脐带间充质干细胞移植

脐带间充质干细胞移植（共7篇）

脐带间充质干细胞移植 篇1

据“中国医药报”9月24日报道, 上海市 (复旦大学附属) 公共卫生临床中心重症肝病医学监护科主任王介非教授等开展的一项最新研究证实, “脐带间充质干细胞移植法”安全、有效, 或可成为治疗肝衰竭的新方法。这是近日从上海举办的长江三角洲肝衰竭临床救治协作网论坛暨第六期危重症肝炎诊断救治新进展学习班上传来的信息。

脐带间充质干细胞是指存在于脐带中的间充质干细胞。研究发现, 这种“本领超强”的干细胞具有亚全能分化潜能, 能分化再生为心脏、肝、肾、肺、胰腺、神经、骨骼、肌肉、脂肪等多种组织细胞, 几乎涵盖了人体的所有组织细胞。为证实这些“特质”会给肝衰竭患者救治带来希望, 王介非团队应用经静脉移植脐带间充质干细胞法治疗肝衰竭大鼠模型, 发现移植后的脐带间充质干细胞使大鼠肝细胞明显出现再生功能, 肝衰竭好转。进一步实验证实, 这种移植法安全可靠有效。在多年动物实验获得成功的基础上, 王介非团队与深圳北科携手合作, 继续深入研究干细胞移植在治疗肝衰竭方面的奥秘。他们对12例放弃肝移植的肝衰竭患者通过外周静脉移植脐带间充质干细胞, 结果表明, 肝衰竭患者的疾病临床表现得到改善, 且证实外周静脉移植脐带间充质干细胞确实安全有效, 并证实脐带间充质干细胞直接参与了患者肝细胞的再生。目前该成果已发表在《中华传染病杂志》上。

脐带间充质干细胞移植 篇2

1资料与方法

1.1 一般资料

①入选条件:<60岁;所有入选患者符合对SLE风湿病学会标准11项中的至少4 项。该合格标准包括狼疮活动指标。疾病常规治疗6个月无效;病情进展, 脏器损害危及生命;移植后有可能改善生活质量;主要脏器功能可耐受移植。②排除条件:明确感染;不能控制的心律失常或心力衰竭;肺功能检查明显异常;肾脏明显缩小;肾皮质厚度<0. 8 cm;血肌酐>442μmol/L。符合条件的病例2例, 男、女各1例, 均合并狼疮性肾炎Ⅳ型, 这个协议经四平市中心医院伦理委员会批准, 获得了患者的知情同意。 ③1例有狼疮性肾炎、浆膜炎、白细胞减少、关节炎。另一例有狼疮性肾炎、浆膜炎、血小板减少。狼疮活动性评分>12分。

1.2 细胞来源

使用我院中心实验室提供的脐带间充质干细胞。

1.3 干细胞回输

输入前地塞米松5 mg静脉注射, 生理盐水开路, 接干细胞悬液, 最后用生理盐水冲管。输入过程中应反复摇匀干细胞悬液, 以免出现凝集, 堵塞管路。

1.4 疗效观察

分别在移植前和移植后1, 6, 12个月对患者临床症状和体征的变化、体液及细胞免疫功能 (CD3、CD4、CD8、CD19) 、风湿谱 (ANA) 进行跟踪随访, 定期检查血常规、尿常规、肾功能的变化。

2结果

2.1 造血和免疫重建

2例患者分别在移植后6 d及7 d复查, 白细胞最低点为3. 2×109/L, 血小板最低点为18×109/L, 淋巴细胞最低点为0. 02×109/L, 血红蛋白最低点为96 g/L、移植过程中未输注红细胞、血小板。

2.2 移植相关并发症

移植过程中未出现明显的并发症, 未出现发热、出血性膀胱炎、肝静脉闭塞综合征、巨细胞病毒感染等。

2.3 移植后临床症状变化

移植后2 d, 患者的临床症状开始缓解, 随访12个月, 没有复发, 均已分别恢复日常工作、学习。

2.4 移植前后有关实验室检查的改变

移植后6个月患者狼疮相关的抗体均逐渐转为阴性, 补体C3、C4在移植后升高, 尿蛋白逐步降低, 随访12个月时患者补体C3均升至正常, 24 h尿蛋白定量降至0.15 g以下。

2.5 移植后免疫功能的变化

经移植治疗后, 患者免疫功能逐渐升高, 尤以CD4、CD19最为显著, 见表1。

3讨论

系统性红斑狼疮是一种累及多器官、多系统, 以免疫调节异常为特征的自身免疫性疾病。确切病因并不清楚, 可能与遗传背景、环境因素、内分泌异常、免疫系统紊乱等多因素相关。目前治疗主要手段是依靠激素和免疫抑制剂等, 但只能部分控制疾病活动, 不能治愈, 尤其对部分患者效果欠佳。

间充质干细胞是一类具有显著的自我更新和多向分化的细胞, 主要存在于骨髓、脐血、脐带、全身结缔组织和器官间质[8]。脐带间充质干细胞 (umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC) 是目前临床研究和应用较多的间充质干细胞之一。它来源于脐带, 易于获取, 对产妇及新生儿均无伤害;且可在体外大量扩增, 传代稳定;其细胞活性、增殖能力及数量均能得到保证, 即质量、数量可控;不受伦理、道德及法律方面的争论与限制;相对纯净, 与干细胞输注相关的病毒和病原微生物感染率远低于骨髓移植;人脐带MSCs不表达或低表达免疫排斥相关标记, 免疫原性低, 是一类低免疫原性细胞, 不需经过严格配对使用, 适宜于不同个体之间的移植。

