骨髓细胞学

骨髓细胞学（精选12篇）

骨髓细胞学 篇1

骨髓抽吸和骨髓活检是造血系统疾病诊断不可或缺的手段。最终的解释需要综合外周血液检查、骨髓抽吸和活检结果, 并与补充试验如免疫表型、细胞遗传学分析、分子遗传学检查相结合。骨髓检查是所有全血细胞减少患者的适应证, 无论其基础疾病如何。这一方面特别需要排除白血病和其他的恶性浸润。常规骨髓抽吸涂片与骨髓活检相结合可以避免干抽或者严重出血。一些学者建议骨髓检查是诊断的基础, 但是采取哪种检查手段尚不明确[1]。本研究的目的在于评价全血细胞减少患者骨髓抽吸和骨髓活检的作用。

资料与方法

2011年1月-2014年12月收治全血细胞减少患者100例, 均符合血红蛋白<90 g/L、白细胞计数<4×109/L、血小板计数<100×109/L。所有患者知情同意。

研究方法:所有入组患者采集相关病史, 并进行详细的体格检查。血液学方面记录包括完整血像, 即血红蛋白百分率、TLC、DLC、血小板计数、红细胞指标、外周血检查和网织红细胞计数。所有病例同时进行骨髓穿刺和骨髓活检, 标本进行Perl's染色和特殊染色如MPO、PAS和网硬蛋白 (reticulin) 。根据抽吸和活检发现分析全血细胞减少原因, 分析重要参数如病因学、年龄、性别、临床发现、血液学参数、外周血像、骨髓抽吸和活检所见。

结果

研究对象年龄6~78岁, 10~30岁最多, 年龄70岁以上者最少。其中, 64%男性, 36%女性 (1.8:1) 。再生障碍性贫血是最多见的原因, 其次是幼红细胞增生、巨幼红细胞贫血。其他原因包括急性白血病、骨髓纤维化、异形红细胞增生、淋巴肿瘤形成、缺铁性贫血。48%患者骨髓细胞过多, 34%骨髓细胞减少, 18%骨髓细胞正常。

48例细胞系增生患者中16例显示巨幼红细胞血像, 有明确用药史和输血史。外周血像最常见的是不均匀性红细胞异形。分叶过多的中性细胞和有核RBCs亦可见。网织红细胞计数1.0%~1.9%。

骨髓抽吸显示87%患者骨髓多细胞性, 23%正常细胞骨髓像;而活检显示100%患者细胞过多伴红系增生。骨髓抽吸标本应用Perls's Prussian蓝反应进行骨髓铁贮备分级, 63%患者铁贮备增加, 25%铁贮备正常, 12%铁贮备减少。铁贮备增多可能是由于慢性吸收障碍综合征或自身免疫障碍所致。

48例骨髓抽吸显示为红系增生者中20例为幼红细胞性红细胞生成, 其中6例进一步检查诊断为溶血性贫血。贫血原因:异形性贫血64%、正细胞贫血18%、小细胞贫血9%、大细胞贫血9%。网织红细胞计数0.5%~1.6%。骨髓抽吸检查显示87%患者正常细胞骨髓像。活检骨髓像6例显示细胞过多。骨髓铁贮备:增多91%、正常9%。

6例怀疑溶血性贫血。2例有黄疸病史, 4例血清胆红素升高及脾肿大。6例患者均有近期输血史。网织红细胞计数1.2~1.6%。骨骼抽吸显示细胞过多骨髓像及幼红细胞生成, 骨髓活检均为细胞过多及红系增生。4例患者G6PD酶缺陷。所有6例患者均显示铁贮备增多, 可能归因于多次输血。

14例患者表现为亚白血病样白血病, 年龄6~45岁, 男10例, 女4例。临床表现见发热100%, 乏力71.5%。其他包括体重减轻和出血倾向。体格检查:苍白100%, 肝脾肿大85.7%, 淋巴结肿大14.3%。网织红细胞计数0.5%~2.5%。外周血像显示异形71.4%、大细胞14.3%和小细胞14.3%。

34例患者表现为细胞过少骨髓像。4例干抽经骨髓活检确诊。此34例中, 有26例再生障碍贫血。骨髓活检诊断显示骨髓脂肪组织增加和骨髓细胞结构减少, 骨髓内淋巴细胞和浆细胞相对增多。网硬蛋白染色显示所有病例均无纤维化。临床症状依次为乏力76.9%、发热61.5%、体重减轻23%、出血倾向15.4%。最多见的体征是苍白 (92%) 。2例可触及脾脏。网织红细胞计数0.5%~3.2%。23%的患者网织红细胞减少。外周血像异形61.5%, 大细胞23%, 小细胞15.5%。34例中8例骨髓活检显示骨髓纤维化。

26例再生障碍性贫血显示细胞过少骨髓像患者中, 6例表明灶性细胞减少, 细胞结构25%~50%;20例患者细胞结构少于25%。所有患者网硬蛋白染色显示无纤维化。所有患者骨髓抽吸显示铁贮备增加, 即3级 (53.8%) 、4级 (38.5%) 与5级 (7.7%) 。对2例干抽经骨髓活检进行铁贮备检测。

讨论

全血细胞减少是一组涉及多系统的临床疾病状态。全血细胞减少的基础病因因地理环境不同而不同。全血细胞减少的最常见原因是再生障碍性贫血 (10%~52.7%) , 本研究进一步证明再生障碍 (26%) 为重要原因, 最多见的主诉是发热和出血倾向。苍白是常见体征, 其次是肝和脾脏肿大。外周血像显示多叶白细胞和异形细胞增生最多见。外周血细胞涂片和骨髓检查是诊断巨幼细胞贫血的重要诊断工具, 与抽吸和活检高度相关。本研究中, 正常形态红细胞增生约18%, 与其他研究相似[1]。正常形态红细胞增生与全血细胞减少的关系尚不清楚。这些病例可能代表增生低下/再生障碍演变的某一时相, 可能是难治性贫血的某些情况。这些组的鉴别标准仍然有争议, 这些患者应保持定期血液学随访[2]。本研究中6例患者诊断溶血性贫血, 与临床所见、血液检查、骨髓抽吸和活检所见一致。黄疸病史见于66.7%的患者, 而肝和脾脏肿大占33.3%。6例患者增多表现为正常形态幼红细胞增生。研究显示脾脏机能亢进和全血细胞减少患者骨髓抽吸可以揭示潜在的血液恶性病变或感染过程。溶血性贫血出现可能是与DIC有关。自身免疫性疾病如Grave’s病、恶性贫血和乳糜泻, 亦可表现为全血细胞减少和相关自身免疫性溶血性疾病。6例患者均有明显的药物使用史。一些药物如头孢西丁可诱发溶血性贫血和全血细胞减少。医生就要想到药物诱发毒性, 应当监测这些患者的血细胞计数。评价患者溶血性贫血很重要, 应认真分析溶血的潜在病因。

本研究中34例患者骨髓抽吸表现低细胞骨髓像, 骨髓活检评价患者骨髓纤维化;其中, 26例诊断再生障碍性贫血, 8例骨髓纤维化, 骨髓纤维化可能是特发性或继发性。本研究中4例患者有明确药物史, 2例患者的HIV感染正在治疗, 另2例患者为类风湿性关节炎, 接受治疗。这几例患者可以作为继发性骨髓纤维化的代表, 停止用药可以缓解。轻微-严重纤维化患者的生存比较无纤维化者要差, 可增加非白血病性死亡, 并可增加演变为白血病的概率。因此, 骨髓纤维化分级具有预后价值。本研究中亦有1例再生障碍性贫血几个月后出现急性髓样白血病, 其白细胞计数正常。骨髓抽吸证实诊断而活检显示细胞过多骨髓像, 再生障碍性贫血转换为急性髓样白血病被认为是一种少见现象。

参考文献

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[2]Tariq M, Khan N, Basri R.Aetiology of Pancytopenia[J].Professional Med J Jun, 2010, 17 (2) :252-256.

