细胞移植

细胞移植（精选12篇）

细胞移植 篇1

上世纪90年代初, 法国医生Touraine 等首次成功地进行了人类宫内胎肝造血干细胞移植。宫内移植造血干细胞 (in utero hematopoietic stem cell transplantation, IUHCT) 为产前治疗一些先天性血液系统疾病提供了新的治疗方案, 引起广泛关注。近年来, 虽然在动物实验中取得了一定的成绩, 但迄今为止, 应用到临床, 宫内移植成功的例数不多, 尚有很多问题亟待解决。

1 IUHCT的优势

造血干细胞移植 (hematopoietic stem cell transplantation, HSCT) 是很多血液系统疾病的主要治疗方法, 但存在缺乏配型合适的供体、常规治疗方案病死率高和需要免疫抑制治疗等问题。理论上, IUHCT较HSCT存在以下优势:①早期胎儿免疫系统不成熟, 能对外源性抗原产生耐受, 故移植前无须HLA配型相合和免疫抑制处理。②在胚胎期, 胎儿造血部位要经过从髓外到髓内的迁移过程, 从肝脏造血到骨髓造血的过渡期, 骨髓造血空间无论从位点上还是细胞数上都呈指数扩增, 造血干细胞易植入形成嵌合体。③胎儿个体小, 在妊娠12周, 胎儿体重<35 g, 所需的造血干细胞相对少, 移植的细胞量相对较高, 易于移植成功。④子宫是造血干细胞移植最理想的“隔离室”, 子宫的特殊环境降低了病原体感染的可能性。⑤宫内移植可及时阻断病情发展, 减少器官损害, 避免出生后HSCT带来的严重并发症。

2 IUHCT存在的问题

随着近年来动物研究的深入, 且临床上对多种不同先天性血液系统疾病应用IUHCT进行了初步研究, 越来越多的资料提示IUHCT的优势并没有理论推测那么明显, 宿主造血空间的容受性、造血细胞的竞争压力和免疫屏障等均在一定程度上阻碍了供者细胞有效、长期的植入。

2.1 宿主造血空间的容受性

虽然胎儿从肝脏造血到骨髓造血的过程中造血位点不断扩增, 但这些不断形成的位点立即迅速被大量宿主细胞抢占。IUHCT 20×106骨髓细胞比生后骨髓抑制后移植40×106同种骨髓细胞长期植入率低 (植入率IUHCT 6%～8%, HSCT 11%) , 这意味着胎儿期每公斤体重将需要比生后多50倍的细胞量。另有研究采用IUHCT鼠模型评估当仅有胎儿肝脏为造血位点时供者细胞的植入率。结果显示胎儿肝脏中骨髓总的植入率<5%, 经静脉注射高度富集的造血干细胞的植入率仅为0.43%。上述资料显示, 胎儿期宿主造血空间的容受性较生后并没有很大的优势。

2.2 宿主造血细胞的竞争压力

与生后骨髓造血的宿主不同, 胎儿宿主在IUHCT后仍保持旺盛的造血空间。因此, IUHCT的成功依赖于供者造血干细胞能否有效地与宿主造血干细胞竞争, 获得有意义的表达。如果供者细胞具有竞争优势, 即使植入相对少量的细胞, 也能在宿主骨髓中重组。相反, 如果宿主细胞有增生优势, 供者细胞则很难植入、扩增。供者细胞植入水平的高低受宿主细胞竞争力的限制。与成人组织比较, 胎儿肝脏和脐血增生和竞争能力较强。

2.3 宿主的免疫屏障

既往认为胎儿存在免疫耐受, 这是IUHCT较生后HSCT最大的优势。这种耐受机制主要在T淋巴细胞受体转基因鼠研究中认识的。在正常小鼠或其他动物中, 淋巴细胞成熟机制不尽相同。近年来越来越多的研究表明胎儿存在免疫屏障。早孕期胎儿肝脏携带自然杀伤细胞和T淋巴细胞, 能通过T淋巴细胞受体重组, 在体外引起对抗MHC的免疫反应。此外, 母体可能在胎儿屏障中起一定作用。母体如果对供者细胞致敏, 母体的自身抗体将诱发T细胞介导的新生儿自身免疫性疾病。如果对胎儿进行免疫抑制, 则IUHCT后嵌合体的形成将增加4～5倍, 这同样说明存在胎儿免疫屏障。如果供者细胞不能战胜胎儿适应性免疫屏障, 将不能植入或嵌合体无法形成。

3 IUHCT的临床应用

在过去的20余年, 很多学者尝试将IUHCT应用于人类多种疾病。其临床应用主要集中在两方面:①通过IUHCT得到治疗水平的高植入率, 直接治疗先天性疾病。②通过IUHCT, 形成低水平的造血嵌合体, 诱导供者特异性免疫耐受。

3.1 IUHCT直接治疗先天性疾病

目前认为, IUHCT最合适的移植时间为妊娠11～14周。因为这一时期胎儿肝脏造血活跃, 胸腺有选择作用。同时, 胎儿非常小, 体重<35 g, 同样量的供者细胞在这一时期占宿主细胞比例大。IUHCT的适应证为:①X连锁严重免疫缺陷病、细胞因子受体信号通路突变所致的严重免疫缺陷病等。此类疾病是IUHCT的最佳适应证, 也是目前仅有的应用较成功的病种。因为在这些病例中, 供者细胞有明显的竞争优势。已有超过10余例IUHCT成功治疗X连锁严重联合免疫缺陷病的报道。功能T淋巴细胞能在宿主体内重建, 但仅有T细胞的植入与免疫抑制的出生后与HSCT相当。由于发病率低, 无法将IUHCT和生后HSCT进行随机对照研究, 没有证据表明产前治疗较新生儿期移植更好。②腺苷脱氨酶严重免疫缺陷病、范可尼贫血和布卢姆综合征等。IUHCT治疗这类疾病时可形成体细胞嵌合和体内选择, 低水平的植入就可以替代宿主造血, 但不能治疗除造血障碍外的其他临床表现。③慢性肉芽肿、高IgM综合征和白细胞黏附缺陷等。治疗该类疾病时, 只要低水平的嵌合体即能有治疗效果, 如只要有5%的正常中性粒细胞, 慢性肉芽肿就可以被纠正。但目前报道的病例多以检测不到供者细胞植入宣告失败。④骨代谢病如骨硬化病、成骨不全等。IUHCT后, 尽管在骨硬化症小鼠模型中检测到大量无效的宿主破骨细胞, 但供者破骨细胞的注入可完全逆转临床表现。IUHCT还用于治疗血红蛋白病如β地中海贫血、α地中海贫血、镰状细胞贫血等, 大多数以失败告终。有7篇报道采用IUHCT治疗代谢沉积性疾病, 仅有2例检测到供者细胞植入, 其中1例临床症状没有改善, 另1例可能因为移植物抗宿主反应导致宫内死胎。

3.2 IUHCT诱导供者特异性免疫耐受

由于治疗水平的植入率要求较高, 在免疫功能正常的胎儿较难实现, 故学者们尝试采用IUHCT诱导供者特异性免疫耐受, 这仅需很低水平的造血嵌合体形成就能实现, 为生后移植解决配型困难的问题, 同时拓宽IUHCT临床应用范围。在不同种属诱导供者特异性免疫耐受的嵌合体水平不同, 平均为1%～2%。在小鼠模型中, <0.5%的微嵌合体可诱导1/3小鼠产生对供者皮肤移植的免疫耐受和对混合淋巴细胞试验无反应。胎儿期形成免疫耐受后, 出生后可通过无毒性途径如低剂量全身照射、供者淋巴细胞输注和单剂白消安条件反射等增加供者细胞嵌合体的形成。这种治疗方案特别适用于血红蛋白病, 如β地中海贫血和镰状细胞贫血等。通过IUHCT使胎儿产生父母一方的免疫耐受, 为出生后采用父母的骨髓进行无毒性HSCT创造条件。意大利的研究表明, 骨髓中达到25%的嵌合体就能改善重型β地中海贫血的症状。显然, 如果血红蛋白病能治疗成功, 包括上述所有疾病在内的其他遗传病都能通过这一途径进行治疗。现在尚需大样本的临床前试验去优化移植方案。

3.3 IUHCT的并发症

IUHCT发生母胎并发症的风险较低。操作风险与临床广泛应用的绒毛活检、羊膜腔穿刺及脐带穿刺等介入性产前诊断技术相似, 可出现流产、早产、胎膜早破、宫内死胎、宫内感染等, 发生率约为1%。此外, IUHCT有可能使母儿感染供者细胞携带的病原体, 出现胎儿移植物抗宿主病、Rh免疫 (若母胎为Rh阴性而供者为Rh阳性) 和母亲移植物抗宿主病 (若供体淋巴细胞通过胎盘渗入母体) 。 针对上述疾病, 可采取下列措施使之降低:采用成人来源的供体 (不用胎肝) ;严格剔除T淋巴细胞;选用Rh阴性供体细胞或注射Rh免疫球蛋白。

4 IUHCT的发展方向

针对IUHCT存在的问题, 主要从以下3方面改良移植策略, 以期获得较好的治疗效果。①改善宿主造血空间的容受性, 增加供者细胞的植入。高选择性、无毒性胎儿骨髓抑制可能是重要的研究方向。采用无毒途径将宿主细胞动员至血循环中, 空出造血空间, 以利于供者细胞占据, 可能是另一研究方向。②改善供者细胞的竞争力, 使其在植入后能扩增。最简单的方法是通过增加供者细胞的数量和重复多次移植达到这一目的。现有研究通过阻断供者细胞二肽基肽酶CD26, 增加供者细胞在胎儿肝脏的定居, 改善其竞争力。③克服免疫屏障, 增加成功植入的几率。

综上所述, 虽然目前仅有X连锁严重免疫缺陷病IUHCT效果最好, 其他疾病疗效不确切, 但相信随着对胎儿免疫耐受机制的不断认识, 针对宿主造血空间的容受性、造血细胞的竞争压力和免疫屏障改进移植方案, IUHCT将有更广阔的临床应用前景。

细胞移植 篇2

Chapter One Nuclear Transplantation of Mammalian cells

cartoonyang（中国生命科学论坛动物科学与动物医学 第1版主）

摘要：本文综述了近年来哺乳动物细胞核移植的相关进展。关键词：哺乳动物 细胞 核移植 进展 Introduction The merge of a sperm and an ovum(fertilization)recovers the diploid cell marking the beginning of the individual development.In the embryonic development, various types of cells are originated from the zygot such as muscle fibers, neurons and hemocytes etc.A question has been asked if the differentiated cells in the development could resume the initiation status or pluripotent stage under proper circumstances which could give rise to other tissues and even the body as a whole.Is the process irreversible? To answer the question, the famous German embryologist Spemman brought out the idea to transplant the nuclei of cells in the anaphase of development to denucleated ova restarting the process in 1938.The aim of the experiment is to testify the totipotency of partially or completely differentiated cells.In 1952, Briggs and King conducted the first nuclear transplantation in tadpoles.1n 1962, the nuclei transplant of gastrula endoblast bred fertile xenopus, which demonstrated the cells post gastrula stage do not undergo irreversible change.All these experiments show the inferior creatures like amphibian possess at least part of differentiated somatic cells could recover their totipotency to develop to adult stage with the effect of oocyte cytoplasma and this has laid the foundation for mammalian nuclear transplantation.引言

一个精子和一个卵子的结合（即受精），恢复二倍体，从而开始了一个个体的发育。在胚胎发育过程中，很多不同类型的细胞都是由受精卵发育开始的。它们有一些专门发育为肌肉细胞，有一些发育为神经细胞，还有发育为血细胞等。从这里就引出了一个问题：在哺乳动物胚胎发育过程中，细胞发生了分化，但是在适宜环境下，已分化的细胞能否重新恢复到发育的起始状态，再重新发育成其它类型细胞组织的多能性，甚至发育成完整个体的全能性呢？细胞的分化是不是发生了不可逆的变化？为了回答这个问题，早在1938年，德国著名胚胎学家Spemann提出了将发育后期的胚胎核移到无核的卵子中使其重新发育的设想，实验的目的就是为了检验部分分化或完全分化细胞的全能性。他通过头发结扎将蝾螈的受精卵一分为二，有核部分可正常发育和卵裂，并发育到16细胞期，无核部分当移入另一个卵裂球的细胞核时，也能发育成为正常的幼虫，证实了蝾螈未分化的卵裂球具有发育的全能性。1952年，Briggs和King等将已发生了分化的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚，最后发育出了完整的蝌蚪。这是首次进行的细胞核移植尝试获得成功。Gurdon等（1962）利用原肠期内胚层细胞进行核移植，分别产下可育爪蟾。由此证明：自原肠胚以后的细胞仍然没有发生不可逆的改变，可以支持核移植胚发育到成体。这些实验结果证实，两栖类等低等动物至少有部分已分化的体细胞在卵母细胞质的作用下，可以恢复其全能性而重新发育到成体。这也为哺乳动物核移植奠定了基础。1哺乳类动物细胞核移植研究进展 1.1哺乳类动物胚胎细胞核移植研究进展

哺乳动物核移植研究始于1975年，研究远远晚于两栖类动物，其主要原因是由于哺乳动物的受精在体内发生，而且哺乳动物早期胚胎的体外培养（In Vitro Culture, IVC）技术和早期胚胎显微操作技术在当时没有建立起来。牛津大学Bromhall（1975）将兔子的胚胎细胞核移植到未受精的卵母细胞内，部分可发育到囊胚阶段，但成功率相当低。由于不能进行染色体和供体特异性标记分析，因而这些发育的胚胎来源是否是注入的细胞核，或者是胚胎自身的细胞核都不能作一清楚的解释。鉴于当时的哺乳动物核移植理论和技术都尚未完善，人们大多将研究的重点放在了卵裂球的分离和胚胎切割上。然而，由于胚胎分割和卵裂球分离技术本身的局限性，动物克隆的数量非常有限，未能达到人们所希望的预期效果，于是人们一直也在探索动物核移植的克隆方法。在1981年，Illmensee和Hoppe将小鼠囊胚的内细胞团（Inner Cell Mass, ICM）的细胞核移植到去核的受精卵内，获得了首批克隆的小鼠。这是世界上首次获得哺乳动物克隆成功的报道，但是其实验未被其他的研究人员所重复，人们仍对核移植技术仍缺乏信心。直到1983年这种局面才被Mcgrath和Solter打破，他们首次利用显微操作技术和细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植，得到了产仔，并建立了重复性很高的核移植程序，使得核移植效率大大提高，人们对核移植技术的应用前景看到了希望。随着核移植技术程序的建立，哺乳动物细胞核移植的研究发展很快。1986年，Willadsen等用绵羊早期胚胎的卵裂球作供体，用去核的第二次减数分裂中期（Second Meiotic Metaphase, MII）卵母细胞作受体，并用电融合的方法代替了仙苔病毒诱导供体卵裂球与去核卵母细胞融合，研究发现电融合方法比病毒融合法更有效，核移植胚胎的体外发育能力更强，重组胚移植后获得了核移植后代，这是首次在家畜上获得了成功。他们的实验阐明了哺乳动物胚胎细胞核移植中两个全新的观念：（1）作为核受体，卵母细胞比受精卵有更大的优越性；（2）绵羊桑椹胚的细胞核具有发育的全能性，并建立了以早期胚胎卵裂球为供体，MII期卵母细胞为受体胞质以及用电融合方法诱导供体细胞核和受体胞质融合这一整套技术。该技术极大推动了核移植技术的发展，并成功运用于其它动物，获得了胚胎克隆牛（Prather et al, 1987）、兔（Stice & robl, 1988）、猪（Prather et al, 1989），和猴（Meng et al, 1997）等。虽然胚胎细胞核移技术的发展总体相似，但是各动物胚胎细胞核移植的发展过程是有所不同的，下面将分别对各种哺乳动物的胚胎细胞核移植技术研究进展作一简单的概述。1.1.1小鼠

小鼠的胚胎细胞核移植的研究开展较早，也是最早获得了核移植后代。1981年，Illmensee和Hoppe将小鼠囊胚的ICM细胞核移植到去核的受精卵内，获得了首批克隆小鼠。1983年，Mcgrath和Solter首次利用显微操作技术和细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植，得到了产仔，并建立了重复性很高的核移植程序，使得核移植效率大大提高。除了这些取得突破的研究外，Hoppe和Illmensee（1981）的研究证明了孤雌生殖胚胎的ICM细胞含有发育个体所需的所有基因，这些细胞具有发育的全能性。在细胞周期的调整和核质互作上，Cheong等（1993）发现细胞周期早期的胚胎细胞核在受体细胞质中可以发生发育程序的重排，核移植胚胎的发育率明显提高，并获得了核移植后代。1996年，Kwon和Kono等通过改进方法，获得了4个和6个遗传上完全相同的继代核移植后代。另外有研究表明，小鼠囊胚期的滋养层细胞与ICM细胞一样具有发育的全能性（Tsunda & Kato, 1997;Sotomaru et al., 1999）。1.1.2 牛

