脂肪干细胞辅助（共7篇）
脂肪干细胞辅助 篇1
重症急性 胰腺炎 (severe acute pancreatitis, SAP)目前在临床并不少见,该病病情凶险、进展迅速,若不及时采取有效措施将导致全身炎症级联反应加重,甚至出现多器官功能衰竭。对于SAP的治疗首先为广谱抗生素、禁食、抑制胰酶分泌等,尝试长期禁食不利于患者全身状态的恢复及炎症水平的抑制,肠外营养十分必须[1]。脂肪乳剂已经广泛用于肠外营养,其中 ω-3鱼油脂肪乳在提高热量之外还具有抗炎、调节免疫功能等作用。本次研究主要分析 ω-3鱼油脂肪乳注射液辅助治疗重症急性胰腺炎的疗效及对患者血清血清肿瘤坏死因子 -α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素 -1β (interleukine-1β,IL-1β)的影响。具体报道如下:
1资料与方法
1.1一般资料
按照下列方式择于2012年7月 -2014年7月在本院接受住院治疗的SAP患者80例作为研究对象,均符合中华医学会制定的临床重症胰腺炎诊断标准。排除标准:1脂质代谢异常及其他代谢性疾病,如甲状腺亢进、减退;2严重肝肾功能异常;3妊娠、哺乳期妇女;4经解释研究过程后拒绝签署知情同意书。
1.2分组方法
按照随机数表法将所有入组患者分为:接受常规治疗的对照组、接受常规治疗联合 ω-3鱼油脂肪乳注射液的观察组,每组各40例。观察组患者中, 男23例,女17例,年龄24~73岁,平均(49.16± 8.33)岁,体质指数(body mass index,BMI)15.83~ 27.52 kg/m2,平均(21.38±2.05)kg/m2;对照组患者中,男22例,女18例,年龄25~74岁,平均(48.35± 8.07)岁,BMI 15.76~27.83 kg/m2,平均(21.51±2.11) kg/m2。两组患者的基线资料差异无统计学意义,P >0.05,具有可比性。
1.3治疗方法
对照组患者接受SAP后常规治疗,禁食、胃肠减压、抑制胰酶分泌、补液和营养支持等,肠外营养所用脂肪乳剂为20%结构脂肪乳制剂。观察组患者肠外营养采用 ω-3鱼油脂肪乳注射液,其余治疗同对照组。
1.4观察指标
1.4.1恢复时间及并发症情况两组患者接受不同治疗方式后,记录肠功能恢复时间、总住院时间,比较并发症包括多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)、急性肾功能衰竭 (acute renal failure,ARF)、胃肠道瘘及胰腺假性囊肿等发生情况。
1.4.2血清相关指标患者入院时、治疗后3 d分别抽取外周静脉血,测定白蛋白、白细胞总数、中性粒细胞总数和血淀粉酶等水平。
1.4.3血清炎症因子水平患者入院时、治疗后3 d分别抽取外周静脉血,采用ELISA法测定血清TNF-α 和IL-1β 等炎症因子水平。
1.5统计学方法
采用SPSS 18.0软件对上述数据进行统计学分析,计量资料采用t检验、计数资料采用 χ2检验,所得结果均按P <0.05判断为具有统计学意义。
2结果
2.1恢复时间及并发症情况
观察组患者接受 ω-3鱼油脂肪乳注射液辅助治疗后的肠道恢复时间、总住院时间均明显短于对照组,住院期间各种并发症发生率显著低于对照组 (P <0.05)。具体见表1。
2.2血清相关指标
两组患者入院前的血清相关指标差异无统计学意义(P >0.05),观察组患者接受治疗后的血清白蛋白水平高于对照组,白细胞总数、中性粒细胞总数和血淀粉酶水平明显低于对照组(P <0.05)。具体见表2。
2.3血清炎症因子水平
入院时两组患者的血清TNF-α 和IL-1β 水平差异无统计学意义(P >0.05),观察组患者接受治疗后的TNF-α 和IL-1β 水平明显低于对照组(P < 0.05)。具体见附图。
1:TNF-α;2:IL-1β;A:术前炎症因子含量;B:术后炎症因子含量;覮,差异有统计学意义
3讨论
SAP为十分凶险的全身消耗性疾病,表现为链式瀑布急性炎症反应,同时胰腺自身释放大量消化酶和炎症介质,可以介导全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),最为严重者甚至可诱发MODS[2]。SAP发病后常规采用广谱抗生素及强力支持疗法,但其病死率仍居高不下。 对于SAP的治疗,阻断其全身炎症反应过程至关重要,目前采用的禁食、胃肠减压、抑制胰酶分泌和补液等治疗手段对于控制SAP病情具有积极意义,但是营养支持及炎症控制对于改善SAP患者营养状况、维持内环境稳定、减少并发症、改善预后等均有极其重要的意义[3]。
脂肪乳剂是近年来发展迅猛的新药物,具有渗透压低、对静脉刺激小、高热量等特性,是临床支持治疗中不可缺少的营养剂,亦成为肠外营养的主要组成成分[4]。目前肠外营养制剂较多,包括长链三酰甘油、结构三酰甘油、单不饱和脂肪酸和 ω-3鱼油脂肪乳等,其中 ω-3鱼油脂肪乳在提供能力同时具有其他脂肪乳剂所不具备的特性,广受临床学者关注。根据已有的动物实验研究显示,ω-3鱼油脂肪乳具有以下作用:1抑制过度炎症反应;2免疫调节作用;3对肝肾等重要脏器功能的保护作用。 ω-3鱼油脂肪乳的这一系列特性使其成为应用于SAP肠外营养的理想营养制剂,但是目前研究多着眼于动物实验研究,相关临床实践研究较少,限制了其临床应用。
本次研究选择SAP患者作为研究对象,重点分析 ω-3鱼油脂肪乳注射液为其带来的治疗效果改变。SAP随着病程延长治疗难度增加,预后也不佳, 故首先比较两组患者接受不同治疗后的恢复情况及并发症发生情况,结果显示:观察组患者接受 ω-3鱼油脂肪乳注射液辅助治疗后的肠道恢复时间、总住院时间均明显短于对照组,住院期间各种并发症发生率显著低于对照组。可见 ω-3鱼油脂肪乳注射液应用后有助于促进SAP患者的病情康复,对于降低疾病过程中并发症发生也有积极意义,但是其发挥作用的具体机制尚未明确,下文将继续分析[5]。
SAP患者全身处于急性炎症反应状态,白细胞及中性粒细胞水平大幅上升,血淀粉酶是急性胰腺炎诊断的特异性标准,在发病后早期血清水平可明显上升,且升高幅度与病情严重程度存在明确的正相关关系[6]。上述研究比较了治疗前后患者的血清白细胞、血淀粉酶等特异性指标水平,结果显示:观察组患者接受治疗后的血清白蛋白水平高于对照组,白细胞总数、中性粒细胞总数和血淀粉酶水平明显低于对照组。两组患者发病后白细胞及中性粒细胞水平大幅上升,证实其处于严重炎症状态,而血淀粉酶水平的剧烈上升又侧面证实患者SAP的诊断。 在 ω-3鱼油脂肪乳治疗后,其有效成分EPA和DHA通过竞争环氧化酶和脂质过氧化酶途径减少来源于花生四烯酸的炎性介质,最终缓解患者的全身炎症反应,降低疾病的凶险性[7]。
IL-1β 与TNF-α 是人体内的主要炎症因子, 可以激发炎症级联反应,已经有研究显示IL-1β 与TNF-α 是SAP预后的一个独立危险因素,其表达水平随病情变化而改变。本次研究结果显示:入院时两组患者的血清TNF-α 和IL-1β 水平差异无统计学意义,观察组患者接受治疗后的TNF-α 和IL-1β 水平明显低于对照组。说明 ω-3鱼油脂肪乳可以 有效降低SAP患者的血 清IL-1β 与TNF-α 表达,改善患者预后,其可能机制为 ω-3鱼油脂肪乳有效成分二十碳五烯酸竞争性结合环加氧酶,抑制前列腺素E2产生,最终抑制前列腺素E2诱导产生IL-1β 与TNF-α 的过程[8]。
综上所述,得出以下结论:ω-3鱼油脂肪乳注射液辅助治疗可以有效促进重症急性胰腺炎患者康复,减少并发症发生,降低血清白细胞、血淀粉酶及炎症因子水平,值得在日后临床实践中推广应用。