骨髓细胞学 篇2

体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样细胞方向分化

探讨成纤维生长因子-2(FGF-2)在体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)向肝细胞样细胞分化的作用及量化关系.体外分离培养大鼠BM-MSCs,将第3代BM-MSCs采用不同剂量的FGF-2诱导.诱导后,在显微镜下观察细胞形态学的改变;用免疫细胞化学法检测白蛋白和CK19的分泌;Shiff染色法检测糖原的分泌.诱导后BM-MSCs由梭形向多角形、卵圆形方向变化,白蛋白、CK19和糖原12 d即有阳性表达,以后随着诱导时间的.延长阳性率逐渐升高.20 ng/mL FGF-2诱导比10 ng/mL FGF-2诱导细胞白蛋白、CK19和糖原的表达量均多.20 ng/mL FGF-2具有较强的诱导BM-MSCs向肝细胞样细胞分化的能力.

作 者：胡晶 牟玲 罗恩杰 HU Jing MU Ling LU En-jie  作者单位：胡晶,罗恩杰,HU Jing,LU En-jie(中国医科大学,病原生物学教研室,辽宁,沈阳,110001)

牟玲,MU Ling(沈阳市传染病医院,辽宁,沈阳,110006)

刊 名：微生物学杂志  ISTIC英文刊名：JOURNAL OF MICROBIOLOGY 年，卷(期)：2008 28(3) 分类号：Q254 关键词：骨髓间充质干细胞   成纤维生长因子-2   肝细胞样细胞  

骨髓细胞学 篇3

下肢动脉闭塞性病变的临床特点

下肢动脉闭塞性病变的临床症状常表现为感觉异常、发冷、下肢肌肉酸麻、疼痛，间歇性跛行，下肢静息痛、溃疡，甚至坏疽等。糖尿病患者合并下肢动脉闭塞性病变，更多地累及膝关节以下动脉。因此，糖尿病下肢动脉闭塞性病变的特点是病变更广泛、更远端，影响的血管往往是多部位、多节段，以小血管病变为主，并有微血管病变。血管脉搏触诊和踝肱指数(ABI)的测量是诊断糖尿病下肢动脉闭塞性病变的基本方法。超声波检查和经皮血氧张力测定可以评估下肢动脉阻塞的严重程度，严重缺血，还可进一步做血管造影检查。

下肢动脉闭塞性病变的治疗

传统治疗：下肢动脉闭塞性病变的内科治疗包括基础治疗和对症治疗。如果内科治疗4～6周后，病情无好转，应考虑手术治疗，以期及时进行血管重建，改善下肢血运、促进溃疡愈合。但是，由于糖尿病下肢动脉闭塞性病变的特点是血管闭塞更严重，下肢远端流出道差，无法进行搭桥手术，或者闭塞血管在膝关节以远，因为血管口径小，搭桥血管再闭塞可能性大，导致医疗费用高，截肢率高。

治疗进展：目前，国内外治疗下肢动脉闭塞性病变的一项新技术就是干细胞移植。干细胞移植是一种崭新的治疗技术，也是近几年来发展最快的技术。骨髓间质干细胞和造血干细胞具有跨系统分化特性，并且造血干细胞在骨髓中最丰富，便于提取，可进行自体骨髓移植，既避免了免疫排斥反应，又不违背社会伦理标准，骨髓间质干细胞和造血干细胞在一定条件下可以分化为血管内皮细胞，在血管受损部位形成新生血管，故这一技术也逐渐被用于治疗下肢缺血。

自体骨髓干细胞移植的宜忌

糖尿病合并下肢动脉闭塞性病变，进行自体骨髓干细胞移植的适应证：(1)有间歇跛行且静息状态下踝肱指数(ABI)＜0．6～0．8；或已有静息痛、溃疡、坏疽。(2)保守治疗无好转且不适合外科搭桥手术的患者，或各种原因不能接受截肢手术的患者。

骨髓细胞学 篇4

关键词：贫血,骨髓细胞学检查,确诊率,临床价值

贫血是一种常见的血液系统疾病, 贫血患者循环血液中单位体积的红细胞数量、血红蛋白浓度以及红细胞比容均低于本地区相同年龄和性别人群正常参考值[1], 为探究骨髓细胞学检查在基层医院临床贫血中的应用价值。该研究整群选取2012年6月—2014年6月间该院收治的105例贫血患者为研究对象, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

105例贫血患者中, 男性患者60例, 女性患者45例;患者年龄在14~73岁之间, 平均年龄为 (43.52±3.78) 岁。入选该次回顾性分析的所有患者均满足以下入选标准: (1) Hb<100 g/L; (2) 排除凝血因子障碍患者; (3) 排除穿刺部位炎症患者; (4) 排除血友病患者; (5) 排除晚期妊娠患者。

1.2 方法

贫血患者均接受骨髓细胞学检查, 行局部麻醉, 选择髓液丰富、容易定位的胸骨、髂前或髂后部位为穿刺点[2]。在无菌环境下, 进行骨髓穿刺操作, 获取患者的骨髓细胞。同时使用血液分析仪及其配套试剂进行其血常规检查, 主要检查贫血患者的血红蛋白、红细胞、比容、血小板、白细胞等。使用瑞氏和铁染色法制作骨髓涂片, 进行有核细胞分类检测[2]。骨髓涂片制作完成后, 使用低倍镜进行观察, 观察骨髓小粒、脂肪滴以及骨髓特有细胞, 判断骨髓的增生程度;使用油镜观察, 观察有核细胞分类计数, 形态是否存在异常, 计算粒/红比值。

2 结果

2.1 临床确诊率

105例患者均接收骨髓细胞学检查, 有97例患者通过骨髓细胞学检查找到了引发贫血的原因, 确诊率为92.38%;另有8例患者贫血原因不明, 占总例数的7.62%。

2.2 贫血患者诊断分型

从骨髓细胞学检查结果上看, 缺铁性贫血、急性白血病、再生障碍性贫血的发生率较高, 详细情况可参考表1。

3 讨论

贫血是指患者外周血红细胞和血红蛋白大量减少, 并且低于正常参考值范围下限的一种血液系统高发疾病[4,5]。作为一种血液系统疾病, 可以影响患者呼吸系统、消化道系统、泌尿系统、生殖系统以及神经系统。贫血的临床症状主要表现为头晕、头痛、注意力分散、心率加快、心悸、消化功能减退、乏力、记忆力减退等[6]。只有正确找出患者贫血发作的原因, 并及时对症治疗, 才能够有效缓解患者的临床症状, 提高患者的生命质量。

骨髓细胞学检查的基本原理如下所示:骨髓铁由细胞内铁和细胞外铁构成, 细胞外贴是骨髓以含铁血黄素形式存在的储存铁, 细胞内铁是幼红细胞合成血红蛋白时的利用形式[7]。使用瑞氏和铁染色法, 可以充分了解机体内铁的动态变化, 如铁原料在人体机体内的储存和吸收程度, 以及幼红细胞对铁的利用程度等, 从而有效反映出铁元素相关细胞的形态变化和功能变化, 并以此作为贫血症的临床诊断依据[9]。目前而言, 贫血的临床诊断最常用的评价指标是红细胞数量、红细胞压积、血红蛋白、骨髓细胞等[9]。

从该次临床研究的结果上看, 经骨髓细胞学检查明确贫血类型的有97例患者, 临床确诊率为92.38%。中青年人正属于人生上升期, 工作生活压力大, 饮食方法和作息习惯不合理。造成缺铁性贫血的主要原因在于患者饮食结构不合理、营养不良等造成铁元素缺乏, 或者是患者存在体内铁元素吸收障碍, 临床治疗主要以补铁为主。肝肾性贫血主要表现为认为年轻, 过度汹酒, 过劳有关。黄作良等[10]报道, 对于骨髓检查报告中存在差异的患者, 应该通过完善其他相关检查的方式, 明确发病原因, 通过给予原发病针对治疗, 提高贫血症的临床治疗效果。彭碧[11]等在研究中指出, 铁代谢相关血清学指标检测具有快速、无创伤性、早期诊断等突出优点, 血清学指标可以作为骨髓形态学检查的有力补充;骨髓细胞学检查是诊断贫血的主要手段, 能够对细胞的形态特征, 比例提供明确依据, 反应骨髓有核细胞的增长情况;与骨髓细胞学检查联合使用, 能够提高临床诊断的准确性。

参考文献

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[8]王彬阶, 胡丽, 陈丹.骨髓细胞学在贫血诊断中的临床价值研究[J].现代诊断与治疗, 2014 (14) :3322-3323.

