海依克赛生物制品公司提供,进口分装。
1.5 统计学分析
所有数据采用统计软件Stata 11.0处理,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用检验。检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 慢性不可预知应激对大鼠体重及行为学指标的影响
(1)体重:慢性应激第4周,抑郁组大鼠的体重明显低于对照组(t=2.80,P<0.01)。(2)液体消耗试验第2周时,抑郁组大鼠1%糖水偏爱百分比显著性下降(t=2.21,P<0.05);到第4～8周时,下降更明显(P<0.01)。(3)Morris水迷宫试验第2周时,两组差异无显著性;第4周时,抑郁组的平均潜伏期较对照组增加,差异具有显著性(t=5.32,P<0.01);第6～8周,差异更加明显(P<0.001)
注:1)与对照组比较,差异有显著性,P<0.05;2)与对照组比较,差异无显著性,P>0.05
注:1)与对照组比较,差异有显著性,P<0.05;2)与对照组比较,差异无显著性,P>0.05;3)与对照组比较,差异有显著性,P<0.01
注:1)与对照组比较,差异有显著性,P<0.05;2)与对照组比较,差异无显著性,P>0.05
2.2 大鼠血清炎症细胞因子
IL-2在0～4周时缓慢上升,至第4周时,抑郁组较对照组有统计学差异(P<0.05),其后缓慢下降;IL-6在第2周时,抑郁组就明显上升,较对照组差异有显著性(P<0.05),2～4周继续上升(P<0.01),至第6周时下降,但第8周时略上升;IL-10在第2周时,抑郁组略下降,第2～6周时上升,于第6周时较对照组有统计学差异(P<0.05),第8周时保持较高水平,结果见表1～3及附图。
3 讨论
3.1 大鼠抑郁模型的建立
采用慢性不可预知应激和孤养两种经典模型结合的方式,建立大鼠抑郁模型,是目前比较成熟、可靠的方法[3]。它不仅可以模拟人类抑郁症的核心症状,即快感缺乏(糖水偏爱百分比的低水平),同时可模拟活动减少、好奇探究能力及记忆力下降(Morris水迷宫试验中抑郁组的平均潜伏期的增加)。从建立模型的数据表明,抑郁症大鼠于第4周末建模成功,并呈动态变化,具有良好的临床相似性及可靠性。
3.2 血清细胞因子的动态变化
IL-6主要由单核巨噬细胞分泌,属于前炎症介质,可促进B细胞增殖和分泌抗体,增强NK细胞的活性,特别是在急性炎症反应期就迅速升高,提示免疫激活;IL-2是由TH1淋巴细胞亚群产生,能够刺激胸腺细胞的增殖,活化B淋巴细胞,并增强NK细胞的细胞毒作用;IL-10主要由TH2分泌,具有抗炎和免疫抑制作用,主要表现为抑制T淋巴细胞及巨噬细胞分泌促炎性因子,并抑制单核巨噬细胞的活化[4,4]。
近年来,国内外学者对抑郁症患者的血清进行了多种细胞因子的检测,大多数认为抑郁症存在炎症因子的浓度异常,但其往往仅是对疾病的某一时期的研究,而且其改变的方向及程度不完全一致。DOWLATI[5]认为除抑郁患者的IL-6和IFN-γ升高外,IL-2、IL-4和IL-10差异无显著性:而SIMON[6]认为IL-2、IL-4、IL-6、IL-10及IFN-γ均升高。而在本实验中,笔者选择了与抑郁症密切相关的3种炎症因子(IL-2、IL-6及IL-10)进行了检测,并进行了动态观察,结果提示大鼠抑郁模型的IL-2、IL-6和IL-10存在异常,并在不同时期表现各自的变化趋势。
结合这3种炎症因子的动态变化及功能,笔者认为:IL-6及IL-2在应激前期的上升,提示免疫激活;而在应激6周左右时,受到炎症抑制因子IL-10的影响,IL-2和IL-6下降,但IL-6随即又升高,提示机体的免疫抑制--即机体的代偿无法抗衡免疫激活以达到免疫平衡,同时也说明在抑郁症的免疫激活中,IL-6起主导作用;而IL-2后期的持续缓慢下降表明其对IL-10的抑制作用比较敏感。IL-10在初期受到高水平IL-6的作用而略下降,而后机体代偿性地对抗免疫激活,导致IL-10在第2～6周升高,而在第6～8周的持续稳定水平意味着机体的免疫抑制与激活将持续对抗,影响疾病的发展。同时上述炎症因子的异常,会导致下丘脑-垂体-肾上腺轴的亢进,而下丘脑-垂体-肾上腺轴的中枢兴奋将使神经-内分泌-免疫系统功能紊乱,下丘脑激素及血浆皮质醇的增高等,最终导致机体产生抑郁症状[7,8]。
综上所述,可见随着应激的推进、抑郁病情的发展,体内细胞因子呈动态变化,免疫激活和免疫抑制之间相互作用,并通过神经内分泌系统与免疫系统之间相互调节,影响抑郁症的发生发展,这也为从细胞因子方向治疗抑郁症提供了一定的帮助。