实验动物中的胚胎细胞核移植研究为家畜的核移植研究奠定了扎实的技术基础。而在家畜中，牛的胚胎细胞核移植研究的历史较为久远，研究的投入是最大的，也取得了丰硕的成果。1987年，Robl等首次进行牛的核移植研究，他们将1-8细胞期胚胎的细胞核移到去核的合子内，结果1-细胞期胚胎的细胞核移植后构成的重组胚可以发育到出生，而处于其它细胞期的胚胎细胞核移植后均不能支持重组胚发育超过4-细胞期。同年，Prather等（1987）用Willadsen相同的核移植技术程序（Willadsen, 1986），将16-32细胞期胚胎的卵裂球移入去核的体内或体外成熟卵母细胞内，最后出生了1头核移植牛犊，其成功率为1%。Bondioli等（1990）用16-64细胞期胚胎作核移植供体，获得了7头来自同一核供体胚胎表现型的牛犊，移植的成功率达20%。Stice和Keefer（1993）获得了54枚来自同一供体胚胎的克隆胚胎，其第一、二、三代克隆胚胎移植后均产下了牛犊。Ector等（1995）克隆与再克隆囊胚发育率（12.9%与14.9%）和妊娠率（35.7%与33.3%）没有差异性。而Heyman等（1995）用体外受精（In Vitro Fertilization, IVF）胚胎作为核移植供体，核移植胚胎的囊胚发育率达到了22.6%，这与体内胚胎作为核移植供体核的囊胚发育率相似（30.2%）。而在国内这方面的研究也取得了进展，李雪峰等（1996）成功的获得了我国第一头胚胎克隆牛。1.1.3猪

1989年Prather等利用合子间的原核交换，并利用电脉冲使供体原核和去核合子融合，得到了7头仔猪，而利用2-8细胞期胚胎的核融合去核的MII期卵母细胞，体内移植后形成11%的桑椹胚，移植88枚核移植胚胎至受体母猪仅生下了1头仔猪，成功率不到1%。因此后来的研究也着重转向影响猪胚胎细胞核移植的因素。同牛一样，猪的核受体卵母细胞既可用体内成熟的也可用体外成熟的（Prather et al., 1991）。但由于当时卵母细胞的体外成熟培养系统还不够完善，使得体外成熟卵母细胞质量较差而不能完成胚胎的体外发育全过程（Nagashima et al., 1992）。Prather等（1990）在研究发现，猪核移植胚发生了发育程序的重排，出现供体核膨胀，并认为核的膨胀程度与卵裂球的发育时期无关。在猪卵母细胞激活上，研究表明：采用合适的场强1次电脉冲就足以激活猪卵母细胞，增加脉冲次数并不能提高激活率（Prather et al., 1989;Prochazka et al., 1992;Nagashima et al., 1992;赵浩斌等, 1999）。而在胚胎发育的早期阶段基因表达和蛋白质合成研究中，也有了初步的成果。Schoenbeck等（1992）研究表明猪胚胎基因组从4细胞期的16h开始控制发育，Prather 和 Rickords（1992）的研究发现RNA的合成与加工始于4细胞期的24h，并认为卵母细胞质对核的重排不受母体-合子转变（Maternal to zygota transition, MZT）的影响。Parry和Prather等（1995）将8-细胞期胚胎的卵裂球融合于去核MII期卵母细胞内，发现在核移植胚胎上发现有51KD的蛋白质带，并证明了蛋白质是由胚胎卵裂球带入的RNA所合成的。

我国窦忠英（1997）和赵浩斌等（1997）用与Prather等（1989）相同的方法得到了克隆猪。1.1.4 兔

兔子胚胎细胞核移植研究起始于1975年，Bromhall等首次将兔桑椹胚的卵裂球细胞注入到成熟后激活的卵母细胞内，得到了发育的囊胚。Stice和Robl（1988）用电融合方法将8-细胞期的卵裂球移入去核的MII期卵母细胞内，获得了世界首批6只基因型完全相同的核移植兔。随后Collas和Robl（1990）改进电激活和电融合技术，以16-细胞期胚胎细胞核为供体核，230枚重组胚移植后有23只仔兔出生，这是到目前为止效率最高的报道。Collas和Robl在兔的细胞核移植上的贡献特别大。他们的研究为以后的体细胞核移植奠定了基础。他们在兔核移植胚胎细胞核质同步对核移植的影响以及供体核形态结构变化上进行了详细的研究，得出了如下的研究成果：随着供体胚胎的发育，胚胎卵裂球构建的重组胚发育力下降，囊胚期ICM细胞构建的重组胚仍可发育到囊胚，而滋养层细胞构建的重组胚发育阻滞于8-细胞前，供体细胞核的形态重塑对核移胚的发育有利（Collas & Robl, 1991）。G1期的卵裂球移入去核的MII期卵母细胞内时，重组胚发生早熟性染色体凝集（Premature Chromosome Condensation, PCC），中期染色体和纺锤体形态正常，核移植胚的囊胚率发育率也高，而早S期和晚S期的卵裂球移入MII期去核卵母细胞时，中期染色体和纺锤体出现异常，核移植胚胎的发育率降低（Collas et al，1992a, b）。在Collas和Robl（1991）的研究理论指导下，Yang等(1992b)将采集的8-细胞期胚胎经体外培养20～24h发育到32-64细胞期后的卵裂球再用作核移植的供体细胞核，获得了8只仔兔，证明了体外培养到32-64细胞期的胚胎仍具有发育的全能性。黄少华等（1993）首次实验证明，兔冷冻-解冻胚胎也能进行核移植，其结果与新鲜胚胎的的核移植胚在激活率、融合率及分裂率上无显著差异。之后，我国科学家王斌等（1995），周琪等（1996, 1999）也获得了胚胎细胞核移植兔。在兔核移植研究中一般体内成熟的卵母细胞作为受体胞质，Park等（1998）尝试了用体外成熟14h的卵母细胞进行核移植，发现用兔体外成熟卵母细胞同样可以获得核移植后代。关于兔继代核移植报道较少。1995年，周琪等获得了第三代继代核移植兔胚。1998年，Rao等尝试用冷冻保存的兔核移植胚胎进行继代核移植，得到了继代核移植囊胚，但未得到后代。Piotrowska等（2000）用兔8细胞胚胎卵裂球进行继代核移植，发现重组胚的发育率无影响，将第三代继代核移植重组胚移入受体后获得了克隆个体。1.1.5羊

绵羊是继小鼠后第二个获得核移植后代的哺乳动物，也是最早获得核移植后代的家畜。早在1986年，Willadsen用8-16细胞期的胚胎作为核移植供体，首次用去核的MII期卵母细胞作为核移植受体，并用电融合方法代替仙苔病毒来诱导供体卵裂球细胞与受体胞质相融合，获得了核移植后代。该方法成为以后核移植的常规方法，为以后其它家畜胚胎细胞核移植和体细胞核移植的成功奠定了技术基础。随后Smith和Wilmut（1989）用绵羊16-细胞和ICM作为核移植供体，采用该方法进行核移植，都得到了活的后代，该研究首次证明了绵羊ICM细胞仍具有发育的全能性。Pugh等（1992）的研究表明，绵羊体外成熟卵母细胞可用于构建核移植胚胎。1997年，Liu等在研究供体细胞与卵母细胞周期的协调性对核移植胚胎体外发育的影响发现，M期卵裂球移入MII期卵母细胞可以提高核移植胚胎的发育率（Liu et al., 1997）。

在国内，山羊的胚胎细胞核移植在国际上一直处于领先地位。1991年，张涌等利用4-32细胞胚胎卵裂球作为核移植供体，去核的MII期卵母细胞作受体，构建的重组胚胎移植后出生了世界首批核移植山羊5只，这是我国在哺乳动物细胞核移植上的首次获得成功。1995年，邹贤刚等通过胚胎继代核移植的方法获得了山羊4只。1.2 哺乳动物体细胞核移植研究进展

Gurdon等（1962;1975）用爪蟾，Diberardino & Orr（1992）用蛙分化的细胞进行核移植都得到了蝌蚪，证实了在两栖动物上至少部分已分化的细胞具有发育的全能性，细胞分化后在基因组上没有发生不可逆的改变，基因组上存在重新启动发育所需的所有基因，这一理论为哺乳动物体细胞核移植研究奠定了理论基础。Czolouska等（1984）的研究表明已分化的小鼠胎儿胸腺细胞移植到激活的卵母细胞后可以发生形态重塑，形成原核样结构，推测体细胞能够支持胚胎的发育。后来，Kono等（1991）报道了用小鼠胸腺细胞核移植后得到了发育的囊胚，但移植后未获得分娩的核移植小鼠。由于当时普遍认为哺乳动物的细胞分化在遗传结构上发生了不可逆的改变，部分基因发生缺失，进而失去了发育的全能性，这些研究结果未引起人们的重视。直到1997年，Wilmut等得到了举世瞩目的第一只成年体细胞核移植绵羊—Dolly后，体细胞核移植才受到广泛的关注，人们才开始重新认识细胞分化的本质以及细胞分化的理论基础。当然，人们对―Dolly‖羊也提出了置疑，但DNA指纹分析证明了Dolly的确来自成年绵羊乳腺上皮细胞（Ashworth et al., 1998;Signer et al., 1998），后来众多的体细胞核移植的成功充分肯定了该研究的结果（Schnieke et al., 1997;Wakayama et al., 1998;Bulter et al., 1998;Shiga et al., 1999;Lanza et al., 2000b）。Dolly的出生，使哺乳动物核移植研究进入了一个崭新的阶段，Wilmut等建立的一整套绵羊体细胞核移植程序，如恢复体细胞核全能性的―血清饥饿法‖，体细胞传代阶段确定以及体细胞克隆后代与亲本核供体间的DNA微卫星分析技术成为全世界同行公认的哺乳动物体细胞核移植技术的基本程序。

在短短的几年里，核移植研究从胚胎细胞核移植转入了体细胞核移植研究阶段，世界各地的科学家对各种类型的体细胞核移植进行了有意义的尝试。用胎儿细胞和成年动物体细胞进行核移植的研究进展迅速，所使用的供体细胞也越来越来广泛，并取得了重大进展。迄今为止，已有下面9种供核类型的体细胞核移植后代产生。

（1）胎儿成纤维细胞：Cibelli 等（1998）采取34日龄牛胎儿成纤维细胞产下了后代。之后Vignon 等（1999）重复了此实验，也获得产仔的结果。后来相继得到了克隆山羊（Baguisi et al., 1999;Keefer et al., 2002），克隆猪（Onishi et al., 2000）和克隆兔（Chesne et al., 2002）。（2）成体乳腺细胞：Wilmut等（1997）从妊娠母羊乳腺中采取细胞，重复Campbell等（1996）的实验方法，成功获得了世界首例成年绵羊体细胞核移植后代—Dolly。之后，Zakhartchenko等（1999a）用1 头3岁的牛乳腺上皮细胞核移植得到了克隆牛。

（3）卵丘/颗粒细胞：Wakayama 等（1998）分离卵母细胞周围的卵丘细胞作为核供体细胞，不经培养直接作核移植，获得50多只克隆小鼠。这是继―多利‖后的第二批哺乳动物体细胞核移植后代。之后也相继研究成功克隆牛（Kato et al., 1999;Wells et al., 1999）、克隆山羊（Baguisi & Overstron, 2000）和克隆猪（Polejavea et al., 2000;Cabot et al., 2001）。

（4）卵管/子宫上皮细胞：Kato 等（1998）进行了输卵管上皮细胞核移植实验，核移植后共获得94枚融合胚，其中24枚发育到囊胚阶段，移植4枚胚胎，最后产下3头牛犊。

（5）肌肉组织的细胞：法国科学家Bulter等（1998）、Vignon 等（1998）报道了用胎儿肌肉细胞作供体得到了核移植牛。而Shiga 等（1999）采取2岁公牛肌肉细胞，传代培养至少4代，经血清饥饿法或不经血清饥饿法培养均产出牛犊。

（6）成体耳部成纤维细胞: Kubota等（2000）用1头17岁老牛的耳缘皮肤成纤维培养传代至15代，用于核移植，得到了6头核移植牛犊。之后，Park等（2002）采用成体耳部成纤维细胞也获得了克隆猪。

（7）睾丸支持细胞：Ogura等（2000a）采用未成熟的小鼠睾丸支持细胞进行体细胞核移植而获得了克隆小鼠。

（8）小鼠尾尖细胞：Wakayama和Yanagimachi（1999）采用成年小鼠的尾尖细胞得到了核移植后代。接着Kato等（1999）和Ogura等（2000b）也分别得到了来自小鼠尾尖细胞的克隆小鼠。

（9）初乳的乳腺上皮细胞：Kishi等（2000）用从初乳中分离出的乳腺上皮细胞作核移植获得了2只克隆牛。

综上所述，自体细胞核移植绵羊成功后，体细胞核移植后代已在牛（Kato et al., 1998）、小鼠（Wakayama et al., 1998）、山羊（Bagsuisi et al., 1999）和猪（Polejaeva et al., 2000;Onishi et al., 2000）等动物上获得了成功，下面将对各动物种类的研究进展进行综述。1.2.1小鼠

小鼠体细胞核移植研究所采用的方法与其它动物有所不同，在其它动物中所采用的方法是电融合法，小鼠上常用的方法是细胞质内注射法，即通过显微操作将供体细胞直接注入去核卵母细胞内。1989年，Tsunoda等尝试将雄性小鼠的胎儿原始生殖嵴细胞移入去核的合子内，构建的重组胚大多未发育到囊胚。1995年，Kato和Tsunoda的研究证明了胎儿生殖细胞具有发育的全能性或多能性。接着Kimura和Yanagimachi（1995）和Sasagawa等（1998）的研究证明成熟个体的生殖细胞（初级、次级精母细胞）具有发育的全能性，其中Sasagawa等（1998）的移植胚胎经移植后出生了2只小鼠。

1998年，Wakayama等（1998）采用不经过培养的小鼠卵丘细胞作为核供体，直接注射给去核的卵母细胞，得到了10只可育的小鼠，这也是继―多莉‖后第二批哺乳动物体细胞核移植后代，它的成功有力地支持Wilmut等（1997）的试验结果。Wakayama等（1998）同时还进行了公鼠睾丸支持细胞和雌鼠神经细胞的核移植实验并获得了附植的结果，但均中途流产。但是Ogura等（2000a）用来源于未成熟的睾丸支持细胞作供核进行细胞质内注射，获得了后代。用小鼠尾尖细胞作供核，也获得了克隆小鼠（Wakayama & Yanagimachi, 1999;Kato et al., 1999;Ogura et al., 2000b）。其中值得一提的是，这次Ogura等（2000b）采用的是电融合方法获得克隆小鼠的。1.2.2牛 在哺乳动物的体细胞核移植研究中，牛的核移植研究是当今的热点，并取得了重大进展。早1995年，Delhaise等就用核移植方法证明来自牛雄性胎儿的原生殖嵴细胞在受体胞质内可以发生发育程序的重编，核移植胚可发育到囊胚。1997年，Lavior等以牛新鲜和冷冻的卵原细胞，早期卵裂球和颗粒细胞为供体构建重组胚，结果重组胚在融合后40h的卵裂率无明显差异，且由这些供体构建的重组胚有部分可以发育到囊胚期，当来自卵原细胞的桑椹胚和囊胚移植到受体后，重组胚可以发育为胎儿和胚外组织。这些都为体细胞克隆牛奠定了基础。Kato等（1998）和Cibelli等（1998）分别用成年牛的卵丘细胞、输卵管上皮细胞和转染的胎儿成纤维细胞作为供体得到了体细胞核移植牛犊。几乎同时，法国科学家也报道了用胎儿肌肉细胞经过培养传代后作供体得到了核移植牛（Bulter et al., 1998;Vignon et al., 1998）。而Shiga 等（1999）采取2岁公牛肌肉细胞，传代培养至少4代，经血清饥饿法或不经血清饥饿法培养均产出牛犊。Hill等（2000a）用血清饥饿法处理牛胎儿成纤维细胞后在进行核移植，可显著提高重组胚的囊胚形成率，而血清饥饿法处理对成体成纤维细胞的核移植胚胎的发育没有影响。Wells等（1999）从活体牛卵巢内采集得到颗粒细胞作为核供体，获得了10头核移植牛，成功率达到10%。杨向中实验室于2000年3月公布了用17岁龄公牛的耳部成纤维细胞，成功得生下了6头克隆牛（Kubota et al., 2000）。Oikawa等（2000）从一头20岁的日本黑牛获得了颗粒细胞，经传代培养（5代）和血清饥饿培养后，核移植后获得了2头牛犊。由此可见，核移植技术可为濒危动物拯救开辟了一条新的途径。1.2.3猪