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[10]黄作良, 李小民.骨髓细胞学检查在血小板减少疾病诊断中的临床意义[J].中国医疗前沿, 2012 (6) :51-52.

骨髓细胞学 篇5

黄曲霉毒素对小鼠血液和骨髓细胞的毒性效应

为探讨黄曲霉毒素(AF)对小鼠血液和骨髓细胞的影响,采用含不同剂量的培养黄曲霉1周后的.PDA配制的食物喂食小鼠,每只每天0.10 kg,时照组喂养等量不合PDA的食物,连续15天,第20天取血,对小鼠红、白细胞计数,测Hb含量、凝血时间和PCE微核率.结果显示,染毒荆量与小鼠白细胞数量、凝血时间、PCE微核率呈正相关,与小鼠红细胞数量、Hb含量呈负相关;PDA致小鼠红细胞、Hb和凝血时间损害的最低剂量为28 mg/kg,引起白细胞、PCE损害的最低剂量为14mg/kg.该结果表明,AF对小鼠红、白细胞、Hn有毒性作用.

作 者：张谨华 杨艳君 王慧阳 李洪燕 ZHANG Jin-hua YANG Yan-jun WANG Hui-yang LI Hong-yan 作者单位：晋中学院,生物科学与技术学院,山西,晋中,030600刊 名：晋中学院学报英文刊名：JOURNAL OF JINZHONG UNIVERSITY年，卷(期)：26(3)分类号：Q936关键词：黄曲霉毒素 小鼠 红细胞 白细胞 血红蛋白 凝血时间 微核 毒性作用

骨髓细胞学 篇6

关键词：自体造血干细胞移植 多发性骨髓瘤

【中图分类号】R4 【文献标识码】B 【文章编号】1008-1879(2012)03-0107-01

为了对采用自体造血干细胞移植技术对患有多发性骨髓瘤的患者进行治疗的临床效果进行研究分析，使临床对多发性骨髓瘤患者的病情有更加细致的了解［1］，为临床提供对多发性骨髓瘤患者进行治疗的有效方案，使该类患者在治疗后存活率进一步提高，我们组织进行了本次研究。在研究的整个过程中，我们抽取在过去一段时间内来我院就诊76例患有多发性骨髓瘤的临床确诊患者病例，将其分为两组，分别采用VAD方案和VAD方案与自体造血干细胞移植技术联合的方法进行治疗。对两组患者的临床治疗效果、并发症和不良反应情况、治疗一年后的存活率进行比较分析。现将分析结果报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料。在2008年6月至2010年6月这两年时间内，采用临床研究过程中常用的随机抽样方法，抽取来我院就诊76例患有多发性骨髓瘤的临床确诊患者病例，将其分为两组。A组患者中包括21例男性患者和17例女性患者；患者中年龄最大者62岁，年龄最小者44岁，平均年龄51.7岁；B组患者中包括22例男性患者和16例女性患者；患者中年龄最大者63岁，年龄最小者42岁，平均年龄52.2岁。抽样患者所有自然资料，统计学差异并不明显，在研究过程中可以进行比较分析。所有患者在接受治疗前，均经过相关的临床检查后确诊，并由患者本人或家属在同意书上签字。

骨髓细胞学 篇7

1资料与方法

1.1基本资料:选取2013年1月至2014年12月我院收治的92例全血细胞减少性疾病患者作为研究对象,其中男性患者52例,女性患者40例,患者的年龄16~81岁,平均年龄为(41.27±7.92)岁。患者白细胞的含量为(0.8~3.9)×109个/L,平均为(2.2±1.2)×109个/L;血红蛋白含量为21~100 g/L,平均为(51.8±21.2)g/L;血小板含量为(6~98)×109个/L,平均为(39.7±31.2)×109个/L。

1.2诊断标准:血常规检查时,有2次或2次以上患者的白细胞含量低于4×109个/L,血红蛋白含量低于100 g/L,血小板含量低于100×109个/L,则可以认为患者血液中的白细胞、红细胞以及血小板均出现了异常的减少,可初步诊断为全血细胞减少性疾病[4]。

1.3方法:使用希森美康XT4000i全自动血细胞分析仪对血液中的白细胞、红细胞以及血小板的数量进行计数,采集患者外周全血作为血液标本,制作血片,对血细胞的形态进行观察。在患者的髂后上棘处进行穿刺,采取反吸法收集患者的骨髓,并将骨髓制作成均匀厚度的骨髓片,厚度约为1.0~1.5 mm,对骨髓片进行染色处理,并置于油镜下进行观察[5]。询问患者是否有相关疾病史,询问患者的药物使用情况。根据患者的具体情况,选择是否对患者进行体格检查、实验室检查以及骨髓活检。

2结果

2.1病因分析:92例患者中,65例患者的病因是造血系统疾病,所占比例为70.7%;27例患者的病因是非造血系统疾病,所占比例为29.3%。造血系统疾病引起的全血细胞减少性疾病中,有20例患者是由再生障碍性贫血引起的,所占比例为21.7%;14例患者是由急性白血病引起的,所占比例为15.2%;8例患者是由巨幼细胞贫血引起的, 所占比例为8.7%;9例患者是由骨髓增生异常综合征引起的,所占比例为9.8%;4例患者是由脾功能亢进引起的,所占比例为4.3%;3例患者是由溶血性贫血引起的,所占比例为3.3%;3例患者是由原发性的骨髓纤维化引起的,所占比例为3.3%;2例患者是由多发性骨髓瘤引起的,所占比例为2.2%;1例患者是由血小板减少性紫癜引起的, 所占比例为2.2%。非造血系统疾病引起的全血细胞减少性疾病中, 有10例患者是由肝性贫血引起的,所占比例为10.7%;10例患者是由炎性疾病引起的,所占比例为10.7%;3例患者是由结缔组织疾病引起的,所占比例为3.3%;1例患者是由骨髓转移癌引起的,所占比例为1.1%;其余3例患者的病因尚未明确,所占比例为3.3%。对病因未明确的患者进行其他检查,诊断其为免疫相关性疾病。

2.2骨髓细胞学特征:造血系统疾病引起的全血细胞减少性疾病患者有65例,有37例患者的骨髓的增生活跃性升高,所占比例为56.9%; 28例患者的骨髓增生活跃性降低,所占比例为43.1%。患者的骨髓细胞形态均出现异常,中性粒细胞、红细胞以及巨噬细胞均出现病态造血情况。

非造血系统疾病引起的全血细胞减少性疾病患者有27例,有20例患者的骨髓的增生活跃性升高,所占比例为74.1%;7例患者的骨髓增生活跃性降低,所占比例为26.9%。患者的骨髓细胞形态均呈感染骨髓象。

3讨论

全血细胞减少性疾病病因复杂,通常可分为造血系统疾病和非造血系统疾病。本次研究选取的92例患者中,65例患者的病因是造血系统疾病,所占比例为70.7%,27例患者的病因是非造血系统疾病, 所占比例为29.3%。在对疑似为全血细胞减少性疾病的患者进行诊断时,应对患者的病史、用药情况进行仔细的询问,对患者进行全面的体检,还应对患者进行实验室检验,骨髓细胞的检验十分重要,不可忽视。对患者进行骨髓细胞学检验,能够对患者的骨髓增生情况进行明确[6],能够了解患者骨髓细胞是否出现异常,通过对骨髓细胞进行染色,从而确定其是否出现异常[7]。以骨髓细胞检验结果为依据,并综合考虑患者的临床检查,对患者进行诊断,能够避免误诊、漏诊的发生。