参考文献
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血清细胞 篇8
CD31 又称为血小板- 内皮细胞黏附分子(plateletendothelialcelladhesionmolecule-1,PECAM-1/CD31),最早发现于1990 年[3],分子量约为130 k Da,其结构属于免疫球蛋白超家族成员,近年来的研究表明CD31 与动脉粥样硬化症、肺癌及卵巢癌[4,5,6]等多种疾病的发病机制有关,然而,CD31在肝细胞癌的发病机制中作用的报道尚少。本文旨在研究CD31 在肝细胞癌患者血清中的表达,以及干扰肝癌细胞中CD31 表达后,对肝癌细胞侵袭及增殖能力的影响,从而对于肝细胞癌的防治提供一定的理论基础。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2013 年6 月-2015 年3 月,本科室肝癌手术患者45 例为研究组。男21 例,女24 例;年龄39~75 岁,平均(51.67±7.37)岁。所有患者术前均未经介入或放化疗等治疗,均接受了肝癌根治性切除术,所有患者术后病理学证实为肝细胞癌,且未发现远处转移,排除合并其他慢性病如高血压、糖尿病,或其他肿瘤的患者。对照组为同期健康体检人群45 例。其中,男20 例,女25 例;年龄37~78 岁,平均(54.02±7.98)岁。
1.2 主要试剂
SMMC-7721 细胞购自ATCC公司,DMEM培养基、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司,荧光标记的2'-O- 甲基si RNA CD31-FAM、稳定阴性对照si R-NA CD31-NC和CD31 引物购自上海吉玛生物技术有限公司,RNA提取试剂盒Trizol购于Gibco公司,Real-time PCR试剂盒购自Roche公司,抗CD31 抗体购自Abcam公司,抗 β-actin抗体购自Santa Cruz公司,羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司,CCK-8购自上海博谷生物科技有限公司。
1.3 细胞培养
SMMC-7721 细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,细胞生长至对数生长期时,以1×105个/ 平皿,接种于6 cm平皿,或以4×106个细胞/ 平皿,接种于10 cm平皿,孵育细胞。
1.4 细胞转染
采用脂质体2000(美国Invitrogen公司)对人肝癌细胞SMMC-7721 中CD31 m RNA抑制表达,于48 h候检测其干扰效率。CD31 si RNA干扰序列:正向5'-UUCCGUUCUAGAGUAUCUG-3',反向5'-CAGA UACUCUAGAACGGAA-3'。
1.5 检测指标
1.5.1 ELISA检测肝癌患者血清CD31 表达水平取研究组和对照组患者外周血2 ml,静置6 h后,离心取上清,依照产品说明书,ELISA试剂检测两组CD31 的表达水平。
1.5.2 Real-time PCR检测肝癌细胞中CD31m R-NA表达水平将培养至对数生长期的肝癌细胞,用Trizol提取各组总RNA,反转录为c DNA,以作为GAPDH内参,依照产品说明书,测定TNF-α 的变化。CD31 引物序列正向:TCCAGGCCAGCTGCTC-CACTT;反向:GCCTTCCGTTCTCTTGGTGAGGC。
1.5.3 Western blot检测肝癌细胞中CD31 蛋白表达水平肝癌细胞培养至对数生长期,按照蛋白抽提步骤,提取总蛋白;采用BCA法测定总蛋白浓度,经SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上,5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h,TBST洗涤后,分别加入1∶1 000抗CD31 抗体、1∶500 抗 β-actin抗体,4 ℃孵育过夜,TBST洗涤后加入1∶5 000 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗,37℃孵育1 h,再用TBST洗涤,化学发光并曝光成像。Weastern blot检测以 β-actin条带作为内参,CD31 条带与其比较,观察CD31 蛋白表达变化。