相对于其它动物而言，猪的体细胞克隆研究困难较大，进展很慢。在1995年，Liu等就将猪原始生殖细胞（Primordial Germ Cells, PGCs）移植到兔卵母细胞质内，核移植胚胎卵裂并发育到4-细胞期。Tao等（1999）和Prather等（1999a）在完善猪卵母细胞体外成熟和胚胎体外培养技术后，用体外培养的卵母细胞和胎儿成纤维细胞获得了发育到囊胚期的核移植胚胎12枚，从这些结果也可以发现猪胎儿成纤维细胞在去核的卵母细胞内同样可以发生发育程序的重编，预示着猪体细胞核移植即将获得成功。接着Ott 等（2000）、Uhm 等（2000a）、Verma 等（2000）和Koo 等（2001）等利用胎儿成纤维细胞和卵丘细胞与体外培养卵母细胞构建重组胚都发育到了囊胚阶段。Kim 等（2000）的研究发现，用胎儿成纤维细胞进行核移植所构建的重组胚的转录和DNA合成发生在24h。2000年3月，PPL公司宣布通过体细胞核移植技术获得5头世界上的第一批体细胞克隆猪（Dave, 2000）。2000年8月，Onishi等将胎儿成纤维细胞直接注入体内成熟去核的卵母细胞内，得到了1头雌性仔猪。同年，Polejaeva等（2000）改进核移植方法，先将颗粒细胞与去核卵母细胞融合，当核移植胚胎发育到原核期后再进行核移植，将核移植胚的原核与体内受精的原核期受精卵的原核进行交换，胚胎移植后由185枚胚胎获得了5头白色的仔猪，核移植效率达到1.2%（Polejaeva et al., 2000）。Betthauser等（2000）也报道了体细胞核移植的4头健康的雄性仔猪。随着猪体细胞核移植技术的发展，人们在研究如何提高核移植胚胎体外发育率（Betthauser et al., 2001;Klocke et al., 2001;Kuhholzer et al., 2001a, b）和利用皮肤成纤维细胞进行核移植的同时（Roh et al., 2001），逐步将研究重点转向转基因克隆猪的研究（Park et al., 2001;Uhm et al., 2000b;Koo et al., 2001）。2001年 4月，PPL公司宣布他们在去年得到体细胞核移植猪后，又通过体细胞核移植的方法得到了5头带有人类基因的转基因猪，这些猪可望减小与人体器官的免疫排斥反应，为人类提供可移植的器官（网上新闻报道，见PPL公司主页）。正因为转基因猪具有如此巨大的商业价值，利用体细胞核移植技术生产转基因猪是未来猪体细胞核移植的主要方向。1.2.4兔

兔的体细胞核移植的研究进展相对较慢。Moens等（1996）将妊娠18-20天的兔胎儿生殖细胞与去核卵母细胞融合，来自雄性和雌性性腺细胞的重组胚卵裂率相同（均为37%），而用培养4天后雄性性腺细胞构建的重组胚囊胚发育率（16%）明显高于雌性的（4%），表明了雄性和雌性二倍体生殖细胞在去核卵母细胞的发育程序重编潜力不同。Yin等（2000）将卵丘细胞经传代培养3-5代后，与去核卵母细胞融合，用电脉冲和6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）结合激活重组胚，其卵裂率和囊胚率发育率分别为66%和23%，174枚重组胚移植到8只受体后，在其中3只受体上观察到3个植入位点，但未发现胎儿。Dinnyes等（2001a）以兔耳部成纤维细胞为供体构建重组胚，得到与Yin等（2000）相近的卵裂率和囊胚发育率。我国的李光鹏（2000）用肌纤维细胞为供体，重组胚囊胚发育率为37.1%。Chensne等（2001）发现卵丘细胞构建的重组胚的囊胚发育率（46.7%）明显高于胎儿成纤维细胞（3.6%），但后者则获得了产兔的结果（Chesne et.al., 2002）。1.2.5羊

Ledda等（1996a）将羊PGCs植到去核的卵母细胞内，重组胚在体外可以发育，但移植后未出生后代。1997年，Wilmut等用成年绵羊乳腺上皮细胞克隆出了世界上第一头首例体细胞核移植羊，这也是人们在长期进行体细胞核移植研究所获得的突破性成果。Wells等（1997）采用与Wilmut等（1997）相似的方法，从一枚8天的羊雄性囊胚的ICM获得了细胞，体外培养后建立细胞系，用低浓度血清诱导G0期，分别移植到去核体内、外成熟的卵母细胞内，最后获得了3只雄性羔羊。克隆羊克隆牛的技术程序相似，但克隆绵羊大多采用体内成熟的卵母细胞作受体胞质。克隆羊的效率也和所报道的克隆牛的效率相似（Colman, 2000）。转基因克隆羊的研究也取得了重大突破，已相继研究成功转基因克隆绵羊（Schnieke et al., 1997;McCreath et al., 2000）和克隆山羊（Keefer et al., 2001）。

我国克隆羊的研究进展很快，郭继彤等（2000）用来自成年雌性山羊的皮肤成纤维细胞作为核移供体，将供体细胞核直接注入去核卵母细胞内，获得了两只遗传上相同的体细胞核移植山羊，这也是世界上首批成年体细胞克隆山羊。在转基因克隆羊的研究上，也取得了一定的成绩。安晓荣等（2001）报道用体细胞克隆出了绵羊转基因囊胚。成勇等（2002）以转基因山羊体细胞为供体细胞克隆出转基因山羊。1.3胚胎干细胞核移植研究进展

胚胎干（Embryonic Stem, ES）细胞是早期胚胎细胞或囊胚ICM细胞经抑制分化后培养而筛选出来的一类全能性细胞，这种细胞具有正常的二倍体核型，它既可以在特定条件下进行无限增殖而不发生分化，又可以在特定条件下分化为包括生殖系在内的各种细胞和组织（Evans & Kaufman, 1981）。此外，将从胎儿的原生殖嵴分离出来的PGCs进行培养，也可以形成在功能和形态上与ES细胞相似的细胞系。ES细胞具有体外发育的全能性，并且可以在体外无限传代，因此，它是动物克隆的理想供体细胞。ES细胞作为核移植供体细胞与体细胞的制备方法类似，亦需进行细胞周期的调控。

迄今为止，只有在小鼠和人已培养建立ES系，而牛、兔、羊、猪仅获得了拟干细胞，因此用真正的ES细胞进行核移植只有小鼠是获得了成功（Wakayama et al., 1999b）。

在研究早期，Tsunda和Kato等（1993）将小鼠的ES细胞移入去核卵母细胞内，核移植胚胎体外发育到桑椹胚和囊胚期，移植到受体后也发现有植入位点，但未获得核移植后代。Sims和First（1994）将培养的ICM注入到去核卵母细胞，获得4头牛犊。Campbell等（1995）将山羊第三代的ES样细胞进行核移植，获得了活的核移植羔羊。猪的ES样细胞，在核移植后可以指导胚胎发育到囊胚阶段，目前仍没有活的后代出生（Chen et al., 1999）。虽然牛ES样细胞经过核移植后，出生的后代在生后不久死亡，但也证明了牛ES样细胞可以参与胎儿的发育，具有发育的全能性（Iwasaki et al., 2000）。Wakayama等（1999b）在继小鼠的体细胞核移植成功后，又利用相同的技术对小鼠ES细胞进行核移植，得到了核移植小鼠31只。该研究证明了用ES细胞进行核移植产生后代的可能性。由于ES细胞在体外具有无限增殖而不发生分化的特性，故可以在体外更方便地对ES细胞进行基因改造，通过基因―敲除‖和―插入‖来研究基因的功能，Sato等（2000）用小鼠的ES细胞系TT2的细胞直接注射入去核的卵母细胞内，核移植胚胎可发育到妊娠14天，但未能出生小鼠。已报道利用小鼠ES细胞可以定向分化为造血细胞（Perkins, 1998），而利用人ES细胞可以在体外分化如分化为分泌胰岛素的胰岛素样细胞（Odorico et al., 2001）等多种细胞。最近，Wakayama等（2001）报道将个体细胞核移植后得到了sntES细胞（具有ES细胞的特性）移植到去核卵母细胞胞质内，获得了20只小鼠，其中11只小鼠发育正常并具繁殖能力。由此表明，sntES细胞器具有发育全能性，可以建立成年动物自身的干细胞系，这些干细胞可以分化产生各种细胞、组织和器官，用于进行自身疾病的细胞治疗。因此对人类体细胞核移植和干细胞的研究与应用有深远的影响。目前，利用ES细胞进行核移植的主要研究方向是利用这些细胞生产转基因动物，并利用核移植建立成年动物体细胞核移植ES细胞系。1.4转基因克隆动物研究进展

随着哺乳动体细胞核移植技术的发展，以及人和家畜基因组计划的完成，转基因技术的研究走出了20世纪90年代徘徊不前的局面，进入了新的发展时期，即转基因克隆动物时期。转基因克隆动物技术是转基因动物技术与克隆技术的有机结合，它是以动物体细胞为受体，将目的基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞，再以这些体细胞为核供体，进行动物克隆。PPL公司Schnieka等（1997）率先克隆出了转基因动物。他们是从35日龄胎儿分离的体细胞，经传代培养后和基因转移后，将转染了新霉素抗性（Neomycin）基因和人凝血因子（IX）基因的体细胞移植到受体卵母细胞内，出生了带有IX基因的转基因羊。Cibelli等（1998）用一个55日龄的雄性牛胎儿分离得到成纤维细胞，体外培养后转代两次，用标记ß-gal/neo对细胞进行转染，转染的细胞用新霉素筛选两周之后，得到5个抗性细胞克隆，经PCR分析，发现它们都是转基因细胞，而且表明了标记基因，选择其中一个细胞为核移植供体，通过核移植得到重组胚276个，其中33个（1%）发育到囊胚，经移植到11头同期化的受体母牛体内后，出生了4头小牛，经过分析检测，发现这4头小牛都在同一个染色体位点整合了外源基因，说明了它们来源于同一个体细胞克隆，而实验中的转基因效率达到了1.4%。1999年，Baguisi等克隆出来的5只转基因山羊中，其中的1只羊在奶中表达了高水平的抗凝血因子III。2000年，McCreath等用基因打靶后的绵羊体细胞生产了转基因绵羊。随后转基因山羊（Keefer et al., 2001）和转基因猪（Lai et al., 2002）也相继获得成功。

我国的转基因克隆技术也取得了一定的成绩。安晓荣等（2001）报道用绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因，用绵羊的转基因颗粒细胞进行核移植，得到了发育的绵羊转基因囊胚。成勇等（2002）以转基因山羊体细胞为供体细胞克隆出转基因山羊。1.5种间细胞核移植研究进展

细胞核移植作为一种重要的科学研究方法，随着这项技术的不断成熟，它也成为挽救濒危动物的一个重要手段，由于濒危动物的卵母细胞来源较少，进行体细胞核移植的难度增大，人们就希望通过种间核移植技术来达到这个目的。但在这方面的研究进展是较为缓慢。

De Roeper 等（1977）将Hela移入非洲爪蟾卵内，结果发现Hela细胞在爪蟾内能够发生染色体扩散和DNA合成，表明爪蟾卵母细胞内有能够激活哺乳动物体细胞的因子，这种激活因子无特异性。McGrath和Solter（1986）利用他们在小鼠胚胎细胞核移植上的方法进行小鼠不同种间原核交换研究，结果获得的种间核移植胚仅出现有限次数的卵裂。梅琪等（1993）进行的鼠-兔种间核移植研究，结果重组胚胎有43.1%分裂率，5.4%发育到囊胚。谭世俭等（2001）作的水牛-黄牛种间胚胎细胞核移植研究，获得了发育的种间核移植囊胚。李光鹏（1998）将小鼠8-细胞胚的卵裂球移入猪去核卵后，重组胚可卵裂至8细胞期。Dominko等（1999）等以牛、猪、羊、大鼠和猴的皮肤成纤维细胞为核供体，牛卵母细胞为核受体，探索牛卵母细胞在已分化体细胞核指导下的有丝分裂能力及用牛卵母细胞作为受体胞质的可能性。结果表明，除了大鼠-牛杂种胚外，其余都发育到囊胚阶段，但是杂种胚移植到受体后没有出生后代。然而，就种间核移植胚发育到囊胚而言，牛卵母细胞维持发育的能力没有因供核动物的物种，染色体数目和年龄的不同而表现出差异，表明哺乳动物保留着调节早期胚胎发育的机制，牛卵母细胞的胞质能支持具有不同染色体种类和数目的异种核发育。Lanza等（1999a, b）把人的体细胞核移植到牛的去核卵母细胞，得到的一些类似核移植胚胎也都发育到较高级阶段。近年来，人们尝试了黄牛-水牛（Kitiyanant et al., 2000;Nguyen et al., 2000），小鼠-猪（Lee et al., 2001），小鼠-牛（Arat et al., 2001;Liu et al., 2001），以及猪-牛（Yoon et al., 2001）等动物种间体细胞核移植的研究，都分别得到了体外发育的胚胎。目前，Lanza等（2000b）的研究获得了令人振奋的结果。他们把一种野牛的皮肤成纤维细胞核移植到家牛的去核卵母细胞中，发育到了妊娠晚期并已分化成复杂的组织和器官的野牛胎儿。接着，Vogel（2001）报道将印度野牛的体细胞作供核移植到去核的家牛卵母细胞内，最后出生了1头发育正常的野牛，但出生后2天就死了，但这一结果无疑证明哺乳动物体细胞可以在异种卵母细胞内完成核发育程序重编，使已分化的体细胞发生去分化并完成整个发育过程。也预示着我国在体细胞克隆大熊猫、猕猴及比格犬上有可能成功。虽然我国科学家陈大元等（1999）把大熊猫的体细胞核移到兔卵母细胞中，重组胚能发育到囊胚阶段，但目前未能获得的后代。这一事实说明，种间核移植确有一定的难度，只有在诸如核发育程序重排程度和可靠性、供体细胞胞质和受体胞质（例如线粒体DNA）之间的相容性等问题弄清后，才有可能实现种间核移植。

2.1受核细胞的准备

2.1.1成熟卵母细胞的获得

成熟卵母细胞的获得的途径也有两种：体外成熟和体内成熟。体内成熟是用超排的方法获得，在牛上很少使用。体外成熟培养既方便又利于大量获得。

体外培养的卵母细胞又有几个来源：①直接由卵巢上有腔卵泡抽取或剥离；②由腔前卵泡培养获得，③冷冻保存的卵母细胞。目前广泛使用的是前者。而后两者则为卵母细胞提供了更为广阔的来源。

2.1.1.1卵巢的采集及卵母细胞得分离

目前卵巢主要来自大型屠宰场，用加双抗的生理盐水保存卵巢，温度在30-38℃之间，也有采用25~37℃的。卵巢的保存温度和时间在不同程度上影响IVF/IVC的囊胚发育率，卵巢在33~35℃保存8小时以内并不会减弱卵母细胞的体外成熟能力。

有认认为卵巢以20~25℃至少可以保存6小时而不影响IVM/IVF效果及随后的胚胎发育。试验证明卵巢以24~33℃保存4小时以内最为理想。卵丘卵母细胞复合物（COC）有剥离法和抽取法两种分离方法，有人认为剥离法对COC损伤较小，更有利于提高卵母细胞的成熟率，但是，此方法太过于复杂，不如抽取法快，故而后者应用较多。

采集卵巢前应先将无菌生理盐水加热到稍高于预定温度（如38~39℃），在出发前倒入预先灭菌的保温瓶中，加入一定浓度的双抗。采集卵巢时要尽量减少对卵巢的污染，动作要快，放入保温瓶前先用温生理盐水冲洗。带回实验室后，用灭菌温生理盐水或PBS冲洗，然后在无菌室内分离卵母细胞。

用抽取法时，选择12号灭菌针头，抽取前先吸一些卵母细胞洗涤液于注射器中，抽取液注入洁净无菌离心管中。在整个过程中要保温，尽量减小温度变化。卵巢的采集及卵母细胞得分离过程最容易受到污染，所以应尽量保证操作过程中的无菌性。2.1..1.2 卵母细胞的成熟培养