造血干细胞移植治疗自身免疫病的原理有两方面, 一是在预处理时, 通过大剂量化疗或全身照射摧毁患者的异常免疫系统, 对自身免疫病起缓解作用;二是移植的自体外周血干细胞重建正常的免疫系统。在免疫重建中阻断自身抗体的产生或诱导对自身抗原的免疫耐受, 后者被认为是造血干细胞移植治疗SEE并使其长期缓解的原理。

非清髓的MSCs移植 (MSCT) 治疗自身免疫性疾病的机制可能是抑制潜在的免疫干扰, 从根本上 改变免疫系统。调节性T细胞是由原始CD4T分化而来的细胞亚群。最近十年来, 关于T细胞在控制免疫活性方面进行了大量研究。最近的研究证实, 活动期SLE患者存在T细胞功能的不足, 但可以恢复。糖皮质激素治疗诱发疾病缓解。在这项研究中, 我们观察到脐带间充质干细胞能明显上调CD4的百分比。

总之, 我们提供直接的证据表明, 脐带间充质干细胞移植对于重症难治性系统性红斑狼疮具有重要影响, 至少在短期内是安全的, 有效的。进一步的临床试验需要更多患者、长时间的随访, 并与标准治疗比较, 以确定这种新型的治疗方法的疗效和安全性。

摘要：目的 脐带源 (UC) 间充质干细胞 (MSCs) 具有自我更新和分化潜能。MSCs移植 (MSCT) 在自身免疫性疾病中的应用还没有足够多的数据。这项研究的目的就是评价异体干细胞移植在严重系统性红斑狼疮患者的有效性和安全性。方法 难治性系统性红斑狼疮患者2例。对标准治疗无效或威胁生命的脏器并发症。对移植前后的狼疮活动指数 (SLEDAI) 进行评价。结果 2例患者的临床症状完全缓解, 异常免疫学指标基本恢复正常, 抗体全部阴转, 肾功能、尿常规恢复正常。结论 我们的研究结果表明, MSCT在控制系统性红斑狼疮疾病活动, 改善血清学方面有作用。这些试验为治疗严重和治疗难治性系统性红斑狼疮提供了数据。

关键词：脐带源间充质干细胞,系统性红斑狼疮

参考文献

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脐带间充质干细胞移植 篇3

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞,目前研究较多的干细胞种类包括胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞和诱导产生的多能性干细胞等。由于脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有多向分化潜能,且具有获取简便、无伦理学争议、增殖力强、来源广泛、不导致免疫排斥等优点[3],成为现在研究的热点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

对2005年1月~2008年12月于我科就诊接受干细胞治疗的99例MND患者进行分析,其中男64例(64.6%),女35例(35.4%)。年龄32~73岁,平均(52.9±9.3)岁。病程4~120个月,平均病程(26.0±19.5)个月。依据1994年世界神经病学联盟在西班牙EI Escorial会议上制定的肌萎缩侧索硬化(ALS)诊断标准[4],本组均为确诊ALS。

1.2 评分

1.2.1 ALSFRS(A)评分

ALSFRS评分包括语言、唾液分泌、吞咽、书写、切断食物和使用餐具、穿衣和卫生保健、在床上翻身和整理衣物、行走、攀登楼梯以及呼吸共十个项目,总分0~40分,分值越低,神经功能损害越严重。但是此项评分方法的缺点是对于延髓功能的评测指标太少,只有一项指标。1.2.2 Plaitaks(P)评分以及改良Plaitaks评分由于ALSFRS评分方法存在不足,因此本项课题同时又使用另一种临床评价方法——Plaitaks评分,此项评分在详细地评价四肢肌力的同时,还对延髓功能做了专门的评价。该项评分方法的满分为165分,分值越高神经功能损伤越轻,但是通过临床验证,我们发现此方法还存在着不足——缺少对躯干活动以及呼吸功能的评分,因此本课题在此基础上稍加改良,以便达到更好地对ALS运动功能进行评价的目的。改良的Plaitaks(满分204分)评分在原有评分基础上,增加了两个方面的评价:(1)在脊髓功能项中增加了对双侧的颈部屈曲、颈部伸展和耸肩的运动功能评价,每项评定采用6级分法;(2)延髓功能中增加了咀嚼运动。除了脊髓功能和延髓功能两项外,还增加了一大项——呼吸肌力量,包括吸气运动和呼气运动(正常3分,轻度损伤2分,中度损伤1分,严重损伤0分)。

1.3 干细胞治疗

1.3.1 干细胞来源

采自健康的正常孕周的剖腹产产妇的脐带,孕妇术前各项检查包括:血常规、尿常规、凝血功能、肝功能、肾功能、血糖、血脂检查结果都正常;梅毒和艾滋病抗体阴性;无甲、乙、丙型肝炎;无家族性、遗传性疾病病史。

1.3.2 脐带间充质干细胞的培养过程

具体方法:经孕妇签署书面同意书后,于剖腹产手术中取脐带约10 cm,无菌条件下分离、培养、传代。收集第4~6代的细胞,利用倒置相差显微镜和流式细胞仪进行鉴定,然后用于移植。

1.3.3 间充质干细胞应用到临床的标准

应用到临床之前,首先对干细胞进行各种检测,包括:(1)细胞形态学检测;(2)细胞表面标记检测;(3)无菌检测;(4)支原体检测;(5)内毒素检测:鲎试剂检查法结果阴性(根据2000年版细菌内毒素检查法)。1.3.4临床治疗过程术前收集干细胞并用生理盐水将其制备成2 m L细胞悬液,细胞浓度为0.5×107/m L,将其吸入1 m L注射器。常规进行腰椎穿刺,进入蛛网膜下腔后,缓慢采集2 m L脑脊液,然后将2 m L细胞悬液缓慢注入。患者去枕平卧6 h。监测患者血压、心率、血氧、呼吸24 h。1周以后重复1次,总共进行4次。

