脂肪源性干细胞

脂肪源性干细胞（共6篇）

脂肪源性干细胞 篇1

脂肪源性干细胞 (adipose-derived stem cells, ADSCs) 是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现这些细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低, 同时它具有来源丰富、取材容易、少量组织即可获取大量干细胞、低免疫源性、不涉及道德伦理问题等优点, 此外, 已证实其具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、心肌细胞、神经细胞和内皮细胞等方向分化的能力[1,2]。因此, ADSCs是一种很有前景的组织工程种子细胞, 具有非常重要的研究价值。本实验通过研究兔脂肪干细胞的分离、培养、鉴定以及体外成骨、成脂诱导分化过程, 为其能够作为骨组织工程理想的种子细胞提供实验基础。

1 资料与方法

1.1 材料

3个月龄新西兰白兔 (福州总院实验动物中心) , 低糖、高糖Dulbeco改良的MEM培养液 (dulbeco′s modifild eagle medium, DMEM) (Gibco公司) , Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、地塞米松、L-抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX) 、吲哚美辛、二甲基亚砜 (DMSO) 、噻唑蓝 (Sigma公司) 、标准胎牛血清 (杭州四季青) , CD44、CD45抗体、正常山羊血清 (武汉博士德) , FITC标记羊抗小鼠IgG (北京中杉金桥) , 碱性磷酸酶染色试剂盒、碱性磷酸酶检测试剂盒、钙离子检测试剂盒 (南京建成生物制品有限公司) , 培养瓶、6孔、12孔及96孔板 (Costar公司) 。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的原代培养、传代培养

取3个月龄新西兰白兔, 雌雄不限, 速眠新0.2～0.3 mL/kg肌注麻醉后, 备皮, 消毒。取颈后部正中切口, 无菌切取皮下脂肪组织, 清除肉眼可见的小血管, 尽可能去除包膜及结缔组织后用PBS清洗3次以去除红细胞。眼科剪将组织剪成1～2 mm3组织块, 置于2倍体积0.1%Ⅰ型胶原酶, 37℃消化60 min后加入等体积含10%胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) 的DMEM终止消化, 200目筛网过滤, 1000r/min离心10 min, 去上清, 加入含10%FBS的DMEM重悬浮细胞, 接种于25 cm2培养瓶中。置于37℃、5%CO2、饱和湿度恒温培养箱进行单层细胞培养。24 h后更换培养液, 以后每3天换液1次, 并于倒置显微镜下观察细胞生长情况。待细胞生长融合达80%～90%后, 经0.25%胰酶消化, 按1∶3进行传代培养。

1.2.2 rADSCs生长曲线的绘制

取10块96孔板, 每块96孔板以5000/孔的密度将第3、5、7、9代细胞各接种于5个孔。此后每天同一时间, 随机抽取一板, 测定光密度值。测量时每孔加入噻唑蓝溶液 (5 mg/mL) 20 μL, 继续在37℃、5%CO2培养箱中培养5 h后, 吸弃孔内液体, 每孔内加入150 μL DMSO, 振荡20 min, 在酶联免疫检测仪上选择492nm波长测定各孔OD值。以5孔OD值的均值为纵坐标, 以时间为横坐标绘制生长曲线。

1.2.3 CD44和CD45间接免疫荧光检测

取生长状态良好的第3代细胞爬片, 参照文献[3]行免疫荧光检测细胞表面的抗原标记CD44和CD45。以PBS代替一抗作为阴性对照, 镜下观察照相。

1.2.4 ADSCs的成骨诱导及碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色鉴定

消化收集第3代ADSCs, 以105/孔接种于预置有细胞爬片的6孔板中, 待完全贴壁后换液为成骨诱导液 (10%FBS的高糖DMEM中加入10-7mol/L地塞米松、L-抗坏血酸50 μg/mL和10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠) 进行成骨诱导。

碱性磷酸酶检测:诱导2周时终止培养, 取出实验组和对照组细胞爬片按照碱性磷酸酶染色试剂盒说明书进行操作。

Von Kossa检测:成骨诱导2、3周时进行。将实验组和对照组细胞爬片用4%多聚甲醛固定, 20 min后加入5%硝酸银避光孵育30 min, 于紫外灯下照射1 h, 苏木素复染核。

1.2.5 ADSCs的成脂诱导及油红O染色鉴定

消化收集第3代ADSCs, 以105个/孔接种于预置有细胞爬片的6孔板中, 待完全贴壁后换液为成脂诱导液 (10%FBS的高糖DMEM中加入10-6mol/L地塞米松、胰岛素10 mg/L、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5 mmol/L、吲哚美辛0.2 mmol/L) 进行成脂诱导。

油红O染色:成脂诱导14 d后的实验组和对照组细胞爬片用甲醛-钙固定液固定15 min, 60%异丙醇媒染2 min, 在油红O工作液内室温染色30 min, 70%酒精分色。

1.2.6 碱性磷酸酶浓度检测

取第3代ADSCs细胞, 以5×104个/孔接种于12孔板, 加入普通培养液进行培养, 待细胞完全铁壁后, 将其中5孔更换为成骨诱导培养液进行成骨诱导, 剩余5孔培养条件不变, 作为对照。于诱导1、2、3、4周时分别中止培养, 加入0.5 mL 0.1%聚乙二醇辛基苯基醚于4℃过夜, 然后按照南京建成碱性磷酸酶测定试剂盒说明书进行操作。碱性磷酸酶浓度以金氏单位/100 mL表示。

1.2.7 钙离子浓度检测

用第3代ADSCs细胞, 以5×104个/孔接种于12孔板, 加入普通培养液进行培养, 待细胞完全贴壁后, 将其中5孔更换为成骨诱导培养液进行成骨诱导, 剩余5孔培养条件不变, 作为对照。于诱导1、2、3、4周时分别中止培养, 加入0.6N HCL 0.5 mL于常温下过夜以将细胞外不溶性钙盐分解成可溶性钙离子, 然后按照南京建成钙测定试剂盒说明书进行操作。钙离子浓度以mmol/L表示。

1.2.8 统计学处理

采用重复测量的方差分析对诱导组和非诱导组不同时间点的碱性磷酸酶和钙离子浓度进行统计学分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ADSCs的体外培养

原代rADSCs培养4 h后, 有少量短梭形或小多角形细胞散在贴壁, 大部分未贴壁细胞为球形或圆形血细胞。第一次换液后, 未贴壁细胞 (大部分为红细胞) 已去除, 可见大部分贴壁细胞呈宽大扁平的成纤维细胞样细胞, 其间也可见少量三角形、多边形细胞 (见图1) 。随培养时间延长, 这些贴壁细胞形态为典型的长梭形细胞, 呈大小不一的集落状、漩涡状生长。培养5～6 d可达80%～90%致密层 (见图2) , 7～9 d可形成100%融合的致密单层。传代后细胞形态主要为长梭形, 少数为三角形或多边形, 呈漩涡状生长 (见图3) , 细胞生长速度较原代细胞明显增快, 3～4 d可长满。连续传12代, 细胞增殖未见明显减弱。

2.2 ADSCs生长曲线绘制

从图4可以看出, 所培养的细胞经过1～3 d的潜伏期, 进入对数生长期, 在第7天到达高峰而进入平台期。与P3相比, P5、P7、P9细胞增殖未见明显减缓。细胞由P0传代至P9, 每代倍增基本保持稳定, 未发现有下降趋势, 说明ADSCs经长期传代, 细胞仍能保持良好的增殖能力。