综上所述,引起全血细胞减少性疾病的因素主要为造血系统疾病,但在进行诊断时不能忽略非造血系统疾病因素。骨髓细胞学检验对诊断全血细胞减少性疾病具有较高的临床价值,能够为全血细胞减少性疾病的诊断提供可靠的依据,具有重要的参考价值。

参考文献

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骨髓细胞学 篇8

1 骨髓间充质干细胞 (MSCs)

MSCs是存在于骨髓中的非造血干细胞, 是中胚层发育的早期细胞, 具有多向分化潜能, 不仅能分化为造血实质, 支持造血, 还可分化为多种造血以外的组织细胞, 特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞。在实验条件控制下能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞和心肌细胞[1,2]。

2 MSCs的分离方法

2.1 贴壁筛选法

抽取骨髓后直接加入培养基, 制成细胞悬液, 以合适的细胞浓度接种培养。培养在早期可混杂多种细胞, 红细胞由于不贴壁随着换液不断被清除;混杂的巨噬细胞、造血细胞、脂肪细胞等可以在传代时利用其与培养介质贴附牢固而MSCs在消化酶的作用下较快与培养皿分离的特点进行纯化。此法虽相对粗糙, 但操作简便, 分离到的细胞分化潜能较好。

2.2 梯度离心法[3]

根据骨髓中细胞成分比重的不同, 分离含有MSCs的单个核细胞群, 再在塑料培养瓶中贴壁培养。但是, 不同密度的分离液比重的微小差别可能筛选不同的细胞群, 对MSCs的纯度影响亦较大。Manas等[4]比较Percoll和Ficoll分离的骨髓标本, 结果表明在外观上Percoll分离者形态均匀, CD14/CD34/CD45均阴性, Ficoll分离者CD34阴性、而CD14/CD45均阳性。国内也有研究发现, 用Ficoll (1.077 g/m L) 分离人骨髓后, 相当部分细胞呈现CD44-/HLA-DR+, 表明有成纤维细胞混入到单核细胞中;而用Percoll (1.073 g/m L) 分离, 细胞较为均一, 具有独特的表型及化学特征[5]。

2.3 免疫或流式细胞分离法

通过MSCs表面带有或缺失的抗原成分进行正选或负选, 从而获得相对较纯的MSCs。有研究用CD105包被免疫磁珠, 经双抗体程序 (DAP) 和单抗体程序 (SAP) 分别分选人CD105+MSCs, 表明SA法分选效率较高[6]。Kopen等[7]用免疫磁珠分选小鼠CD11b+MSCs, 亦获得较高的分选效率。Orilic等[8]用免疫磁珠结合流式细胞仪, 从骨髓分选Linc-kit+细胞获得更高的效率和专一性, 但分选过程中的机械剪切力和高能激光可能对MSCs有一定损伤。Vlasselaer等[9]发现经流式细胞仪分离到的Sca-1阳性MSCs, 培养过程中大多数不贴壁, 并在24 h内死亡, 且成骨分化活性很低。

3 将MSCs诱导分化为心肌细胞的方法

3.1 化学试剂诱导

Makino等[10]在体外实验中利用5-氮胞苷将永生型骨髓间充质干细胞诱导分化为成心肌细胞系细胞。发现当用3 mol/L的5-氮胞苷诱导细胞24 h后, 即可在显微镜下观察到能够自发性跳动的细胞亚克隆, 这些亚克隆被命名为成心肌细胞系细胞。国内学者多数认为10 mol/L 5-氮胞苷诱导分化的阳性率最高。此外, Shim等[11]利用含有抗坏血酸、胰岛素和地塞米松的培养基培养骨髓间充质干细胞5～6代后, 亦将骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞。

3.2 体外微环境培养

3.2.1心肌细胞培养液:

龚觉晓等[12]将新生1～3 d内的SD大鼠乳鼠用胰蛋白酶解法将心室肌消化成细胞悬液, 差速离心分离出心肌细胞培养液成功诱导MSCs分化成为心肌样细胞,

3.2.2心肌细胞裂解液:

吕学翔等[13]将生长较好的第1、2代心肌细胞制成106/m L的细胞悬液, 迅速置于-70℃冰箱中, 4～5 h后取出融化, 用吸管反复吹打细胞悬液, 如此反复3次后将细胞裂解液在2 000 r/min的条件下离心10 min, 将上清用0.45μm的滤器过滤后在其内成功诱导MSCs分化成为心肌样细胞。

3.3 心肌细胞培养液与化学诱导剂相结合

Cheng等[14]将人心肌细胞条件培养基与普通的细胞生长培养基按一定比例配制成心肌细胞分化诱导培养基。在利用心肌细胞分化诱导培养基开始对脐带血中的MSCs进行诱导分化培养时, 同时给予10μmol/L的5-氮胞苷进行诱导24 h, 结果14 d后, MSCs分化为心肌细胞的比例较上述几种办法明显增高, 转化率高达70%左右。

4 诱导后MSCs的细胞形态学变化及心肌特性检测

4.1 形态学变化

MSCs诱导分化培养基刺激孵育24 h, 一般从第3 d开始, 可见MSCs的自我修饰现象, 即细胞的伪足渐渐回缩, MSCs由螃蟹样的多伪足形态逐渐转变为橘子样形态。随着诱导时间的延长, 逐渐转变为纺锤形、梭形的心肌纤维样细胞。

4.2 免疫组化检测

用免疫组化方法检测心肌的一些特异性蛋白, 如横纹肌肌动蛋白, 是分布于肌节Z线处的细胞骨架蛋白, 主要存在于胚胎及新生动物心肌中, 具有收缩功能, 分布广泛;c Tn T是心肌特异性肌钙蛋白T, 是心肌细胞中一种调节蛋白, 在钙离子参与下调节、控制收缩蛋白的舒缩活动。此外细胞心肌特异性结构蛋白还有Troponin-T、Connexin 43, 心钠素 (Atrial Natriuretie Peptide, ANP) 、脑钠素 (Brain Natriuretie Peptide, BNP) 等。

4.3 RT-PCR检测

主要是检测一些心肌特异性基因的表达情况, 如ANP基因、BNP基因、p-MHC基因、a-心肌肌动蛋白基因和a-骨骼肌肌动蛋白基因等, 以及GATA4、TEF-1和Nkx 2.5/Csx等心肌特异性转录因子。

骨髓细胞学 篇9

近期国内外大量实验研究发现，骨髓间充质干细胞在一定条件下经体内外诱导可定向分化为肝细胞样细胞，而且易于分离、培养、扩增，易于外源基因的导入和表达，在体外长期培养的过程中始终保持多向分化的潜能，遗传背景相当稳定有望成为治疗终末期肝病的一种新型种子细胞[4]。下面就骨髓间充质干细胞向肝细胞转化的研究进展作简要综述。

1 形态及生物学特征

1987年Friedenstein等首先发现骨髓单个细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞经过20-30个培养周期仍能保持其多向分化潜能。由于骨髓中的这种多能细胞能够分化为多种中胚层来源的间质细胞，故称之为间充质干细胞（MSCs）。

MSCs在形态上类似成纤维细胞样，核浆比大，核染色质细，核仁明显，平行排列或旋涡样生长。骨髓MSCs无特异性表面标志，在培养时贴壁附着后较一致的表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等多种表面蛋白[5]，但不表达造血细胞表面标志，如CD14、CD34、CD45、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原 (HLA) 识别有关的共刺激分子B71、B72及主要组织相容性复合物Ⅱ类分子如HLA-DR。但是至今没有找到MSCs特异性抗原标记，所以目前鉴定MSCs主要依赖其形态水平及功能特征。