1.4 统计学方法

应用软件SPSS 11.5进行统计分析,经正态性检验,治疗前后ALSFRS评分、原始Plaitaks评分以及调整Plaitaks评分数据符合正态分布,治疗前后评分比较采用配对t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般病例资料结果

在99例确诊ALS患者中年龄最小的32岁,最大的73岁,平均(52.9±9.3)岁,且住院时的病程为4~120个月,平均病程(26.0±19.5)个月。这比国际上公布的平均发病年龄(55岁)要早。另外性别比例男64例(64.6%),女35例(35.4%),男性的发病率明显高于女性。

2.2 流式细胞学检测干细胞表面标记物

CD90+100%,CD44+99.82%,CD73+100%,CD105+99.95%,CD45,CD34,CD19,CD11b表达率小于2%。

2.3 干细胞治疗结果

99例患者在移植前以及移植后分别进行A评分,P评分以及改良的P评分,三种评分结果在应用统计分析后结果P值均<0.001(表1),说明干细胞治疗ALS是有效的,并且统计学上有显著意义。

2.4 随访结果

99例ALS移植治疗后随访半年,失访19例(19.2%),死亡10例(10.1%),症状改善25例(25.3%),病情进展45例(45.5%)。在有效随访的人群中改善率为25/80(31.3%)。随访半年~1年,患者死亡25例(25.3%),症状改善4例(4.0%),病情进展41例(41.4%)。随访1~2年,患者死亡28例(28.3%),症状改善1例(1.0%),病情进展16例(16.2%)。

3 讨论

MSC用于临床应用研究的种类主要是骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞,这两类细胞都具有MSC共同的特点即低免疫源性。与成体阶段与多种细胞共同生存的骨髓间充质干细胞相比,脐带间充质干细胞发育阶段更早,其所生长的组织环境更为单纯,因此便具有更强的增殖能力与分化能力,更低的免疫源性,更加强大的分泌因子能力,加之大量的细胞来源、方便的提取提纯以及易于体外培养等特性,是选择其为细胞来源的主要原因。

Mazzini等[5]应用骨髓来源的间充质干细胞移植治疗ALS,将培养好的干细胞悬浮于自体脑脊液中,外科暴露胸段脊髓,在平T7~9水平脊髓局部移植。分别在移植后3~6个月行MRI检查,没有发现脊髓结构改变和异常细胞增殖,且一半的患者的下肢肌力减弱的趋势渐趋缓和。而且长期观察已经证实BMSC的培养扩增和移植入人脊髓是安全的,在ALS患者可以耐受[6]。Karussis和他的同事在经过大量的临床前研究后,利用静脉或者鞘内注射MSCs治疗ALS或者多发性硬化[7],证实了两种方法治疗神经系统变性病是安全有效地。因此本课题从安全角度考虑下选择了使用腰椎穿刺蛛网膜下腔注射的方式移植干细胞,操作简单、安全、创伤小。

本课题的研究结果发现,患者接受干细胞治疗后症状明显改善,且移植前后的评分统计学上有显著差异,说明干细胞治疗ALS是有效的,通过临床观察,治疗后患者的改善主要是(1)肌肉力量的增加;(2)四肢肌张力下降;(3)肌束震颤次数明显减少;(4)言语及吞咽功能明显好转。考虑到MSCs发挥作用的机制主要是(1)神经替代作用;(2)神经营养作用;(3)激活自身干细胞。人们利用添加某种递质(如神经营养因子)或者与人类神经元共培养的方法诱导出神经样细胞,并且证明诱导的神经样细胞存在某些神经功能[8]。GDNF具有与运动神经元高亲和性的特性,能够预防神经元的死亡。Suzuk等[9]证明在大鼠身上证实了移植入肌肉的h MSCs能够在肌肉中存活,并且可以不断分泌GDNF,给予肌肉、神经肌肉接头持续的神经营养支持,从而减少ALS大鼠脊髓运动神经元的丢失,改善生存以及神经功能。接受干细胞移植的部分ALS患者最短在移植后4 h即有明显的神经功能恢复,有研究证实ALS患者在运动神经元以及神经胶质细胞受损之前,伴随神经肌肉接头受损同时,有60%前根受损[10]。因此考虑干细胞如此早的发挥神经修复作用可能与干细胞分泌神经营养物质有关。

在治疗结束后的半年随访结果:失访19.2%,死亡10.1%,症状改善25.3%,病情进展45.5%,在有效随访的人群中改善率为25/80(31.25%)。可以看出大部分患者症状出现反复,病情复又进展。这说明干细胞治疗ALS在短期内确实有效,但是长期疗效还有待进一步探讨,从随访情况来看有效期维持在3~6个月,大部分患者在干细胞治疗半年后又开始出现恶化趋势。这是否从临床方面说明了干细胞发挥作用的机制是神经营养或者免疫调节呢,亦或是干细胞在体内的生存期大概在半年左右呢,还需要进一步的实验证实。

从安全角度来看,所有的患者住院20余天期间没有发现任何不适症状。随访中发现大部分的死亡患者死因为呼吸衰竭,其次为饮食导致的窒息。没有发现任何因为免疫排斥或者肿瘤导致的死亡。说明了干细胞移植治疗ALS是安全的。