1.5.4 细胞迁移实验将处于对数生长期的肝癌细胞,调整细胞密度至4×l05个/ml,按0.1 ml/ 孔加入到transwell小室的上层,小室下层加入1 ml的含有10%血清的培养液。培养24 h后,对己迁移至小室下层的细胞进行计数(随机选取5 个视野)。
1.5.5细胞增殖实验将对数生长期的细胞以50%的汇合率接种至96 孔板,每组设置3 个复孔,同时设置不含细胞的空白培养基作为对照,37℃,5%二氧化碳CO2,95%湿度下培养24 h后,分别在培养孔加入10μl CCK-8 溶液;再置于孵箱孵育2 h,酶标仪检测450 nm的吸光值,每孔实测OD值需减去空白对照OD值,取3 复孔平均值,记录OD值。
1.6 统计学方法
数据以均数±标准差(±s)表示,采用SPSS19.0 软件进行统计分析。两组间差异比较采用Student’s t检验,P <0.05 认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肝癌患者血清CD31 表达水平
与建康人群相比,CD31 在肝癌患者血清中的表达水平显著增高,差异有统计学意义(P <0.001),提示CD31 的高表达在肝癌的发生发展中可能发挥重要的调节功能(表1)。
2.2 肝癌细胞转染si RNA CD31 后CD31 表达变化
SMMC-7721 肝癌细胞转染si RNA CD31 后,同对照相比,CD31m RNA的表达水平明显下降(见图1A),CD31 蛋白表达水平也明显降低(见图1B),差异均具有统计学意义,提示低表达CD31 肝癌细胞构建成功。
2.3 肝癌细胞中CD31 对细胞侵袭功能的影响
SMMC-7721 肝癌细胞转染si RNACD31 后,同对照相比,transwell小室下层细胞数量显著减少(图2),差异具有统计学意义(P <0.001),提示了CD3具有增强肝癌细胞侵袭能力。
2.4 肝癌细胞中CD31 对细胞增殖的影响
SMMC-7721 肝癌细胞转染si RNA CD31 后,同对照相比,肝癌细胞增殖显著减少(图3),差异具有统计学意义(P <0.001),提示了CD31 具有增强肝癌细胞侵袭能力。
注:†与正常组对比,t =14.24,P <0.05
†P<0.001;A:肝癌细胞中CD31mRNA表达变化;B:肝癌细胞中CD31蛋白表达变化
3 讨论
肝癌是常见的恶性肿瘤之一,在全球范围内,肝癌的发病率居恶性肿瘤的第5 位,病死率居第3 位,而且55%的肝癌患者分布于我国[7]。目前,肝癌的发病机制尚未明确,诊断和治疗仍是临床难题之一。近年来,研究学者认为基因调控在肝癌发病机制中起到重要作用,特别是对肝癌细胞的黏附、侵袭和增殖的影响[8],所以,肝癌细胞特异性的基因调控靶点是肝癌的诊断和治疗的全新研究方向。
CD31/PECAM-1 是血管内皮细胞特异性标志物,可以通过细胞间、细胞核细胞基质间的相互作用,参与多种信号转导和炎症反应。随着研究的深入,在肿瘤细胞表达CD31,在肿瘤的基因调控中发挥作用[9,10]。本研究检测肝癌患者血清CD31 的表达水平明显高于正常健康人群,提示高表达CD31 可能起到调控肝癌细胞中的信号途径[11],从而影响肝癌的发生发展。这与DAROM等人[12]研究发现CD31/PECAM-1 在非何杰金氏胃淋巴瘤患者体内表达增高结果是一致的,从侧面支持了本研究。
小分子干扰RNA(small interference RNA,si R-NA)正逐渐取代反义核苷酸技术,成为肿瘤基因疗法的理想工具[13]。研究表明,阳离子脂质体可有效地实现si RNA的靶向输送,2'-O- 甲基修饰的si RNA可提高si RNA的稳定性[14]。本研究通过si RNA干扰抑制肝癌细胞中CD31 的表达,用以研究CD31 对肝癌细胞的影响。结果显示采用si RNA干扰抑制CD31 的表达后,检测肝癌细胞中CD31 的基因和蛋白表达水平均显著低于未受干扰的肝癌细胞,,说明低表达CD31 肝癌细胞株构建成功。
肿瘤细胞的侵袭和增殖能力与肿瘤的转移和生长速度密切相关,影响着肿瘤的发展和转归[15,16]。本研究运用已构建成功的低表达CD31 肝癌细胞与未受干扰抑制高表达CD31 肝癌细胞相比,通过tran-swell实验发现高表达CD31 肝癌细胞的侵袭能力显著强于低表达CD31 肝癌细胞,说明CD31 表达水平的高低影响着肝癌细胞的侵袭能力。此外,本研究运用CCK-8 实验研究肝癌细胞增殖能力发现,高表达CD31 肝癌细胞的增殖能力显著强于低表达CD31 的肝癌细胞,说明CD31 表达水平越高,肝癌细胞的增殖能力越强。CD31 的表达水平影响肝癌细胞的侵袭和增殖能力,这与TACHEZY M等人在导管内乳头状黏液性肿瘤中的研究结果是一致的[17]。