MSCs的分裂方式有两种，一种是对称分裂，形成两个相同的MSCs细胞。另一种是非对称方式，一个子细胞保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来，另一个子细胞不可逆的分化成为功能专一的分化细胞。MSCs通过不对称分裂一方面实现增殖与分化，另一方面维持自身干细胞数量的稳定。在正常生物体内，绝大多数MSCs处于相对静止的状态。只有在某些信号的诱导下，其分化潜能才被激发出来，经过多个细胞分裂周期，最终分化成为某种分化细胞。MSCs在体外具有很强增殖能力，可以在体外大量扩增和长期培养，并且可以长时间保持其未分化状态。不同来源的MSCs具有不同的生物学性质。Peister等[6]的研究显示不同品系小鼠来源的骨髓MSCs具有不同的增殖能力、免疫表型和分化能力。Javazon等[7]的研究显示大鼠骨髓MSCs比人骨髓MSCs具有更强的增殖能力，而且这两群细胞具有不同的细胞表型。

2 体外分离、纯化、培养

目前，骨髓MSCs的分离方法主要有以下几种： (1) 贴壁法：主要根据骨髓MSCs的贴壁生长特性，通过换液将其与不贴壁的造血系细胞分离，再利用单核细胞、MSCs、成纤维细胞等贴壁细胞在培养板上粘附性, 控制酶的浓度和消化时间纯化MSCs，该方法操作简单、成本低廉、对细胞损伤小，分离到的细胞分化潜能较好，是目前分离MSCs的主要方法； (2) 密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。普遍采用Ficoll或Percoll分离液来实现细胞间的分离。但是不同密度的分离液对MSCs的纯度影响极大。这种方法分离培养的MSCs大小均匀，纯度较高，也被广泛采用； (3) 细胞表面分子标记分选法：主要是根据骨髓MSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法进行分选。但由于目前仍未找到骨髓MSCs特异性的细胞表面标记，因而骨髓细胞体外培养较难获得纯的MSCc，且分离步骤复杂，该法较少采用。

3 体外实验研究

国内外研究表明，MSCs可以在体外分化为神经细胞、成骨细胞、造血细胞、肌细胞、表皮细胞、腱细胞、脂肪细胞、肝细胞等。目前，研究者在向肝细胞分化方面已经取得了一定的突破。

目前, 对于MSCs在体外进行肝细胞定向诱导条件主要有以下几种： (1) 在培养基中添加诱导MSCs的HGF等细胞因子或某种药物; (2) 在培养基中添加肝患者血清等物质; (3) 与肝细胞共同培养; (4) 通过目的基因的转染。其中在培养液中加入细胞生长因子来诱导干细胞分化最为常用，这种方法主要是通过改变细胞的生长的环境来诱导干细胞分化，将干细胞诱导成目的细胞。将骨髓干细胞诱导分化为肝细胞，可以解决肝细胞的来源问题，将为治疗各种肝病提供可能。

在肝再生过程中起重要作用的生长因子和细胞因子很多，如：HGF, EGF, TGF2，白介素26, TNF2，胰岛素，去甲肾上腺素等[8,9]。HGF主要在肝脏kuffer细胞与肝窦内皮细胞中产生，一定浓度（1mg/ml）对肝细胞有促进有丝分裂作用，是正常肝细胞最强的促有丝分裂剂。HGF是作用于肝脏发育及肝再生的过程中最基本的细胞因子，其受体c-met表达的多种细胞的有丝分裂及塑型都具有刺激作用。并且在胚肝发育过程中也发挥重要作用。HGF的作用贯穿于整个肝脏的发生、发展及肝再生的过程，因此HGF是体外诱导骨髓干细胞向肝细胞方向分化的关键性细胞因子。

日本学者Oh等[10]早在2000年通过RT-PCR技术检测发现新鲜分离的大鼠骨髓细胞中存在表达AFP和C-met的细胞，因此他们在体外对骨髓干细胞转化为肝细胞进研究。经不同浓度的HGF体外诱导培养，他们检测到表达ALB、AFP、C-met和GAPDH mRNA肝细胞样细胞。因此认为骨髓中可能包含表达AFP的肝脏祖细胞，可被HGF诱导分化为肝细胞。但是这群细胞仅表达的是部分肝细胞的标记物，因此只能说为肝细胞样细胞。后来进一步对诱导体系进行改进，加入FGF4和EGF作为诱导因子，在试验过程中发现了肝细胞形态样细胞的出现，而且在RNA水平检测到成熟肝细胞标记物的表达[11]，从结果看，表达成熟肝细胞标记物的那类细胞可以认为是肝细胞。Schwartz等[12]从人、大鼠、小鼠的骨髓中分离出间充质干细胞的一个亚群CD44-、CD45-、HLA-Ⅰ-、HLA-Ⅱ-和c-kit-，在培养体系中加入成纤维细胞生长因子 (FGF-4) 、HGF等生长因子进行诱导后可分化为具有肝细胞的功能特征的上皮样细胞，可检测到AFP、ALB、CK-18等肝细胞标志物，并能合成糖原、尿素，还具有肝细胞的超微结构。

4 体内实验研究

早在1999年，Peterson等在《Science》杂志上发表了关于骨髓源性肝干细胞修复肝脏的论文，在研究中为证实肝系细胞和骨髓的相关性，他们通过大鼠雌雄授受法骨髓移植及将DPPIV+的骨髓细胞移植到DPPIV-小鼠体内，证实了肝卵圆细胞的骨髓源性。其后一系列研究证实MSCs可以在体内分化为肝细胞，来修复受损伤的肝脏。2001年Avital等[13]用免疫磁珠分离法从人和大鼠的骨髓中分离出一种Thy-1+/β2-m-的干细胞，这些细胞同时表达肝细胞特异性标志物如ALB、AFP、CK-18等，体内移植实验证实这些细胞整合入肝板，具有肝细胞的超微结构，而且还具有肝细胞的部分合成和代谢功能，能分化为成熟肝细胞。因此Thy-1+/β2-m-细胞可能是肝祖细胞，研究者命名为骨髓源性肝干细胞BDHSCs。近年，Terai等[14]建立CCL4诱导的小鼠肝硬化模型，然后从尾静脉注入1×105个经绿色荧光蛋白标记的骨髓细胞，1 d后GFP阳性标记细胞的骨髓细胞定植在肝小叶门脉周围，4w后肝脏中有25%的细胞是GFP阳性标记细胞，而无肝硬化的对照组中却没有GFP阳性的细胞出现。骨髓细胞移植组的血清ALB明显高于非细胞移植组。实验结果提示，体内环境和肝脏本身微环境是促进骨髓细胞向肝细胞转化的关键因素。Yamamoto等[15]在Terai实验的基础上，以孕11.5 d鼠胎肝作为抗原，获得一种单克隆抗体anti-Liv8，以此作为分选骨髓干细胞的标志，利用单克隆抗体anti-Liv8从GFP转基因大鼠骨髓中分选出anti-Liv8阴性细胞，并经尾静脉移植入持续性肝损伤的小鼠模型体内，4w后发现多数移植细胞分布于门静脉周围的肝实质内，同时表达Liv2和ALB。Liv8-negative细胞增殖并分化为肝样细胞的数量明显多于Liv8-positive细胞，后者同时表达CD45，而CD45是HSCs的重要标志。在受体血清ALB水平方面，Liv8-negative细胞移植组也显著高于Liv8-positive细胞移植组，由此得出认为：在一定条件下，MSCs更有可能分化为肝细胞。实验结果也提示，在肝脏损伤的情况下，骨髓干细胞可横向分化为肝细胞来更好地修复损伤的肝脏。以上实验为MSCs移植治疗肝损伤提供很好的思路。