参考文献

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脐带间充质干细胞移植 篇4

1 材料与方法

1.1 一般材料

①本组实验研究的30例SD大鼠均由南通大学动物中心提供, 所有大鼠周龄为16周, 体质量178~228 g, 雌雄数量相同。②脐带标本均来自健康产妇足月分娩的健康新生儿的脐带 (由南通大学附属医院的妇产科提供) , 该项取样均告知新生儿家属并取得同意。③培养瓶及培养板均采购于Corning公司 (美国) , 胎牛血清、低糖达氏修正、脂肪诱导以及成骨诱导等培养基均购自Gibco公司 (美国) , 其他试剂均为国产。

1.2 方法

1.2.1 UC-MSCs的分离与培养

将DMEM培养液中浸泡的脐带标本在超净台上取出, 用PBS完全冲洗干净后剪成几小段 (1~2 mm3) , 在37℃下用0.075%的胶原酶Ⅱ配合0.125%胰酶分别消化30 min。待脐带血分解后进行过滤、离心处理, 然后用PBS连续冲洗2次, 将离心后的单个核细胞 (以1.0×106个/cm2分布) 接种于DMEM的培养液中 (低糖) 。细胞自行生长到80%用胰蛋白酶 (0.25%的EDTA混合液) 消化, 使细胞培养能够传代接种, 原代培养记为P0, 传代的第1代、第2代依次类推。

1.2.2 创面治疗方法

首先应用生理盐水对所有SD大鼠的烧伤创面清洗3次, 注射麻醉药物, 沿着大鼠背部两侧的烧伤创面皮肤至深处的肌筋膜切除全层皮肤, 积极采取止血措施。止血后, 观察组滴入1 m L的UC-MSCs悬液 (1×106个) , 完全覆盖创面, 应用两层纱布和透气胶带包扎创面 (底层用无菌的凡士林纱布, 上层再加用普通纱布) 。4 h后拆除包扎, 重新覆盖一层无菌纱布并持续滴入UC-MSCs上清液。对照组大鼠滴入PRMI 1640培养液于创面, 步骤同观察组同步。

1.3 统计学方法

选用SPSS 11.0软件对数据进行处理, 计量资料用±s表示, 并用t进行检验, P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 创面愈合时间

两组大鼠经治疗后, 皮肤创面的面积均有所缩小, 未发现感染症状, 观察组大鼠的创面愈合时间明显短于对照组 (P<0.05) , 见表1。

2.2 创面愈合率

观察组大鼠术后创面愈合率明显高于对照组 (P<0.05) , 见表2。

3 讨论

Petrova ES等[2]通过体外培养在骨髓中分离出多种间质分化细胞 (MSCs) , 提示MSCs可长期传代培养、迅速体外扩增、易纯化等特点。MSCs是一类来源于机体发育早期的中胚层多能干细胞, 广泛存在于全身或局部的多处器官组织中, 比如胰腺、骨髓、胚胎前体组织以及脐带血, 具有以下特点:①免疫调控功能:不会表达协同的刺激分子, 体外可抑制混合淋巴细胞的活性反应, 体内可诱导免疫细胞的耐受力。②多向分化潜能:在一定的诱导条件下, 可分化成骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经、心肌、肝、内皮以及韧带等多种组织细胞, 经长期连续传代培养液培养及冷冻, 多向分化潜能仍然存在。③促进植入与支持造血功能:可分泌多种细胞因子和细胞外基质直接作用于细胞, 达到调控造血, 促进造血干细胞生长[3]。基于MSCs的特点, 近年来已被逐渐应用于移植物抗宿主病、遗传性骨病、骨髓移植等疾病治疗中, 提示MSCs具有很多的组织器官修复功能。

脐带的取材容易、成本低, 且UC-MSCs最接近胚胎干细胞, 抗原性最低, 本研究结果显示UC-MSCs大鼠的创面愈合时间和愈合率明显提高, 提示UC-MSCs可作为皮肤组织的新选择。

摘要：目的 探究脐带间充质干细胞促进创面愈合的实验价值, 为临床应用提供重要参考依据。方法 选取30例重度烧伤的大鼠为实验对象, 随机分为观察组 (从正常足月的新生儿脐带中分离培养脐带间充质干细胞 (UC-MSCs) 进行移植) 和对照组 (滴入PRMI 1640培养液) , 对比观察两组大鼠的创面愈合情况。结果 观察组大鼠的创面愈合时间明显短于对照组 (P<0.05) , 且观察组大鼠术后创面愈合率明显高于对照组 (P<0.05) 。结论 纯化的UC-MSCs应用于创面移植, 可有效促进创面新愈细胞的修复与重建, 缩短创面愈合时间, 提高创面愈合率, 改善创面的愈合效果。

关键词：脐带间充质干细胞,严重烧伤,创面愈合

参考文献

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脐带间充质干细胞移植 篇5

实验使用UCB-Ms Cs移植治疗帕金森病患者,观察UCB-Ms Cs移植改善帕金森病患者神经功能的效果及中脑黑质磁共振波谱变化。

1 资料与方法

1.1 对象选择

2011年1月至12月枣庄市妇幼保健院细胞中心与华北油田总院收治的帕金森病患者30例,均经过英国皇家医师学会帕金森病诊断与管理指南的帕金森病UK脑库诊断标准确诊,男16例,女14例,年龄45-66岁,平均年龄56岁,Hoehn-Yahr分级为Ⅱ~Ⅳ级。按2005年国务院《医院管理条例》第33条规定对患者的治疗及风险进行如实告知[3],患者签署治疗知情同意书,治疗方案经过医院医学伦理委员会批准。

干细胞移植适应证:原发性帕金森病,Hoehn-Yahr分级在Ⅱ~Ⅳ级,排除其他系统重大疾病。干细胞移植相对禁忌证:(1)有高度过敏体质者;(2)合并肿瘤者;(3)凝血功能障碍者,如血友病;(4)血清学检查阳性者,如艾滋病、乙型肝炎、梅毒等;(5)有严重精神障碍者。