将抽取液倒入平皿中检卵，检出符合要求的卵丘卵母细胞复合物。

用培养液洗涤几次后，于CO2培养箱内，5%CO2浓度，38.5℃培养18-24小时，检查成熟率。影响卵母细胞成熟率的因素很多，但主要还是培养液成分。内刘泽隆等

认

为，TCM199+

体

积

分

数

10%~15%的FCS+1~2mg•L-117β–E2+10mg•L-1FSH+20~50mg•L-1LH是牛卵母细胞成熟培养的理想培养系统，且成熟率达90%以上。过高浓度庆大霉素会抑制卵母细胞中先粒体的有丝分裂增殖，但如果不能保证无菌操作，还是应该添加。雷安民等的研究中使用丙酮酸钠、庆大霉素和NCS(ECS),并证明单独添加发情牛血清即可满足成熟的要求，为防止污染而使用的庆大霉在40mg/L的添加剂量下对牛卵母细胞的成熟率没有显著影响。卵丘细胞发散呈放射状是卵母细胞成熟的一个标志，用吸管吹打去卵丘细胞，然后在显微镜下观察极体排出情况。2.1.2成熟卵母细胞去核

卵母细胞成熟后要去掉原有细胞核或使其丧失功能，分去核和灭能两种方法，实践中多采用显微去核。

成熟卵母细胞去核是核移植技术中的一个重要环节，要求去的干净，又尽可能的减少对细胞质的损伤。

目前使用的去核方法有以下几种：

1.挤压法，于近第一极体（PB1）处的透明带作一切口，用移核管挤压卵母细胞，使PB1和附近1/3的胞质挤出透明带。此法与细胞分裂相有关，必须在恰当的时间进行，否则不能将染色质去净。

2.改进的点击去核法，该法与前者相比对胞质损伤小，但技巧性较高。

3.负压吸取法，据报道在微分干涉差倒置显微镜的高分辨率视野下是卵母细胞轻微旋转，当纺锤体与焦平面垂直时核区与胞质的折光率略有差别，可准确吸出细胞核和少量细胞质，去核率可达100%。

4.半卵法，切开透明带，将一半细胞质吸出并移入另一个空透明带中，然后用荧光染料检查染色质在哪一半中。2.2供核细胞的准备

现在已经成功使用的供核细胞有胚胎细胞、胎儿成纤维细胞、成年和老年转基因成纤维细胞、乳腺上皮细胞、卵丘细胞、颗粒细胞、尾部细胞及耳细胞等。

核移植前必须对这些细胞进行同期化处理，实践证明GO、期G1期是最佳时期。诱导分化细胞进入静止期是克隆成功的关键。

对供核细胞进行同期化处理常用方法是血清讥饿法，血清浓度和饥饿时间也有一定的要求。其他方法还有：秋水仙胺塞氨酯哒唑诱导M期同步化、用阿菲迪霉素诱导G1期同步化期、用环己酰胺诱导G2同步化。

也有通过选择细胞类型来获得的，原理是不同类型的细胞在细胞周期不同阶段上得数目相差很大，如刚排出的卵母细胞周围的卵丘细胞90%以上处于G0或G1期。2.3移核

移核有两种方式：把细胞核移入去核卵母细胞和把体细胞移入去核卵母细胞。在体细胞核移植中多用后者，移入后进行融合与激活。按移入位置也可分为两种：移入卵周间隙和直接移入细胞质内。移核时需要借助显微操作系统进行，用固定吸管固定去核卵母细胞，调节注射吸管，使之处于同一焦平面上，移动注射吸管慢慢沿去核时的切口将供核体注入卵周间隙。

2.4融合与激活

融合方法分化学法和电融合法。但通常使用的是电融合法，需要在专门的融合仪器上进行，往往通过增加电刺激数来提高激活率，另外还可以通过化学试剂（如乙醇、钙离子载体、锶等）处理以提高核移植的效率。关于电融合的研究很多，从融合时间到电压、频率都有较详细的论述。目前，一般采用交流电场排细胞的方向即交流定位，常用的频率为600~1000kHz，电压为5~6V，持续时间约5~10秒钟。常用的直流电融合条件为1.0~2.0KV/CM的场强M，30~60ì¾的持续时间。

2.5重构胚的培养

重构胚经激活处理后，需要培养一段时间，待发育至桑椹胚或囊胚期时再移植给受体母牛。重构胚的培养有体外和体内两种培养方式，实践中主要用前者。胚胎体外培养是影响克隆成功率的一个重要环节，也是克隆胚生产工厂化的一个前提。目前有关胚胎体外培养系统的研究很多，但最热的时共培养系统。

体外培养哺乳动物胚胎的主要障碍是发育阻滞，但不同的动物出现再不同的时期。研究表明，胚胎发育阻滞与基因组激活关系密切，多发生在胚胎卵源性基因调控向胚源性基因调控转化，即胚源性基因激活时期，因此推测发育阻滞可能与胚源性基因激活激活不全或激活失败有关。体细胞共培养系统能在一定程度上克服胚胎发育阻滞可能在于体细胞能：产生促有丝分裂因子；产生细胞外基质成分，促进胚胎细胞分化；可代谢或除去培养液中的胚胎毒性因子

不同类型的体细胞的共培养效果是不一样的，一般采用输卵管上皮细胞和颗粒细胞。桑润滋等在研究兔的核移植时认为，在基础培养液相同的条件下，与胎儿成纤维细胞饲养层共培养，尤其是与同源胎儿成纤维细胞饲养层共培养，有利于重构胚的发育，尤其是有利于提高桑椹胚和囊胚的发育率。培养液主要有TCM-199和CR1aa等，在基础液的基础上再加其他因子。2.6克隆胚移植

胚胎培养至桑椹胚或囊胚期时，需要移植到同期假孕母牛体内，使其继续发育。受体母牛可选自然发情的，也可进行人工同期化处理，但受体母牛必须有明显的黄体。为了维持妊娠，可移入多枚胚胎或施以外源激素。3.核移植技术已取得的成就

在供核细胞受核细胞的选择上，以大量的实践证明MⅡ期的成熟卵母细胞是最佳受核细胞 卵母细胞体培养技术与超数排卵技术已经相当成熟，培养系统不断完善，不但效率上有所提高，简化的培养系统也有报道

腔前卵母细胞的体外培养及卵巢、卵母细胞的冷冻保存为卵母细胞提供了更为广阔的来源。体细胞的体外培养技术也已经比较成熟，体细胞的冷冻保存与体外成功传代同样为大量克隆提供可能。

核移植技术已经在多种动物上获得成功，而且用多种类型的细胞获得克隆后代，以事实证明了克隆技术的可行性。

核移植技术在理论上也已取得了巨大成就。

4.现有技术的不足

哺乳动物核移植技术虽然在多种动物上获得成功，但技术仍然不成熟，仍没有走出实验室。①受核细胞的来源问题还没有真正解决，实践证明卵母细胞是目前的最佳选择，体外成熟培养技术也已经比较成熟，但是来源仍受到限制。从屠宰场采集的新鲜卵巢上抽取，一是容易受到污染，二是对试验造成了巨大的限制。现在卵巢及卵母细胞的冷冻保存以及腔前卵泡的体外培养已取得了一定的进展，但仍有大量的工作要做。

②供核细胞的来源也仍未解决，现在的研究还没有证明是否所有的体细胞都适合。某些类型的体细胞在化过程中基因可能发生了不可逆的转变，以至丧失再程序化的可能。③去核技术还不过关，目前使用的主要是显微操作去核，怎样既去的干净又尽量减少对细胞质的损伤仍是目前要解决的问题。④重构胚的融合与激活技术还有待于进一步研究，融合与激活是关系到重构胚能否发育的重要一步。

⑤重构胚的培养技术也还在研究中，有效的培养技术是提高重构胚发育率的必不可少的条件。⑥细胞核再程序化机制仍不清楚，如果能解决这一问题，将会给动物克隆带来具有划时代的意义的变化。⑦对动物克隆过程中出现的问题还没有找到确切的原因。如：Kruip等和Garry 等对利用核移植技术培养的克隆牛后代分析表明，克隆动物在妊娠时间及出生 重等方面远远超过对照组个体但没有找到确切的原因。

5.核移植技术的前景

5.1核移植技术在普通畜牧生产上的意义 哺乳动物克隆技术在畜牧生产上的应用将带来划时代的意义。首先，在迅速扩大优秀个体数量，提高畜产品数量和质量上有重要意义。在已优秀个体的生产性能之后，利用体细胞核移植技术，可以迅速复制出大量与其遗传基础完全相同的个体来，以便于迅速提高产品数量。如果采用传统的方式进行改良，则需要很长的时间才能满足需要，即便是用胚胎细胞克隆，也远不如体细胞核移植技术优越。

另外，随着核移植技术的不断完善，将真正实现胚胎的工厂化生，从而大大降低胚胎及畜牧生产成本，不需要进行生产目的的育种工作。其次，核移植技术还是动物育种的新途径。传统的育种方法不仅费时费力、效率低、耗资巨大，而且由于遗传漂变，往往很难达到预期目的；而核移植技术则不同，与胚胎移植相结合，则能迅速提高优良基因及其组合在群体中的频率，加速育种进程，提高育种效率。

最后，核移植技术还是动物保种的有效措施。现在，许多家畜品种濒临灭绝，而传统的保种方法则要建立保种群，代价既高，有难以防止近交衰退，很难起到保种效果；建立精子、卵子及胚胎库保种虽然已经比较有效，但仍某些缺陷，如果结合核移植技术则将更加完善。

5.2核移植技术再生产转基因动物上的意义

细胞核移植技术与转基因相结合是当今研究的一个热点，它有医学上和畜牧生产上的巨大的价值。生产转基因动物是提高畜产品质量和数量的现代手段。知道基因与功能的对应关系之后，我们就可以挑选出需要的基因，然后生产转基因动物，从而优化动物的性状以满足我们的物质需求。在医学上，我们一方面可以利用转基因动物生产移植器官，另一方面制作乳腺反应器生产药物。有些药物依靠传统的提取方法获得，成本是很高的，而且也很不安全，通过转基因从动物获得已成为必然。目前外源DNA导入方法有显微注射法、电穿孔法、胚胎干细胞法、精子载体法、逆转录病毒转染法，但自1985年显微注射技术问世以来，对受精卵细胞的原核进行DNA显微注射一直是获得转基因家畜的唯一实用手段。

但该方法基因整合率低，是其最大的缺点，只有0.5—3%的显微注射受精卵可以产生转基因后代，对大动物 则更低。转基因随机组合造成的―位置效应‖所引起的表达结果的不稳定性，除了采用基因座控制区、核基质结合区序列或将完整的基因座导入动物的基因组等方法消除位置效应外还需要从大量的转基因动物中筛选出高效表达的动物。

Capeddhi(1998)报道用显微注射法可得到很高的转染率，占接受外源DNA细胞的10—20%，但一次只能注射一个细胞；电穿孔法可以同时使许多细胞得到转染，Mansour（1988）研究发现电穿孔可使1%ES细胞稳定转染。但是，如果与核移植技术结合，就可以进行大量克隆。体细胞数量远比受精卵多，对体细胞进行基因打靶，筛选已经转染的细胞，然后进行核移植，这样不仅可降低成本还，能提高转基因效率。6.核移植技术的负面效应

核移植技术虽然回给人们带来巨大的方便和经济利益，但也有其副效应。克隆作为一种无性繁殖手段，没有双亲的基因组合，其性状上不会超过供体，更谈不上进化，这无疑是违背生物进化规律的，必将导致物种退化；

干细胞移植新进展等 篇3

辽宁省人民医院消化内科最近成功地为一名晚期肝硬化患者实施了骨髓干细胞肝内移植。该患者43岁，有10余年乙肝病史，5年前被确诊为肝硬化，经脾切除和断流手术，病情稍有缓解。但术后经常发作肝性脑病，已经到了肝功能衰竭的晚期。医生们采取患者自身骨髓干细胞移植，注入患者发生坏死的肝脏。术后患者恢复情况良好，原来经常发作的肝性脑病术后未再发作，肝功情况有所改善。据悉，待患者的骨髓干细胞恢复和增生到一定程度时，医务人员将择期为其再做一次干细胞移植手术，使患者受损肝细胞进一步恢复。

河南科技大学第一附属医院血液科最近为一名3岁的类风湿关节炎患儿实施骨髓干细胞移植，成功地挽回了患儿的生命。这名患儿治疗前持续低烧后继而高烧，四肢关节红肿，疼痛难忍，无法行走，被确诊为小儿类风湿性关节炎，生命垂危。医务人员从患儿体内抽取140毫升骨髓，净化处理后又移植回患儿体内，使患儿成功重建了正常的免疫系统，抵御有害细胞继续攻击患儿关节，健康地走出了无菌病房。

运用腹腔镜切除病肾

北京友谊医院近日应用腹腔镜微创技术，为一位曾在外院做过两次外科大手术的肾病患者，成功实施了肾脏切除手术。患者是一位中年女性，7年前因患先天性肾盂输尿管连接部狭窄，在外院做过两次手术。近年来患者左肾萎缩、积水加重，肾功能逐渐丧失并伴发高血压体征，住进北京友谊医院泌尿外科。专家诊断后认为，需要再次手术切除已失去功能的肾脏。但患者此前已做过两次大手术，再做开放性手术十分困难。经过认真慎重的研究．医生决定采取经腹腔入路的腹腔镜微创手术摘除肾脏。专家按照预定的方案，将内视镜和超声止血刀沿着患者左侧腹部两个约1厘米的切口进入肾脏病灶区域，在电视直接监视下，专家饶开病灶周围重要的神经和血管，游离肾蒂，暴露肾动、静脉，分别结扎、切断肾脏血管，然后剥离肾脏和榆尿管，吸除肾内积水，把缩小的肾脏从腹部切口取出。手术共进行了3个小时，术中出血极少，未进行输血。经过短期住院观察后，患者恢复良好，各项体检指标均正常，已平安出院。

据悉，像这样复杂的病例手术成功，在国内尚属首次。

北大医院完成首例肺移植术

近日，北大医院胸外科成功地为一位18岁的女性患者实施了肺移植术，这也是我国首例成功的肺移植术。

患者因髓母细胞病在外院手术后化疗，引起双肺纤维化，导致进行性呼吸困难，住进北大医院胸外科。鉴于患者情况，专家认为必须进行肺移植术，才能挽救患者的生命。经过认真研究，北大医院胸外科提前两个多月开始了积极筹划和周密准备。一方面积极联系肺的供体，一方面成立了以胸外科李简主任为首的肺移植小组，开展理论学习、讨论和大量的动物实验。取得供体后，立即为患者进行手术。在手术过程中，麻醉科、心外科、心内科的专家积极予以配合。鉴于患者术前肺功能差、氧合低，心外科提前准备配合体外转流。手术开胸后发现患者左侧胸腔内粘连严重，肺切除遭遇困难，在麻醉医生和体外转流支持下，病人度过最艰难的时刻。术中，心内科经食道超声严密监测患者的心功能和循环情况。肺切除后，供体肺吻合、支气管和肺动、静脉均一次吻合成功。手术后患者转入监护室，循环、呼吸状况平稳。目前病人恢复良好，已开始进行功能锻炼。

粉碎性骨折可以复原

粉碎性骨折从传统意义上来说是不可能完全复原的。但不久前北京大学第三医院近乎完美地创造了奇迹，成功挽救了一名全身八处粉碎性骨折的患者的生命，并用40多个钉子对其粉碎性骨折进行拼对，使其肢体得以重组完整。

造血干细胞移植的护理 篇4

1 移植前护理

1.1 供者的选择和准备

1.1.1 选择

其原则是以健康供者与受者的人白细胞抗原 (HLA) 配型相合为前提, 首选HLA配型相同的同胞, 次选HLA配型相合无血缘关系的供体。以年轻、男性、ABO血型相合和巨细胞病毒阴性者为佳。

1.1.2 配型

供、受者做HLA配型, 混合淋巴细胞培养、细胞遗传及基因检查等。自体移植的供者就是自己, 不需作HLA配型, 但身体情况应能承受大剂量放化疗。

1.1.3 采集造血干细胞

①骨髓采集:在手术室无菌条件下进行。供者髂前和髂后上棘多个部位抽取骨髓。移植前2周～3周对供者进行循环采血, 以保证骨髓移植时有足够的新鲜血液提供给供者, 此外可刺激骨髓造血干细胞生长。②外周血采集:通过血细胞分离机多次采集而获得。一般常于采集外周血前5 d～7 d, 给予供体皮下注射造血生长因子, 如粒-巨噬细胞集落刺激因子等。③脐血采集:在手术室进行。健康产妇分娩时待胎儿娩出后, 迅速结扎脐带, 以采血针穿刺静脉收集残留于脐带和胎盘内的血液。④造血干细胞的保存:零上温度保存即非冷冻保存, 细胞不经过冷冻损伤, 但保存时间短, 一般采用4 ℃冰箱保存。零下温度保存即冷冻保存, 将细胞保存于零下温度, 冷冻过程会造成细胞损伤或丢失, 但细胞保存时间长, 应用方便, 多在液氮中储存或直接放置到-80 ℃冰箱中冷冻保存。