2.3 CD44和CD45间接免疫荧光检测

免疫荧光检测结果见培养细胞为CD44阳性, 表明这种细胞为间充质干细胞;而CD45为阴性表达, 证明所检测细胞并非来自于血液循环中的干细胞 (见图5) 。

2.4 ADSCs的成骨诱导及碱性磷酸酶染色、VonKossa染色鉴定

成骨诱导后3 d细胞无明显变化, 诱导4 d后可观察到少许细胞逐渐由梭形变为立方形、多角形, 体积增大;诱导8 d后, 多数细胞转变为多角形, 有数个突起, 细胞持续增殖、重叠, 逐渐聚集形成多个散在的细胞结节。14 d后可见细胞结节中央区形成矿化结节;诱导21 d后, 可见矿化结节较诱导14 d时明显增大, 数量明显增多。碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 染色结果:成骨诱导2周时可见有红棕色或咖啡色、深咖啡色颗粒充满胞浆 (见图6) 。

Von Kossa染色结果:成骨诱导2周和3周时用VonKossa方法检测钙盐的沉积, 染色的阳性结果为棕黑色结节。镜下观察到成骨诱导2周时, 形成的矿化结节较小, 数量少 (见图7) ;而诱导3周时, 结节较大, 数量增多 (见图8) 。对照组没有阳性染色表现。

2.5 ADSCs的成脂诱导及油红O染色鉴定

成脂诱导分化3 d后, 细胞中开始有小脂滴出现, 主要集中于细胞核周围;诱导5 d时细胞内可见较明显脂滴;诱导10 d后细胞内布满大小不等的脂滴, 小脂滴逐渐聚集成大的脂泡, 细胞核被挤于细胞一侧, 细胞逐渐增大;诱导12～14 d后细胞由原来的梭形变为圆形或多角形。油红O染色见脂滴被染成橘红色 (见图9) ;对照组细胞未见阳性染色。

2.6 碱性磷酸酶浓度的测定

ALP浓度在诱导组与非诱导组之间存在组间差别, 在各个时间点诱导组ALP浓度均高于非诱导组 (P<0.05, n=5) 。诱导组ALP浓度在不同诱导时相其浓度变化趋势不同, 诱导培养1周时, 诱导组ALP浓度明显增加, 2周时处于最高值, 并且于3、4周时逐渐降低 (P<0.05, n=5) , 而对照组ALP浓度变化不大 (见表1) 。

2.7 钙离子浓度的测定

钙离子浓度在诱导组与非诱导组之间存在组间差别, 在各个时间点诱导组钙离子浓度高于非诱导组 (P<0.05, n=5) 。诱导组钙离子浓度在不同诱导时相其浓度变化的趋势不同。诱导培养1周时钙离子浓度稍增高, 自第2周开始诱导组钙离子浓度逐渐增加, 并且始终显著高于非诱导组, 呈递增趋势并于4周时处于最高值 (P<0.05, n=5) , 而对照组钙离子浓度变化不大 (见表2) 。

3 讨 论

自20世纪90年代以来, 以干细胞为基础的组织工程的发展已成为治疗各种组织缺损和退行性疾病的有效手段。作为组织工程最重要的的组成部分之一——种子细胞的获取、增殖和分化是组织工程研究的基础和前提。对骨组织工程而言, 理想的骨种子细胞应具有以下特点[4]:a) 取材容易, 对机体损伤小;b) 增殖能力强, 体外培养易定向分化为成骨细胞, 短时间体外培养即可获得足量成骨细胞;c) 成骨能力强, 适应受区环境能力强, 植入人体后能很快形成新骨以替代支架材料;d) 组织相容性好, 能适应体内环境, 保持良好的生物学特性且不引起免疫排斥反应等条件。ADSCs是近年来发现的一种新的成体干细胞。ADSCs体外培养时贴壁能力强, 贴壁的细胞为梭形似成纤维细胞样形态, 呈集落状、漩涡状生长, 胞浆和核仁丰富。细胞周期分析显示, G0/G1期的细胞占69%, S期的细胞占24%, G2/M期的细胞占8%, 提示ADSCs具有较强的再生能力[5]。ADSCs传至第10代时凋亡细胞率低于5%, 15代时仅仅增加到15%, 表明ADSCs体外扩增和自我更新能力很强, 传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。其次ADSCs的获得量也很大, 平均300 mL脂肪组织可获得2×108～6×108个ADSCs, 传至10～20代时, 细胞的增殖速度无明显减慢[6], 而且脂肪组织中所含干细胞的数量不会随着患者年龄的增加而减少。另外, 研究显示ADSCs能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、心肌细胞、神经细胞、内皮细胞以及干细胞方向分化[7,8]。

注:1) 表示各个时间点诱导组ALP浓度与非诱导组之间有显著性差异 (P<0.05) ;2) 表示诱导组ALP浓度在不同诱导时相的变化趋势有显著性差异 (P<0.05) 。

注:1) 表示各个时间点诱导组钙离子浓度与非诱导组之间有显著性差异 (P<0.05) ;2) 表示诱导组钙离子浓度在不同诱导时相的变化趋势有显著性差异 (P<0.05) 。

迄今为止, 还没有发现ADSCs特异的表面标记。在本试验中, CD44、CD45免疫荧光检测结果证明我们所分离培养的细胞为间充质细胞来源并非血液循环中的干细胞。此外, 对所分离的细胞进行成骨、成脂诱导, 表明其具有多向分化潜能。两种实验结果相结合, 可以充分证明我们所分离培养的细胞为间充质来源的干细胞。

用于向成骨细胞诱导的条件培养基成分为10%FBS的DMEM中加入10-7mol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠, 这些化学物质被认为是诱导间充质干细胞向成骨细胞定向分化的诱导基, 称为成骨定向培养基 (osteogenic medium, OM) 。在成骨定向培养基中, 各个诱导成分发挥着不同的作用。L-抗坏血酸在地塞米松的调控下参与早期Ⅰ型胶原的合成合成, 还具有调控碱性磷酸酶活性和蛋白合成的作用;β-甘油磷酸钠是提供发生钙沉积所需要的无机磷, 从而参与细胞外基质矿化;地塞米松通过增强其受体与基因组中靶序列的亲和性从而调控分化细胞中的基因表达, 提高碱性磷酸酶的活性, 促进向成骨细胞转化。研究表明, 大于10-7mol/L高浓度地塞米松对ADSCs的生长、增殖有明显抑制作用;在其他诱导条件一致的情况下, 10-7mol/L地塞米松最有利于ADSCs向成骨细胞分化[9]。最终经上述三者的联合干预, 成骨过程基本完成。

ADSCs在OM中诱导后能分化为成骨细胞, 细胞由梭形的类成纤维细胞形态转变成为立方形、多角形, 体积增大, 并表达与成骨表型相关的基因和蛋白, 包括碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、骨连接素、降钙素、骨唾液酸蛋白等, 并可沉积矿化的细胞外基质[6]。在本实验中, ADSCs在成骨诱导液作用下, 培养2周时碱性磷酸酶高效表达, 表明成骨过程进入成骨过程的基质成熟期;诱导3周时Von Kossa染色检测到钙盐沉积, 4周时钙盐沉积比3周明显增多, 表明进入到了成骨过程的细胞外基质矿化期。通过对诱导过程中碱性磷酸酶浓度和钙离子浓度变化进行分析发现, 细胞碱性磷酸酶在1周时有少量表达, 2周时达高峰, 此后逐步下降;而钙离子浓度则呈现出递增趋势, 于4周时达到峰值。此研究结果与国内郝伟的实验研究相似[10]。由此证明实现了脂肪干细胞的成骨诱导分化。