1.2 方法

按患者意愿,30例帕金森病患者分为细胞移植组、对照组,15例/组,两组患者在性别、年龄、UPDRS运动部分评分、日常生活能力评分方面均无显著性差异(P>0.05)。

临床检查:所有患者均住院治疗,第1周进行常规检查,30例患者常规检查(血、尿、便常规、肝肾功能、腹部B超,肿瘤全项标记物、胸片、心电图)均正常;4例患者血糖略高,经饮食控制及口服二甲双胍治疗后血糖控制良好;7例患者血脂异常,主要为胆固醇升高,给予瑞舒伐他汀钙降脂治疗后血脂控制正常。

治疗组患者采用复方左旋多巴制剂进行药物治疗,根据患者反应适当调整用药剂量。细胞移植组在其基础上给予UCB-Ms Cs移植。移植前及移植后12周分别行中脑黑质磁共振破谱分析。

脐带间充质干细胞的分离培养:UCB-Ms Cs由青岛奥克生物开发有限公司提供,经脐血采集、分离、扩增2~3代后,细胞数量为1×109/L。UCB-Ms Cs移植患者自第2周起应用UCB-Ms Cs进行鞘内注射移植治疗,1次/周,4次为1个疗程,共治疗1个疗程。患者取左侧卧位,屈髋屈膝,屈颈双手抱膝,选取第3、4腰椎间隙为穿刺点,常规消毒后铺无菌洞巾,以2%利多卡因局部浸润麻醉,以9号穿刺针垂直刺入蛛网膜下腔,待有无色清亮脑脊液流出后首先缓慢注入地塞米松2mg,然后在10min内缓慢注入脐带间充质干细胞注射液5m L(干细胞数目1000万),观察患者无不适症状后拔出穿刺针,穿刺点敷以无菌敷料,治疗结束后嘱患者去枕平卧6h。

磁共振MRS检查方法检查采用Philips Achieva 3.0T磁共振成像系统,常规进行轴位、矢状位、冠状位TSE T1WI和轴位TSE T2WI扫描,1H-MRS采用T1WI轴位定位于帕金森患肢(或症状重侧)对侧中脑黑质层面,选取正方体感兴趣区(Vo I)(图l、2),体素大小为10mm×10mm×10mm,并在轴位、矢状位和冠状位上观察,使所选择的VOI尽量避开侧脑室及脑沟池内的脑脊液。选择点解析波谱序列(PRESs)采集波谱,所测定的代谢产物主要包括NAA、Cr、Cho。用配套软件测量各峰下面积并分别计算NA/Cr、Cho/Cr和NAA/Cho的比值。

辅助治疗:常规给予改善循环、抗自由基、营养神经等治疗。分别在移植前、移植后1个月和移植后3个月,采用帕金森统一评分量表(UPDRS)进行评分,其中主要指标为UPDRSⅡ日常生活活动能力总评分和UPDRSⅢ运动检查总评分及其相对基线的变化,移植组中脑黑质磁共振波谱分析。次要指标为UPDRSⅠ精神、行为和情感及UPDRSIV治疗及并发症总评分相对基线的变化。治疗效果评定[4]采用(治疗前UPDRS总分-治疗后UPDRS总分)/治疗前UPDRS总分×100%。结果>30%为显效。5%~30%为有效,<5%为无效。

1.3 统计学分析

由第一作者采用采用SPSS 13.0软件.计量资料以均值±标准差表示,动态分布的多组计量资料采用方差分析,组间比较采用t检验;计数资料采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

移植前后治疗效果的比较:通过对收集的数据进行统计学分析,移植组UPDRS总分和UPDRSⅢ评分均值在4周,12周均显著低于治疗组(P<0.01),移植组UPDRSⅡ评分均值在4周,12周低于治疗组且有统计学意义(P<0.05),见表1,见表2;治疗后两组总有效率均为为100%。移植组总显效率为80%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),见表3。移植前后磁共振波谱比较:移植组患者移植后其症状对侧黑质NAA/Cr,NAA/Cho较移植前的相应比值均值明显下降,两组差异有显著意义(P<0.05),但移植组移植后其症状对侧黑质Cho/Cr较移植前相应代谢比值均值无明显差异(P>0.05),见表4。并发症和不良反应:移植组有2例患者出现移植后低热,体温不超过38.0℃,伴有头痛或腰痛等不良反应,对症处理后均完全缓解。15例患者均未出现移植物抗宿主病。所有不良反应经对症治疗均好转。治疗组出现的不良反应有头晕4例、恶心2例、呕吐4例和异动增加2例,移植组无上述不良反应,经比较上述不良反应有统计学意义。所有不良反应经对症治疗均好转。

3 讨论

帕金森病的主要病理学改变是由于中脑黑质细胞变性而导致多巴胺合成减少,左旋多巴类药物是临床上最常用且最为有效的药物,但随着用药量和病情的进展会逐渐产生运动波动、晨僵、少动、开关现象和异动症等不良反应[5]。核团毁损术PD对于中晚期PD患者具有较好的疗效,但是长期疗效相对较差。脑深部电刺激(DBS)手术疗效确切,但DBS的不仅价格高昂,同时手术本身也存在着风险,这限制了其临床管饭使用。无论是内科治疗还是外科治疗,都只是缓解症状的对症治疗,并不能阻止和逆转DA能神经元的变性。