脂肪干细胞辅助 篇2
1资料与方法
1.1一般资料
选择我院2010年3月至2013年9月收治的63例患者, 均为女性, 年龄21岁~42岁, 平均年龄 (28.9±6.8) 岁;湿性CAL隆乳术13例, 隆乳假体取出后立即隆乳术11例, 隆臀术14例、全面部皮下组织萎缩症丰面治疗4例、美容性面部年轻化丰面术15例、受区外伤、感染引发局部瘢痕凹陷血运差接受注射填充治疗6例。术后患者在手术前与手术后, 均测量臀位和胸围, 并拍照, 彩超定期扫描。
1.2手术方法
使用人工注射器, 术者肿胀液, 注射过程中保持力度, 避免压力过快、过大、过高, 使用注射器吸脂法。使用螺口注射器一次性注射20ml, 并采取无创吸脂针进行吸脂, 每次吸脂后将注射器自然悬浮, 将注射器内的颗粒脂肪水分排除, 将脂肪物中的悬浮颗粒使用生理盐水洗涤, 注射器中的颗粒脂肪中的油脂部分不排除, 不离心将干细胞和浓缩纯化颗粒脂肪分离, 排除注射器的混合填充物, 行直接填充移植。在对受区注射前, 需先使用局部浸润麻醉, 确保层次组织的疏松无创分离、膨胀。从注射肿胀液的剂量, 判断湿性CAL填充物的需要量。单点微量 (0.8ml) 、多平面、多点、无创钝针线状成为退针边注射。干细胞“微粒”和颗粒脂肪, 均定为于植体床内, 在隆乳时, 注入剂量为100ml, 在隆臀时需一侧注入300ml。行肌肉注射时, 可将其分为多层注射, 减少损伤, 确保血运状态。对受区作处理后, 凹陷湿性CAL, 其主要在于肌肉分层注射, 减少损伤, 确保血运状态, 湿性CAL在面部, 主要为全面肌肉深层注射移植。术后, 因充分填充, 会发生肿胀, 可使用间歇性冰敷, 或行热敷理疗, 可快速恢复正常。
2结果
63例患者, 术后均无明显并发症, 24例患者隆乳术后, 且外观满意, 手感良好。所有患者均采取单次注射移植, 未采取重复注射可取得满意效果。经随访发现, 术后使用MRI检查, 脂肪清除其发生率不足1%。
3讨论
湿性CAL注射移植前, 受区先局部肿胀浸润使各层次组织液压膨胀和蔬松无创分离, 即在受区局部肿胀浸润呈现一个“生理湿性内环境”, 使注射移植混合填充物微粒易白行弥散开, 不易形成脂肪结节, 同时又对体表软组织凹陷及扁平小乳房等受区部位起到一定的术中即时预扩张作用[1]。本研究结果提示单次注射即可获得满意效果。
湿性CAL临床应用技术指南及注意事项:1湿性肿胀注射器吸脂, 尽量减少额外人工处理中间环节和最大限度减少损伤;2受术者体质和注射填充部位具体状况与成活率密切相关;3操作过程中每一个环节, 均是影响术后成活率的关键因素;4受区血运状况是成活率的决定性因素[2]。
总之, 采取湿性脂肪干细胞对自体颗粒脂肪注射移植术进行辅助, 能提高手术成功率, 降低手术风险, 操作简单, 术后并发症少, 值得临床进一步推广使用。
摘要：目的:探讨湿性脂肪干细胞在自体脂肪移植中的效果。方法:一次性螺口注射器20ml吸脂, 自然悬浮后, 排除注射器下层水分, 不离心分离浓缩纯化颗粒脂肪, 行直接注射移植;先对注射受区肿胀进行局部浸润麻醉, 组织各层次行疏松分离, 行分层次注射移植, 对注射后损伤、血运和操作时间进行分析。结果:经术后随访, 相较于传统单纯颗粒脂肪湿性注射隆乳术、隆臀术、隆乳术后假体取出直接注射隆乳术等自体颗粒脂肪注射移植术比较, 其临床效果有显著改善。结论:采取湿性脂肪干细胞对自体颗粒脂肪注射移植术进行辅助, 能提高手术成功率, 降低手术风险, 操作简单, 术后并发症少, 值得临床进一步推广使用。
关键词：脂肪干细胞,自体颗粒脂肪注射移植,血管基质层片段细胞
参考文献
[1]刘乃军, 王艳.湿性脂肪干细胞辅助自体脂肪移植术的临床研究[G].第十一届上海国际整形美容外科会议论文集, 2012, 4:117-118.
脂肪干细胞研究进展 篇3
关键词：脂肪干细胞,多向分化,研究进展
长期以来, 脂肪组织被认为是惰性组织, 主要致力于能量储存与释放。近年的研究表明, 脂肪组织不仅参与内分泌和免疫调控, 还含有具备多向分化潜能的多能干细胞。2004年国际脂肪应用技术协会 (International Fat Applied Technology Society) 将此干细胞命名为脂肪来源干细胞 (Adipose-derived Stem Cell, ASC) [1], 因为来源于中胚层间充质, 也常将其称为脂肪间充质干细胞 (Adipose-derived Mesenchymal Stem Cell, AMSC) 。
目前常用的干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞。因为面临伦理、法律和政治争议, 人体胚胎干细胞一般不可用于当前的医疗实践。中胚层来源的骨髓干细胞是最早研究的成体多能干细胞, 已广泛用于组织工程, 但它来源有限, 抽取骨髓时有疼痛, 而且从骨髓组织中提取的干细胞比例非常低 (大约每105个黏附间质细胞可获得1个干细胞) ;脐带血干细胞也属于成体多能干细胞, 其分化潜能低于骨髓干细胞, 且需要长期保存;而脂肪干细胞可以从脂肪组织抽吸物中大量分离获取, 而且容易培养、生长速度快、衰老也比骨髓干细胞慢, 另外, 其致病性低、分化稳定、移植安全的特点使其成为基础和临床研究中理想的成体干细胞。
1 脂肪干细胞的分离
吸脂术产生的脂肪吸取物是自体ASC的理想来源, 从脂肪吸取物原代培养得到的细胞称为脂肪基质微管碎片细胞 (SVF) , 这种细胞不仅含有脂肪干细胞, 还包括内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞、白细胞、造血干细胞、内皮祖细胞等[2]。在细胞培养过程中, ASC通过与塑料培养皿粘附而与其它细胞分离[3], 但是成纤维细胞也会和塑料培养皿壁粘附, 所以, 一些批评意见指出, 如果存在造血干细胞污染, 那么细胞分化的来源就不是单一的。
2 脂肪干细胞的培养特性
骨髓干细胞对胎牛血清的来源和质量有严格要求, 而脂肪干细胞在添加任何批号胎牛血清的DMEM培养基中均能很好地扩增, 细胞形态成纤维状, 传代培养平均倍增时间为60小时, 并且保持稳定的倍增率直至13～15代, 其中衰老和死亡细胞的比例也很低, 这表明ASC体外扩增能力很强, 易于获得大量有分化能力的细胞。但是Rubio等人发现[4], 人类ASC连续增殖传代超过4个月后, 将出现恶变现象, 提示新提取的ASC较培养传代后的ASC更安全、更适合用于临床。
3 脂肪干细胞表面的分子标记
特异性细胞表面的分子标记有助于ASC的纯化、鉴定以及进一步研究, 但大量实验结果表明ASC细胞表面分子标记存在异质性[5], 不同研究小组报道的分子标记有差异, 这与ASC细胞纯化和培养方法不同以及分子标记检测时细胞处于不同的阶段有关。
大多数研究人员通过原代培养得到的SVF细胞是异源的细胞混合物, 其中的ASC会通过和塑料培养皿壁粘附而与其他细胞分离, 所以伴随细胞生长、传代, 造血干细胞的分子标记CD11、CD14、CD45会逐步丧失[6];而利用塑料培养皿进行ASC培养时, 一些分子标记也极易发生变化, 比如粘附分子;研究还表明ASC和骨髓干细胞有相似的分子标记[7], 一些骨髓干细胞分子标记也可以作为ASC的分子标记, 比如STRO1、CD73[8], 但是它们仍然不是特异性分子标记。不过已有实验结果表明ASC细胞是SVF细胞中的CD34+、CD31-细胞群[9]。但目前ASC细胞仍然只能通过功能实验或者后续的分化结果加以确切鉴定。
4 脂肪干细胞的多向诱导分化