综上所述, 脂肪干细胞易分离培养、增殖快和良好的成骨诱导活性完全符合对种子细胞的要求, 因此, ADSCs在组织工程研究中将有较好的前途, 是一种理想的骨组织工程种子细胞。

(本文图1～9见后插页)

参考文献

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为脂肪细胞减肥 篇2

林珊珊来到武汉军区总医院消化内科，医生这样告诉她:“你可能是遗传性肥胖。”“可是我爸妈都是瘦子啊。”“如果父母双方都是瘦子，他们的子女也有10％的可能肥胖。”林珊珊不幸身处这10%当中。遗传性肥胖与家庭饮食结构及生活习惯有关，父母双方都肥胖，子女有高达60％ ~80％的可能肥胖。不仅体型具有遗传性，肥胖的部位也有遗传性。这些患者，在出生半年左右就会出现肥胖症状，身体脂肪细胞数目增多，细胞体积也较一般人的肥大，他们饮食亢进，通常摄取过多。的确，充足甚至过量地摄入食物是林珊珊受肥胖困扰前一贯的作风。体内成了一个堆放食物的仓库，代谢开始变慢，合成的速度超过了分解的速度。也就是说，仓库中的货物还没有搬走，就来了一批新的。

脂肪细胞的数目和细胞内脂质含量的多少，也就是脂肪细胞的体积大小决定了人的肥胖程度。儿童期就开始肥胖，成年后仍然肥胖的人，体内脂肪细胞的数目明显增多，林珊珊的肥胖史与此吻合。成年后才开始肥胖的，主要是脂肪细胞的体积增大。脂肪细胞的增加及增大让“能量摄入－能量消耗”这一人类能量系统的反应式失衡。而负责统筹人体内能量储备的能量调节系统也有不靠谱的时候，当遇上基因突变或其他环境因素的变化时，调节系统失常，人们必须面对无法遏制的增重。

脂肪，这个现代社会遭人唾弃的物质，在食物匮乏的年代和地区却是人类的救星。人体会把能量以脂肪的形式储存起来，提高自身在饥饿状态下的生存能力。而今，人们的问题不再是吃不饱而是控制在七八分饱，在这个饮食习惯本末倒置的时代，大部分人都希望用于储存能量的脂肪组织土崩瓦解。

注定失败的计划

自初中开始，林珊珊就不得不面对日益增加的体重。现在在襄樊市公共交通总公司电子信息中心工作，每天朝九晚五，周末不时加班的作息，让平时爱吃的林珊珊无法制定规律的运动计划。普通肥胖的人群和林珊珊的临床反应相似，过度摄取食物之外的显著特点就是不爱运动。能量摄入明显高于消耗，只进不出，体内储存能量的脂肪组织不断壮大。这种因为膳食结构不平衡，偏腥、荤、油，缺乏运动导致肥胖的普通人群也要面临残酷的减肥计划。

林珊珊一直尝试减肥，她的计划和普通肥胖人的相似，分三步走：节食、运动、药物。尝试过运动和节食减肥，因为没有持久一直不见成效。看到周围同样生活方式却身材正常的同事，林珊珊不愿承认这是自己肥胖的唯一原因。最后她选择服用减肥药。服用之前，还必须与昂贵的价格、不可预知的副作用引发的一系列健康问题纠缠。最终，林珊珊即使向药物妥协，依旧避免不了减肥失败。

减肥失败已经成了林珊珊生活中无法抹去的标签。那些驻扎在体内的脂肪是否就这样成为林珊珊的终身伴侣？林珊珊体内的确有一位终身伴侣，它就是脂肪细胞中两位成员——棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞——中的后者。成人的脂肪细胞主要由白色脂肪细胞组成，主要分布在皮下及内脏周围，这种含有大量脂肪滴的细胞贮藏了肥胖症患者的脂肪，更可怕的是它的体积可以增大百倍，试想：一颗玻璃弹珠变成篮球的情况发生在人身上，会是怎样一番情景。林珊珊当然不敢想象这番情景，可是她必须接受白色脂肪细胞储存了自己过剩的能量，不断膨胀且挥之不去的事实。

现在，林珊珊等遗传性肥胖和普通肥胖症患者们除了无奈还可以做一件事，就是把希望寄托在脂肪细胞中的另一位成员——棕色脂肪细胞（也称褐色脂肪细胞）上。当人们感到寒冷和饥饿却不会被冻死或饿死、进食后因消耗能量而浑身发热（当然冷冻食品除外）这都是因为接收到棕色脂肪细胞发出的信号。它是一种产热器官，可以转移或释放人体内的热量，除了产生热量，棕色脂肪细胞没有其他存在的理由。然而，令人头疼的是，这种细胞主要存在于婴儿体内，成人体内很难发现，分布的范围极其有限。

“关掉”肥胖

“我希望有个开关能让我不断增长的体重瞬间停止。”林珊珊开始调侃自己的肥胖。她想不到的是，这种“开关”的确存在。找到棕色脂肪细胞的触发器，增加肥胖者体内棕色脂肪细胞的数量，将多余的能量通过棕色脂肪细胞转变为热量，而不是进入白色脂肪细胞的存储库中。这就是哈佛医学院的生物化学家兼细胞生物学家布鲁斯• 斯皮格曼教授当前的研究课题。

棕色脂肪细胞浑身都是劲：内含体积大而数量丰富的线粒体，被称为“细胞发电厂”的线粒体增加了棕色脂肪细胞的活性，提高代谢效率，将人体内的能量“燃烧” 殆尽。这样一来，肥胖者体内不再有脂肪积淀，大街上的“水桶腰”、“蝙蝠袖”、“太阳脸”都会逐渐消失。

首先找到的是形成脂肪细胞的开关——氧化物酶体增殖物活化受体（PPAR）。它存在于棕色脂肪细胞和白色脂肪细胞内，PPAR 在棕色脂肪细胞的分化中起了重要作用。另外一种名为PGC-1 的蛋白质也在启动棕色脂肪细胞中的发热基因上表现出色，PGC-1 在棕色脂肪细胞中的含量丰富，它可以增加棕色脂肪细胞中线粒体的活性，加速代谢从而提高能量作为热量释放的效率。PGC-1 成为控制棕色脂肪细胞热生成的一个按键。

如果把在PPAR 和PGC-1 比作开关的装置和电线的话，还需要一个起控制作用的基因，决定“开关”何时打开或关上。PPAR 和PGC-1 双剑合壁共同影响棕色脂肪细胞分化的时候，斯皮格曼教授在小白鼠体内的棕色脂肪细胞内找到了这个起控制作用的基因——蛋白质PRDM16。事实上，小白鼠体内的棕色脂肪细胞内含有大量的PRDM16 的蛋白，该蛋白在白色脂肪细胞却很罕见。研究人员利用基因技术令正在生长中的小白鼠脂肪细胞表达PRDM16，结果，这些细胞变成了棕色脂肪细胞。而当他们把表达PRDM16 所需基因从棕色脂肪细胞中移走后，棕色脂肪细胞则不再具有高代谢率，也就是不再燃烧脂肪了。

找到可以表达PRDM16 的基因成了在成人体内生成棕色脂肪细胞的关键，也成了减肥的终极手段。斯皮格曼教授及同事似乎已经知道怎么去解决问题，接下来的就是重复而冗长的实验。开发“肥胖开关”的整个过程就像研制一辆汽车，找到PPAR 和PGC-1，以及调控它们的PRDM16只是搞定了一些零部件而已。情况似乎很糟，但没有想象的那么糟。人们对PRDM16 和PGC-1 的了解越来越多，对“开关”的把握也越来越大，总有一天，减肥就像关灯一样，“啪”地一声就完成了。如果林珊珊知道这一消息，清晨站在穿衣镜前，眼角一定会增加许多因微笑而起的鱼尾纹。