干细胞替代PD患者黑质内缺失的多巴胺能神经元是治疗PD的关键。UCB-Ms Cs移植治疗后,能促使神经元突触延伸至损伤位点。对残余的神经轴索起到保护作用,并刺激内生的神经前体细胞产生,说明其具有神经保护和促神经重建功能[6]。MRS是测定人体内化学物的一种非损伤性技术,其基本原理是利用磁共振现象和化学位移作用对一系列特定原子核及化合物进行分析。MRS可测定多种代谢产物,如NAA、Cr、Cho。NAA主要存在于神经元及其前体细胞,是被公认的神经元标志[7,8],其含量可以反映神经元的功能状态。Cr和Cho同时存在于神经元和神经胶质细胞中,但它们在神经胶质细胞中的浓度远高于在神经元中,故Cr和Cho峰值升高提示胶质增生[9]。Cho是细胞膜磷脂代谢成分之一,反映细胞膜的代谢;Cr波峰值总是非常稳定的,常用来作参照值。移植后患NAA/Cr,NAA/Cho较移植前升高提示神经元再生。

UCB-Ms Cs是一种具有未分化细胞的特性,能高效率的自我更新,并且有着向多种成熟细胞分化潜能的成体干细胞。间充质干细胞移植治疗必须具备:(1)取材方便,脐带在各大医疗机构均容易获得。(2)在特定培养条件下,细胞增殖能力强,可大量扩增,扩增后的子代干细胞数量过亿。(3)能分化成足够数量体细胞,包括黑质多巴胺能神经元细胞,并具有分泌,调节等功能,多巴胺能神经元能够释放多巴胺。(4)安全可靠,没有肿瘤形成证据,或分化的神经元细胞进一步破坏黑质-纹状体通路。(5)无免疫源性,所以不需要长期使用免疫抑制剂。UCB-Ms Cs细胞移植治疗,能有效的改善帕金森患者的临床表现。目前认为间充质干细胞治疗帕金森病的机制可能有:(1)间充质干细胞移植入脑后,能分化成表达特定神经标志性蛋白的神经元样细胞或星形胶质细胞,如多巴胺能神经元细胞等,产生多巴胺能神经元细胞可在受损部位或周围存活[10]。(2)间充质干细胞在中枢神经系统的微环境下通过分泌脑源性神经营养因子、碱性成纤维生长因子,或者刺激损伤部位产生内源性因子来促进损伤组织的修复并减少细胞凋亡[11]。(3)间充质干细胞可分化成血管内皮细胞和细胞外基质,促进受损部位新生血管的发生,改善局部血液循环[12]。(4)脑内本身就是适宜干细胞扩增、分化的微环境,间充质干细胞分化为神经细胞后,能替代受损的细胞并重建神经功能区和传导通路[13]。关于UCB-Ms Cs治疗帕金森病能否保持长期疗效,因本课题观察时间较短,还有待进一步观察。

摘要：目的 观察脐带间充质干细胞移植对帕金森病神经元细胞的修复与重建。方法 选择2011年1月至12月枣庄市妇幼保健院与华北油田总院收治的帕金森病患者30例,均经过英国皇家医师学会帕金森病诊断与管理指南的帕金森病诊断标准确诊,男16例,女14例,年龄4566岁,平均年龄56岁,Hoehn-Yahr分级为ⅡⅣ级。按患者意愿,30例帕金森病患者分为细胞移植组、对照组,15例/组,两组患者在性别、年龄、UPDRS评分运动部分、日常生活能力评分方面比较均无显著性差异(P>0.05)。所有患者均住院治疗,第1周行常规检查,自第2周起移植组患者应用脐带间充质干细胞进行鞘内注射移植治疗,1次/周,4次为1个疗程,共治疗1个疗程。治疗组患者采用常规复方左旋多巴制剂进行药物治疗。采用帕金森病统一评分量表对患者治疗前后神经功能进行评定,分值越高表示神经功能缺损越严重。移植组细胞移植前及移植后4周,12周分别行中脑黑质磁共振破谱分析。用配套软件测量各峰下面积并分别计算NA/Cr、Cho/Cr和NAA/Cho的比值。比值越高提示神经元修复越好。结果 移植组UPDRS总分和UPDRSⅢ评分均值显著低于治疗组(P<0.01),UPDRSⅡ评分均值低于治疗组且有统计学意义(P<0.05)。移植组患者移植后其症状对侧黑质NAA/Cr,NAA/Cho较移植前的相应比值均值明显下降,两组差异有显著意义(P<0.05)。结论 脐血间充质干细胞移植对多巴胺能神经元有修复与再生作用,可以一定程度地改善帕金森病患者的临床症状。

脐带间充质干细胞移植 篇6

关键词：脐带,间充质干细胞,生物学性状

间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞，具有高增殖、多分化潜能的特性，可被广泛应用于多系统疾病的治疗[1]。研究发现，MSC在人胎儿和出生后的骨膜、脂肪、羊水、真皮、牙、胎肺、胎肝和脐血中广泛存在。但是，胎儿的应用受到道德伦理和传统观念的限制;脐血含有MSCs，但传代培养困难，不易大量获得[2];骨髓源MSC细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，病毒感染率较高。因此，寻找新的MSC来源成为国内外研究的热点。通过实践探索，本实验室成功地从健康胎儿脐带中分离扩增到脐带源间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cell,hUC MSC)并研究其形态及生长特性，可作为MSC的重要替代源[3]。

1 材料和方法

1.1 材料

二氧化碳培养箱(日本SANYO)，细胞培养瓶(美国CORNING)，倒置显微镜(日本Olympus);胎牛血清(Hyclone公司);牛血清白蛋白(Sigma公司)，α-MEM培养基(Hyclone公司)，胰蛋白酶(GIBCO公司)，FITC标记的CD44和CD90(购自CHEMICON公司)。