多能ASC细胞可以分化为多种中胚层来源的细胞类型, 包括骨骼肌、心肌、软骨、脂肪、成骨等分化方向, 其中心肌分化的重复性和产量是最低的[10]。在软骨分化方面, ASC不如骨髓干细胞有效[11]。来源于中胚层的脂肪干细胞分化为外胚层起源的神经细胞[12]和内胚层起源的胰腺表型细胞[13]是非常令人惊奇的, 而且脂肪干细胞可能还有助于血管[14]和造血细胞的生成[7]。
ASC在不同成分的培养基中培养, 其生长和分化存在极大的差异, 比如牛血清促进细胞生长, 马血清则有助于细胞分化;转化生长因子β、纤维生长因子2增强ASC细胞增殖却对分化没有作用, 表皮生长因子被证实是抗分化因子;体外ASC向不同细胞类型分化依赖于培养基中不同的添加剂, 比如在含有地塞米松、β-甘油磷酸钠、L-谷氨酰胺和维生素C的培养基中, ASC经过3～4周培养可以产生成骨反应;添加胰岛素、地塞米松、吲哚美辛、异丁基-甲基黄嘌呤的DMEM培养液, 可诱导ASC分化为脂肪细胞, 其它分化方向的诱导条件见表1。另外, 在组织工程领域, 理想的支架有利于细胞贴附、生长和分化, 最终形成组织。比如结合于胶原微球支架的ASC可以表现出成骨与成脂方向的分化与增殖[15], 结合有硫酸软骨素的聚乙二醇水凝胶也被应用于促进ASC分化为软骨细胞[16]。
5 脂肪干细胞的应用研究
体外扩增的ASC与生物材料结合, 是实现修复较大器官组织缺损, 重建缺损部位生理功能的新途径。但是目前脂肪干细胞的应用研究多是个案报道, 临床研究也处于Ⅰ期临床的早期。以下对脂肪干细胞在不同方向的应用研究作简要阐述。
ASC在分化为脂肪细胞的同时, 还有助于血管生成, 可以明显提高脂肪移植后的长期存活率, ASC的成脂分化在面部轮廓整形、除皱等软组织重建中发挥着重要的作用。
成熟脂肪细胞及其前体细胞均表达单纯疱疹病毒的受体, 体内和体外实验证明复制缺陷的单纯疱疹病毒可以有效转染脂肪细胞, 携带的外源基因在脂肪细胞中亦能稳定表达。故以脂肪细胞为靶细胞, 复制缺陷单纯疱疹病毒介导的基因转移有可能成为基因治疗的一种方式[17]。
ASC的成骨分化, 在临床上可用于骨折和关节植骨融合的治疗。2003年首次实验证明将体外成骨分化后的大鼠ASC, 重新植入皮下, 8周后有骨骼形成[18];2004年德国Macro Pore Biosurgery公司与德国Giessen大学联合对外公布了一项使用脂肪干细胞治疗一名七岁女孩颅骨缺损的临床报告。在这项手术中, 因骨伤面积接近120 cm2, 髂嵴来源的骨数量有限, 自体脂肪组织干细胞被加入到患者髂嵴移植骨, 然后均匀地敷在颅骨缺损部位, 并固定两片可降解的Macro Pore TM保护膜, 3个月后CT分析显示新骨形成, 并且颅骨创伤区周围颅顶几近完全连续[19]。
Rodriguez等将正常人ASC移植到Duchenne型肌营养不良模型小鼠 (抗肌营养不良蛋白缺陷) 的胫骨前肌, 6个月后, 90%的胫骨前肌检测到抗肌营养不良蛋白表达, 50天时, 在相邻腓肠肌发现由胫骨前肌迁移而来的抗肌营养不良蛋白阳性肌纤维[20]。
注射ASC到裸鼠缺血的后肢, 后肢血流量和毛细血管密度明显增加[14]。这和ASC分泌血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子β[14]等血管生成因子有关, 不太可能是ASC直接分化为血管内皮细胞。有报道指出, 使用自体脂肪移植治疗20位放疗后期因慢性组织缺血导致并发症的患者, 都表现出新血管形成等进行性组织再生现象[21]。尽管机制仍不明了, 但这种方法也有可能用于治疗微血管病变。
ASC能表达、分泌巨噬细胞集落刺激因子和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等造血相关细胞因子[7]。2003年报道腹腔注射ASC可以挽救40%被辐射小鼠的生命, 虽然效果较骨髓干细胞慢, 但存活率和骨髓干细胞一样;文章分析认为, ASC促进了骨髓造血干细胞的增殖[22], 不过脂肪干细胞静脉注射会出现辐射小鼠死亡[22]的现象。
脂肪干细胞用于治疗复发性克罗恩瘘 (recurrent Crohn’s f istulae) 的Ⅰ期临床已在马德里La PazUniversityHospital进行[23], 4位患者的9处瘘管进行自体ASC接种治疗, 在每周随访的8处瘘管中, 6处瘘管 (75%) 在8周内完全治愈, 无副作用发现, 更多评价还有待于Ⅱ期临床试验的进行。
6 ASC研究需要解决的问题
尽管有报道称ASC用于人体是安全的[24], 但是, 也有研究指出植入ASC会导致机体出现免疫抑制[19], 显然这个问题需要进行大规模的临床实验加以证实。
除此之外, 以下一些问题的解决将有助于ASC在临床实践中的应用。首先, 特异性分子标记的发现可以从根本上改变ASC细胞的纯化和鉴定。其次, 要建立可靠、快速、有效的细胞分化方案。ASC脂肪分化大约需要两周时间, 成骨和软骨分化时间更长且分化的细胞数量少。改进现有分化方法可从以下方面进行:不同细胞因子和生长因子的应用、利用可靠有效的生物材料进行3-D培养、更清楚了解细胞分化相关的受体配体以及细胞外基质成分等。另外无血清细胞培养和分化方法的建立、可靠稳定的动物模型实验也是ASC临床应用需要解决的问题。
脂肪干细胞辅助 篇4
1 材料与方法
1.1 实验动物及试剂
SD大鼠由徐州医科大学实验动物中心自繁自养。3-MA、Rapamycin购自美国Sigma公司。LC3及SOX-9抗体购自美国Cell Signaling Technology (CST) 公司。Trizol Regent、荧光定量试剂盒购自Invitrogen公司。FITC标记二抗购自中国碧云天公司。ATG5干扰分子 (si ATG5) 由苏州吉马公司设计合成。
1.2 ADSCs的分离培养
取雄性SD大鼠, 颈椎脱臼法处死, 在无菌条件下取大鼠大网膜, 肾周脂肪囊, 睾丸周围等处取脂肪组织。脂肪组织经D-Hank’s液漂洗后剪碎, 并置于0.1%的I型胶原酶中消化, 随后经过滤后置于含10%FBS高糖DMEM中, 37℃、5%CO2孵育箱中培养。72h后换液, 去除未贴壁细胞, 待细胞长满后0.25%胰酶消化传代。
1.3 Western blot
ADSCs接种6孔板, 置于含软骨细胞诱导剂 (50nmol/L抗坏血酸、6.25mg/L胰岛素、100nmol/L地塞米松、50μg/L TGF-β1) 的DMEM培养基中培养, 每3天更换培养液。细胞培养至第14天后, 弃上清, 细胞经裂解液裂解, 收取总蛋白。等量的蛋白通过12%的SDS-PAGE胶进行跑胶分离, 并转移至PVDF膜上。洗涤后, 用5%脱脂奶粉封闭。并分别用SOX-9、LC-3及内参β-actin一抗孵育, 室温孵育1h后, 使用HRP标记的二抗进行孵育并显色。
1.4 qRT-PCR
ADSCs经诱导培养14d后, 收取样品, 按TRIzol Reagent说明书提取细胞总RNA。并通过逆转录酶将其反转录为c DNA。依据RT-PCR试剂盒说明书, 进行实时荧光定量PCR扩增。SOX-9 mRNA表达水平与内参 (GAPDH) 作均一化处理。引物采用Primer 5进行设计, 序列见表1。
2 结果
2.1 诱导自噬促进ADSCs的分化