Tips

导致肥胖的因素

药源性肥胖

长期服用一些治疗慢性病的药物会导致肥胖，比如降血糖药物。它是病理性肥胖的一种。这种因中枢神经或内分泌系统的病变等引起的肥胖在临床上比较少见，只占肥胖患者的2％左右。药源性肥胖一般停药就可以改善。

神经源性肥胖

脂肪源性干细胞 篇3

关键词：组织工程,脂肪源性干细胞,诱导分化

盆底功能障碍性疾病是中老年女性的常见疾病,经产妇盆腔脏器脱垂(POP)发生率达50%[1]。胶原蛋白是韧带和筋膜等支持结构的主要组成部分,对维持盆底支持组织的弹性和韧性起重要作用。研究发现子宫脱垂合并膀胱膨出的患者其胶原含量较非POP者要低[1]。脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)作为组织工程的种子细胞已经用于治疗压力性尿失禁[2,3],由于它能有效促进胶原的合成,以及促进成纤维细胞向损伤组织迁移[4],所以ADSCs有望成为治疗POP的种子细胞。本实验观察ADSCs的分离培养及其向成脂诱导的生物学特性,为ADSCs作为治疗POP的种子细胞的生物工程学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验于2010年6～12月在广州市呼吸疾病研究所(国家重点实验室)完成。仪器及试剂:倒置相差显微镜(Leica,Japan),流式细胞仪(Beckman,USA),培养瓶(Corning,USA);DMEM/F12(Gibico),胎牛血清(Hyclone),Ⅰ型胶原酶(Gibico),MTT(Gibico),青-链霉素(Gibico),成脂诱导培养基A液(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液、青-链霉素100 U/L、1μmol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L 1-甲基-3-异丙基-黄嘌呤、200 μmol/L吲哚美辛),成脂诱导培养基B液(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液、青-链霉素100 U/L、10 mg/L胰岛素),藻红素标记的小鼠抗大鼠CD34、CD44、CD45、CD49d、CD90、CD105和CD106单克隆抗体以及对照抗体藻红素标记的小鼠抗大鼠IgG1(Biolegend)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ADSCs的分离和培养[5,6]

雌性SD大鼠2只(由广东省实验动物中心提供,许可证号:SCXK(粤)2008-0002)。腹腔麻醉大鼠,无菌条件下切取双侧腹股沟区脂肪垫,置入磷酸盐缓冲液(PBS) 移至超净工作台内,剥离肉眼所见血管及筋膜后用PBS液漂洗3次,剪成糊状,加入2～3倍体积的0.1%Ⅰ 型胶原酶,37℃水浴消化1小时。2000 r/min离心5分钟,取下层沉淀,PBS漂洗2次,加入2 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12 (含青-链霉素100U/L )悬浮细胞,以1×105/ml接种到培养瓶中,置37℃、含5%的CO2饱和湿度细胞培养箱中培养。接种48小时后全量换液去除未贴壁细胞,以后每2天半量换液。待原代细胞生长接近铺满瓶底约80%时,胰酶消化后以1∶2进行传代。

1.2.2 噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长曲线

选取铺满约80%的第1代细胞(P1),第3代细胞(P3)和第5代细胞(P5)的细胞,用胰酶消化为单个悬浮细胞。以浓度为1×104/孔接种于96孔板,于培养1～8天后分别加入5 mg/ml的MTT液20 μl继续培养4小时,吸出液体,每孔加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO),室温下置微振荡器上10分钟,检测490 nm吸光度(A值),绘制细胞生长曲线。

1.2.3 细胞周期检测

胰酶消化第3代铺满培养瓶约80%的ADSCs,以冰冻的PBS漂洗3次,细胞计数板计数,取大约1×106个细胞,加入预冷的冰冻乙醇2 ml固定,4℃过夜,次日1000 r/min离心10分钟收集细胞,预冷的PBS洗2次,加入400 μl的PBS重悬细胞,加入Rnase-A约3 μl至终浓度50 μg/ml,37℃水浴消化30分钟,加入50 μg/ml 的碘化丙啶(PI)100 μl轻轻吹打,室温避光染色30分钟,上机检测。

1.2.4 表面标记物的鉴定

胰酶消化第3代铺满80%的ADSCs,制成105/ml的细胞悬液,分别加入藻红素标记的小鼠抗大鼠单抗CD34、CD44、D45、CD49d、CD90、CD105、CD106和同型阴性对照小鼠抗大鼠IgG1,室温避光反应30分钟,PBS液清洗弃上清,用PBS液重悬细胞,流式细胞仪分析。

1.2.5 ADSCs的成脂诱导[7,8]

第3代ADSCs铺满80%～90%,胰酶消化,细胞计数,以每孔1×105个细胞接种12孔板,培养48小时后更换培养液为诱导液A,继续培养3天后更换为诱导液B,培养24小时后再次更换为诱导液A,如此反复直至诱导14天。诱导14天后,弃去培养液,PBS漂洗2次,加入油红“O”染液染色30分钟,倒置显微镜下观察。

2 结 果

2.1 ADSCs的体外生长特点

原代培养12小时内可见大部分贴壁,接种48小时后全量换液,接种3天后可见多角形、星型和梭状贴壁细胞,胞浆可见空泡及黑色粗颗粒,并可见少数细胞集落形成,见图1。接种4天后可见细胞呈集落样、梭状排列,形态与成纤维细胞相似,第6天细胞铺满约90%,进行传代培养。传代培养细胞增殖迅速,其形态的均一性增加,细胞形态为梭形、多角形等。见图2。

2.2 MTT法绘制细胞生长曲线

P1、P3和P5均在1～2天处于潜伏期,在3～5天处于对数生长期,6天后进入平台期,生长曲线呈“S”形,见图3。

2.3 第3代ADSCs细胞周期

处于G0/G1期细胞为90.60%,表明细胞绝大多数为2倍体细胞,处于增殖前期。见图4。

2.4 第3代ADSCs的表面标记物结果

流式细胞仪检测ADSCs的表面标记物阳性表达率分别为CD44 99.88%,CD105 95.00%,CD90 99.74%,CD34 3.04%,CD106 0.85%, CD45 0.26%,CD49d 89.56%。

2.5 ADSCs向成脂诱导分化结果

加入成脂诱导液后,细胞形态失去原来梭形、长条形的细胞轮廓,变成以类圆形和长椭圆形为主。诱导3天后细胞内可见小脂滴,随着诱导时间的增加,细胞内脂滴逐渐增加并融合成大的脂滴,诱导14天后可见大部分细胞内存在脂滴,油红“O”染色可见细胞内脂滴染成橘红色,而对照组未见脂滴出现。见图5、图6。