5 存在问题与展望

骨髓间充质干细胞来源于中胚层具有多向分化潜能即可塑性，在不同培养条件下、不同的微环境可以使骨髓干细胞向不同的组织分化，因此可以作为多种器官细胞的种子细胞。BMSCs诱导为肝细胞在临床再生医学中具有重要的理论意义和的使用价值。骨髓MSCs具有多向分化潜能并易于体外基因操作，是一种较为理想的基因治疗靶细胞，已经在基因治疗领域显示出广阔的应用前景，但实际应用中仍有一些问题尚待解决。首先，要寻找合适的培养体系，使MSCs数量扩增的同时保持其多向分化潜能；其次，MSCs作为基因治疗靶细胞所带来的安全性问题也需谨慎对待，已有报道植入的MSCs具有致瘤性[16,17]。Rubio[17]的实验结果显示，尽管转基因的MSCs通过体外实验发现在6至8w内可以安全有效表达，但是在长期的体外实验中有可能会发生自发性的突变（4-5个月）。此外，进行转基因时有病毒载体和非病毒载体两大类，前者的安全性更需要提防，而后者的转导效率偏低，未能得到广泛应用。因此，如何考虑病毒安全性及转基因过程中可能导致的插入突变，从而带来比既往基因治疗更为严重的后果，是值得认真研究对待的重要问题。最后，如何实现MSCs携带的外源基因在目的组织可调控的表达，体现外源基因表达的时间、空间特异性是此类治疗手段得以推向临床应用前必须解决的问题。因为，最初的干细胞治疗主要是胚胎干细胞, 但由于胚胎干细胞具有免疫排斥, 可形成畸胎瘤, 伦理方面有争议并且目前认为成人的心脏和胰腺几乎没有干细胞等问题限制了其应用。骨髓间充质干细胞的多向分化潜能揭示人类组织工程的细胞来源不一定是胚胎干细胞，由于它可以来自自体，避免了伦理问题的困扰，避免了组织相容性的限制，更适用于临床的细胞移植。研究证实微环境在细胞的转化中具有非常重要的作用，因此，深入研究微环境对骨髓间充质干细胞的诱导影响及转化机制，对于BMSC分化为有功能的组织细胞有着深远的影响。未来的某一天可能通过对BMSC的研究深入，能够使其发育成一个完整的器官。骨髓间充质干细胞对于组织的再生和构建有深远的意义。研究表明，MSCs是作为基因治疗的更理想的靶细胞。MSCs作为靶细胞具有以下诸多优势： (1) MSCs取自骨髓，来源充足，取材相对较容易； (2) MSCs体外分离培养操作简便，细胞数通过培养可获得大量扩增，且具有体外长期培养的遗传稳定性和可移植性； (3) MSCs免疫原性低，移植引起的排斥反应相对较轻； (4) 作为靶细胞，MSCs易于外源基因的表达，而且所携带的外源基因表达受所处微环境的影响，具有明显的组织特异性。这些优势使MSCs在基因治疗中具有较好的应用前景。

参考文献

[1]Campagnoil C, Roberts IA, Kumar S, et al.Identification of mesenchy-mal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver and bone-marrow[J].Blood, 2001, 98:2396-2402.

[2]M.Kassem, M.Kristiansen and B.M.Abdallah, Mesenchymal stem cells:cell biology and potential use in therapy[J].Basic Clin.Pharma-col.Toxicol.95 (2004) , pp.209-214.

[3]S.Sethe, A.Scutt and A.Stolzing, Aging of mesenchymal stem cells[J].Ageing Res.Rev.5 (2006) , pp.91-116.

骨髓细胞学 篇10

1 材料和方法

1.1 材料健康雏鸡, 0.01%秋水仙素, 2%柠檬酸钠液, 0.075%

KCl, 甲醇, 冰醋酸, Giemsa原液, pH为7.2～7.5的磷酸缓冲液, 显微镜, 水浴锅, 离心机, 解剖器具 (剪刀、镊子) , 载玻片及盖玻片等。

1.2 方法

1.2.1 秋水仙素处理:

在雏鸡腹腔注射秋水仙素, 剂量为每克体重2 μg。

1.2.2 取骨髓:

注射秋水仙素3～4 h后, 将雏鸡处死, 立即取出两侧股骨, 剔净股骨上的肌肉, 以等渗的柠檬酸钠2%, 洗净股骨上血污及肌肉碎渣。剪断股骨。用尖镊子小心地取出骨髓, 置于放有少量等渗液的小培养器中捣碎, 再加入少量等渗液制成2～3 mL的骨髓细胞悬液, 也可用骨剪将股骨两端膨大的关节头剪掉, 使其露出骨髓腔, 用吸有适量柠檬酸钠液的注射器, 从股骨腔的一端插入注射针头, 将骨髓冲入离心管内, 可反复冲洗数次, 直至股骨变白为止, 此时离心管内的细胞悬浮液约有4～5 mL。

1.2.3 低渗处理:

将细胞悬液经1000 r/min, 离心10 min, 吸去上清液, 加预温的0.075% KCL低渗液5 mL, 立即将细胞团打匀, 在37℃条件下静置25 min。

1.2.4 固定:

低渗处理后, 向试管低渗液中加1～2 mL的固定液 (3∶1的甲醇∶冰醋酸) 进行5 min的预固定, 然后以1000 r/min, 离心10 min, 吸去上清液, 先向离心管内加入少量固定液, 用吸管轻轻吹打成细胞悬液, 再加入5 mL的固定液, 混匀后, 固定30 min。如此重复固定2～3次, 最后用适量的固定液 (大约5倍于沉积物) , 吸打均匀成细胞悬液。

1.2.5 制片:

从冰箱中取出冰冻载玻片, 用吸管吸取细胞悬液, 距离玻片10 cm左右的高度滴片, 每片滴1～2滴细胞悬液, 或者滴片后用嘴轻轻吹片, 以帮助染色体分散。必要时在酒精灯上微火烘片, 这样可促使染色体展开, 空气干燥保存。

1.2.6 染色:

将染色体玻片标本, 经10% Giemsa染液 (Giemsa原液与磷酸缓冲液之比1∶9) 染色30 min, 自来水冲洗, 洗去上面的浮色, 晾干。

2 结果与讨论

2.1 秋水仙素的注意事项

秋水仙素为一种植物碱, 它具有抑制细胞纺锤丝的形成, 使细胞分裂停止于中期, 以积累大量的中期细胞的作用。秋水仙素的浓度范围比较宽广, 可差几十倍之多。一般其浓度为0.25～0.5 μg/mL培养液。其浓度应根据不同的实验动物选用不同浓度和不同处理时间来控制染色体形成和收缩程度, 秋水仙素作用时间越长, 被阻止的中期细胞越多, 但染色体也越凝集和收缩。经过多次的对比实验, 我们总结出雏鸡骨髓细胞染色体标本制作中秋水仙素的注射量控制在2 μg/g较好, 处理时间控制在3～4 h为好。

2.2 低渗处理的注意事项

低渗液处理能使核膜膨胀, 破裂, 染色体分散而易于观察和计数。常用的低渗液有蒸馏水、柠檬酸钠和0.075% KCl, 实践证明, 应用0.075% KCl作低渗液, 对染色体结构影响较小, 且对制备显带标本效果最佳。不同动物的不同组织处理的时间有差异, 处理时间不足染色体铺展不好, 处理时间过长, 会引起细胞破碎, 染色体丢失, 甚至染色体胀得太大而导致形态结构模糊。因此, 对任一组织的低渗液都应事先进行预实验, 以确定最合适的处理时间。

2.3 固定注意事项

染色体标本的好坏受固定液及操作影响, 常用的固定液为甲醇∶冰醋酸 (3∶1) , 要注意现用现配, 用后倒掉, 否则会形成酯类, 发生沉淀, 影响固定的效果。为了消除中期染色体外层物质对染色体在载玻片上展开和对染色体亲和力的影响, 需要更换2～3次固定液, 每次20～30 min。如所制标本染色体固缩不良时, 可改变固定液的冰醋酸比例 (2∶3或1∶3视染色体分散程度而定) 。加入细胞悬液中, 混匀, 离心后再制片, 染色体分散程度可得到提高。但与3∶1固定液相比, 所制得的染色体标本, 形态易改变, 染色欠佳, 故一般情况下不宜用2∶3或1∶3比例的固定液。