血清细胞 篇9
【关键词】 骨关节炎；独活寄生汤；含药血清；软骨细胞；细胞凋亡；大鼠
doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2014.12.008
Effects of Serum Medicated with Duhuo Jisheng Decoction on the Expression of the Degenerated Cartilage Cells Bcl-2 and Bax in Rats
PAN Cai-bin，WANG Wu-lian，WU Guang-wen，FU Chang-long，WENG Mei-rong，LIU Xian-xiang
【ABSTRACT】Objective：To observe the effects of serum medicated with Duhuo Jisheng Decoction on the expression of the degenerated cartilage cells Bcl-2 and Bax in rats.Methods：The degenerated cartilage cell models in vitro were established，which were intervened by the serum medicated with Duhuo Jisheng Decoction（the medicated serum group）and the blank serum （the blank serum group）for 24 h，48 h and 72 h，collecting chondrocytes.The RT-PCR method was used to detect the expression of degenerated cartilage cells Bcl-2 and Bax mRNA after serum intervention.The Western Blot method was used to detect the expression of degenerated cartilage cells Bcl-2 and Bax protein after serum intervention.Results：The effects of the serum medicated with Duhuo Jisheng Decoction on the expression of Bcl-2 and Bax protein had the same tendency as on the expression of Bcl-2 and Bax mRNA，.along with the extension of time，the positive expression rate of Bcl-2 protein in the two groups gradually increased，the medicated serum group being more significant than the blank serum group；while the positive expression rate of Bax protein in the two groups gradually decreased，the medicated serum group being more significant.The difference between each time point was statistically significant（P < 0.01）.Conclusion：Duhuo Jisheng Decoction can inhibit the activation of the mitochondrial apoptosis pathway by up-regulating the expression of rat osteoarthritis cartilage cells Bcl-2 and down-regulating the expression of Bax，thus effectively inhibiting chondrocyte apoptosis.