3 讨 论

近年来组织工程取得了巨大的进展,但作为主要种子细胞的骨髓间充质干细胞由于取材和分离的困难导致了骨髓间充质干细胞作为种子细胞的发展前景。2001年,Zuk等[5]从人体脂肪组织中分离出ADSCs,并发现其具有多向分化能力,其具有取材方便、量大、可以反复抽取等优点,已经成为整形美容、骨材料研究的热点。目前,已有将ADSCs作为治疗压力性尿失禁的种子细胞的研究报道,2010年Yamamoto等[3]报道了2例利用自体ADSCs治疗前列腺根治术后尿失禁的临床研究,术后观察12周ADSCs能持续存在,尿失禁和尿潴留得到明显改善。Park等[4]发现ADSCs能有效促进胶原的合成以及成纤维细胞向损伤组织迁移,因此,利用ADSCs作为治疗盆底功能障碍性疾病的种子细胞是一种新的尝试。本研究发现大鼠腹股沟区脂肪垫易于获取,提取ADSCs方法简单易行,传代后细胞形态均一性好,传至13代仍能保持较好的增殖活性。MTT法测细胞生长曲线提示细胞1～2天处于潜伏期,3～5天处于对数生长期,6天后进入平台区,与郭宝锋等[7]的报道相似。

第3代ADSCs的表面标记物鉴定结果显示CD44 99.88%,CD90 99.74%,CD105 95.00%,CD49d 89.56%,而CD34 3.04%,CD106 0.85%,CD45 0.26%。符合Dominici等[9]提出间充质干细胞的表面标记物CD105、CD90或CD73阳性表达率必须大于95%,CD45、CD34阳性表达率必须≤2%的要求。其中CD90和CD105是间充质干细胞的通用标记,CD44是间充质干细胞的标记,本实验中均高表达;CD49d在ADSCs中表达,在骨髓间充质干细胞中不表达,相反CD106在ADSCs中不表达,而在骨髓间充质干细胞中表达,鉴定CD49d和CD106是为了更好地鉴定其来源;CD45是白细胞的表面标记,CD34是造血细胞和内皮细胞表面标记,本实验中阳性率均小于5%。由于本实验细胞来源为脂肪,故表面标记物鉴定结果证明细胞为ADSCs。 Park等[10]发现随着细胞传代的增加,其表面标记物CD29、CD44和CD90阳性率增加,而Nanog, Oct-4 和 Rex-1等细胞多能性相关基因表达减少,提示随着ADSCs细胞传代的增加,细胞增殖能力降低,而第3～5代细胞杂质细胞减少,均一性良好,因此本实验均采用第3代细胞。

本实验对所提取细胞进行成脂诱导,经诱导后胞内出现脂滴,诱导14天后油红“O”染色结果表明所提取的ADSCs具有向成脂方向分化的能力。实验过程发现按照张丽华等[8]的细胞密度接种,细胞密度过大,影响细胞活性,实验发现1×105/孔接种,细胞接种2天后可铺满孔底,进而采用1×105/孔的细胞密度进行诱导实验。油红“O”染色原理为脂滴溶解油红“O”,使脂滴呈现橘红色,本实验染色方法与张丽华等[8]有改良,未经甲醛固定,经PBS漂洗后直接染色,染色时间30分钟时脂滴着色不明显,延长染色时间至1小时,染色效果好。

国际细胞治疗协会(international society for cellular therapy,ISCT)[9]提出关于间充质干细胞的基本条件:①标准体外培养条件下细胞具有贴壁生长特性;②CD105、CD90或CD73阳性表达率必须大于95%,CD45、CD34阳性表达率必须≤2%;③具有向成脂、成骨和成软骨方向分化的能力。本实验可证明该实验方法培养的干细胞为ADSCs,完全符合上述条件,为间充质干细胞研究的另一更好的组织来源。

POP患者其韧带及阴道壁胶原蛋白含量较正常者降低,ADSCs及其分泌因子具有促进胶原蛋白合成和促进成纤维细胞迁移的特性,且ADSCs取材简便、来源丰富。由此推测,ADSCs是治疗POP生物工程学方法中的可选择的种子细胞之一。

参考文献

[1]Maher C,Baessler K,Glazener CM,et al.Surgical management of pel-vic organ prolapse in women:a short version cochrane review[J].Neurourol Urodyn,2008,27(1):3-12.

[2]Lin G,Wang G,Banie L,et al.Treatment of stress urinary inconti-nence with adipose tissue-derived stem cells[J].Cytotherapy,2010,12(1):88-95.

[3]Yamamoto T,Gotoh M,Hattori R,et al.Periurethral injection of autol-ogous adipose-derived stem cells for the treatment of stress urinary in-continence in patients undergoing radical prostatectomy:report of twoinitial cases[J].International Journal of Urology,2010,17(1):75-82.

[4]Park BS,Jang KA,Sung JH,et al.Adipose-derived stem cells andtheir secretory factors as a promising therapy for skin aging[J].Der-matol Surg,2008,34(10):1323-1326.

[5]Zuk PA,Zhu M,Ashjian P,et a1.Human adipose tissue is a souree ofmultipotent stem cells[J].Mol Biol Cell,2002,13(12):4279-4295.

[6]Bunnell BA,Flaat M,Gagliardi C,et al.Adipose-derived stem cells:isolation,expansion and differentiation[J].Methods,2008,45(2):115-120.

[7]郭宝峰,尹维田,刘浩宇,等.人脂肪干细胞体外培养特性及成脂成软骨分化[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,113(3):6625-6628.

[8]张丽华,汤银娟,刘杰明,等.大鼠附睾脂肪垫脂肪源性干细胞的分离培养及分化潜能[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(14):2685-2690.

[9]Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for definingmultipotent mesenchymal stromal cells[J].Cytotherapy,2006,8(4):315-317.

脂肪源性干细胞 篇4

1资料与方法

1.1一般资料

选择我院2010年3月至2013年9月收治的63例患者, 均为女性, 年龄21岁~42岁, 平均年龄 (28.9±6.8) 岁;湿性CAL隆乳术13例, 隆乳假体取出后立即隆乳术11例, 隆臀术14例、全面部皮下组织萎缩症丰面治疗4例、美容性面部年轻化丰面术15例、受区外伤、感染引发局部瘢痕凹陷血运差接受注射填充治疗6例。术后患者在手术前与手术后, 均测量臀位和胸围, 并拍照, 彩超定期扫描。

1.2手术方法

使用人工注射器, 术者肿胀液, 注射过程中保持力度, 避免压力过快、过大、过高, 使用注射器吸脂法。使用螺口注射器一次性注射20ml, 并采取无创吸脂针进行吸脂, 每次吸脂后将注射器自然悬浮, 将注射器内的颗粒脂肪水分排除, 将脂肪物中的悬浮颗粒使用生理盐水洗涤, 注射器中的颗粒脂肪中的油脂部分不排除, 不离心将干细胞和浓缩纯化颗粒脂肪分离, 排除注射器的混合填充物, 行直接填充移植。在对受区注射前, 需先使用局部浸润麻醉, 确保层次组织的疏松无创分离、膨胀。从注射肿胀液的剂量, 判断湿性CAL填充物的需要量。单点微量 (0.8ml) 、多平面、多点、无创钝针线状成为退针边注射。干细胞“微粒”和颗粒脂肪, 均定为于植体床内, 在隆乳时, 注入剂量为100ml, 在隆臀时需一侧注入300ml。行肌肉注射时, 可将其分为多层注射, 减少损伤, 确保血运状态。对受区作处理后, 凹陷湿性CAL, 其主要在于肌肉分层注射, 减少损伤, 确保血运状态, 湿性CAL在面部, 主要为全面肌肉深层注射移植。术后, 因充分填充, 会发生肿胀, 可使用间歇性冰敷, 或行热敷理疗, 可快速恢复正常。

2结果

63例患者, 术后均无明显并发症, 24例患者隆乳术后, 且外观满意, 手感良好。所有患者均采取单次注射移植, 未采取重复注射可取得满意效果。经随访发现, 术后使用MRI检查, 脂肪清除其发生率不足1%。