骨髓细胞学 篇11

【关键词】 自体骨髓干细胞移植；中药；糖尿病足

糖尿病足是由于糖尿病患者并发神经病变及各种不同程度末梢血管病变而导致下肢感染、溃疡形成和(或)深部组织的破坏，是导致糖尿病患者致残致死的严重慢性病发症之一。我院自2006年－2010年间，采用自体骨髓干细胞移植联合益肾安足中药治疗糖尿病足，初步临床观察结果令人满意，现将治疗过程和随访情况报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2006年10月～2010年4月我院内分泌科收治的确诊为糖尿病足患者10例。所有患者肢体均有不同程度的病变，包括肢体疼痛、冷感、麻木、间歇性跛行、溃疡和(或)坏疽、足背动脉搏动减弱、踝肱指数(ABI)降低、震动感觉阈值（VPT）增高等。其中有八处足部溃疡，四处足趾坏疽。将病变级别相同的患者随机地分为两组，保证各组病情严重程度相似，性别、年龄、病程等一般情况也相似。A组为常规治疗组，所有患者均给予控制血糖、血压、血脂，并给与扩血管、改善循环、抗炎、营养神经、换药等传统内科治疗。B组在A组治疗的基础上加用自体骨髓干细胞移植术联合益肾安足中药治疗。

1.2 移植方法

自体骨髓干细胞的动员：术前三天起每天皮下注射一次粒细胞集落刺激生长因子150ug,每天查血常规一次,直至白细胞达到30×109/L左右。

自体骨髓干细胞的采集及处理：在层流手术室严格无菌操作条件下, 局部麻醉后于患者髂后上棘处穿刺采髓, 每例约采集骨髓250～300 mL，并将其置于肝素化1640液中。在超净工作台上用Ficcol液密度梯度离心液分离出骨髓液中的干细胞，干细胞数总量要在1×109以上，根据移植点数将细胞悬液总容量稀释到20ml至30ml。

自体骨髓干细胞移植：采用缺血肌肉局部注射法：连硬麻，消毒患肢皮肤，用注射器行腓肠肌及足部网状注射，每点注射单个核细胞悬液0.1ml至0.5ml，每点间隔约3cm，共注射50—70点，最后在溃疡或坏死周边组织进行点状注射。完毕后用无菌纱布包扎。

中药方剂治疗：术后第一天开始服补肾、益气、活血中药。给予我院院内自拟方剂益肾安足汤（熟地，狗脊，牛膝，补骨脂，当归，黄芪等），每剂水煎成200 mL，100 mL／次，2 次／d口服，连续服用两周。

1.3 观察指标

分别于治疗前、治疗后4周及12周对患者进行静息痛、肢体冷感、肢体麻木感﹑间歇性跛行评分, 测量溃疡及坏疽的面积和深度，用Doppler动脉分段测压计算踝/肱指数（ABI），用震动感觉阈值测量仪测定震动感觉阈值（VPT），观察不良事件和副反应。

1.4 评分标准

①静息痛评分：0分：无疼痛；1分：偶有疼痛，被问及能回忆起来；2分：疼痛经常出现但能耐受，不需或偶用一般止痛剂；3分：经常用一般止痛剂；4分：因疼痛影响睡眠，一般止痛药难以缓解。②肢体冷感评分：0分：无冷感；1分：患者偶述肢体有发凉怕冷的感觉；2分：受累肢体经常有发凉怕冷的感觉；3分：受累肢体有明显的冷、凉感觉，需要采取局部保温措施，症状方能得到一定程度的缓解；4分：受累肢体有明显的冷、凉感觉，采取局部保温措施，症状也无明显改善。③肢体麻木感评分：0分：无肢体麻木；1分：患者偶述受累肢体有麻木感；2分：受累肢体经常有麻木感；3分：受累肢体有明显的麻木感，采用保温、按摩等措施，症状能得到一定程度的缓解；4分：受累肢体有明显的麻木感，采用保温、按摩等措施，症状也无明显的改善。④间歇性跛行评分：按正常速度( 60～70 m/min) 步行，0分：行走≥500 m, 无疼痛；1分：行走400～499 m，有疼痛；2分：行走300～399 m，有疼痛；3分：行走200～299 m，有疼痛；4分：静息痛，无法行走或行走<100 m，有疼痛。

1.5 随访

治疗后1个月、3个月﹑12个月﹑24个月随访，了解患者足部情况，以及是否有不良事件和副反应发生。

1.6 统计学

应用SPSS13.0统计软件进行数据统计。组间比较用X2检验，计量资料用Paired-Sampies T Test。

2 结果

2.1 治疗前后患者静息痛、肢体冷感、肢体麻木感、间歇性跛行、震动感觉阈值（VPT）、踝/肱指数（ABI）评分的比较，详见下表。

A组治疗后4周疼痛较前改善，治疗后12周麻木较前改善，仅这两项差异有统计学意义（P<0.05）。B组治疗后4周、12周较治疗前静息痛、肢体冷感、肢体麻木感、间歇性跛行、VPT及ABI均得到不同程度的好转，差异有统计学意义，尤其是治疗后12周麻木及间隙性跛行好转更明显（P<0.01），溃疡面也得到好转。B组与A组治疗12周后比较麻木及疼痛有显著改善（P<0.01），VPT及ABI也得到了明显改善（P<0.05）。B组溃疡及坏疽好转亦较A组明显。

两组患者治疗前后各项指标评分分值比较（x±s）。

与治疗前比较，*P＜0.05，**P＜0.01；B组与A 组治疗后比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

2.2 糖尿病足溃疡变化情况

A组患者中有3处足部溃疡, 其中1处在3个月内愈合, 1处在3个月内接近愈合, 1处在3个月内仍未愈合。B组患者中有5处足部溃疡, 其中4处在2个月内愈合,1处在足趾的溃疡随坏疽趾残端处理术一并切除。

2.3 糖尿病足坏疽变化情况

A组患者中有2例足趾坏疽, 在3个月内仍未愈合。B组患者中有2例足趾坏疽, 在做骨髓干细胞移植的同时行坏疽趾残端处理术, 一例于半个月后痊愈，一例于三个月痊愈。

2.4 不良事件和副反应

B组有1例患者移植当天晚上出现低热，未予特殊处理，于术后第二天体温恢复正常。未见其他异常症状或体症出现。

2.5 随访情况

B组三例患者随访24个月,一例随访六个月，足部情况稳定，未见不良事件和副反应发生。

3 讨论

在导致糖尿病足形成的多种因素中,下肢血管病变及周围神经病变无疑起着至关重要的作用。糖尿病足的常规治疗包括内科保守治疗、介入和血管搭桥手术等,但疗效多不理想,多数患者最终难免截肢。如何能最大程度地提高糖尿病足患者的生存质量、保存患肢、降低截肢平面是近年来国内外学者普遍关注的问题。

自体骨髓干细胞移植技术是目前国际上最先进的医疗技术之一。将自体骨髓干细胞移植到缺血部位，可从先前存在的血管床发芽生成新的毛细血管，能给血管狭窄或闭塞的患者提供一个治疗性生物“旁路”。因为自体骨髓干细胞移植采用的是患者本人的骨髓干细胞，所以不存在排异及伦理问题。

初步研究发现某些补肾、益气、活血中药对于EPCs 的增殖和功能具有动员作用[5]。中药可通过对相关细胞因子的影响，使血管再生因子的数量增加。中药的干预在干细胞移植中发挥重要的生物反应调节剂的效应。