为证实细胞自噬对ADSCs分化的调控作用, 我们用含软骨细胞诱导剂的培养基培养ADSCs, 同时设置雷帕霉素处理的实验组。细胞培养14d后, 收取样品。细胞自噬被诱导后LC3蛋白会由LC3-I型转化为LC3-II型, 这也是公认的细胞自噬被诱导的标志。为此, 我们首先通过Western blot检测LC3-I和LC3-II蛋白的表达变化情况, 结果发现雷帕霉素处理显著促进LC3-II的表达 (图1A) , 证实雷帕霉素可以提高ADSCs的自噬水平。进一步, 通过qRT-PCR和Western blot分别检测软骨标识蛋白SOX-9在mRNA和蛋白水平的表达变化情况。结果发现, 雷帕霉素处理显著促进SOX-9的表达 (图1B, 1C) 。
2.2 抑制细胞自噬抑制ADSCs向软骨细胞分化
随后, 我们检测抑制细胞自噬对ADSCs分化的影响。同样, ADSCs在含软骨细胞诱导剂的培养基中培养, 实验组用细胞自噬抑制剂3-MA处理, 同时设未处理组对照。细胞培养14d后通过qRT-PCR及Western blot检测SOX-9的表达变化情况。结果表明, 3-MA处理显著抑制SOX-9的表达 (图2A, 2B) 。
2.3 干扰自噬相关基因的表达抑制ADSCs向软骨细胞分化
为进一步对上述结果进行验证, 我们通过干扰分子抑制自噬相关基因的表达, 检测其对ADSCs分化的影响。首先我们通过qRT-PCR验证干扰分子的干扰效果。结果证实ATG5干扰分子可显著抑制ATG5的表达 (图3A) 。同时, SOX-9的表达也受到明显抑制 (图3B, 3C) 。表明抑制细胞自噬, 可显著抑制ADSCs向软骨细胞的分化。
3 讨论
研究发现, 软骨受损后自身修复能力有限, 当受损部位直径大于4 mm时, 则软骨组织不能自行修复[1]。通过“微骨折”、软骨移植等方法进行软骨缺损治疗取得一定效果, 但同时面临着排斥反应、修复质量差等缺陷。通过组织工程学对软骨缺损进行治疗, 是医学中的又一进步, 通过组织工程制造的器官为创伤的修复提供了更丰富的来源, 同时也是医学进入制造组织和器官的新时代。然而, 在组织器官体外制造的过程中, 种子细胞的来源又制约着其发展。如, 在对软骨组织进行研究的过程中自体软骨细胞最早被用作种子细胞, 但该细胞存在体外分化能力弱且培养传代中部分细胞会失去表形等缺点[2]。
脂肪干细胞是成体干细胞之一, 2001年由Zuk等人从脂肪组织中分离得到, 自身可不断更新增殖, 同时具有干细胞特有的多向分化潜能。大量的研究证实了, ADSCs在特定条件下可分化为神经细胞、成骨细胞、内皮细胞及软骨细胞等[3~4]。细胞自噬是一种真核细胞高度保守的降解途径, 细胞自噬可降解体内过剩聚集蛋白或衰老的细胞器, 在维持细胞内环境的稳定发挥重要作用。随着研究的不断深入, 细胞自噬的作用不断被揭示, 如自噬通过调节干扰素的产生而影响天然免疫, 通过调控MHC分子的表达调节获得性免疫等。此外, 细胞自噬水平的改变还影响多种细胞的分化。如, 通过基因敲除自噬相关基因, 显著抑制了成骨细胞的分化生成;细胞自噬可以通过降解PDLIM1蛋白而调控精子细胞的分化生成[5];诱导自噬可以促进大鼠神经干细胞的增殖与分化等[6]。
ADSCs在软骨诱导培养基中培养可分化为软骨细胞。然而, 迄今为止细胞自噬对脂肪干细胞分化的调控作用仍未见报道。为此, 我们并对ADSCs进行软骨细胞分化的诱导培养, 同时, 通过化学试剂或干扰分子等手段改变细胞自噬水平。通过qRT-PCR和Western blot手段检测软骨细胞标示蛋白SOX-9的表达变化情况, 探明了细胞自噬在AD-SCs向软骨细胞分化过程中的正调控作用。为AD-SCs做为种子细胞构建工程组织软骨提供了更丰富的理论基础。同时, 也首次证实了在ADSCs中细胞自噬可以被诱导产生。
摘要：目的:探讨细胞自噬对ADSCs分化的影响。方法:无菌条件下取大鼠大网膜, 肾周脂肪囊, 睾丸周围等处取脂肪组织并分离ADSCs, 用软骨细胞诱导培养基进行培养, 并通过抑制剂或干扰分子改变细胞自噬水平, 检测ADSCs向软骨细胞分化的变化情况。结果:抑制自噬, 细胞表达软骨细胞标识蛋白, SOX-9的量显著下调:诱导自噬, SOX-9的表达显著升高, 结论:细胞自噬促进ADSCs向软骨细胞分化。
关键词：脂肪干细胞,细胞自噬,细胞分化
参考文献
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脂肪干细胞辅助 篇5
关键词：脂肪干细胞,肺部气道疾病
慢性阻塞性肺病伴随气道损伤是临床常见病, 该病的发生与进展与环境污染及人们生活方式的变化有直接关联, 发病率逐年升高[1]。患者不同程度气流受限, 肺部气道结构及血管变化, 需要选择合适的疗法帮助肺部气道修复、重建[2]。本研究尝试借助脂肪干细胞移植治疗此病, 效果满意, 现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取自愿接受治疗研究的慢性阻塞性肺病气道损伤患者共20例, 男12例, 女8例;年龄27~64 (39.3±3.4) 岁。治疗组大鼠20只, 体重195~205g (198.3±1.4) g, 均雄性;空白对照组大鼠20只, 体重190~210g (201.7±1.2) g, 均雄性, 2组基本数据对比无差异 (P>0.05) 。
1.2 方法
抽取全组志愿者脂肪组织各25g并置入无菌离心管内, 随后转入无菌培养皿待处理。专业研究人员将组织中的血管、筋膜剔除, 后以无菌PBS反复冲洗, 将处理后的组织以眼科剪分割成1.5mm3大小, 最终剪成糊状, 使用0.1%的I型胶原酶以120r/min震荡、37℃环境下消化处理[2];随后以10%胎牛血清+LG￣DMEM培养液终止消化过程, 离心处理10min, 获取高浓度间质组织细胞团, 使用红细胞裂解液处理并将其中红细胞去除, 使用100μm筛网过滤, 取过滤液, 以LG￣DMEM+100g/l链霉素+10%体积分数的胎牛血清+100U/ml青霉素对细胞重悬处理, 在100mm直径的细胞培养皿中接种, 浓度设定为4×104/cm2;在CO2培养箱 (体积分数为5%) 中培养, 培养环境为37℃, 每2d换液1次。检测到细胞生长至80%~90%时, 以1:2的比例传代培养。
取85g健康大鼠乙醚麻醉, 腹腔注入肝素, D￣Hanks灌注右心室直至双肺发白, 剑侠肺外侧0.3cm组织, 剪切成01mm3的组织块并以PBS处理, 培养瓶中培养, 加入FBS+L￣DMEM培养基, 每72h换液1次, 获取肺微血管内皮细胞。治疗组首先腹腔注射LPS, 30min后将培养扩增的细胞静脉注射;对照组先后腹腔、静脉注射生理盐水, 7d之后, 均放血处死, 检测左肺含水量、右肺下叶蛋白印迹。
1.3 统计学分析
采用SPSS18.0软件包对所得的数据进行统计学分析, 计量资料采用±s表示, 组间比较采用t检验, 计数资料采用率表示, χ2检验, 检验标准α=0.05, P<0.05具有统计学意义。
2 结果
2.1 体外培养增殖状态MTT检测结果
细胞接种首日为静止期, 之后为对数生长期, 4~5d阶段达到顶峰, 之后进入平台期, P5、P10、P15代细胞生长速度无统计学差异, P>0.05。见表1。
2.2 肺湿干
对照组治疗前后W/D水平无明显变化, 治疗组治疗前W/D明显高于对照组同期, 治疗后明显较治疗前得到改善 (P<0.05) , 且与同期对照组无明显差异, P>0.05。见表2。
注:*表示相比同组治疗前有明显改善, P<0.05;#表示相比对照组同期有明显差异, P<0.05
2.3 蛋白印迹检测结果
治疗组治疗前e NOS蛋白含量54±0.02, 明显高于对照组同期 (P<0.05) , 治疗后明显较治疗前得到改善 (P<0.05) , 且与同期对照组无明显差异, P>0.05。见表3。