1.2 方法

1.2.1 hUC MSC的分离与培养

无菌取足月剖宫产健康胎儿脐带，采集后6 h内处理。用加双抗的PBS洗涤至无血迹变白。剪成4 cm左右小段，纵向剖开，去除血管后剪成小片。将几片脐带组织放在直径3.5 cm的小培养皿里剪碎成泥状后转入50 m L离心管中，加PBS,1 200 r/min,10 min，洗涤3遍。洗涤完毕将沉淀用少量培养基浸润混匀后，种到直径10 cm的培养皿中于5%二氧化碳培养箱内培养。48h首次换液，培养第5天、第8天和第11天再换液，第10天可看到有细胞从组织块边缘爬出，到第13天细胞长满皿底，此时用PBS冲掉组织块，5 m L0.25%胰酶消化贴壁细胞，进行传代，种到培养瓶内于5%二氧化碳培养箱继续培养，此时记为P1代。传代培养过程中二三天换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满整个培养孔的底面，再用胰酶消化1∶3传代培养记为P2代，以后以此类推。倒置光学显微镜下观察细胞形态及生长情况，并适时照相。

1.2.2 hUC MSC生长曲线的测定

取生长良好的P1、P5和P10细胞，用0.25%胰酶(含1 mmol ED-TA)消化，以2×107/L接种于24孔板，每天各取3孔消化计数细胞，取平均值，连续培养6 d。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制生长曲线。

1.2.3 hUC MSC表面标志的测定

取生长良好的P5细胞，用0.25%胰酶(含1 mmol EDTA)消化，以5×107/L接种于预先放置盖片的6孔板中，待细胞贴壁3 d后进行免疫荧光染色鉴定(CD44和CD90并设同型对照)。于6孔板中加入4%的多聚甲醛固定细胞10 min，吸去固定液，PBS洗涤3次，37℃烤箱烤片至干。加入牛血清封闭液，将玻片放入湿盒中，37℃孵育1 h。吸去封闭液，加入稀释好的荧光标记，37℃孵育1 h。吸去抗体，PBS洗3遍，封片剂封片，荧光显微镜下观察。

1.2.4 hUC MSC的冻存及复苏

收集生长良好的细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 m L)计数细胞浓度及冻前存活率。将细胞加入到含10%DMSO和30%血清的新鲜培养基中用无菌塑料冷冻保存管(Corning)放入到程序降温盒中，于-70℃24 h后转入液氮保存。30 d后，复苏细胞，用台盼蓝染色检测细胞活性，于37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养，每日倒置光学显微镜下观察细胞生长状况(细胞生长状态及数量)。

2 结果

2.1 倒置显微镜下观察细胞形态

原代脐带组织贴壁7 d后可见少数细胞从组织边缘爬出，第10天已有较多细胞爬出并倍增，见图1。第13天可爬满皿底。传代后细胞呈放射状均匀分布生长，见图2。

2.2 生长曲线分析

传代的细胞生长较原代要快，一般4、5 d左右能达到90%以上融合。传代培养20代内细胞无老化征象。通过对第1、5和10代细胞的生长曲线观察，发现3代细胞具有以下共同特征:传代培养的潜伏期约为24 h，对数增殖期约为2～4 d，对数增殖期后第4、5天进入平台期，见图3。

2.3 细胞表面标志检测结果

免疫荧光染色后细胞膜着色明显，CD44和CD90阳性率均大于90%，见图4、5。

2.4 细胞冻存及复苏生长特性分析

台盼蓝计数细胞存活率90%以上，增殖能力强，和未冻存过的传代细胞具有同样的生长特性。

3 讨论

脐带间充质干细胞移植 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

将2011年8月-2012年8月辽宁医学院附属第一医院神经外科就诊的35例脑卒中后遗症患者随机分为移植组和对照组,移植组20例患者,移植组男性17例,女性3例,年龄16～48岁,平均为(29.50±9.43)岁;对照组男性11例,女性4例,年龄18～50岁,平均(30.93±16.93)岁。两组患者平均年龄和性别构成的差异不具有统计学意义(P>0.05),提示一般情况均衡。病例入选标准:(1)年龄<80岁;(2)无意识障碍、颅内感染、高敏体质;(3)病程1年以上;(4)患者及家属同意,并经伦理委员会批准;(5)无心、肝、肾和其他脏器严重的功能伤害;(6)不伴有癫痫。

1.2 方法

1.2.1 骨髓间充质干细胞的制备

术前签署抽取骨髓同意书,排除异常后抽取骨髓20 mL与肝素2 mL混匀后立即送无菌细胞室,严格无菌条件下进行BM-MSCs培养。采用密度梯度离心法,结合贴壁筛选法分离BM-MSCs:用含10%胎牛血清的DMEM重悬细胞,接种于75 cm2培养瓶中,在37℃、5%CO2培养箱中培养,多次换液可达到分离纯化的目的。待贴壁细胞铺满瓶底85%时,用2.5%的胰蛋白酶消化,按1:3进行传代、纯化,流式细胞仪鉴定BM-MSC备用。

1.2.2 移植方式

常规检查排除手术禁忌证后,选取皮下静脉穿刺,将100m L干细胞混悬液缓慢滴入静脉。每隔5-7天移植1次,连续行3次。

1.3 疗效评定

移植组患者于干细胞移植前和移植后的3个月接受运动功能评定(Fugl-Meyer Assessment,FMA)。对照组患者于第一次门诊时和3个月后接受FMA。所有的评定由同一名有资质的康复师完成。为避免其他因素干扰神经功能评定,要求两组患者在3个月内均不得服用影响神经功能评定的药物或接受手术治疗。

1.4 统计学方法

采用SPSS16.0软件进行统计分析,计量资料以表示,两时间点自身前后对照数据比较采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1.1两组患者FMA基线评分信息