3讨论

湿性CAL注射移植前, 受区先局部肿胀浸润使各层次组织液压膨胀和蔬松无创分离, 即在受区局部肿胀浸润呈现一个“生理湿性内环境”, 使注射移植混合填充物微粒易白行弥散开, 不易形成脂肪结节, 同时又对体表软组织凹陷及扁平小乳房等受区部位起到一定的术中即时预扩张作用[1]。本研究结果提示单次注射即可获得满意效果。

湿性CAL临床应用技术指南及注意事项:1湿性肿胀注射器吸脂, 尽量减少额外人工处理中间环节和最大限度减少损伤;2受术者体质和注射填充部位具体状况与成活率密切相关;3操作过程中每一个环节, 均是影响术后成活率的关键因素;4受区血运状况是成活率的决定性因素[2]。

总之, 采取湿性脂肪干细胞对自体颗粒脂肪注射移植术进行辅助, 能提高手术成功率, 降低手术风险, 操作简单, 术后并发症少, 值得临床进一步推广使用。

摘要：目的:探讨湿性脂肪干细胞在自体脂肪移植中的效果。方法:一次性螺口注射器20ml吸脂, 自然悬浮后, 排除注射器下层水分, 不离心分离浓缩纯化颗粒脂肪, 行直接注射移植;先对注射受区肿胀进行局部浸润麻醉, 组织各层次行疏松分离, 行分层次注射移植, 对注射后损伤、血运和操作时间进行分析。结果:经术后随访, 相较于传统单纯颗粒脂肪湿性注射隆乳术、隆臀术、隆乳术后假体取出直接注射隆乳术等自体颗粒脂肪注射移植术比较, 其临床效果有显著改善。结论:采取湿性脂肪干细胞对自体颗粒脂肪注射移植术进行辅助, 能提高手术成功率, 降低手术风险, 操作简单, 术后并发症少, 值得临床进一步推广使用。

关键词：脂肪干细胞,自体颗粒脂肪注射移植,血管基质层片段细胞

参考文献

[1]刘乃军, 王艳.湿性脂肪干细胞辅助自体脂肪移植术的临床研究[G].第十一届上海国际整形美容外科会议论文集, 2012, 4:117-118.

肌源性干细胞研究进展 篇5

一、肌源性干细胞的分离纯化

1999年Jackson等[3]报道,利用Hoechst/流式细胞仪法从小鼠骨骼肌中分离到一群与卫星细胞明显不同的干细胞,这些细胞表达造血干细胞的表面标志,能有效重建造血功能,说明这种具有分化多能性的肌源干细胞与肌肉干细胞或卫星细胞是两种不同的细胞。Gussoni E等在Nature杂志上也报道了用Hoechst/FACS方法纯化MDSCs的方法,即3~5周龄小鼠骨骼肌中消化分离出的细胞,经Hoechst33342染色,用FACS方法富集到MDSCs,移植到致死照射处理的小鼠体内能有效重建造血系统。Lee等[4](2000)、Jankowski等[5](2001)、Qu-Petersen等[6](2002)用差速贴壁法从正常的骨骼肌中分离出三个细胞亚群:成纤维细胞很快在PP1和PP2培养板中贴壁,称之为早期贴壁细胞群;PP3和PP4细胞贴壁稍慢,其主要成分为肌卫星细胞,称之为晚贴壁细胞群;PP5和PP6贴壁速度很慢,称为慢贴壁细胞群,此细胞群为一种新的细胞群,其具有很高的分化潜能,称之为肌源性干细胞。

国内也有相关的报道,张金明等[7](2006)采用差速贴壁分离技术,分别用Ⅺ型胶原酶、dispase蛋白酶及胰蛋白酶分步消化肌肉,得到了兔的MDSCs;迟猛等[8](2008)采用消化法和差速贴壁法分离纯化得到了人的MDSCs;韩颖等[9](2008)使用胶原酶消化牛骨骼肌,然后采用差速贴壁分离技术纯化获得牛的MDSCs。

二、肌源性干细胞的表面标志

干细胞表面特异性分子标志,是区分不同干细胞的主要依据,肌源性干细胞的表面标志已被初步认识,但其结果具有很大差异,这些不同的结果可能是由于各实验室的条件、细胞分离培养方法及分析方法不同所造成。Lee[4,5,6,7,8,9,10]等通过免疫组化、PT-PCR和流式细胞术等方法分析MDSCs表达标记,发现其表达肌源标志Desmin、Bcl-2、C-met,和干细胞标志Sca-1、CD34,但不表达C-kit、CD45。Torrente[11]等报道MDSCs虽然也表达Sca-1、CD34,但不表达Desmin。Zhuqing Qu[12]等发现60%的原代MDSCs不表达Desmin,而传代培养时Desmin阳性细胞逐渐增加。我们注意到造血干细胞的表达标志如Sca-1、CD34也在MDSCs表达,而有些肌细胞的标记却不被MDSCs表达,这种现象说明当干细胞的全能性增加,其组织特异性标志减少,而不同组织来源的干细胞共有的标志增多。

pax7是一个促进MDSCs向卫星细胞分化的重要因子[13]。Olguin和Zammit等发现Pax7可以调节卫星细胞的繁殖和自我更新[14,15],对卫星细胞的功能起重要作用[16]。Pax7在MDSCs与卫星细胞表达有所不同[17,18],pax7-/-的小鼠中完全缺乏卫星细胞而MDSCs数不受影响,说明MDSCs与卫星细胞是两种不同的细胞。

三、肌源性干细胞的分化潜能

MDSC具有多向分化潜能,在适当的营养素和生长因子的作用下能分化为不同胚层的细胞,如造血细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等。但MDSCs的分化机制尚不清楚,可能与细胞融合有关,因此也是目前研究的热点。

1. MDSCs向神经细胞分化

睫状神经因子作为一种神经营养因子,通过细胞表面的受体可以使得成肌细胞去分化而转变为多能干细胞;丹参也具有诱导多能干细胞向神经细胞分化的功能,但具体机制尚不明确。曾祥一等(2009)应用差速贴壁法和酶消化法获得MDSCs后接种于6孔板内,诱导组用含有睫状神经营养因子的DMED预诱导24h,更换培养液,洗涤3次,再加入含丹参注射液的无血清DMEM诱导5h;对照组使用无血清DMEM培养基处理。结果显示诱导前MDSCs未见神经丝蛋白表达,诱导后的神经元样细胞神经丝蛋白呈阳性表达;凝胶电泳及Western blot检测结果显示,与诱导前比较,诱导后对照组核因子k B抑制蛋白的表达无明显变化,诱导组核因子k B抑制蛋白的表达明显下降[19]。

李进等[20](2008)从成年SD大鼠骨骼肌组织中培养出肌源性干细胞,采用b FGF、EGF诱导出神经球样细胞团,并检测nestin免疫组化染色示强阳性。在再贴壁培养下,用RA、BDGF诱导分化,部分细胞表现出神经元样或胶质细胞样形态,并表达NSE、GFAP。为治疗臂丛神经根性撕脱伤及其它中枢神经损伤提供了一种新方法。

2. MDSCs向胰岛素分泌细胞分化

刘福强等用大鼠胰腺提取液(RPE)诱导MDSCs向胰岛素分泌细胞分化,通过形态学观察、双硫腙(DTZ)染色、免疫细胞化学显色、葡萄糖刺激实验和RT-PCR对诱导细胞进行体外结构和功能鉴定,结果显示RPE诱导后第5日有胰岛样结构出现;免疫细胞化学显示,诱导后第12日细胞团表达胰岛素、胰高血糖素,而未诱导组细胞不表达上述蛋白;RT-PCR结果表明,诱导后第6日检测到PDX-1的表达,诱导后第12日检测到胰岛素1、胰岛素2、胰高血糖素和葡萄糖转运体2基因的表达。说明大鼠MDSCs可定向分化为胰岛素分泌细胞[21]。