注:*表示相比同组治疗前有明显改善, P<0.05;#表示相比对照组同期有明显差异, P<0.05
3 讨论
肺部气道损伤患者会出现局部炎性反应、微血管内皮细胞凋亡现象, 及时促进组织血管修复和重生是控制病变、积极治疗的关键[3]。本次研究对脂肪干细胞临床价值的探讨主要集中在慢性阻塞性肺病气道损伤临床的应用情况, 此类患者在病情发生和进展过程中发生肺血管、肺实质、外周气道、中央气道病变, 且多为不可逆病变。临床急需寻找肺部组织重建、修复途径。近年来, 临床工作者和专家学者对脂肪干细胞相关研究和实践不断深入, 干细胞陆续在心肌梗死、糖尿病、帕金森疾病等方面得到逐步应用, 还有望在肺部病变、血管损伤、关节损伤、心脏病等领域得到运用。脂肪干细胞存在于人体丰富的脂肪组织中, 来源多、获取便利, 且具有多向分化能力, 可塑性极强, 方便向组织移行, 可在适当条件下向血管细胞、脂肪细胞、软骨细胞等分化发展, 还可向胰岛细胞、干细胞、神经元细胞、上皮细胞等分化发展。另外, 脂肪干细胞本身没有明显的免疫原性, 不容易与机体组织产生相互排斥和负面影响。由于脂肪干细胞潜质大、培养方向广泛、易采集、可连续传代、性能稳定, 有良好的多向分化、自我更新能力, 在多种组织器官内修复作用良好, 在各类疾病修复、重建中有重要作用。
本研究尝试进行脂肪干细胞体外培养观察和大鼠体内移植研究, 发现脂肪干细胞可向血管内皮细胞分化, 促进血管内皮细胞修复, 并促进e NOS表达, 从而更好地修复肺部气道及受损的其他组织[4]。本研究将所得脂肪干细胞静脉注射进入大鼠体内达到移植的目的, 关注大鼠肺湿干重比、e NOS蛋白含量等指标变化, 发现肺湿干重比、e NOS蛋白含量等都得到改善, 这是因为脂肪干细胞可分泌角化细胞生长因子, 有利于肺泡上皮钠离子通道各类酶活性的提升, 因而可以大大减轻肺部气道损伤病情[5]。
考虑到肺部气道疾病者多有肺血管通透性增加、气道受损现象, 病情进展迅速、死亡率高, 病情严重时可见全身炎性综合反应、器官功能障碍, 传统疗法无法快速有效地控制病情、保障治疗效果。脂肪干细胞移植治疗有助于快速修复受损组织, 帮助重建患处组织结构, 从而可治疗肺部气道损伤, 抑制炎性反应、控制病情进展、降低病死率、改善临床预后效果。脂肪干细胞治疗肺部气道疾病, 可通过多种细胞因子的分泌而达到血管内皮舒缩调节目的, 同时影响炎性因子的产生和作用、平衡血管内皮渗透性。此种治疗还可调节血管内一氧化氮合酶的水平, 刺激血管生成和张力调节, 帮助维持有利的血管内皮细胞生理功能, 调节肺血管e NOS蛋白合成, 提升该蛋白作用, 恢复肺血管内皮屏障, 调节血管渗透压, 促进血管重生。
将脂肪干细胞移植进入大鼠体内, 可对i NOS蛋白在肺部表达作用产生阻碍, 从而影响导型NO的产生。脂肪干细胞的移植还能快速到达肺部气道, 作用于血管组织, 其产生的抗凋亡因子、血管生长因子可强化患处e NOS蛋白表达功能[6]。
目前临床上多种干细胞均可用于肺部气道疾病治疗, 但脂肪干细胞获取相对容易。其他很多干细胞因伦理学、社会学的限制难以获取。脐带血源性干细胞数量较少, 且难以得到2份以上相同基因的该干细胞;骨髓源性干细胞提取难度大, 且过程痛苦;外周血源性干细胞提取过程注射药物会引发全身不良反应, 痛苦大且来源有限, 由此可见, 脂肪干细胞是合理的肺部气道疾病治疗来源。
总之, 脂肪干细胞移植疗法可直接调节肺湿/干重比及e NOS蛋白水平, 对肺部气道疾病临床治疗有积极意义。
参考文献
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脂肪干细胞辅助 篇6
1 资料与方法
1.1 材料
3个月龄新西兰白兔 (福州总院实验动物中心) , 低糖、高糖Dulbeco改良的MEM培养液 (dulbeco′s modifild eagle medium, DMEM) (Gibco公司) , Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、地塞米松、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX) 、吲哚美辛、二甲基亚砜 (DMSO) 、噻唑蓝 (Sigma公司) 、标准胎牛血清 (杭州四季青) , CD44、CD45抗体、正常山羊血清 (武汉博士德) , FITC标记羊抗小鼠IgG (北京中杉金桥) , 碱性磷酸酶染色试剂盒、碱性磷酸酶检测试剂盒、钙离子检测试剂盒 (南京建成生物制品有限公司) , 培养瓶、6孔、12孔及96孔板 (Costar公司) 。
1.2 方法
1.2.1 ADSCs的原代培养、传代培养
取3个月龄新西兰白兔, 雌雄不限, 速眠新0.2～0.3 mL/kg肌注麻醉后, 备皮, 消毒。取颈后部正中切口, 无菌切取皮下脂肪组织, 清除肉眼可见的小血管, 尽可能去除包膜及结缔组织后用PBS清洗3次以去除红细胞。眼科剪将组织剪成1～2 mm3组织块, 置于2倍体积0.1%Ⅰ型胶原酶, 37℃消化60 min后加入等体积含10%胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) 的DMEM终止消化, 200目筛网过滤, 1000r/min离心10 min, 去上清, 加入含10%FBS的DMEM重悬浮细胞, 接种于25 cm2培养瓶中。置于37℃、5%CO2、饱和湿度恒温培养箱进行单层细胞培养。24 h后更换培养液, 以后每3天换液1次, 并于倒置显微镜下观察细胞生长情况。待细胞生长融合达80%～90%后, 经0.25%胰酶消化, 按1∶3进行传代培养。
1.2.2 rADSCs生长曲线的绘制
取10块96孔板, 每块96孔板以5000/孔的密度将第3、5、7、9代细胞各接种于5个孔。此后每天同一时间, 随机抽取一板, 测定光密度值。测量时每孔加入噻唑蓝溶液 (5 mg/mL) 20 μL, 继续在37℃、5%CO2培养箱中培养5 h后, 吸弃孔内液体, 每孔内加入150 μL DMSO, 振荡20 min, 在酶联免疫检测仪上选择492nm波长测定各孔OD值。以5孔OD值的均值为纵坐标, 以时间为横坐标绘制生长曲线。
1.2.3 CD44和CD45间接免疫荧光检测
取生长状态良好的第3代细胞爬片, 参照文献[3]行免疫荧光检测细胞表面的抗原标记CD44和CD45。以PBS代替一抗作为阴性对照, 镜下观察照相。
1.2.4 ADSCs的成骨诱导及碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色鉴定
消化收集第3代ADSCs, 以105/孔接种于预置有细胞爬片的6孔板中, 待完全贴壁后换液为成骨诱导液 (10%FBS的高糖DMEM中加入10-7mol/L地塞米松、L-抗坏血酸50 μg/mL和10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠) 进行成骨诱导。
碱性磷酸酶检测:诱导2周时终止培养, 取出实验组和对照组细胞爬片按照碱性磷酸酶染色试剂盒说明书进行操作。
Von Kossa检测:成骨诱导2、3周时进行。将实验组和对照组细胞爬片用4%多聚甲醛固定, 20 min后加入5%硝酸银避光孵育30 min, 于紫外灯下照射1 h, 苏木素复染核。
1.2.5 ADSCs的成脂诱导及油红O染色鉴定