1.2 无菌层流室准备

室内及其一切物品及空间均需严格清洁、消毒、灭菌处理。室内不同空间采样行空气细菌学检测, 合格后方可以进病人。常将造血干细胞移植病人安置于100级空气层流洁净室内进行严密的保护性隔离。

1.3 病人准备

①心理护理:解释造血干细胞移植的必要性、要求、程序、可能出现的并发症以及预防并发症的措施, 鼓励病人树立信心, 减少其紧张及孤独感。②消毒入室物品:衣被、药、食具、便器、书报等, 均需消毒处理, 以防外源性感染。③全面检查:特别要注意检查有无感染灶, 发现感染或者带菌情况应该积极治疗, 彻底清除慢性和潜在的感染病灶。④清洁身体:入室前3 d:每天口服不吸收抗生素, 食消毒饮食, 每天用1∶2 000氯己定液擦浴, 便后清洗或坐浴;每天两次0.05%碘伏擦拭外耳道、鼻腔及0.5%卡那霉素和0.1%利福平眼药水滴眼。入室前1 d:修剪指 (趾) 甲、剔毛发。入室当天:清洁灌肠。沐浴后经1∶2 000氯己定液药浴30 min, 更换无菌衣、裤、拖鞋方可入室。⑤预处理:造血干细胞移植前, 受者需要常规接受一个疗程超剂量的化疗和 (或) 全身放射线照射, 称为“预处理”。⑥静脉置管:移植前1 d行颈外静脉或锁骨下静脉置管术, 备用。

2 移植术中护理

①造血干细胞输注地点:造血干细胞输注在无菌层流室进行。②输注前用药:输注前遵医生嘱咐给予地塞米松5 mg静脉注射, 以减少输注反应。③输注时间:异基因造血干细胞在采集后当日用输血器经中心静脉插管快速静脉滴注, 护理人员要在床旁监护, 注意有无过敏、溶血反应等;自体干细胞或脐血干细胞, 在深低温下保存的置40 ℃水浴中迅速解冻静脉回输, 4 ℃保存的在48 h内静脉回输。④中和肝素:输注骨髓造血干细胞时另建一静脉通路输注鱼精蛋白以中和骨髓液中肝素。

3 移植后护理

3.1 移植早期护理

移植早期护理是整个治疗过程的关键, 一般指预处理到移植后20 d左右。此阶段病人免疫力极度低下, 容易发生严重感染、出血等并发症。因此, 应严格执行消毒隔离制度;认真观察病情变化, 每日测体温、脉搏各4次, 测血压、体重各1次, 详细记录出入量。观察病人皮肤黏膜有无出血, 有无恶心、呕吐及呕吐物、大小便的色、质、量的改变;嘱咐病人绝对卧床休息。

3.2 移植物抗宿主病 (GVHD) 护理

GVHD是异基因造血干细胞移植成功后最严重的并发症。系植入的供者T细胞与受者组织发生免疫反应, 引起受者组织损伤破坏。发生GVHD后治疗常较困难, 死亡率很高。单独或联合应用免疫抑制剂和清除T淋巴细胞是预防GVHD最常用的两种方法。①急性GVHD主要表现为皮肤、肠道的改变和肝功能异常, 通常发生在移植后100 d内, 发生越早, 预后越差。护理措施:给予无刺激、清淡、少渣半流质饮食;做好皮肤护理;注意观察病人大便次数和量的改变, 大量便血者应观察血压和心率变化;定期检测肝功能, 注意有无黄疸及严重程度。②慢性GVHD发生于移植后100 d之后, 主要累及皮肤、肝、肌肉、口腔和食管。护理措施:遵医嘱按时按量坚持应用免疫抑制剂, 注意观察药物不良反应。密切观察皮肤、肝、肌肉、口腔和食道病变情况, 发现异常及时通知医生, 做好各种救治工作。

3.3 移植后恢复期

正常情况下病人的白细胞、血小板回升, 一般情况转好。但因长期卧床, 体质仍较弱, 生活不能完全自理, 且仍有消化道症状, 应帮助病人做好生活护理, 鼓励进食高蛋白、高热量、高维生素、易消化的饮食, 协助进行适当活动, 增强机体抵抗力。

4 造血干细胞移植病人的无菌护理

入室当天, 病人用1∶2 000氯己定液药浴30 min, 更换无菌衣裤、鞋、帽, 戴无菌口罩, 送入洁净室。进无菌饮食: ①做熟的饭菜, 饮料经微波炉高火消毒后食用, 餐具每次同时消毒。②水果经1∶2 000氯己定液浸泡消毒30 min后去皮食用。③口服药片经紫外线正反照射各30 min后供病人服用。穿刺部位严格无菌消毒, 中心静脉插管局部换药, 每天1次。1%氯霉素、0.5%利福平眼药水交替滴眼, 每天4次。鱼腥草、链霉素滴鼻剂交替滴鼻, 每天4次。3%碳酸氢钠液、3%硼酸水、庆大霉素盐水含漱, 口腔护理每天3次。骨髓移植后, 近期以抗细菌感染为主, 中后期以抗真菌为主, 局部可涂擦制霉菌素甘油。75%乙醇棉签擦外耳道每天3次。每天以1:2 000氯己定液清洗全身1次, 注意保暖, 防止受凉。每次排便后以1∶2 000氯己定液清洗会阴部及双手, 0.05%活力碘涂擦肛门。排泄物的处理: ①呕吐物装于无菌塑料袋中。②尿排在洁净室内的便器中, 集中定时测量, 倒掉。③粪便可使用无菌塑料袋垫在便盆上, 便后取出弃之。洁净室内各种物品每天经高压蒸汽灭菌后更换1次, 或用1∶2 000氯己定溶液浸泡消毒2 h后更换1次。

5 注意事项

①预处理时输液量要充分, 并鼓励病人多饮水, 保证足够入量以稀释尿中药物和尿酸浓度, 防止出血性膀胱炎和尿酸性肾病。②输注注意点:因骨髓中的脂肪颗粒可以引起肺栓塞, 所以骨髓血干细胞回输前应将装有骨髓血的采集瓶倒置30 min, 使骨髓中脂肪浮于上层, 每袋骨髓液输至最后5 mL时弃去, 以防肺栓塞。③空气层流病房的消毒和监测空气层流病房分为四室。一、二室为缓冲间, 三室为相对无菌室, 四室为100级空气层流洁净室。100级空气层流洁净室为病人在行造血干细胞移植时居住的, 也就是在一般情况下, 1 min内1立方英尺的空间最多只能通过100个粒径大于等于0.5 μm的微粒子。空气层流病室的温度宜22 ℃～26 ℃, 相对湿度宜50%～70%, 噪声不过55 dB。空气层流设施每年检测1次, 一般每3年更换1次高效过滤器, 每6年更换1次中效过滤器。病人入室前, 整个病房首先用肥皂水 (洗衣粉) 或清水去污, 冲洗, 然后用氯消毒液 (一壶水加入四片爱尔诗) 擦洗。房间包括屋顶、墙壁、和地面, 设施包括病床、垫子、物品柜、床头柜、桌椅、心电图机、抢救车、治疗车等所有不宜高压灭菌的病房设备, 然后为了达到充分熏蒸消毒的目的, 物品摆放, 相互之间要有一定的距离, 打开柜门, 拉开抽屉。按每立方米空间40%甲醛10 mL, 加高锰酸钾5 g的比例进行熏蒸消毒。 (方法:一室一坐浴盆, 楼道一盆, 加入半瓶高锰酸钾, 然后倒入一瓶甲醛, 依次由内向外迅速跑出、关门) 2 d～3 d后开风机, 一般开风机24 h后作细菌培养。注意提前将封条弄好, 收拾好私人物品, 约需7个或8个盆。跑出后迅速封仓, 消毒密封时间最短为24 h, 如是新建造的空气层流病房, 最好连续消毒2次。病人入室前, 整个房间包括所有设施均用灭菌毛巾浸75%乙醇擦拭, 以去掉消毒造成的微尘。空气采样方法:空气层流病房的各室均设3个点, 高度为1.5 m, 中间一个点, 斜对角两个点。用直径为9 cm普通琼脂平皿自然沉降法检测, 打开盖子, 盖子口向下放在大于它的无菌处 (下可垫无菌纱布) , 暴露5 min后盖好送检。记录当时的温度, 相对湿度及人员活动情况。手得采样:首先被检人双手五指并拢伸平, 检验人员将浸有无菌生理盐水的棉拭子在双手指曲面, 从指根到指端来回涂擦各2次, 并随之转动采样棉拭子, 用无菌方法放入封闭的无菌试管内送检。④加强对病人的心理护理:随着现代医学模式的转变, 心理护理的作用日益受到重视。心理护理作为一门实践性很强的应用学科, 已得到普遍认可并广泛应用于临床护理实践。心理护理作为现代护理模式的重要组成, 应贯彻临床护理全过程, 遍及护理实践的每一个角落。做好心理护理, 掌握、提高交流技巧, 做好心理疏导。护理全过程中, 护士运用心理学的理论和技能通过各种方式和途径, 积极地影响病人的心理状态, 以达到较理想的护理目的。

摘要：造血干细胞移植是目前治疗白血病最为有效的方法, 从供者的选择和准备、无菌层流室准备、病人准备、造血干细胞输注地点、输注时间、移植后护理等方面对造血干细胞移植术的护理进行综述。

细胞移植 篇5

2.2 动物细胞工程 2.2.1 动物细胞培养和核移植技术

1．对某种动物的肝肿瘤细胞进行细胞培养，下列说法正确的是()A．取单个肝肿瘤细胞进行培养，获得细胞群的方法不属于克隆培养法 B．细胞培养过程中不需考虑细菌的污染问题 C．该培养液也能用来培养乙肝病毒

D．在原代培养过程中，培养的细胞最终也会出现停止增殖的现象

解析：A选项的描述属于细胞层次的克隆，A项错误。培养液受细菌污染后，其中营养成分要发生改变，不利于细胞的培养，B项错误。病毒的生存离不开细胞，用培养液不能培养病毒，C项错误。一般的细胞繁殖10代后，将停止增殖，D项正确。

答案：D 2．动物细胞培养过程的顺序是()①原代培养 ②传代培养 ③用胰蛋白酶处理组织，形成分散的细胞悬液 A．①②③

C．②①③

B．①③② D．③①②

解析：动物细胞培养过程的程序为选取幼龄动物或早期胚胎组织作培养材料→用胰蛋白酶处理组织，制备细胞悬液→原代培养→传代培养。

答案：D 3．用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织或细胞()A．容易产生各种变异 C．取材十分方便

B．具有更高的全能性 D．分裂增殖的能力强

解析：用于培养的细胞大都取自胚胎或幼龄动物的器官或组织，主要因为胚胎或幼龄动物的器官或组织分裂能力旺盛。

答案：D 4．某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞(甲)和正常肝细胞(乙)进行动物细胞培养。下列叙述正确的是()A．制备肝细胞悬液时，可用胃蛋白酶处理肝组织块 B．恒温培养箱中的CO2浓度维持在5%左右，以促进细胞呼吸 C．为了保证细胞培养所需的无毒环境，需大量添加各种抗生素 D．本实验应设置对照实验，以检测药物对甲、乙的毒性大小

解析：在利用肝组织块制备肝细胞悬液时，常用胰蛋白酶，不能使用胃蛋白酶，因为胃蛋白酶需要在强酸环境下才能起作用，但这样的环境不适于细胞生存，A项错误；细胞培养应在含CO2恒温培养箱中进行，CO2的作用是维持培养液的pH值，B项错误；抗生素是用来杀菌的，不是杀病毒的，C项错误；本实验应设置对照实验，用添加甲药物、乙药物的培养液分别培养细胞，根据变异细胞占培养细胞的比例，以检测药物对甲、乙的毒性大小，D项正确。

答案：D 5．如图表示动物细胞培养程序图，请据图回答下列问题。

①取动物组织块

↓ ②________

③处理组织分散成单个细胞

↓ ④制成________

↓

⑤转入培养液中进行培养

↓

⑥处理贴壁细胞分散成单个细胞，制成________

↓

⑦转入培养液中进行培养

(1)过程②表示________________________________________。

(2)过程③和⑥用________处理组织或贴壁细胞分散成单个细胞，这样做的目的是_______________________________________ ________________________________。

(3)④和⑥的过程都要把分散的细胞制成__________________。(4)过程⑤进行的细胞培养是________，细胞适于____生长增殖。

(5)过程⑦进行的细胞培养是________，一般传至______代后就不易传下去了，传至________继续培养时，增殖会逐渐缓慢，以至于完全停止，部分细胞的________会发生改变。继续培养时，少部分细胞发生了________，朝着等同于________的方向发展。

解析：进行动物细胞培养时，首先将组织块剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，使其分散成许多单个细胞，然后，用培养液将分散的细胞稀释制成细胞悬液，再将细胞悬液放入培养瓶内，置于适宜环境中培养。悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。以后，细胞进行有丝分裂，数目不断增多。当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就 会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。贴满瓶壁的细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分别继续培养，让细胞继续增殖，这样的培养过程通常被称为传代培养。

答案：(1)剪碎组织(2)胰蛋白酶 解除由于接触对细胞生长和繁殖的抑制(3)细胞悬液(4)原代培养 贴壁(5)传代培养 10 10～50代 细胞核型 突变 癌细胞

A级 基础巩固

1．动物细胞培养与植物组织培养的重要区别在于()A．培养基不同

B．动物细胞培养不需要在无菌条件下进行 C．动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能

D．动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株

解析：此题考查的是动物细胞培养与植物组织培养的区别与联系。动物细胞培养的培养基与植物组织培养的培养基不同，动物细胞一般用液体培养基培养，而植物组织培养一般用固体培养基，与植物组织培养的培养基相比，动物细胞培养的培养基中还要加动物血清等，A项正确。它们都是在无菌条件下进行的，都可以传代培养，且都能够大量培养。B、C、D项的叙述有误。

答案：A 2．下列关于动物细胞培养的说法正确的是()A．连续细胞系不具有异倍体核型

B．动物组织细胞间的胶原纤维可用纤维素酶水解

C．原代培养细胞、有限细胞系比无限细胞系、肿瘤细胞更容易克隆 D．提高动物细胞克隆形成率需要以滋养细胞支持生长及激素刺激等条件

解析：连续细胞系大多数具有异倍体核型；动物组织细胞间的胶原纤维的主要成分是胶原蛋白，可以用胰蛋白酶酶解，不能用纤维素酶水解；在进行细胞克隆时，原代细胞、有限细胞系通常不如无限细胞系、肿瘤细胞。

答案：D 3．一只羊的卵细胞被另一只羊的体细胞核移植后，这个卵细胞经过多次分裂，再植入第三只羊的子宫内发育，结果产下了一只羊羔，这种克隆技术具有多种用途，但是不能()A．有选择地繁殖某一性别的家畜 B．繁殖家畜中的优秀个体 C．用于保存物种 D．改变动物的基因型

解析：目前的克隆技术是将动物的一个细胞的细胞核植入一个去核的卵细胞，经过试管 培养一段时间后，再移入另一个体的子宫内发育、分娩的技术。通过该技术能够保持亲本的优良性状，保持性别不变，也能够用于保存物种，但不能改变动物的基因型。

答案：D 4．据英国《卫报》披露，纽卡斯尔大学研究人员不久前成功实现一项生殖医学技术，将患有线粒体疾病妇女的受精卵中的细胞核移植到健康妇女捐献的去核卵子中，最终产下了健康的婴儿。下列叙述错误的是()A．此项技术的基础是动物的细胞和组织培养 B．此项技术的原理与克隆羊“多莉”完全相同

C．健康妇女捐献的卵子的细胞质具有调控移入细胞核发育的作用 D．婴儿出生后具有患病夫妇以及捐献健康卵子的妇女三方的遗传特征

解析：动物克隆技术的基础是动物细胞和组织培养，A项正确；此项技术用的受精卵的细胞核，而克隆羊用的是高度分化的乳腺细胞，分化程度不同，B项错误；卵细胞的细胞质具有调控移入细胞核发育的作用，C项正确；该婴儿细胞的核基因由形成受精卵的夫妇提供，质基因由提供去核卵子的妇女提供，D项正确。

答案：B 5．2015年2月3日，英国国会表决同意允许医学界利用3个人的基因共同育子，成为全世界第一个准许“三亲育子”的国家。“三亲育子”技术是将父母细胞核基因与一位妇女捐赠者的健康线粒体结合在一起，引入的基因只占婴儿总基因的0.1%。这项技术旨在防止因线粒体基因缺陷引起的严重遗传疾病。下列相关描述正确的是()A．线粒体基因缺陷引起的遗传病是母系遗传病，传女不传男 B．“三亲育子”可能会用到人工授精技术、胚胎移植技术等