干细胞移植组和对照组上肢运动功能基线评分分别为(16.60±11.70)和(15.80±10.97),下肢运动功能基线评分分别为(12.75±6.25)和(13.60±9.31),感觉功能基线评分分别为(15.75±7.25)和(13.33±9.73),平衡功能基线评分分别为(5.40±3.19)和(5.13±3.78),两组总分基线评分分别为(50.50±21.80)和(47.87±28.12)。两组患者入组时五项基线评分差异不具有统计学意义(P>0.05)(见表1)。

2.1.2干细胞移植组患者3个月前后FMA评分比较

干细胞移植组患者移植前后3个月上肢运动功能FMA评分分别为(16.60±11.70)和(19.15±12.42);下肢运动功能评分分别为(12.75±6.25)和(13.90±6.52);感觉功能评分分别为(15.75±7.25)和(16.55±7.35),平衡功能评分分别为(5.40±3.19)和(6.50±3.12),总分分别为(50.50±21.80)和(56.10±23.10)。统计学分析结果:该组患者术后3个月下肢运动、感觉功能评分均较移植前显著改善(P<0.05);而上肢运动功能、平衡功能及FMA总分与移植前改善十分显著(P<0.001)(见表2)。

2.1.3对照组患者3个月前后FMA评分比较

对照组基线和观察3个月后上肢运动功能FMA评分分别为(15.80±10.97)和(16.00±10.87);下肢运动功能及感觉功能3个月前、后评分无任何变化;平衡功能3个月前后评分分别为(5.13±3.78)和(5.26±3.77),观察3个月前后FMA总分分别为(47.87±28.12)和(48.20±28.12)。统计学分析表明,对照组患者经3个月自然观察,前后对比评分在上肢运动、下肢运动、感觉功能、平衡功能各项功能评分及总分均不具有统计学差异(P>0.05),其中下肢运动功能及感觉功能评分3个月前后完全无变化(见表3)。

2.2 干细胞移植组患者治疗及随访期间不良反应

在治疗期间,移植组有2例患者术后24 h内出现发热,体温<38℃。48 h内症状缓解和消失。除此之外,在治疗及随访期间未见发生其他不良反应。

3 讨论

脑卒中后的运动功能障碍是常见的脑血管意外后遗症,目前大量的基础实验及临床治疗证明骨髓间充质干细胞在神经功能修复方面具有非常大的潜力。目前骨髓间充质干细胞在神经修复方面的作用机制主要有以下几个观点:(1)骨髓间充质干细胞分化并替代受损细胞,国外人员通过动物实验发现骨髓间充质干细胞可以分化为类神经细胞及类神经胶质细胞[2,3],从而替代受损的神经细胞及胶质细胞发挥作用。(2)骨髓间充质干细胞可以通过激活内源性修复途径修复受损的神经系统。一些实验研究表明骨髓间充质干细胞能能够增加缺血损伤组织的BDNF及NGF的表达,从而减少细胞凋亡,促进内源性细胞的增值[4,5]。(3)骨髓间充质干细胞可以促进卒中后受损区域的血管再生。LIU等[5]发现骨髓间充质干细胞可以减少损伤面积,诱导血管再生从而改善神经功能。(4)骨髓间充质干细胞可以促进血脑屏障的修复。BORLONGAND等[6,7]通过设立对照组发现,骨髓间充质干细胞对恢复卒中后脑血流量及血脑屏障的重建有肯定效果。

本研究采用骨髓间充质干细胞对35例脑卒中后遗症患者进行移植治疗,手术方式为静脉注射手术。疗效评定采用运动功能评定(Fugl-Meyer Assessment,FMA),分别从肢体运动、感觉、平衡功能等方面进行评价。两组患者在两种评定方法评定前基线评分均衡,提示两组具有可比性。研究结果显示:FMA评价,对照组患者经3个月观察,其上肢运动、下肢运动、感觉、平衡等功能未见明显改善,尤其下肢功能和感觉功能无任何改善,干细胞移植组患者移植3个月后其上肢、下肢、感觉、平衡功能均较前改善,其中上肢运动、平衡功能改善尤其显著(P<0.001)。下一步研究将继续扩大样本量,增加评价方法,如FIM评分,神经电生理检查等评价方法进行专项的研究。

此项研究充分证实骨髓间充质干细胞移植对脑卒中后遗症患者临床治疗的有效性。为脑卒中后的神经功能修复提供了一条新的途径。

参考文献

[1]魏岗之.应重视脑卒中的综合治疗[J].中华神经科杂志,2002,35(5):257-258.

[2]Sanchez-Ramos J,Song S,Cardozo-Pelaez F,et al.Adult bonemarrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro[J].ExpNeurol,2000,164(2):247-256.

[3]Bahat-Stroomza M,Barhum Y,Levy YS,et al.Induction of adulthuman bone marrow mesenchymal stromal cells into functionalastrocyte-like cells:potential for restorative treatment in Parkinson'sdisease[J].J MolNeurosci,2009,39(1-2):199-210.

[4]Zhang J,Li Y,Chen J,et al.Expression of insulin-like growth factor1 and receptor in ischemic rats treated with human marrow stromalcells[J].Brain Res,2004,1030(1):19-27.

[5]Liu H,Honmou O,Harada K,et al.Neuroprotection by PIGFgenemodified human mesenchymal stem cells after cerebralischaemia[J].Brain,2006,129(10):2734-2745.

[6]Borlongan CV,Lind JG,Dillon-Carter O,et al.Intracerebralxenografts of mouse bone marrow cells in adult rats facilitaterestoration of cerebral blood flow and blood-brain barrier[J].Brain Res,2004,1009(1-2):26-33.