消化收集第3代ADSCs, 以105个/孔接种于预置有细胞爬片的6孔板中, 待完全贴壁后换液为成脂诱导液 (10%FBS的高糖DMEM中加入10-6mol/L地塞米松、胰岛素10 mg/L、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5 mmol/L、吲哚美辛0.2 mmol/L) 进行成脂诱导。
油红O染色:成脂诱导14 d后的实验组和对照组细胞爬片用甲醛-钙固定液固定15 min, 60%异丙醇媒染2 min, 在油红O工作液内室温染色30 min, 70%酒精分色。
1.2.6 碱性磷酸酶浓度检测
取第3代ADSCs细胞, 以5×104个/孔接种于12孔板, 加入普通培养液进行培养, 待细胞完全铁壁后, 将其中5孔更换为成骨诱导培养液进行成骨诱导, 剩余5孔培养条件不变, 作为对照。于诱导1、2、3、4周时分别中止培养, 加入0.5 mL 0.1%聚乙二醇辛基苯基醚于4℃过夜, 然后按照南京建成碱性磷酸酶测定试剂盒说明书进行操作。碱性磷酸酶浓度以金氏单位/100 mL表示。
1.2.7 钙离子浓度检测
用第3代ADSCs细胞, 以5×104个/孔接种于12孔板, 加入普通培养液进行培养, 待细胞完全贴壁后, 将其中5孔更换为成骨诱导培养液进行成骨诱导, 剩余5孔培养条件不变, 作为对照。于诱导1、2、3、4周时分别中止培养, 加入0.6N HCL 0.5 mL于常温下过夜以将细胞外不溶性钙盐分解成可溶性钙离子, 然后按照南京建成钙测定试剂盒说明书进行操作。钙离子浓度以mmol/L表示。
1.2.8 统计学处理
采用重复测量的方差分析对诱导组和非诱导组不同时间点的碱性磷酸酶和钙离子浓度进行统计学分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 ADSCs的体外培养
原代rADSCs培养4 h后, 有少量短梭形或小多角形细胞散在贴壁, 大部分未贴壁细胞为球形或圆形血细胞。第一次换液后, 未贴壁细胞 (大部分为红细胞) 已去除, 可见大部分贴壁细胞呈宽大扁平的成纤维细胞样细胞, 其间也可见少量三角形、多边形细胞 (见图1) 。随培养时间延长, 这些贴壁细胞形态为典型的长梭形细胞, 呈大小不一的集落状、漩涡状生长。培养5～6 d可达80%～90%致密层 (见图2) , 7～9 d可形成100%融合的致密单层。传代后细胞形态主要为长梭形, 少数为三角形或多边形, 呈漩涡状生长 (见图3) , 细胞生长速度较原代细胞明显增快, 3～4 d可长满。连续传12代, 细胞增殖未见明显减弱。
2.2 ADSCs生长曲线绘制
从图4可以看出, 所培养的细胞经过1～3 d的潜伏期, 进入对数生长期, 在第7天到达高峰而进入平台期。与P3相比, P5、P7、P9细胞增殖未见明显减缓。细胞由P0传代至P9, 每代倍增基本保持稳定, 未发现有下降趋势, 说明ADSCs经长期传代, 细胞仍能保持良好的增殖能力。
2.3 CD44和CD45间接免疫荧光检测
免疫荧光检测结果见培养细胞为CD44阳性, 表明这种细胞为间充质干细胞;而CD45为阴性表达, 证明所检测细胞并非来自于血液循环中的干细胞 (见图5) 。
2.4 ADSCs的成骨诱导及碱性磷酸酶染色、VonKossa染色鉴定
成骨诱导后3 d细胞无明显变化, 诱导4 d后可观察到少许细胞逐渐由梭形变为立方形、多角形, 体积增大;诱导8 d后, 多数细胞转变为多角形, 有数个突起, 细胞持续增殖、重叠, 逐渐聚集形成多个散在的细胞结节。14 d后可见细胞结节中央区形成矿化结节;诱导21 d后, 可见矿化结节较诱导14 d时明显增大, 数量明显增多。碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 染色结果:成骨诱导2周时可见有红棕色或咖啡色、深咖啡色颗粒充满胞浆 (见图6) 。
Von Kossa染色结果:成骨诱导2周和3周时用VonKossa方法检测钙盐的沉积, 染色的阳性结果为棕黑色结节。镜下观察到成骨诱导2周时, 形成的矿化结节较小, 数量少 (见图7) ;而诱导3周时, 结节较大, 数量增多 (见图8) 。对照组没有阳性染色表现。
2.5 ADSCs的成脂诱导及油红O染色鉴定
成脂诱导分化3 d后, 细胞中开始有小脂滴出现, 主要集中于细胞核周围;诱导5 d时细胞内可见较明显脂滴;诱导10 d后细胞内布满大小不等的脂滴, 小脂滴逐渐聚集成大的脂泡, 细胞核被挤于细胞一侧, 细胞逐渐增大;诱导12～14 d后细胞由原来的梭形变为圆形或多角形。油红O染色见脂滴被染成橘红色 (见图9) ;对照组细胞未见阳性染色。
2.6 碱性磷酸酶浓度的测定
ALP浓度在诱导组与非诱导组之间存在组间差别, 在各个时间点诱导组ALP浓度均高于非诱导组 (P<0.05, n=5) 。诱导组ALP浓度在不同诱导时相其浓度变化趋势不同, 诱导培养1周时, 诱导组ALP浓度明显增加, 2周时处于最高值, 并且于3、4周时逐渐降低 (P<0.05, n=5) , 而对照组ALP浓度变化不大 (见表1) 。
2.7 钙离子浓度的测定
钙离子浓度在诱导组与非诱导组之间存在组间差别, 在各个时间点诱导组钙离子浓度高于非诱导组 (P<0.05, n=5) 。诱导组钙离子浓度在不同诱导时相其浓度变化的趋势不同。诱导培养1周时钙离子浓度稍增高, 自第2周开始诱导组钙离子浓度逐渐增加, 并且始终显著高于非诱导组, 呈递增趋势并于4周时处于最高值 (P<0.05, n=5) , 而对照组钙离子浓度变化不大 (见表2) 。
3 讨 论
自20世纪90年代以来, 以干细胞为基础的组织工程的发展已成为治疗各种组织缺损和退行性疾病的有效手段。作为组织工程最重要的的组成部分之一——种子细胞的获取、增殖和分化是组织工程研究的基础和前提。对骨组织工程而言, 理想的骨种子细胞应具有以下特点[4]:a) 取材容易, 对机体损伤小;b) 增殖能力强, 体外培养易定向分化为成骨细胞, 短时间体外培养即可获得足量成骨细胞;c) 成骨能力强, 适应受区环境能力强, 植入人体后能很快形成新骨以替代支架材料;d) 组织相容性好, 能适应体内环境, 保持良好的生物学特性且不引起免疫排斥反应等条件。ADSCs是近年来发现的一种新的成体干细胞。ADSCs体外培养时贴壁能力强, 贴壁的细胞为梭形似成纤维细胞样形态, 呈集落状、漩涡状生长, 胞浆和核仁丰富。细胞周期分析显示, G0/G1期的细胞占69%, S期的细胞占24%, G2/M期的细胞占8%, 提示ADSCs具有较强的再生能力[5]。ADSCs传至第10代时凋亡细胞率低于5%, 15代时仅仅增加到15%, 表明ADSCs体外扩增和自我更新能力很强, 传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。其次ADSCs的获得量也很大, 平均300 mL脂肪组织可获得2×108～6×108个ADSCs, 传至10～20代时, 细胞的增殖速度无明显减慢[6], 而且脂肪组织中所含干细胞的数量不会随着患者年龄的增加而减少。另外, 研究显示ADSCs能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、心肌细胞、神经细胞、内皮细胞以及干细胞方向分化[7,8]。
注:1) 表示各个时间点诱导组ALP浓度与非诱导组之间有显著性差异 (P<0.05) ;2) 表示诱导组ALP浓度在不同诱导时相的变化趋势有显著性差异 (P<0.05) 。
注:1) 表示各个时间点诱导组钙离子浓度与非诱导组之间有显著性差异 (P<0.05) ;2) 表示诱导组钙离子浓度在不同诱导时相的变化趋势有显著性差异 (P<0.05) 。