【Keywords】osteoarthritis；Duhuo Jisheng Decoction；medicated serum；
chondrocyte；apoptosis；rat
骨关节炎（osteoarthritis，OA）又称退行性关节炎、增生性关节炎、肥大性关节炎等，是老年常见的骨关节疾病。随着社会老龄化的加剧，OA患者逐渐增多，已严重影响到人们的健康和生活。目前，普遍认为OA是在力学和生物学等多种因素共同作用下导致软骨细胞、软骨细胞外基质、软骨下骨三者降解与合成耦联失衡的结果[1]，其中软骨细胞破坏及软骨基质降解是其主要病理过程。换言之，延缓软骨细胞及软骨基质降解是OA的主要治疗目的和方法之一。独活寄生汤出自《备急千金要方》，为治疗久痹而致肝肾两虚、气血不足证之验方，临床应用日益广泛，并获得良好疗效[2]，但其确切作用机制尚未完全明了。本实验通过独活寄生汤含药血清对大鼠退变软骨细胞Bcl-2、Bax影响的研究，探讨本方延缓OA软骨退变的可能机制，为临床应用提供实验依据。
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1 实验材料
1.1 实验药物 独活寄生汤由独活、桑寄生、牛膝、杜仲、秦艽、防风、肉桂、细辛、川芎、当归、芍药、干地黄、人参、茯苓、甘草组成，由福建中医药大学附属第二人民医院药剂科提供。
1.2 实验动物 健康2月龄清洁级SD大鼠36只（雌雄各半），健康4周龄清洁级SD大鼠20只（雌雄不限），由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物合格证号：SCXK（沪）2007-0011。福建中医药大学实验动物中心提供清洁级医学实验动物环境设施，许可证号：SYXK（闽）2009-0001。
1.3 主要试剂 DMEM培养基（Hyclone公司）；胎牛血清（GIBCO公司）；质量分数0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司）；TRIZOL试剂（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（Fermentas公司）；引物合成（上海生工生物工程公司）；Bax，Bcl-2和β-actin一抗（美国Santa Cruz Biotechnology公司）、二抗（美国Cell Signaling Technology公司）。
1.4 主要仪器 二氧化碳培养箱（Thermo公司）；荧光倒置相差显微镜（徕卡仪器公司）；PCR仪，蛋白核酸分析仪（美国Beckman Coulter公司）；化学发光成像系统ChemiDocXRS +（Bio-Rad公司）。
2 方 法
2.1 独活寄生汤含药血清的制备 健康2月龄清洁级SD大鼠36只，随机分为独活寄生汤组（含药血清组）27只和生理盐水对照组（空白血清组）9只。根据“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比率表”换算[3]，含药血清组给予独活寄生汤
9.3 g·kg-1·d-1，空白血清组给予质量分数0.9%生理盐水10 mL·kg-1·d-1；连续灌胃7 d，在麻醉下行腹主动脉采血，经离心获取含药血清，并经56 ℃水浴灭活30 min及过滤除菌后，-20 ℃保存。
2.2 退变软骨细胞模型的建立及干预 采用酶消化法从4周龄清洁级SD大鼠的膝关节软骨中分离得到软骨细胞[4]，进行细胞培养至第3代软骨细
胞；再予10 ng·mL-1 IL-1β诱导获得退变软骨细胞[5-6]；分别给予独活寄生汤含药血清或空白血清干预，并分别于24 h、48 h、72 h后检测相应指标。
2.3 RT-PCR法检测血清干预后退变软骨细胞Bcl-2、
Bax mRNA表达 血清干预退变软骨细胞结束后，弃掉培养液，用PBS轻轻漂洗后，加1 mL Trizol进行裂解，提取总RNA，逆转录反应合成cDNA，
进行目的基因的扩增。将24 h、48 h、72 h 3个时点的PCR产物一起进行琼脂糖凝胶电泳、拍照、结果分析。目的基因引物序列见表1。
2.4 Western Blot法检测血清干预后退变软骨细胞Bcl-2、Bax蛋白表达 血清干预结束后，退变软骨细胞中总蛋白的提取，BCA法测定蛋白含量，Western Blot 法检测蛋白表达，抗体稀释倍数如下：Bax 1∶500；Bcl-2 1∶500。