3. MDSCs向成骨细胞分化

肌肉中骨祖细胞的存在和MDSCs分化为成骨细胞的能力有效地促进了骨的愈合。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是TGF-β超家族的成员,广泛分布于动物骨组织的酸性蛋白质,在人类基因组中发现的BMP家族有20多个成员。BMP-2是已知的所有生长因子中对骨的形成最强的生长因子,对骨组织形成、生长和修复有促进作用[22]。经BMP-2诱导的人MDSCs形态发生显著变化,出现了胞体肥大并呈圆形的细胞,这些肥大的圆形细胞经检测证实,其胞体内有ALP、骨钙素的表达,说明MDSCs能向成骨细胞转化,且随着BMP-2剂量的增加,ALP、骨钙素含量相应增加[23]。Kuroda等[24]的研究表明由MDSCs的BMP-4的局部传递增强了小鼠的软骨形成并促进了关节软骨的修复。Peng等[25]研究发现VEGF与BMP-4能协同作用促进骨的愈合,但如果两种因子的比例不当,将对骨愈合产生有害的结果。Wright等[26]用编码BMP-4的反转录病毒体外转染人MDSCs,移植到免疫力正常的小鼠后,成骨量少于SCID小鼠。Alden等[27]认为,表达BMP-2的腺病毒转染MDSCs异体移植成骨存在免疫反应。避免或减轻免疫反应,改进并简化MDSCs的分离和纯化方法,过渡到自体细胞移植是尚待解决的重要问题。

四、肌源性干细胞在基因治疗与组织工程中的应用

1. 在脊髓损伤修复中的应用

常用于脊髓损伤修复的种子有胚胎神经干细胞、嗅鞘细胞、骨髓基质干细胞等,这些细胞移植至脊髓损伤区均能使损伤再生或修复,但都有其各自的缺点和不足。MDSCs具有诱导分化为神经细胞的潜能,并能向神经干细胞一样在中枢神经组织里迁移和整合;自体移植又克服了伦理学争议和排斥反应等问题,是组织工程临床用于脊髓损伤修复的理想种子细胞。

目前,干细胞移植治疗脊髓损伤的机制尚不清楚,一般认为:①干细胞在适合的环境条件下具有分化为神经细胞的潜能,神经细胞从结构上修复脊髓损伤。②植入的干细胞与定居部位神经组织间相互作用,并产生某些细胞因子,这些细胞因子不仅能促进神经功能的修复,也能保障植入干细胞的存活、增殖,并诱导神经细胞向受损部位迁移。③干细胞本身也可以作为填充物填补损伤部位,定向再生为神经细胞锚靠周围组织完成上行下传功能的重建,移植时创造抑制胶质细胞再生、保护神经细胞体存活、促进自体神经细胞再生的微环境。④干细胞具有向血管内皮祖细胞和神经细胞方向分化的作用,有利于受损区神经和血管组织的修复[28]。⑤减少损伤区的细胞凋亡。⑥抑制T细胞的增殖等[29,30]。

2. 在治疗压力性尿失禁中的应用

全世界约有20亿人患有尿失禁,其严重影响了人们的生活质量。压力性尿失禁是尿失禁中最常见的一种类型,且发病率越来越高[31]。发生压力性尿失禁的机制主要是尿道括约肌结构及功能缺陷和膀胱颈支撑功能障碍。传统的治疗方法只能取得短期的疗效,不能从本质上纠正成肌功能障碍,而且还会引起慢性炎症反应,尿道周围脓肿、糜烂,及尿道阻塞而引起尿潴留,内脏器官偏移和肺栓塞等不良反应[32]。

目前,治疗压力性尿失禁的最新方法就是应用干细胞移植技术。在干细胞移植术中,所应用的干细胞必须具有较强的增殖能力。MDSCs是肌肉内高度未分化的多潜能干细胞,增殖快、融合慢、分化能力强存活率高等优点,是治疗压力性尿失禁的一种理想的种子细胞。

Atalad等[33]最早报道了在一猪模型应用培养的自体软骨细胞治疗压力性尿失禁,他们还研究了使用人膀胱平滑肌细胞和尿道细胞在生殖泌尿重建中作组织替代[34]。Lee JY等[35]报道在一尿失禁模型注射肌肉干细胞和胶原,在注射后第四周肌肉干细胞和胶原具有相似的改善LPP和逼尿肌压力的作用,但在移植后12周,胶原的作用明显减弱而肌肉干细胞的作用持续。Peyromaur M等[36]研究了正常大鼠尿道肌源性细胞移植的存活和分化,发现移植后细胞可长期存在和分化。研究表明用人的肌源性干细胞治疗妇女的压力性尿失禁,与传统的治疗方法相比较取得了良好治疗效果,但其具体的细胞移植数量和试验中存在的随机性还有待进一步研究[37]。

五、展望

脂肪干细胞研究进展 篇6

关键词：脂肪干细胞,多向分化,研究进展

长期以来, 脂肪组织被认为是惰性组织, 主要致力于能量储存与释放。近年的研究表明, 脂肪组织不仅参与内分泌和免疫调控, 还含有具备多向分化潜能的多能干细胞。2004年国际脂肪应用技术协会 (International Fat Applied Technology Society) 将此干细胞命名为脂肪来源干细胞 (Adipose-derived Stem Cell, ASC) [1], 因为来源于中胚层间充质, 也常将其称为脂肪间充质干细胞 (Adipose-derived Mesenchymal Stem Cell, AMSC) 。

目前常用的干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞。因为面临伦理、法律和政治争议, 人体胚胎干细胞一般不可用于当前的医疗实践。中胚层来源的骨髓干细胞是最早研究的成体多能干细胞, 已广泛用于组织工程, 但它来源有限, 抽取骨髓时有疼痛, 而且从骨髓组织中提取的干细胞比例非常低 (大约每105个黏附间质细胞可获得1个干细胞) ;脐带血干细胞也属于成体多能干细胞, 其分化潜能低于骨髓干细胞, 且需要长期保存;而脂肪干细胞可以从脂肪组织抽吸物中大量分离获取, 而且容易培养、生长速度快、衰老也比骨髓干细胞慢, 另外, 其致病性低、分化稳定、移植安全的特点使其成为基础和临床研究中理想的成体干细胞。

1 脂肪干细胞的分离

吸脂术产生的脂肪吸取物是自体ASC的理想来源, 从脂肪吸取物原代培养得到的细胞称为脂肪基质微管碎片细胞 (SVF) , 这种细胞不仅含有脂肪干细胞, 还包括内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞、白细胞、造血干细胞、内皮祖细胞等[2]。在细胞培养过程中, ASC通过与塑料培养皿粘附而与其它细胞分离[3], 但是成纤维细胞也会和塑料培养皿壁粘附, 所以, 一些批评意见指出, 如果存在造血干细胞污染, 那么细胞分化的来源就不是单一的。