迄今为止, 还没有发现ADSCs特异的表面标记。在本试验中, CD44、CD45免疫荧光检测结果证明我们所分离培养的细胞为间充质细胞来源并非血液循环中的干细胞。此外, 对所分离的细胞进行成骨、成脂诱导, 表明其具有多向分化潜能。两种实验结果相结合, 可以充分证明我们所分离培养的细胞为间充质来源的干细胞。
用于向成骨细胞诱导的条件培养基成分为10%FBS的DMEM中加入10-7mol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠, 这些化学物质被认为是诱导间充质干细胞向成骨细胞定向分化的诱导基, 称为成骨定向培养基 (osteogenic medium, OM) 。在成骨定向培养基中, 各个诱导成分发挥着不同的作用。L-抗坏血酸在地塞米松的调控下参与早期Ⅰ型胶原的合成合成, 还具有调控碱性磷酸酶活性和蛋白合成的作用;β-甘油磷酸钠是提供发生钙沉积所需要的无机磷, 从而参与细胞外基质矿化;地塞米松通过增强其受体与基因组中靶序列的亲和性从而调控分化细胞中的基因表达, 提高碱性磷酸酶的活性, 促进向成骨细胞转化。研究表明, 大于10-7mol/L高浓度地塞米松对ADSCs的生长、增殖有明显抑制作用;在其他诱导条件一致的情况下, 10-7mol/L地塞米松最有利于ADSCs向成骨细胞分化[9]。最终经上述三者的联合干预, 成骨过程基本完成。
ADSCs在OM中诱导后能分化为成骨细胞, 细胞由梭形的类成纤维细胞形态转变成为立方形、多角形, 体积增大, 并表达与成骨表型相关的基因和蛋白, 包括碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、骨连接素、降钙素、骨唾液酸蛋白等, 并可沉积矿化的细胞外基质[6]。在本实验中, ADSCs在成骨诱导液作用下, 培养2周时碱性磷酸酶高效表达, 表明成骨过程进入成骨过程的基质成熟期;诱导3周时Von Kossa染色检测到钙盐沉积, 4周时钙盐沉积比3周明显增多, 表明进入到了成骨过程的细胞外基质矿化期。通过对诱导过程中碱性磷酸酶浓度和钙离子浓度变化进行分析发现, 细胞碱性磷酸酶在1周时有少量表达, 2周时达高峰, 此后逐步下降;而钙离子浓度则呈现出递增趋势, 于4周时达到峰值。此研究结果与国内郝伟的实验研究相似[10]。由此证明实现了脂肪干细胞的成骨诱导分化。
综上所述, 脂肪干细胞易分离培养、增殖快和良好的成骨诱导活性完全符合对种子细胞的要求, 因此, ADSCs在组织工程研究中将有较好的前途, 是一种理想的骨组织工程种子细胞。
(本文图1～9见后插页)
参考文献
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脂肪干细胞辅助 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 核酸适体adipo 8及随机序列
adipo 8共87个碱基, 5'-3'序列为:ATGAGAAGCGTCGGTGTGGT TAAACACGGAACGAAGGTGCAGGAAGATTTGTCG ATGCGGTGCCTGAGCGGGCTGGCAAGGCGCATA;随机序列同样为87个碱基, 均由湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室合成。
1.1.2 动物、仪器及试剂
4周龄雄性C57BL/6小鼠60只, 购置于中南大学实验动物学部;微型渗透压泵购置于北京鼎国昌盛生物技术有限公司;Leica冷冻切片机、正置荧光显微镜、光学显微镜、Image Pro-Plus软件及其他常规仪器及试剂, 由中南大学湘雅医院医学科学研究中心提供。
1.2 方法
1.2.1 核酸适体adipo 8及随机序列的合成及修饰
ABI3400合成仪合成核酸适体adipo 8及随机序列, 应用高效液相色谱法 (HPLC) 对合成产物进行分离纯化。10 OD未修饰adipo 8和10 OD修饰adipo 8分别用cy 3荧光标记, 荧光显微镜下观察。40 OD修饰adipo 8用于连续腹腔输注。修饰的adipo 8进行部分硫代碱基修饰。具体为:每3个碱基构成1个密码子, 最后1个碱基进行硫代修饰。87个碱基, 总共29个硫代修饰。5'-端加20 k D聚乙二醇。87个碱基的随机序列修饰同adipo 8。
1.2.2 构建DIO小鼠模型
4周龄雄性C57BL/6小鼠60只。普通饲料 (24.1%蛋白质, 13.2%脂肪, 62.7%碳水化合物) 适应性喂养2周后, 高脂饲料 (18.1%蛋白质, 61.6%脂肪, 20.3%碳水化合物) 喂养8周, 可复制DIO小鼠模型。复制肥胖模型后, 继续予以高脂饮食。
1.2.3 核酸适体adipo 8与脂肪组织结合
将硫代碱基修饰、结合聚乙二醇的adipo 8注射入4只小鼠腹腔, 剂量为125 nmol/kg。注射后1 h采集肝脏、肾脏、肌肉及附睾脂肪组织于冷冻切片机切片。设置冷冻切片机箱体温度为-23℃。组织固着器先放少量OCT包埋剂, 放上组织, 周围加适量的包埋剂。冻结后切片, 每片厚10μm, 每次切2块。载玻片贴附后吹干。同一组织的2块冷冻切片, 1块于正置荧光显微镜下观察各组织的荧光信号强弱, 另1块用于HE染色, 光学显微镜下观察组织。
1.2.4 腹腔注射未修饰和修饰核酸适体adipo
8取24只DIO小鼠, 随机均分为两组, 分别腹腔注射未修饰和修饰adipo 8, 剂量125 nmol/kg。注射后30min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h处死小鼠, 采集附睾脂肪组织冷冻切片。正置荧光显微镜下荧光显像, 观察比较未修饰adipo 8和修饰adipo 8与脂肪组织结合的荧光信号。见图1。
1.2.5 核酸适体adipo 8对脂肪组织成脂的作用
分别将装有随机序列和修饰adipo 8的微型渗透压泵埋入随机序列组和adipo 8组小鼠腹腔, 连续腹腔输注, 剂量为0.136μg/d。分别于连续腹腔输注第1、2、3、4周, 取小鼠4只撤泵处死, 取附睾脂肪组织冷冻切片, HE染色, 光学显微镜下观察 (×200) , 单个视野, Image Pro-Plus软件测量脂肪细胞大小, 取平均值, 用像素点数目表示。每份标本测量4个视野, 取其均数进行统计分析。见图2。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行数据处理, 实验数据用均数±标准差 (±s) 表示, 组间计量资料用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 核酸适体adipo 8在DIO小鼠体内可与白色脂肪组织高度特异性结合
腹腔注射硫代碱基修饰、结合聚乙二醇的adipo8 1 h, 小鼠脂肪组织可见较强的荧光信号, 而其余组织仅可见微弱信号。结果证明, adipo 8在DIO小鼠体内可与白色脂肪组织高度特异性结合。见图3。
2.2硫代碱基修饰、结合聚乙二醇的核酸适体adipo 8能有效增强其与脂肪组织结合的强度及延长结合时间
由图4、5显示, 未修饰adipo 8与脂肪组织结合弱且作用时间短 (4、8及24 h均显示为基本无荧光信号) 。硫代碱基修饰、结合聚乙二醇的adipo 8与脂肪组织结合强且时间长, 荧光信号先增强后减弱, 1 h的荧光信号最强, 30 min和24 h仅可见微弱信号。结果说明, adipo 8经硫代碱基修饰、结合聚乙二醇, 增强了其与脂肪组织结合的强度及延长结合时间。