2.5 统计学方法 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用t检验；多组数据间比较采用单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 血清对退变软骨细胞Bcl-2、Bax mRNA表达的影响 随着干预时间的延长，空白血清组和含药血清组Bcl-2 mRNA的表达量均逐渐升高，Bax mRNA逐渐降低，具有时间依赖性，且各时点之间比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。含药血清组24 h Bcl-2 mRNA表达量比空白血清组24 h高，差异有统计学意义（P < 0.05）；Bax mRNA表达量比空白血清组24 h低，差异有统计学意义（P < 0.01）。
含药血清组48 h Bcl-2 mRNA表达量比空白血清组48 h高，差异有统计学意义（P < 0.05）；
Bax mRNA表达量比空白血清组48 h低，差异有统计学意义（P < 0.01）。含药血清组72 h Bcl-2 mRNA表达量比空白血清组72 h高，差异有统计学意义（P < 0.05）；Bax mRNA表达量比空白血清组72 h低，差异有统计学意义（P < 0.01）。见图1。
3.2 血清对退变软骨细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 独活寄生汤含药血清对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响与其对Bcl-2和Bax mRNA的影响具有相同的趋势，随着干预时间的延长，空白血清组和含药血清组Bcl-2蛋白表达量均逐渐升高，Bax蛋白表达量逐渐降低，具有时间依赖性，且各时点之间比较，差异有统计学意义（P < 0.01）。含药血清组24 h Bcl-2蛋白表达量比空白血清组24 h
高，Bax蛋白表达量比空白血清组24 h低，差异均有统计学意义（P < 0.01）。含药血清组48 h Bcl-2蛋白表达量比空白血清48 h高，而Bax蛋白表达量比空白血清组48 h低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。含药血清组72 h Bcl-2蛋白表达量比空白血清组72 h高，但Bax蛋白表达量比空白血清组72 h低，差异均有统计学意义（P < 0.01）。
4 讨 论
OA属中医学“痿证”“痹证”“骨痹”范畴，气血营卫内虚是致病的内在因素，风寒湿邪外袭是致病的外在因素，经络气血阻滞则是痹证的主要病机。独活寄生汤以独活为君药，祛下焦与筋骨间的风寒湿邪。臣以细辛散阴经风寒，搜筋骨风湿，通络止痛；秦艽除风湿舒筋；肉桂心温里祛寒，通利血脉。佐以桑寄生、牛膝、杜仲补肝肾，壮筋骨，祛风湿；当归、川芎、地黄、芍药养血活血；人参、茯苓、甘草补气健脾，扶助正气。甘草调和诸药，为使药。诸药合用，祛邪扶正，标本兼顾，达到祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气血之功效[7-8]。纵观全方，以祛风寒湿邪为主，辅以补肝肾、益气血之品，邪正兼顾，祛邪而不伤正，扶正而不留邪，正与OA的病机相契合，从而发挥治疗作用[9-10]。
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“线粒体凋亡途径”是脊椎动物最常见的凋亡通路。IL-1β诱导软骨细胞复制软骨细胞退变模型，是目前较为经典的退变软骨细胞造模方法[11-12]。本研究选用IL-1β做诱导剂，并参照相关文献[13]，选取10 ng·mL-1作为IL-1β的诱导含量，干预第3代软骨细胞。Bcl-2蛋白家族是线粒体凋亡途径的关键调节因子，包括以Bcl-2为代表的抗凋亡成员和以Bax为代表的促凋亡成员。在凋亡因子刺激下，活化的促凋亡蛋白Bax插入线粒体外膜并明显增高线粒体外膜的通透性，释放Cytochrome c
等促凋亡因子；释放到胞浆的Cytochrome c能与凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1以及pro-caspase-9、ATP/
dATP形成凋亡复合体。pro-caspase-9在凋亡复合体中被剪切形成有活性的caspase-9；活化的caspase-9
激活caspase-3等成员，进而引发caspases级联反应，导致细胞凋亡。本实验研究发现，独活寄生汤能上调大鼠OA软骨细胞抑制凋亡因子Bcl-2表达，下调促凋亡因子Bax表达，从而抑制线粒体凋亡通路的激活，有效抑制软骨细胞凋亡，这或许是其治疗OA的可能机制之一。