C．通过“三亲育子”技术得到的“三亲婴儿”的健康线粒体基因不一定能传给其后代 D．若父亲患有线粒体基因缺陷病，需要通过“三亲育子”技术避免将有缺陷的基因传给下一代

解析：线粒体基因缺陷引起的遗传病是母系遗传病，是由母亲的卵细胞传给子代的，表现为母亲患病子女都患病，A项错误；“三亲育子”技术主要利用的是胚胎工程技术，目前在生产实践中应用较多的是体外受精、早期胚胎培养、胚胎移植，B项错误；通过“三亲育子”技术得到的“三亲婴儿”如果是个女孩，其健康线粒体基因可以通过卵细胞传给其后代，如果是个男孩，其健康线粒体基因一般不能通过精子传给子代，C项正确；精子的线粒体都集中在尾部，且受精时只有精子的头部进入卵细胞，故男子的线粒体基因一般不能通过精子传给子代，若父亲患有线粒体基因缺陷病，子代一般不会患病，D项错误。

答案：C

B级 能力训练

6．回答下列有关动物细胞培养的问题：(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面相互接触时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的________。此时，瓶壁上形成单层细胞，这种单层培养法的出现，对细胞培养的发展起了很大的推动作用。

(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，但极少数细胞克服细胞寿命的自然极限，获得________，朝着等同于癌细胞的方向发展，该种细胞由于细胞膜上________减少，导致细胞间的黏着性________。

(3)在动物细胞体外培养过程中，一般要满足四个方面的条件：无菌无毒的环境、营养、温度、pH及气体环境，其中在培养液中添加________，以防培养过程中的污染；由于人们对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，故在使用合成培养基时，通常需加入________等天然成分；气体环境主要是提供细胞所需的O2和CO2，其中O2的作用是_____________，CO2的作用是______________________。

(4)动物细胞培养可用于检测某种物质的毒性大小，若用被检测物质培养的细胞与对照组相比，发生变异的细胞数目所占的百分比大，则该物质的毒性大，判断的依据是________________________。

答案：(1)接触抑制(2)不死性 糖蛋白 降低

(3)抗生素 血清、血浆 供给细胞进行有氧呼吸 维持培养液的pH(4)物质的毒性越大，越容易导致细胞发生变异

7．某生物兴趣小组对一种抗癌新药进行实验时，以动物肝癌细胞为材料，测定抗癌药物对体外培养细胞增殖的影响。请回答下列有关动物细胞培养的问题。

(1)在动物细胞培养时，将细胞所需的营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基称为________培养基。通常在培养基中还需要加入适量________等一些天然成分。细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是________________。另外，还应该保证被培养的细胞处于________、________的环境。

(2)在细胞生长过程中，当细胞贴壁生长到一定程度时，其生长会受到抑制，这种现象称为________。

(3)为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的________。(4)请你帮助兴趣小组的同学分析本实验，实验的自变量是________________，实验组和对照组除了自变量不同外，其他处理均应该相同，这是为了遵循实验设计的________原则。

解析：(1)将动物细胞所需要的各种营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于对细胞所需的营养物质还没有完全搞清楚，因此，在使用合成培养基时，还要加入一些动物血清、血浆等天然成分。细胞培养所需的气体中有CO2，作用是维持培养液的pH。被培养的细胞必须处于无菌、无毒的环境中，才能保证细胞正常地生长增殖。(2)动物细胞在分裂过程中有接触抑制的现象。(3)抗生素能杀死培养基中的微生物，保证无菌无毒环境。(4)要测定抗癌药物对体外培养细胞增殖的影响，实验的自变量为抗癌药物的有无。其他无关变量应该相同，否则会干扰实验结果，这种设计遵循的是实验的单一变量原则。

答案：(1)合成 血清、血浆 维持培养液的pH 无菌 无毒(2)接触抑制(3)抗生素(4)是否加入抗癌药物 单一变量

8．美国威斯康星州的一个奶牛场有一头奶牛，年产奶量达30.8 t，我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4 t。某人用该高产奶牛的耳朵细胞，采用核移植技术获得高产奶牛(如下图)。

(1)目前完成①的方法有______________、________________、________________、化学物质处理等。

(2)③过程中选择去核卵母细胞作为受体细胞的原因是 _______________________________________________________ ______________________________________________________。(3)④过程所利用的技术是_____________________________。其原理是______________________________________________ __________________________。

(4)该实验的成功说明已分化的耳朵细胞的细胞核中含有与________一样的全套基因，这种繁殖方式属于______________。

解析：进行动物体细胞核移植需用去核的卵母细胞作受体细胞，对构建的重组细胞需经历动物细胞培养，并诱导形成早期胚胎。重组细胞能够培育为动物体，表明动物细胞核具有全能性；克隆动物属无性繁殖。

答案：(1)显微操作去核 梯度离心 紫外光短时间照射

(2)卵母细胞体积大，易操作，营养物质丰富，且细胞质中含有激发细胞核全能性表达的物质(3)动物细胞培养 细胞增殖(4)受精卵 无性繁殖

9．华南虎是原产中国的老虎品种，已有近30年没有野生华南虎出现的报告，野生华南虎也被一些专家认为已经濒临灭绝。科学工作者尝试用普通老虎完成体细胞克隆华南虎的研究，下图是其培育过程，请据图回答：

(1)克隆华南虎的遗传性状与________(填字母)虎基本一致。(2)A、B、C 3只虎哪一只没有提供遗传物质？________。(3)克隆华南虎的过程是否遵循孟德尔的遗传定律？为什么？ _______________________________________________________ _______________________________________________________ ______________________________________________________。

(4)有人设想将虎的体细胞与牛的体细胞进行融合，以期获得新物种“虎—牛”，你认为依据目前的生物技术和理论能否实现这一愿望？________。原因是______________________________________ _____________________________________________________。

解析：(1)由克隆华南虎的过程可知，华南虎A提供细胞核，华南虎B提供细胞质，所以克隆虎D的遗传性状与供核的A更接近，即相当于克隆了A。(2)老虎C只提供胚胎发育的场所，没有提供遗传物质给D。(3)核移植过程没有经过两性生殖细胞的结合，属于无性生殖，没有减数分裂方式的出现，不遵循孟德尔遗传定律。(4)无论是高度分化的动物体细胞，还是不同种动物体细胞融合后的杂交细胞，经细胞培养只会细胞增殖，不会发生细胞分化，形成不了个体，动物体细胞的全能性无法体现。

答案：(1)A(2)老虎C(3)不遵循。克隆属于无性生殖，而孟德尔的遗传定律仅在有性生殖的减数分裂过程中起作用

细胞变墨水，3D打印器官在移植 篇6

3D打印技术已经有将近20年的历史，使得多功能、个性化的创意设计成为现实。现在的“3D食物打印机”已可以实现放入食品原料，输入菜谱后输出美味佳肴；“3D塑料打印机”使得各种奇形怪状的玩具、珠宝等塑料品进入人们的生活；环保又安全的3D打印汽车不再是科幻电影中的某个场景；各种个性款式的衣服也可以通过3D打印机来实现。总而言之，3D打印引领了个性化时代，应用广泛，几乎无所不能。而其中一个非常重要的领域就是3D打印在医学上的应用，3D生物打印机更是掀起了医疗界的又一场革命，它是等待器官捐献患者的一大福音。

3D打印的基本工作原理

所谓3D打印即是一种通过前期的计算机设计，利用喷墨打印的方式打印出真实三维立体结构的技术，简单说就是电脑和打印机的结合。通过前期计算机关于物体的结构、形状和颜色等各个细节的设计，再到后端的打印设备（也就是我们通常称为的3D打印机），打印机的喷头根据电脑中的空间扫描图或三维设计立体虚拟图慢慢喷出所用原材料到多个薄层上，像“叠罗汉”一样层层将二维图像砌成精确率极高的立体实物，这种工艺与激光成型技术类似，都是采用分层加工和叠加成型的两步，实质就是二维平面印刷的叠加，将计算机设计的图像打印出平面的层（最薄的层可以达到100μm厚度），层与层之间根据要求再添加一些诸如聚酰胺塑料粉、钛粉等特殊粒子，通过离子束或电子束使得层与层之间紧密胶合形成最终的立体实物。其与传统的去除材料减法工艺完全不同，完全省去了金属切割、研磨打孔等繁琐的工艺环节，同时赋予设计制作无穷的设计自由，只有设计不出来的，没有打印不出来的。同时还有一种方法也可以形成三维立体结构，通过激光或胶水先造出一个材料为树脂、金属或塑料的三维结构模型，然后根据具体的计算模型往上一点点添加原材料，这种三维印刷技术又叫做“添加印刷技术”。

3D打印在医学上的应用

3D打印在医学上的应用原理

3D打印在医学上的应用，同样基于上述基本原理，通过对连续物理层的创建获得细胞组织甚至是器官。具体也是分层加工和叠加成型两步，首先在需要成型的区域喷洒液滴非常小且不易扩散的“特殊胶水”，随后均匀喷洒一层粉末，有胶水的地方类似于阳图中的文字部分迅速固化凝结，无胶水部分保持松散状态，类似于空白部分，在后期处理过程中再去掉。这样层层胶体叠加，实体模型被打印出来。只不过在生物打印上，具体的材料则由传统的耗材改为生物耗材。

3D打印在医学上的原料

在生物打印中，所用材料分别被称为“生物墨”和“生物纸”，其中生物纸主要成分就是水的凝胶，它包含两种糖分子链，当添加一种反应性的化学物质时，两种链发生交联作用得到一种无纺布化学等价物，从而在几分钟之内从液体变成凝胶，其破裂形成碎片再重新建造的过程为细胞增值生长组织重生提供骨架，也可以使用“热逆”凝胶（一种无毒、可以进行生物降解的黏合剂，具有逆热的特性，温度低于20℃时呈液态，高于20℃则呈固态）；生物油墨则是从骨髓或脂肪中按照相应要求提取的干细胞，然后将其放在一个营养丰富的液体环境中，通过不同类型的成长因子培养分化为不同类型的细胞，如血管和心瓣膜的细胞，将这些细胞分散成液滴状以供喷墨打印使用（保持每个液滴具有1到3万个细胞的黏稠度），同时对喷墨头的性能也具有一定的要求，必须能够保持一定速度和数量的喷射出人体细胞（通常细胞以1inch/s的速度射出，加速度可达到1000倍重力），这就满足了生物打印的油墨要求。

3D打印出细胞器官的工作流程

生物纸和生物墨提供好以后，相关技术人员通过测量病人的伤口等诊断工作获取相关数据，输入计算机计算设计出相应模型，确定最终需要的细胞数量范围和模型分布，按照要求将足够的细胞装入生物打印机的“墨盒”中，充当油墨的细胞和充当纸张的液体水凝胶能够融合连接在一起，彼此接触慢慢形成水凝胶固体层，最后在计算机设计的三维模型的控制下足够的固体层层层叠加，细胞融合到组织形成三维空间结构，得到最终的打印品。这就以喷墨印刷的方式，完成了“墨盒”中相应组织细胞的“定点植入”，这就是3D打印实现器官细胞打印的整个过程。简单来说，就是将细胞打印在培养皿中得到的液体水凝胶上，打印机反复添加液体、化学成分和细胞，一层层地把组织层制造出来，最终叠加创造出三维的生物机体，具体流程如图1和图2所示。

生物器官打印的所要思考的问题

通过3D打印来实现生物器官的按需印刷，利用所需要的细胞来进行组织和器官的再造，在理论上是完全行得通的，而且已经有相关实验取得成功，误差可以控制在20微米以内，得到的器官也可以显著降低排异反应。但应该看到，这种打印机目前还处于实验阶段，也只是复制一些简单的器官，比如皮肤、肌肉和较短的血管等，而且主要以研究为目的，包括动脉和静脉血管以及其他身体器官等较为复杂的器官，如何制造并改进是值得思考研究的。有相关文献上写到对于复杂的器官，可以先用水溶性材料打印一个用于排列细胞的“支架”，通过细胞的排列来完成器官的再造，一旦完成打印就清洗掉支架，进而可以实现随时更换器官的远景目标。再者复制器官内部错综复杂的滋养器官为器官供养的血管网络同样是非常困难的，这对计算机模型的设计人员和电脑本身的数据处理软件开发人员提出了巨大的挑战，为此相关文献提出最好的办法可能是打印出一个器官最大的连接性血管，然后给那些大血管细胞留出充足的时间、空间和理想环境自造剩余血管，足够大的空间同时可以保证在打印的过程中为细胞提供充足的氧气和养分，解决了复杂器官的正常循环和新陈代谢，最终器官便可以被植入体内，经科学家预测，通过世界上第一台“三维生物印刷机”可在2015年内“印刷”出直接用于心脏搭桥手术需要的动脉，在2020年内“印刷”出心脏和肝脏等重要器官。

细胞移植 篇7

1材料与方法

1.1 临床资料

患者, 女, 58岁, 与2006年8月21日入院, 经过CT显示右肺占位, 做病理后确诊为sCLC局限期。

1.2 aSCT动员、采集、保存及回输

1.2.1 aSCT动员

采用大剂量化疗加动员剂进行动员。方案:紫杉醇 (135mg/m2) +卡铂 (AUC=5) +VP-16 (75mg/m2) , 第1天至第3天, 四个周期 (每个周期10天) 获得完全缓解后, 给予动员剂重组粒细胞集落刺激因子rhG-CSF (Kirin公司产品) 5～10μg/kg皮下注射, 共5～10天[2]。

1.2.2 aSCT采集、保存及回输

当外周血WBC>1.0×109～5.0×109/L, PLT>20×109～50×109/L, 外周血CD34 (+) 细胞>1%时开始采集。使用CS-3000plus细胞分离机 (美国Baxter公司生产) 。分离夹用GRANULO, 收集夹用A-35, 全血流速55mL/min, 全血∶抗凝剂为10∶1, 终点量值10 000mL (根据需要确定) , 1 000mL生理盐水, 500mL抗凝剂 (ACD-A) , 600mL转输袋, 以及消耗品管路一套。按程序进行采集。采集的aSCT 200mL在4℃冰箱保存, 待预处理72小时后经静脉回输。

1.3 预处理方案

基本方案为紫杉醇175mg/m2+卡铂 (AUC=7) +VP-16 (600mg/m2) , 第1天至第3天。

1.4 支持治疗与并发症的防治

患者于预处理方案进行前一天住进无菌层流净化病房。根据患者进食情况适当给予肠外营养。强迫利尿, 水化, 5%碳酸氢钠化尿液及Mesna预防出血性膀胱炎, 常规口腔及肛周护理, 在粒细胞缺乏期防感染而用广谱抗生素[3]。

2结果

移植后患者获得了造血重现, MNC≥0.5×109/L及PLT≥20×109/L。没有出现预处理后的不良反应, 也未出现严重感染及出血性膀胱炎等严重并发症。移植后的生存期已达300天。

3讨论

近几年来aSCT正在越来越广泛地应用于治疗恶性肿瘤, 而sCLC对化疗高度敏感, 许多学者多选择局限期患者中诱导化疗达CR或接近CR的患者, 将aSCT作为后强化治疗手段。这样它可以使肿瘤患者耐受大剂量化疗, 最大限度杀伤肿瘤细胞, 而且由于造血重建快, 从而减少了出血感染的机会, 降低了治疗费用, 体现了aSCT的优越性[4]。有研究表明, 采集的aSCT在4℃可以安全保存4～5天, 期间患者可接受大剂量化疗。我们采集的aSCT也采取在4℃保存的方法, 无需超低温保存设备及技术, 这不仅可简化移植过程, 降低医疗费用, 也可减少aSCT在体外被污染的机会, 该患者目前仍处于CR中。对于患者提高了其生存率, 但aSCT治疗sCLC长期疗效还有待进一步观察[5]。

参考文献

[1]张季平.临床内科学[M].天津:天津科技出版社, 1999:1888.

[2]张继良, 何华.自体造血干细胞移植治疗小细胞肺癌的护理[J].护理学杂志, 2003, 18 (1) :21-22.

[3]达万明.自体造血干细胞移植治疗恶性淋巴瘤的近况[J].中华血液学杂志, 1996, 17 (10) :554-557.

[4]杨建伟, 陈强, 蔡雄超, 等.自体外周血干细胞移植支持大剂量化疗治疗恶性淋巴瘤[J].福建医学杂志, 1998, 20 (5) :35-36.