2.3 核酸适体adipo 8可抑制DIO小鼠脂肪组织的成脂作用
分别连续腹腔输注随机序列和硫代碱基修饰、结合聚乙二醇的adipo 8小鼠于第1、2、3、4周后分别处死4只, 取附睾脂肪组织HE染色, 光学显微镜下观察, Image Pro-Plus软件测量脂肪细胞大小平均值。由图6、7显示, 相同放大倍数视野下, 第1周, adipo 8组脂肪细胞大小与随机序列组比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。第2、3、4周, adipo 8组脂肪细胞小于随机序列组 (P<0.05) 。结果表明, 随着腹腔输注adipo 8, DIO小鼠体内脂肪组织成脂受到抑制, 并且此作用随着时间的延长而加强, 即adipo 8在体内抑制成脂的作用呈时间依赖性。
第1周, adipo 8组脂肪细胞大小与随机序列组比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。第2、3、4周, adipo 8组脂肪细胞小于随机序列组 (P<0.05)
3 讨论
肥胖是指体内脂肪组织过度蓄积, 超过正常生理需要, 且有害于身体健康和正常功能活动的一种疾病, 是现代社会最亟待解决的流行病之一, 与多种严重危害人类健康的疾病, 如2型糖尿病、心脑血管疾病以及癌症等的发生、发展密切相关。肥胖不仅直接降低人们的生活质量和减少预期寿命, 也给患者及社会带来了沉重的经济负担[6]。肥胖以机体白色脂肪组织过度积聚为重要特征, 白色脂肪组织可分泌瘦素、脂联素、抵抗素等多种脂肪因子, 是肥胖治疗最重要的靶组织之一[7,8]。近年来针对作用于脂肪组织的药物开发以防治肥胖备受关注。有些针对脂肪组织的小分子药物, 在体外显示出良好的调节脂肪代谢的作用, 但这些药物缺乏特异性并有毒副作用, 限制了其进一步应用于体内用于肥胖的治疗[9]。因此, 通过新的分子技术, 开发特异性作用于脂肪细胞的载体及药物, 为肥胖等代谢性疾病的防治提供新思路和新方法, 显得尤为重要。
核酸适体是在体外通过SELEX筛选得到的短链核苷酸。体外研究已经证实, 核酸适体可以与靶标高特异性、高亲和力稳定地结合, 同时能确保目标分子保持天然构象, 最大程度保留其生物功能。那么在体内, 核酸适体是否同样具有在体外显示的作用?早在1990年, 人们便尝试着将核酸适体用于体内实验。2004年Pegaptainb (Macugen) 经美国FDA批准用于治疗年龄相关性黄斑变性, 成为第1个应用于临床治疗的核酸适体[10]。近年来, 越来越多被筛选出的核酸适体应用于体内, 包括各种疾病的诊断与治疗, 例如:应用于血栓、急性冠状动脉综合征、血管性血友病因子相关疾病、急性髓系白血病等已处于不同临床试验阶段[11,12,13]。此外, 核酸适体还被应用于生物标志物的发现, 纳米载体、分子成像等[14]。本研究将通过Cell-SELEX筛选到的脂肪细胞特异性核酸适体adipo 8应用于DIO小鼠体内, 证实adipo 8在肥胖小鼠体内可与白色脂肪组织高度特异性结合。
体外筛选出的核酸适体主要通过静脉注射、皮下注射、腹腔注射、吸入、鞘内注射等方式进入体内。经血循环吸收后, 最终作用于靶细胞膜蛋白。未修饰的核酸适体进入体内, 迅速被核酸酶经内源性嘌呤代谢和嘧啶代谢途径分解, 半衰期可短至2 min[15]。核酸适体主要通过2’-Fluoro、2’-O-methyl、硫代碱基等修饰以降低核酸酶的分解。硫代修饰, 主要适用反义实验中降低寡核苷酸被核酸酶分解。可以选择全硫代修饰, 但随着硫代碱基的增加, 寡核苷酸的Tm值会降低, 为了降低这种影响, 可以对引物两端部分碱基进行部分硫代修饰[16]。核酸适体分子量低, 一般为5~15 k D, 主要通过结合聚乙二醇或胆固醇来增加其分子量, 以延缓核酸适体的肾脏清除率[17]。本研究将硫代碱基修饰、结合聚乙二醇的adipo 8应用于DIO小鼠体内, 增强了其与脂肪组织结合的强度及延长结合时间。
KAIDA等[18]筛选出针对晚期糖基化终末产物 (advanced glycationend products, AGEs) 的核酸适体, 硫代碱基修饰并进行[γ-32P]ATP同位素标记。小鼠腹腔连续输注AGEs核酸适体8周, 通过检测放射性核素单位CPM值显示, AGEs核酸适体主要分布于肾脏、主动脉和肌肉。AGEs核酸适体通过阻断AGEs-AGEs受体轴, 减少肾小球AGEs沉积, 抑制肾小球的肥大和细胞外基质蛋白的积累, 减少血肌酐、尿素氮浓度, 降低尿白蛋白和8-羟化脱氧鸟苷排泄率, 降低肾脏炎症反应和纤维化等, 从而明显延缓糖尿病肾病进展。本研究通过给DIO小鼠连续腹腔输注脂肪细胞特异性核酸适体adipo 8, 发现adipo 8在肥胖小鼠体内可以抑制脂肪组织成脂, 并且该作用随着时间的延长而加强, 即adipo 8在体内抑制成脂的作用呈时间依赖性。
综上所述, 使用SELEX体外筛选所得的脂肪细胞特异性核酸适体adipo 8在DIO小鼠体内, 同样显示出与脂肪组织的高度特异性结合, adipo 8在肥胖小鼠体内可以抑制脂肪组织成脂。本研究结果为进一步探索adipo 8的生物功能、阐明脂肪细胞代谢调控机制提供了新证据, 为开发新的防治肥胖的靶向药物提供了有效的分子工具, 具有重要的意义。
摘要：目的 通过研究体外筛选的脂肪细胞特异性核酸适体adipo 8在肥胖小鼠体内是否可以与脂肪组织特异性结合, 初步探讨adipo 8在肥胖小鼠体内对脂肪组织成脂的影响作用。方法 1高脂喂养雄性C57BL/6小鼠60只复制肥胖小鼠模型;2取小鼠4只, 腹腔注射cy 3荧光标记并硫代碱基修饰, 结合聚乙二醇的adipo 8, 注射后1 h取肝脏、肾脏、肌肉及附睾脂肪组织于冷冻切片机制成冰冻切片2块, 荧光显微镜下观察各组织荧光信号和HE染色;3取小鼠24只分为未修饰adipo 8组和修饰adipo 8组, 每组12只。Cy 3荧光标记的未修饰和修饰adipo 8分别腹腔注射入两组小鼠体内, 注射后30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h分别取附睾脂肪组织制成冷冻切片, 荧光显微镜下显像;432只小鼠分为随机序列组和adipo 8组, 每组16只。微型渗透压泵埋入小鼠腹腔, 分别连续腹腔输注随机序列和修饰adipo 8, 于连续腹腔输注第1、2、3、4周, 分别取附睾脂肪组织制成冷冻切片, HE染色观察分析脂肪细胞大小改变。结果 1腹腔注射cy 3荧光标记并修饰的adipo 8, 1 h荧光显微镜下观察显示:脂肪组织可见非常强的荧光信号, 而其余组织仅可见微弱信号;2未修饰adipo 8与脂肪组织结合弱且作用时间短, 修饰adipo 8与脂肪组织结合强且时间长。修饰adipo 8组中, 脂肪组织的荧光信号呈先增后减, 1 h最强, 30 min和24 h信号弱;3光学显微镜相同放大倍数单个视野内, 第1周, adipo 8组脂肪细胞大小较随机序列组无明显差异 (P>0.05) , 第2、3、4周, adipo 8组脂肪细胞小于随机序列组 (P<0.05) 。结论 1核酸适体adipo 8在肥胖小鼠体内可与白色脂肪组织高度特异性结合;2Adipo 8经硫代碱基修饰、结合聚乙二醇, 增强了其与脂肪组织结合的强度及延长结合时间;3Adipo 8在肥胖小鼠体内可以抑制脂肪组织成脂, 并且该作用随着时间的延长而加强, 即adipo 8在体内抑制成脂的作用呈时间依赖性。