5 参考文献
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收稿日期：2014-09-09；修回日期：2014-09-30
血清细胞 篇10
1 材料
新生小鼠,吉林大学动物试验中心提供;RPMI1640细胞培养基、0.25%胰蛋白酶、台盼蓝染液,均由Sigma公司生产;胎牛血清,Hyclone公司生产。
2 方法
2.1 不同血清浓度培养小鼠肺细胞
将小鼠颈椎脱臼法处死,解剖,取出肺组织,加入0.25%胰酶液,37℃消化30 min后终止消化,液体过300目筛置于无菌培养皿中,用注射器的活塞橡胶头在筛子上轻轻研磨组织,得到滤液2 000 r/min离心10 min,弃上清液。加入0.5 m L红细胞裂解液,常温裂解2 min,离心5 min,PBS缓冲液2 m L重悬细胞,离心10 min,弃上清液。加入PBS缓冲液5 m L,再次离心1次,弃上清液,血细胞计数板计数。将细胞数量调整到5×105/m L左右,转移至96孔培养板中分别用配制好的血清浓度为5%、10%、20%、40%的培养液中,在37℃恒温培养箱中培养。
2.2 观察与计数
每2 d在倒置显微镜下观察细胞形态,并拍照记录。细胞活性测定(台盼蓝排斥试验)。重复3次求平均值,并计算细胞的存活率[6]。
3 结果与分析
3.1 细胞形态学观察结果
细胞培养5 d后,在倒置显微镜下能看到5%、10%、20%、40%血清浓度组的肺细胞,细胞成规则的卵圆形,透亮折光度较好,但均未见贴壁细胞。
5%血清浓度组细胞生长状态好,细胞数目较多(见298页彩图1)。10%血清浓度组目测细胞数目最多,细胞生长状态较好,能清晰看到细胞中心的细胞核(见298页彩图2)。20%血清浓度组细胞数目较少,有形态不完整的细胞(见298页彩图3)。40%血清浓度组细胞数量最少(见298页彩图4)。
3.2 台盼蓝染色检测肺细胞成活数目
乳鼠肺细胞在第3~5 d达到对数生长期,生长速度较快,第7天后趋于平缓,维持一定时间的稳定期后,细胞数量开始减少。在4个浓度中,10%浓度组的细胞生长状况较好。5%血清浓度组的细胞总体生长状况良好,细胞数目仅次于10%血清浓度组;10%血清浓度组的细胞,活细胞数量是4个浓度组中最多的,细胞生长趋势好;20%血清浓度组的细胞,指数生长期后细胞有膜破损状况,细胞死亡数目开始增多,短暂的稳定期后细胞数量开始下降;由于血清浓度过高,40%血清浓度组的细胞潜伏期及指数期时细胞增长速度缓慢,后期细胞死亡速率超过细胞生长速率,因此细胞数量是4个浓度中最少的(见图5)。
4 讨论
呼吸系统疾病发病率高,在该领域内的试验性研究已从实验动物的大体水平逐渐转移到单细胞乃至分子水平,要从结果复杂的肺组织检测某种细胞必须对肺组织进行分离,首要步骤是肺细胞体外原代培养,这就需要一种简单、稳定、高效的肺细胞原代培养的方法,为科研工作提供高效的平台[8]。研究发现:不同血清浓度培养基对乳鼠肺细胞原代培养有不同程度的影响,5%血清浓度组的细胞生长状态较好,可能因血清浓度不是很高,营养不够充分,活细胞数量少于10%血清浓度组的细胞;20%血清浓度组的细胞,显微镜下细胞数量较少,偶有细胞膜破损的细胞,生长曲线显示,指数期后细胞的死亡速率低于生长速率,细胞成衰退趋势,这个血清浓度不太适宜肺细胞的体外原代培养;40%血清浓度组的细胞生长状况不好,细胞生长缓慢且细胞膜破碎,潜伏期及指数期细胞均生长缓慢,短暂的稳定期后细胞数量急剧下降,此血清浓度过高不适宜小鼠肺细胞的体外原代培养;10%血清浓度组的细胞,在倒置显微镜下的细胞形态完整,台盼蓝染色测定的活细胞数目最多,是4个浓度组中生长状态最好的,因此也是体外小鼠肺细胞原代培养的最适血清浓度。
摘要：为了比较不同血清浓度的培养基对小鼠肺细胞原代培养的影响,在常规RPMI 1640培养基的基础上添加不同浓度的新生牛血清(5%、10%、20%、40%),每隔1 d在倒置显微镜下观察培养细胞的形态并用台盼蓝染色法统计细胞数目,绘制生长曲线。结果表明:4个血清浓度组中均有原代肺细胞生长增殖,血清浓度为10%的培养液培养的细胞生长状况最好,细胞形态完整清晰,数量较多,更适合小鼠的肺细胞生长。说明10%血清浓度的培养液最适合小鼠肺细胞的原代培养。
关键词：小鼠,肺细胞,胰酶消化法,原代培养,血清浓度,生长曲线
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