2 脂肪干细胞的培养特性

骨髓干细胞对胎牛血清的来源和质量有严格要求, 而脂肪干细胞在添加任何批号胎牛血清的DMEM培养基中均能很好地扩增, 细胞形态成纤维状, 传代培养平均倍增时间为60小时, 并且保持稳定的倍增率直至13～15代, 其中衰老和死亡细胞的比例也很低, 这表明ASC体外扩增能力很强, 易于获得大量有分化能力的细胞。但是Rubio等人发现[4], 人类ASC连续增殖传代超过4个月后, 将出现恶变现象, 提示新提取的ASC较培养传代后的ASC更安全、更适合用于临床。

3 脂肪干细胞表面的分子标记

特异性细胞表面的分子标记有助于ASC的纯化、鉴定以及进一步研究, 但大量实验结果表明ASC细胞表面分子标记存在异质性[5], 不同研究小组报道的分子标记有差异, 这与ASC细胞纯化和培养方法不同以及分子标记检测时细胞处于不同的阶段有关。

大多数研究人员通过原代培养得到的SVF细胞是异源的细胞混合物, 其中的ASC会通过和塑料培养皿壁粘附而与其他细胞分离, 所以伴随细胞生长、传代, 造血干细胞的分子标记CD11、CD14、CD45会逐步丧失[6];而利用塑料培养皿进行ASC培养时, 一些分子标记也极易发生变化, 比如粘附分子;研究还表明ASC和骨髓干细胞有相似的分子标记[7], 一些骨髓干细胞分子标记也可以作为ASC的分子标记, 比如STRO1、CD73[8], 但是它们仍然不是特异性分子标记。不过已有实验结果表明ASC细胞是SVF细胞中的CD34+、CD31-细胞群[9]。但目前ASC细胞仍然只能通过功能实验或者后续的分化结果加以确切鉴定。

4 脂肪干细胞的多向诱导分化

多能ASC细胞可以分化为多种中胚层来源的细胞类型, 包括骨骼肌、心肌、软骨、脂肪、成骨等分化方向, 其中心肌分化的重复性和产量是最低的[10]。在软骨分化方面, ASC不如骨髓干细胞有效[11]。来源于中胚层的脂肪干细胞分化为外胚层起源的神经细胞[12]和内胚层起源的胰腺表型细胞[13]是非常令人惊奇的, 而且脂肪干细胞可能还有助于血管[14]和造血细胞的生成[7]。

ASC在不同成分的培养基中培养, 其生长和分化存在极大的差异, 比如牛血清促进细胞生长, 马血清则有助于细胞分化;转化生长因子β、纤维生长因子2增强ASC细胞增殖却对分化没有作用, 表皮生长因子被证实是抗分化因子;体外ASC向不同细胞类型分化依赖于培养基中不同的添加剂, 比如在含有地塞米松、β-甘油磷酸钠、L-谷氨酰胺和维生素C的培养基中, ASC经过3～4周培养可以产生成骨反应;添加胰岛素、地塞米松、吲哚美辛、异丁基-甲基黄嘌呤的DMEM培养液, 可诱导ASC分化为脂肪细胞, 其它分化方向的诱导条件见表1。另外, 在组织工程领域, 理想的支架有利于细胞贴附、生长和分化, 最终形成组织。比如结合于胶原微球支架的ASC可以表现出成骨与成脂方向的分化与增殖[15], 结合有硫酸软骨素的聚乙二醇水凝胶也被应用于促进ASC分化为软骨细胞[16]。

5 脂肪干细胞的应用研究

体外扩增的ASC与生物材料结合, 是实现修复较大器官组织缺损, 重建缺损部位生理功能的新途径。但是目前脂肪干细胞的应用研究多是个案报道, 临床研究也处于Ⅰ期临床的早期。以下对脂肪干细胞在不同方向的应用研究作简要阐述。

ASC在分化为脂肪细胞的同时, 还有助于血管生成, 可以明显提高脂肪移植后的长期存活率, ASC的成脂分化在面部轮廓整形、除皱等软组织重建中发挥着重要的作用。

成熟脂肪细胞及其前体细胞均表达单纯疱疹病毒的受体, 体内和体外实验证明复制缺陷的单纯疱疹病毒可以有效转染脂肪细胞, 携带的外源基因在脂肪细胞中亦能稳定表达。故以脂肪细胞为靶细胞, 复制缺陷单纯疱疹病毒介导的基因转移有可能成为基因治疗的一种方式[17]。

ASC的成骨分化, 在临床上可用于骨折和关节植骨融合的治疗。2003年首次实验证明将体外成骨分化后的大鼠ASC, 重新植入皮下, 8周后有骨骼形成[18];2004年德国Macro Pore Biosurgery公司与德国Giessen大学联合对外公布了一项使用脂肪干细胞治疗一名七岁女孩颅骨缺损的临床报告。在这项手术中, 因骨伤面积接近120 cm2, 髂嵴来源的骨数量有限, 自体脂肪组织干细胞被加入到患者髂嵴移植骨, 然后均匀地敷在颅骨缺损部位, 并固定两片可降解的Macro Pore TM保护膜, 3个月后CT分析显示新骨形成, 并且颅骨创伤区周围颅顶几近完全连续[19]。

Rodriguez等将正常人ASC移植到Duchenne型肌营养不良模型小鼠 (抗肌营养不良蛋白缺陷) 的胫骨前肌, 6个月后, 90%的胫骨前肌检测到抗肌营养不良蛋白表达, 50天时, 在相邻腓肠肌发现由胫骨前肌迁移而来的抗肌营养不良蛋白阳性肌纤维[20]。

注射ASC到裸鼠缺血的后肢, 后肢血流量和毛细血管密度明显增加[14]。这和ASC分泌血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子β[14]等血管生成因子有关, 不太可能是ASC直接分化为血管内皮细胞。有报道指出, 使用自体脂肪移植治疗20位放疗后期因慢性组织缺血导致并发症的患者, 都表现出新血管形成等进行性组织再生现象[21]。尽管机制仍不明了, 但这种方法也有可能用于治疗微血管病变。

ASC能表达、分泌巨噬细胞集落刺激因子和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等造血相关细胞因子[7]。2003年报道腹腔注射ASC可以挽救40%被辐射小鼠的生命, 虽然效果较骨髓干细胞慢, 但存活率和骨髓干细胞一样;文章分析认为, ASC促进了骨髓造血干细胞的增殖[22], 不过脂肪干细胞静脉注射会出现辐射小鼠死亡[22]的现象。

脂肪干细胞用于治疗复发性克罗恩瘘 (recurrent Crohn’s f istulae) 的Ⅰ期临床已在马德里La PazUniversityHospital进行[23], 4位患者的9处瘘管进行自体ASC接种治疗, 在每周随访的8处瘘管中, 6处瘘管 (75%) 在8周内完全治愈, 无副作用发现, 更多评价还有待于Ⅱ期临床试验的进行。

6 ASC研究需要解决的问题

尽管有报道称ASC用于人体是安全的[24], 但是, 也有研究指出植入ASC会导致机体出现免疫抑制[19], 显然这个问题需要进行大规模的临床实验加以证实。

除此之外, 以下一些问题的解决将有助于ASC在临床实践中的应用。首先, 特异性分子标记的发现可以从根本上改变ASC细胞的纯化和鉴定。其次, 要建立可靠、快速、有效的细胞分化方案。ASC脂肪分化大约需要两周时间, 成骨和软骨分化时间更长且分化的细胞数量少。改进现有分化方法可从以下方面进行:不同细胞因子和生长因子的应用、利用可靠有效的生物材料进行3-D培养、更清楚了解细胞分化相关的受体配体以及细胞外基质成分等。另外无血清细胞培养和分化方法的建立、可靠稳定的动物模型实验也是ASC临床应用需要解决的问题。