细胞移植 篇8

法, 用于临床移植的造血干细胞 (HSC) 来源有外周血、骨髓和脐血。大量临床研究表明, 外周血造血干细胞移植 (PBSCT具有供者不麻醉, 患者易接受;可获得较多造血干细胞数, 造血以及免疫重建快, 因此发生感染、出血的机会减低, 同时, 需要输血减少也会减少GVHD的发生和严重程度。移植后造血功能的重建主要取决于输入HSC的数量和质量[1], 输入的移植物中必须含有足够数量的造血干细胞才能保证移植受者获得快速持久的造血重建。因此, 临床上快速而准确地检测移植物中造血干细胞水平, 能够确保移植成功, 在造血干细胞移植中有重要意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2006年4月-2012年8月, 32例患者 (男18例, 女14例, 中位年龄32岁) 在我院进行外周血造血干细胞移植。25例自体、7例异基因 (5名父系供者, 2名同胞供者, 男5例, 女2例, 中位年龄28岁) 接受rh G-CSF 5μg.kg-1, 皮下注射, 第5天上午给予rh G-CSF 2小时后用全自动血细胞分离机以MNC程序进行PBSC采集。32例患者均进行MNC计数、CD34+细胞计数。最低限MNC>4×108/Kg, CD34+细胞细胞数>4×106/Kg, 比较两种计数指标对造血重建的影响。

1.2 MNC检测

将EDTA抗凝的造血干细胞移植物应用全自动血细胞分析仪 (美国贝克曼公司生产LH-755) 进行干细胞计数 (WBC×109/L) , 同时做移植物涂片两张, 用贝索公司生产的瑞氏-姬姆萨染液染色, 在显微镜下分类计数MNC, HSC直径8um, 胞体圆形, 胞浆量极少。两次计数200个有核细胞, 取均值。计算公式:MNC计数 (108/kg) =WBC×MNC%×移植物容积/受者体重。

1.3 CD34+细胞检测

采用BDFACSCalibur型流式细胞仪 (美国BD公司) 检测, PE一抗CD34+细胞单抗为法国Immunotech公司产品, 按常规测定计算CD34+细胞计数 (106/kg) 。

2 结果

2.1 输入MNC和CD34+细胞数

(1) 32例受者输入MNC的中位数为6.75 (2.92-18.76) ×108/Kg, 输入CD34+细胞的中位数5.03 (2.35-15.14) ×106/Kg; (2) 32例受者造血重建均达到了100%。

2.2 MNC组和CD34+细胞组造血重建时间 (见附表)

附表MNC组和CD34+细胞组造血重建时间的比较

项目MNC组CD34+细胞组ANC>0.5×109/L时间+9d (+9-+14) +9d (+9-+21) PLT>20×109/L时间+11 d (+9-+42) +11 d (+9-+38) 植活率100%100%

*中位数 (范围, d) *ANC=中性粒细胞计数*PLT=血小板计数。*ANC>0.5×109/L和PLT>20×109/L为造血功能重建的标准。

3 结论

CD34+表面抗原是造血干细胞重要标记之一, 检测方法是流式细胞术 (FCM) [2]。但部分单位不具备购买流式细胞仪的条件, 不能检测, 另外, FCM检测CD34+细胞的方法缺乏统一标准, 在不同实验室的结果会有很大差异。实践证明, 动员后供者外周血MNC与CD34+细胞计数呈显著正相关, MNC与CD34+细胞同步增加, MNC可用来估计外周血CD34+细胞的水平[3]。MNC计数不用流式细胞仪, 仅用显微镜及全自动细胞分析仪两种仪器即可, 具有设备要求低、结果准确、稳定、操作省时等优点[4]。本组一例女性急性髓性白血病患者, 检测CD34+细胞数未达到快速造血重建的数量, 而MNC计数已达到造血重建的数量, 根据经验我们未增加采集次数, 该受者移植后造血功能重建顺利。该现象提示, 单独应用MNC计数能可靠预示造血重建。因此, 用MNC计数取代CD34+细胞计数来作为造血干细胞移植中造血干细胞含量的指标是完全可行的。

摘要：目的 探讨造血干细胞移植中单个核细胞 (MNC) 计数与CD34+细胞细胞计数之间的比较。方法 2006年4月-2012年8月, 32例患者 (男18例, 女14例, 中位年龄32岁) 在我院进行外周血造血干细胞移植。25例自体、7例异基因 (5名父系供者, 2名同胞供者, 男5例, 女2例, 中位年龄28岁) 接受统一的动员方案, 用全自动血细胞分离机以MNC程序进行外周血造血干细胞 (PBSC) 采集。32例患者均进行MNC计数及CD34+细胞计数, 进行相关分析, 比较两种计数指标对造血重建的影响。结果 ①32例受者输入MNC的中位数为6.75 (2.92-18.76) ×108/Kg, 输入CD34+细胞的中位数5.03 (2.35-15.14) ×106/Kg;②32例受者造血重建均达到了100%。。结论 MNC作为造血干细胞含量的计数依据, 其植活率和植活速度与CD34+细胞作为依据的病例相似, 结果表明:MNC计数完全可代替CD34+细胞计数, 可作为造血干细胞移植中造血干细胞含量的指标。

关键词：造血干细胞移植,单个核细胞,CD34+细胞

参考文献

[1]Bensinger WI, Longin K, Appelbaum FR, et al.Peripheral bloodstem cells (PBSCs) collected after recombination human granulocytecolony-stimulating factor (rhG-CSF) :an analysis of factorscorrelating with the tempo of engraftment after transplantation.Br JHematol, 1994, 87:825-831.

[2]张之难, 杨天楹, 郝玉书.血液病学 (下册) [M].北京:人民卫生出版社, 2003:2011-2059.

[3]温丙昭, 李玲, 丁凌录, 等.供者单采外周血中幼稚粒细胞检测的研究[J].白血病, 2000, 9 (3) :136-138.

细胞移植 篇9

目前,肉羊胚胎移植工作在全国大部分养殖地区正如火如荼的进行,由此,给肉羊产业化的发展带来了契机,逐年增大纯种肉羊在我国本地羊群中所占的比例,可预见未来几年,我们在餐桌上就将见到颜色鲜美、口感好、脂肪含量低的高档羊肉进入到餐馆。近年来,新疆地区在肉羊胚胎生产及胚胎移植中的投入不断增大,在多地开展了肉羊胚胎移植工作,如:克拉玛依、昌吉、哈密、二师、三师和十师等地,开展了千枚或万枚胚胎移植工程。这些工程的逐年实施将给新疆本地肉羊发展和育种工作带来便利,迎来肉羊育种的曙光。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物来源本试验材料来源是克拉玛依市白碱滩区肉用羊研究所提供的萨福克、陶赛特、白萨福克和杜泊肉羊。选择繁育过1胎以上的成母羊,年龄段在3~5岁,发情周期正常,无生殖道疾病,膘情适中。

1.1.2主要药品和试剂常用消毒、药品有:新吉尔灭,500 ml/瓶(辽宁修正生物制药有限公司);75%酒精:100 ml/瓶(新疆佳宁八四消毒液制品有限公司);碘酒:500 ml/瓶(新疆佳宁八四消毒液制品有限公司)。

促卵泡素(FSH)400 mg/瓶(加拿大);氯前列烯醇(PG)0.2 mg/支(上海计划生育研究所);孕马血清促性腺激素(PMSG)1 000 IU/瓶(宁波三生药业股份有限公司);促黄体生成素(LH)200 IU/支(宁波三生药业股份有限公司);CIDR 20个/包(新西兰进口);冲胚液、胚胎保存液等为ICP公司;黄体酮注射液;麻醉药、解麻药和长效土霉素为国产。

1.1.3主要器材常用器材:恒温水浴锅、恒温台、实体显微镜、剪毛剪、止血钳、帕巾钳、手术刀柄和刀片、镊子、手术保定架、平皿(100 mm、35 mm)和四孔板、冲胚管、捡胚针、缝合针和缝合线、采精设备等。

1.2方法

1.2.1供体超数排卵供体羊采用CIDR+FSH+PMSG+LH法进行处理,FSH总剂量为12.2 ml,递减肌肉注射,每天2次,间隔12 h。放置CIDR阴道栓的第1天设置为0 d,第9~11 d开始肌肉注射FSH,分7次注射,共计注射剂量为12.2 ml,在FSH倒数第2次肌肉注射时,撤出CIDR栓并肌肉注射PMSG,移除CIDR后的24~48 h开始试情,如有发情立即静脉或肌肉注射LH,在发情后的6~8 h阴道输精或10~18 h后采用子宫角输精,在输精后的第6天,采取手术法取胚胎。在手术法取胚胎前的24 h,要给供体羊控食、控水,等待手术。

1.2.2受体同期发情处理受体羊为了降低成本一般是放置海绵栓,放置第1天为0 d,撤栓时间安排在供体羊移除CIDR栓前的6 h受体羊移除海绵栓,同时肌肉注射PMSG,24~48 h受体羊试情,并标记记号,记录发情日期,待供体冲胚日进行受体移植工作。

1.2.3胚胎移植二细胞期胚胎移植采用的是手术法移植,在受体羊后腿两侧芡窝部剃毛、消毒和脱碘,技术人员勾或夹出子宫角细端,另一技术员翻开找到输卵管伞部,并将移胚针从伞口插入输卵管5~12 mm处,将二细胞胚胎放置在此处,缝合后,消毒,待45~60 d时妊娠检查。

1.2.4试验结果进行X2检验。

2结果与分析

2.1不同肉羊品种对FSH超排效果的影响

4个不同肉羊品种经FSH超数排卵后,卵巢上红体数、卵泡数以及获得二细胞胚胎数、未受精数,详见表1。从表1中可以看出,4个不同肉羊品种,经超数排卵处理后,平均每只供体获得二细胞胚胎数为11.5枚,获得较好的效果。

注:同一上标表示差异不显著。

2.2不同肉羊品种二细胞胚胎受胎率

4个不同肉羊品种二细胞胚胎,经镜检分类,挑出分裂不好的胚胎,搭配正常二细胞胚胎,输卵管伞端移植,于45~60 d B超检查,怀孕阳性率平均达到62.3%。详见表2。

注:同一上标表示差异不显著,不同上标表示差异显著。

3讨论

3.1不同肉羊品种获得二细胞胚胎数分析

本试验中采用同一厂家的、同一型号的激素,并采取同样的激素处理剂量和方案,得到较好的结果。通过对不同品种试验得出的数据可知,本文所列四个肉羊品种中,平均获得可用二细胞期胚胎11.2枚,平均回收率85.2%,二细胞期胚胎位于输卵管伞端或壶腹部,胚胎集中分布,取卵时从宫管结合部打孔插入先穴式冲胚针,使用冲胚液较少,冲胚液回流好,胚胎回收率高,且易于捡胚操作。在这四个萨福克、陶赛特、白萨福克和杜泊肉羊品种中使用同一超排方案平均获得胚胎10.2、10.3、12.2和14.6枚。通过目测这四个肉羊品种体重均在60~80 kg,说明了基本相同体重的情况下,品种之间的差异不大。同时,因为这四个肉羊品种均为进口品种,且双羔率基本维持在5%~15%左右。从以上两个方面说明了体重悬殊不大和双羔率较低的供体肉羊,在同一超排方案下可以取得较好的胚胎生产效果。

3.2不同肉羊品种二细胞胚胎的移植受胎率

本试验中将获得的全部二细胞期胚胎用于移植研究,从得到的数据可以看出,二细胞期胚胎移植受胎率为62.3%,取得较好的受胎结果,可能与二细胞期胚胎正在处于细胞分裂的基数分裂期,细胞活动旺盛,不易损伤细胞;或二细胞期胚胎移植部位在输卵管壶腹部,更有利于二细胞期胚胎的继续发育[10]。但是二细胞期胚胎移植的成功率受到移植的二细胞期胚胎数和供、受体羊生殖生理周期的同步化程度密切相关[11]。与桑椹胚或囊胚移植相比,在胚胎移植时桑椹胚或囊胚直接移植到子宫角小弯,而二细胞期胚胎则直接被移植送至输卵管壶腹部,这样更有利于胚胎进一步发育,对随后的胚胎着床更为有利[12,13,14]。

哺乳动物细胞核移植研究进展 篇10

1 核移植技术的国内外研究现状

细胞核移植技术是德国发育生物学家Spermann[1]于1938年为解决核质相互关系问题提出把分化的细胞导入去核的卵母细胞中并观察其胚胎发育情况的研究,同年他还提出将任何时期的细胞核注入去核卵母细胞内然后通过观察其发育能力就可以确定该时期细胞核的发育潜能的设想。但由于当时核移植技术条件的限制,用分化的细胞未能获得成功。直到20世纪50年代,才有两栖类美洲豹蛙和非洲瓜蟾克隆的报道(Briggs和King,1952)。随后Gurdon等用蟾蜍、蝌蚪的肠上皮细胞和体外短期培养的完全分化的体细胞进行核移植分别获得成体蟾蜍和蝌蚪,证实两栖类已分化细胞的基因组具有结构上的完整性和功能上的全能性。此后,人们转向哺乳动物细胞核移植研究。

哺乳动物核移植研究的最初成果在1981年取得,Illmensee和Hoppe[2]用鼠内细胞团细胞直接注入去核的合子后,培育出发育正常的3只小鼠。但这一试验未能被重复出来;1983年,Mc Grath和Solth首次利用显微操作技术和细胞融合技术,以单细胞期的小鼠胚胎作为供核细胞进行核移植,得到了核移植后代,并建立了重复性很高的核移植操作程序[3];1994年,Collas和Barrnes将供核细胞通过卵母细胞内直接注射的方法构建了核移植重构胚胎,并得到了犊牛[4];这一时期许多研究者对胚胎干细胞和成年动物体细胞的核移植试验也做了大胆尝试,但进展不大。1997年,在细胞核移植研究历史上发生了一件具有轰动效应的事件,英国罗斯林研究所的研究人员首次利用成年母绵羊的乳房上皮细胞,通过细胞核移植技术得到了体细胞克隆羊———“Dolly”[5],“Dolly”的出生以事实向人们证明,完全分化的体细胞不仅可以被逆转,而且完全可以发育成一个新的个体。从此以后,全世界掀起了体细胞克隆的热潮。1998年Wakayama等利用小鼠卵丘细胞进行体细胞核移植研究获得成功[6];1999年Wells等用牛颗粒细胞进行核移植也获得了成功[7]。至2002年,Keefer等[9]人将91枚重构胚移植到8只受体山羊体内,50%受孕,生出7只小山羊,核移植效率明显比以前提高。迄今为止,全世界已有乳腺细胞[5]、卵丘细胞和输卵管上皮细胞[8]、颗粒细胞[7]、肌肉细胞[10]、皮肤细胞[11]、睾丸支持细胞[12]、胎儿成纤维细胞[9]和耳皮肤成纤维细胞[13]等9种体细胞克隆后代成功诞生。

我国的细胞核移植技术研究开始于20世纪60年代。1963年,著名试验胚胎学家童第周利用胚胎细胞克隆技术进行鱼类囊胚细胞核移植研究,在70年代获得属间和种间核移植鱼。上个世纪九十年代起,国内学者开始进行哺乳动物克隆研究。1991年,张涌等[14]利用4~32细胞的胚胎克隆了5只山羊。2000年,杨向中领导的科研小组,用一头17岁高龄奶牛耳皮肤细胞进行体细胞核移植研究,获得了6头体细胞克隆牛[15]。标志着中国已完全掌握了世界一流的体细胞克隆牛技术,从1997年到现在短短几年的时间里,在体细胞核移植领域里,人们相继在牛、山羊、猪、猫和兔等多种动物上取得了成功。

2 目前核移植技术中存在的问题

2.1 体细胞克隆成功率低

同体外授精相比,效率低是目前核移植技术应用发展中普遍存在的现象。主要表现在:囊胚发育率不稳定,移植后受胎率低,出现畸胎、死胎、流产以及出生后早亡率高,造成效率低。但不同的学者对此产生的意见却不一,有人认为是培养条件未达到最佳化,也有人认为是细胞的问题,现有资料表明,即使应用体内培养的方法成活率也不过10%,看来试图通过改进培养体系来提高核移植效率还无从着手。因此,要更深入地研究核质间的互作机理,以便使核移植技术得到进一步改善。

2.2 供体核与受体胞质细胞周期同步的问题

第一次体细胞核移植获得成功的重要因素之一就是对细胞周期同步化的认识,而且研究人员也首次认识到应用G0期细胞的必要性。目前体细胞核移植中常用的方法就是将处理后的供体细胞核移入到去核的MII期卵母细胞中,迄今为止,几例成功的猪体细胞核移植研究中,都采用了去核的成熟MII期卵母细胞作为核受体。大多数研究者认为用成熟的去核MII期卵母细胞作为核受体,有利于启动已分化的供体核在重构胚中的再程序化,保证一定的核移植成功率。当用去核的MII期卵母细胞作为受体细胞时,必须使供体细胞与受体细胞的细胞周期同步化,这样有助于重组胚胎的发育。在卵母细胞激活后,MPF活性下降、染色质去凝集,在核膜重建的过程中DNA复制,染色体加倍,因而核移植时供体细胞周期的选择对于第一次细胞分裂末期,染色体二倍体的保持是很重要的。

2.3 体细胞基因突变和其他遗传问题

研究证明,基因突变与DNA复制次数有着密切的关系,分裂次数越多的体细胞,发生突变的可能性越大。对于核移植材料来源方面,这是不可避免的问题。如果把动物的基因组弄清楚,并能对体细胞的突变基因加以修复的话,核移植的效率一定能够得到大大的提高。

3 哺乳动物核移植技术的应用前景

3.1 扩大优良育种群和拯救濒危动物

采用核移植技术可加速育种的过程,在短时间内有效地扩大种群的数量,保持种群的性状,避免了自然交配所带来的优良性状的分离和减弱。将核移植与基因打靶相结合,可以对物种的基因进行定点修饰,产生具有优良性状的新品种。用家畜的体细胞进行(下转第97页)(上接第33页)基因打靶可将我们感兴趣的目的基因插入到特定的位置,把筛选出的阳性克隆作为核供体进行核移植,这样便可获得组织特异性表达的转基因动物。

3.2 体细胞克隆技术在医药生产方面的价值

将体细胞克隆技术与生物反应器的生产制作技术结合可以对体细胞进行转基因或基因组修饰后,制作生产生物反应器利用动物的乳腺、膀胱等器官,生产治疗人类疾病、保健所需的蛋白。许多全球知名的生物技术企业尤其看重体细胞克隆技术在这些方面的应用价值,纷纷投资科研机构开展研究,实际上第一个体细胞克隆动物绵羊Dolly的诞生就是这种动机的直接产物。

3.3 在临床方面的作用

通过深入研究细胞核质的相互作用控制胚胎细胞的分化方向,有望获得适合向人体移植的具有遗传改变的动物器官。通过细胞核移植技术可以避免不必要的免疫排斥作用。目前,人们已经利用体细胞克隆技术获得了小鼠-小鼠、人-兔、人-人ES细胞系,并已经在小鼠模式上开展了如帕金森氏症等神经退行性疾病的治疗尝试。

4 结语

有关动物细胞核移植过程的思考 篇11

人教版普通高中课程标准实验教科书《生物·选修三》——《现代生物科技专题》47页给出的动物细胞核移植的观念为：动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。同时，教材48页还以图解的形式提供了克隆牛的培育过程（具体过程略。请参照此教材48页《体细胞核移植过程流程图》）。

核移植的概念强调的是核的移植，但在操作过程中却是将供体的细胞植入了受体细胞——去核的卵母细胞。上课时有学生就提出了此问题。其实我在备课的时候也想到了，但没有深究，过后就给忘了。哪想在我校高三（2）班上课时，有个别同学在课堂直接就提出来：体细胞核移植过程和概念不符，是不是错了？我强调：“概念肯定没有错的，大学教材也是这么定义的，此操作过程中之所以将整个受体细胞注入是为了提高成功率。”其实在内心深处，我说这句话的底气是不足的，我为自己没有认真研究教材而感到惭愧。

上完高三（2）的课，我就马上查阅相关资料，研究此问题。首先我们看一下克隆羊多利的培育过程：

“多莉”绵羊是如何“创造”出来的呢？Wilmut等学者先给“苏格兰黑面羊”注射促性腺素，促使它排卵，得到卵之后，立即用极细的吸管从卵细胞中取出核，与此同时从怀孕三个月的“芬多席特”六龄母羊的乳腺细胞中取出核，立即送入取走核的“苏格兰黑面羊”的卵细胞中；手术完成之后，用相同频率的电脉冲刺激换核卵，让“苏格兰黑面羊”的卵细胞质与“芬多席特”母羊乳腺细胞的核相互协调，使这个“组装”细胞在试管里经历受精卵那样的分裂、发育而形成胚胎的过程，然后，将胚胎巧妙地植入另一只母羊的子宫里进一步发育。Wilmut等人一共进行了277次这样的乳腺细胞移植实验，获得29个发育为8细胞的“胚”，分别移植入13头代孕母亲的子宫中。1996年7月5日，原始记录为6LL3的羊羔出生了，它被命名为“多莉”。

通过克隆羊的培育过程我们确实看到在此过程中是将供体细胞的细胞核植入了受体的去核卵母细胞（以上材料来自百度百科——克隆技术——克隆多莉羊）。

我们再阅读下面的来自《基础生命科学》第二版197页有关“克隆羊培育过程”的部分文字：将来自一头6岁的白色芬兰母羊（核供体）的冷冻乳腺上皮细胞取出，并进行营养限制性培养。然后通过电脉冲技术使芬兰母羊乳腺细胞中的细胞核释放并融合进入到去核的苏格兰黑面母羊卵细胞的细胞质中。电脉冲还进一步刺激了这种重组卵细胞一周内分裂了3次，形成8细胞的“胚”。8细胞的“胚”最后被植入另一头苏格兰黑面母羊（代孕母亲）的子宫内进一步发育。

通过这些资料显示，可见在克隆羊的培育过程中确实是将受体细胞的细胞核取出后，再植入了受体细胞中的，这对体细胞核移植的概念做了非常完美的阐述。但这并不意味教材48页《体细胞核移植过程流程图》或克隆牛过程中将供体细胞（不是细胞核）通过显微操作注入受体细胞不符合体细胞核移植的要求。

其实，科学家按供体核移植入受体细胞（即卵母细胞）的部位不同，可将核移植分为：胞质内直接注射法和透明带下注射法。胞质内直接注射法是用注射针（直径约为10um）吸取供体核，然后直接刺破去核的卵母细胞的细胞膜，将核注入，完成核移植。但是，这种方法对卵膜和胞质的损伤比较大，容易造成卵母细胞的死亡，故目前多采用后一种方法。透明带下注射法即用注核针将完整的核供体细胞注射到透明带和去核卵母细胞之间的卵周隙中，使之和供体细胞和卵母细胞质膜接触，然后用电脉冲刺激诱导其进行融合，使供体核进入受体细胞，形成重组细胞。这种方法的优点是，可避免对卵母细胞膜和胞质的损伤，提高重组胚的存活率。

可见，教材48页体细胞核移植过程是对体细胞核移植概念更准确、更深刻、更全面的阐述。因此在具体教学过程中可对教材进行适当的拓展和延伸，有助于学生对体细胞核移植的准确理解。

通过对教材体细胞核移植概念和过程的探究，我得到的启发是：难点、疑点最怕的就是研究，只要你能沉下心去研究教材、研究知识，你的课堂永远是精彩的。同时，作为知识的传播者，不断地更新知识，紧跟时代步伐，才是你知识文库永葆青春的法宝。

细胞移植 篇12

关键词：造血干细胞移植,非清髓性干细胞移植,肾移植,免疫学

目前,肾脏移植已成为终末期肾病的有效治疗手段之一,随着新型免疫抑制剂的广泛应用,肾移植1年人/肾存活率已经达到90%以上,但移植物长期存活率没有得到明显改善。慢性排斥反应和免疫抑制剂的不良反应仍是影响肾移植长期存活的主要因素[1]。诱导受体对移植肾特异性的免疫耐受可以减少排斥反应的发生、减少免疫抑制剂用量,提高移植肾的长期存活。目前,诱导免疫耐受的方法主要是供者特异性输血和供者特异性造血干细胞移植[2]。本研究对48例肾移植受者进行了非清髓性的供者特异性造血干细胞移植,并观察其免疫功能变化,以探讨其诱导免疫耐受、降低排斥反应的可行性及安全性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集1998年1月~2005年12月在我院行供体特异性造血干细胞移植的肾移植患者48例,设为观察组,患者均为女性,年龄20~48岁,平均34岁。收集同期接受同一供者另一肾脏的肾移植患者48例,设为对照组,患者均为女性,年龄22~49岁,平均36岁。供者为48例健康男性,年龄20~50岁,平均35岁。供、受者ABO/Rh血型相同,补体依赖性淋巴细胞毒交叉配型试验(CDC)≤10%,受者术前检查群体反应性抗体(PRA)均为阴性,依据氨基酸残基配型原则,HLA-A、B、DRB1为1~2位点错配。供体热缺血时间少于8 min,冷缺血时间少于8 h。

1.2 方法

1.2.1 骨髓采集、处理与移植

取肾的同时,于供者的双侧髂前、髂后上棘及胸骨部位,采集骨髓200~380 ml,ACD抗凝,经过去除脂肪、血浆、部分红细胞后浓缩为80~100 ml,加入等体积的细胞冷冻保护液,经程序降温后置-196℃液氮中保存。常规方法行肾移植,造血干细胞移植的预处理方案采用ATG(德国,Fresenius,兔抗)3 mg/(kg·d),连用5 d,肾移植术后第14天,将冷冻的骨髓于42℃水浴中快速复温,立即输注,输注的单个核细胞数为(0.9~2.5)×108/kg,台盼蓝拒染率为(93±4)%。

1.2.2 预防排异的治疗方案

移植后应用三联免疫抑制剂环孢素A 5 mg/(kg·d)[或普乐可复0.1 mg/(kg·d)]、吗替麦考酚脂1.5 mg/d、泼尼松30 mg/d。两组随访1~10年,观察急性排斥反应发生率及5年人/肾存活率。所有受者均经医院伦理道德委员会讨论批准,并与患者签署知情同意书。

1.2.3 标本采集

于移植后第30、60、90、360天同一时间点留取外周血标本:血清2 ml,肝素抗凝血4 ml。

1.2.4 试剂与仪器

抗CD3、CD4、CD8、CD19、CD25购自美国BD公司(Becton,Dicki-nson and Company);IL-10、TNF-α细胞因子检测试剂购自深圳晶美生物工程公司;主要仪器FACS Calibur流式细胞仪:美国BD公司,ELX800型酶标分析仪(美国Bio-Tek公司)

1.2.5 检测方法

应用流式细胞仪直接免疫标记技术检测淋巴细胞亚群,T淋巴细胞选择CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD25+,B淋巴细胞选择CD19+。酶联免疫法检测细胞因子IL-10、TNF-α。

1.3 统计学处理

应用SPSS 13.0软件包进行统计学处理,计量资料数据以均数±标准差表示,比较采用t检验,百分率比较采用χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

移植后随着时间延长,观察组CD3+、CD4+、CD19+细胞百分比及TNF-α浓度持续降低,与对照组相比,60 d后CD3+、CD4+、CD19+下降最明显(P<0.05),之后稳定在一个水平;观察组CD8+降低不明显,但CD4+/CD8+比值明显降低;观察组CD4+CD25+百分比及IL-10浓度持续升高,与对照组相比,CD4+CD25+百分比90 d时升高最明显(P<0.05),IL-10浓度30 d时升高最为明显(P<0.05)。结果见表1。

注:移植后同一时间段,与对照组相比,*P<0.05

两组急性排斥反应发生率:观察组为12%,低于对照组(29%),两组比较,差异有统计学意义(P<0.05);随访5年人/肾存活率,观察组为100%/100%,对照组为100%/88%。

3 讨论

非清髓性供体特异性造血干细胞移植是指在肾移植后通过相对较经典、预处理强度较低的非清髓性诱导治疗来抑制受者的免疫应答,使供者造血干细胞在受体内得以植入,再经过免疫抑制剂应用,以期达到宿主和移植物之间的双向免疫耐受,提高肾移植患者长期存活率。Spitzer等[3]报道1例多发性骨髓瘤继发肾功能衰竭患者,经环磷酰胺、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)和胸腺照射处理后,采取HLA配型相合的骨髓联合肾脏移植,术后2个月停用免疫抑制剂,肾功能正常,无排斥反应发生。Kawai等[4]报道,肾移植联合骨髓输注患者5例,移植后9~14个月停用免疫抑制剂,移植肾功能仍保持稳定2~5年。傅耀文等[5]报道61例肾移植后接受供者特异性骨髓输注,可以诱导嵌合体发生,提高受者对供者的免疫耐受,降低排斥反应发生率。王志余等[6]报道3例活体亲属肾移植,首先对供体进行外周血动员,采集外周血干细胞,于肾移植后2周分次输注,能更好地促进微嵌合形成,更有利于产生免疫耐受。

本文主要观察供体特异性造血干细胞移植对肾移植受者免疫功能的影响,探讨免疫耐受及排斥反应发生情况。T细胞亚群主要分为CD4阳性辅助性T细胞和CD8阳性抑制性T细胞。CD4辅助性T细胞(Th)又分为Th1和Th2细胞,能介导免疫应答,分泌多种具有调节细胞功能的高活性、多功能低分子蛋白即细胞因子,在移植免疫中发挥重要作用。Th1细胞分泌的细胞因子(IL-2、TNF-α等)能促进细胞免疫应答,激活天然杀伤细胞,特异性杀伤移植物抗原,启动排斥反应。Th2细胞分泌的细胞因子(IL-10等)是一种强有力的免疫抑制和炎症抑制因子,抑制免疫排斥和炎症的发生。Th1和Th2细胞间动态平衡对诱导和维持免疫耐受十分重要[7]。因此,肾移植受者T细胞亚群和T细胞分泌的细胞因子检测,一定程度上反映了T细胞的活化程度,几种不同的细胞因子联合检测可反映不同辅助性T细胞亚群的活化状态。

移植后随着时间延长,观察组CD3+、CD4+细胞百分比持续降低,与对照组相比,60 d后CD3+、CD4+下降最明显(P<0.05),之后稳定在一个水平;观察组CD8+降低不明显,但CD4+CD8+比值明显降低,表明受者免疫功能处于明显的免疫抑制状态,有利于降低排斥反应的发生。CD4+CD25+调控T细胞具有免疫抑制及诱导活化的T细胞成为免疫无能两大功能特征,是机体维持自身耐受的重要组成部分,其对免疫反应具有抑制效应[6]。观察组CD4+CD25+持续升高,与对照组相比,90 d时升高最明显(P<0.05),提示受者形成免疫耐受,呈现低免疫反应状态;IL-10为Th2细胞分泌的抑制性细胞因子,观察组IL-10持续升高,与对照组相比,30 d时升高最为明显(P<0.05),也提示受者免疫功能受到抑制。TNF-α为Th1细胞分泌的促炎症因子和免疫抑制因子,观察组TNF-α持续降低,与对照组相比,60 d时降低最为明显(P<0.05),提示可减少炎症反应的发生,降低排斥反应,受者免疫功能受到进一步抑制。CD19+是B淋巴细胞的表面标志,观察组CD19+持续降低,与对照组相比,60 d时下降最明显(P<0.05),之后稳定在一个水平,提示B淋巴细胞功能受到抑制,从而可以减少排斥性抗体的分泌,降低排斥反应的发生率。随访结果表明,观察组急性排斥反应发生率明显低于对照组(12%vs 29%,P<0.05);5年人/肾存活率,观察组高于对照组(100%/100%vs 100%/88%)。

本研究发现,尽管观察组与对照组都使用了免疫抑制剂环孢素A,但从免疫重建结果来看,观察组的CD4+CD25+调节性T细胞、IL-10明显增多,与环孢素A参与免疫抑制IL-2、TNF-α分泌减少的药理机制无关。显然输注同一供者骨髓干细胞,可以通过抑制性T细胞克隆的增加,改变了受体免疫重建后的淋巴细胞群系,从而可能诱导了受体的免疫耐受。

本组结果提示供体特异性造血干细胞移植能够抑制肾移植受者CD3+、CD4+、CD8+T细胞免疫功能,使患者处于低免疫反应状态;增强CD4+CD25+调节性T细胞功能,有利于诱导免疫耐受;同时,又能够抑制B淋巴细胞,减少排斥性抗体的分泌,降低排斥反应发生率,对提高人/肾存活率具有重要作用。

笔者认为,供体特异性造血干细胞移植是一种安全、有效地诱导肾移植免疫耐受的临床治疗方法,能够降低排斥反应的发生,其更深层次的免疫机制有待进一步探讨。

参考文献

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[2]黄君龄,王祥慧.供者特异性输注诱导肾移植受者免疫耐受的研究进展[J].上海交通大学学报:医学版,2009,29(7):877-881.

[3]Spitzer TR,Delnonico F,Tolkoff-Rubin N,et al.Combined histo-compatibility leukocyte antigen-matched donor bone marrow and renaltransplantation for multiple myeloma with end stage renal disease:theinduction of allograft tolerance through mixed lymphohe-matopoieticchimerism[J].Transplantation,1999,68(4):480-484.

[4]Kawai T,Cosini AB,Spitzer TR,et al.HLA-mismatched renal transplantationwithout maintenance immunosuppression[J].N Engl J Med,2008,358(4):353-361.

[5]傅耀文,王伟刚,周洪澜,等.肾骨髓联合移植与嵌合体发生及急性排斥反应的关系[J].中华医学杂志,2004,84(23):1983-1985.

[6]王志余,葛永超,赵晓武,等.肾-骨髓联合移植诱导免疫耐受:能够促进移植后嵌合体的形成吗?[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(53):10457-10460.