本研究中，常规治疗组治疗前后仅在疼痛和麻木方面有显著缓解，肢体冷感、间歇性跛行、踝/肱指数（ABI）、震动感觉阈值（VPT）均无明显改善，溃疡愈合也不理想；而自体骨髓干细胞移植联合中药方剂益肾安足汤治疗组，患肢静息痛、肢体冷感、肢体麻木感、间歇性跛行、踝/肱指数（ABI）、震动感觉阈值（VPT）均有明显改善，尤其是在改善患肢麻木及间隙性跛行方面效果更显著。两组比较，自体骨髓干细胞移植联合中药方剂益肾安足汤治疗组在改善疼痛、麻木、VPT及ABI明显更佳。足部溃疡及坏疽均痊愈,未见明显不良事件和副反应,随访6-24个月足部情况稳定。这提示,自体骨髓干细胞移植术治疗过程简单、安全、创伤小、并发症少，能有效地增加患者的下肢血流，促进溃疡及坏疽愈合。中药益肾安足汤具有增强自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足疗效的作用。这可能与补肾生血药通过动员骨髓EPCs的迁移、分化，促进局部的血管新生,达到改善供血的作用有关，其确切机制还需进一步研究。10例患者均具有明显的双下肢麻木症状，这与合并周围神经病变有关。自体骨髓干细胞移植治疗能改善患者双下肢麻木症状机理不清, 可能与改善周围神经供血有关，因微血管病变是糖尿病周围神经病变的主要发病机制，故循环改善后就能缓解糖尿病周围神经病变。另外，从骨髓提取的干细胞中还有神经干细胞，在下肢神经病变的情况下，自体骨髓干细胞会向神经组织分化，用以替代修复神经[6]。故有可能在局部形成神经再生，从而缓解糖尿病周围神经病变。由于这一方法应用临床应用时间不长，观察病例数不多，尚有许多问题有待研究，但最终的结论还需要进一步增加病例数量和进行远期效果随访观察。今后的研究方向主要应致力于如何提高临床疗效，包括适应证的选择,摸索干细胞移植的细胞种类与最佳移植方法。同时开展干细胞移植的时机也需要进一步探索,目前所治疗的患者大都已到了疾病晚期,临床疗效相对较差。在下肢血管病变早期或糖尿病高危足阶段就进行干细胞移植治疗，对于预防、治疗糖尿病足坏疽或许会有积极的意义。随着这项新技术的日趋成熟,预期治疗的适应证将会逐渐放宽使更多的患者受益。

参考文献

[1]郭连瑞, 谷涌全, 张建. 自体骨髓干细胞移植治疗糖尿病足13 例报告[J ]. 中华糖尿病杂志, 2004, 12 (5)。

[2]谷涌泉，糖尿病下肢缺血的外科治疗进展[J ]临床外科杂志，2008，5 (16) ：305。

[3]张敏州，王磊，曹爱琴，内皮祖细胞与中医药研究进展[J]中西医结合心脑血管病杂志，2007，4，(5 )。

骨髓间充质干细胞的三维培养 篇12

关节部位的损伤或关节疾病如骨关节炎、关节退行性病变严重影响人类健康,而究其原因主要是关节部位软骨不同程度的缺损或病变。组织工程技术是目前修复关节软骨损伤研究领域的热点,其中种子细胞、组织工程支架、生长因子的选择是当前研究的核心,其主旨是利用支架为种子细胞提供三维培养环境,从而促进细胞的渗入、黏附和组织的形成。

2 材料和仪器

2.1 实验动物

日本大耳白兔(武警医学院动物实验中心)。

2.2 实验材料

壳聚糖粉末(医用,山东奥康生物科技有限公司)。

2.3 主要试剂

聚乙二醇(Sigma公司);CD44、CD45试剂盒(Sigma公司);冰醋酸、速眠新、肝素钠等(华北制药厂)。

2.4 主要实验仪器

冻干机(北京博医康);超纯水系统(英国Millipore公司);台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂);FEI Quanta 200扫描电镜(荷兰FEI公司)。

3 实验方法

3.1 壳聚糖支架制作

将3%壳聚糖醋酸混合溶液100 mL,加入相对分子质量为1 000的聚乙二醇1 g,放入37℃水浴箱内以溶解腊状聚乙二醇,以1 500 r/mim转速离心10 min去除气泡。将壳聚糖醋酸溶液缓慢倒入72孔板内,放入冰箱-20℃预冷冻10 h,再放入冷冻抽干机中冻干24 h,制备壳聚糖支架。将支架从72孔板内取出,放入0.1mol/L NaOH中,中和支架内的残余醋酸,以PBS液反复冲洗至pH值中性备用。

3.2 扫描电镜观察支架超微结构

将制备好的壳聚糖支架用锐刀切开放入3%戊二醛固定4 h,磷酸盐缓冲液漂洗10 min×3次,1%四氧化锇固定2 h,磷酸盐缓冲液漂洗10 min×3次,梯度乙醇(30%~100%)脱水,乙酸异戊酯置换,冻干法干燥,金离子溅射法镀膜(SCD-005),FEI Quanta 200扫描电镜观察该支架的孔径大小及支架的超微结构。

3.3 骨髓间充质干细胞的提取及鉴定

无菌胸骨穿刺针从日本大耳白兔胫骨近端采取骨髓约5 mL,全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞,10%胎牛血清的LG-DMEM作为细胞培养基,在37℃、体积分数为5%的CO2及饱和湿度条件下培养,取第3代BMSCs,免疫细胞化学测定其细胞表面抗原CD44、CD45,对BMSCs进行鉴定。

3.4 骨髓间充质干细胞-壳聚糖支架的三维培养

将壳聚糖支架浸泡在装有75%酒精的6孔板内,放入超净台内紫外线照射30 min,无菌条件下以PBS缓冲液反复清洗3次,再用LG-DMEM反复清洗2次,吸去培养液后,重新加入LG-DMEM液浸泡24 h备用。将支架从培养液中取出,置入24孔培养板内,取第3代BMSCs以1×106/mL密度接种于支架内(各孔加入3 mL培养基将支架完全浸没),放入37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养。分别在培养24、48 h后取出细胞/支架复合体进行电镜检测,观察细胞在支架上的黏附生长情况。

4 结果

4.1 细胞培养及鉴定结果

细胞培养2周后长满培养板底壁,细胞形态多呈梭形(如图1所示)。CD44免疫细胞化学检测可见阳性细胞主要集中在细胞密度高的区域,胞浆内可见棕黄色颗粒,细胞周围也出现黄染区(如图2所示);CD45检测结果为阴性(如图3所示),符合骨髓间充质干细胞的生物学特性。

4.2 扫描电镜观察壳聚糖支架的超微结构

电镜下壳聚糖支架在横断面上可见内部密布大小均一的孔洞,孔径为150~360μm,平均为255μm左右(如图4所示)。

4.3 骨髓间充质干细胞与支架的三维培养

BMSCs与支架共培养24 h后,多孔支架表面密布细胞,部分细胞已渗入支架孔内生长(如图5~6所示),分泌少量细胞外基质,并与支架建立连接;48 h后,部分孔内可见细胞呈簇生长,底层细胞已呈现梭形黏附在支架上,部分细胞分泌大量细胞外基质,与支架黏附较好,细胞在三维培养环境下生长较好(如图7~8所示)。

5 讨论

5.1 骨髓间充质干细胞作为种子细胞的可行性

骨髓腔内含有造血和基质两大系统。前者由造血干细胞及其分化的细胞组成,后者是富含骨髓基质的异质细胞群体,BMSCs是存在于骨髓基质中的非造血干细胞。20世纪70年代,Friedenstein等[1]在骨髓标本中首次发现骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)。它具有自我复制能力及多向分化潜能。在体内和体外通过外界干预及环境的变化,可以分化成具有多种功能的细胞,干细胞可分为成体干细胞和胚胎干细胞,BMSCs是成体干细胞的一种。现阶段,BMSCs已广泛应用于组织工程、基因治疗等方面。其中在神经系统、心肌组织、骨组织、软骨组织的组织工程应用尤为广泛[2,3,4]。BMSCs不仅存在于骨髓,在软骨膜、骨膜及肌肉中也有间充质干细胞的分布,但骨髓中的含量相对较多,BMSCs可以来源于机体各部位的骨髓,不同来源的BMSCs的功能状态不一。Minguell等发现同等条件下,椎骨来源的BMSCs其碱性磷酸酶活性低于胫骨来源的细胞[5],故我们选取胫骨取材,另外,有研究发现BMSCs的数量随年龄增加而逐渐减少[6]。D’Avis等观察到随供体年龄增长BMSCs数目下降并对生长因子的反应性降低[7]。而成年后长骨骨髓腔内以黄骨髓为主,若以此作为BMSCs的来源,则分离出的脂肪细胞较多,BMSCs少,而幼年动物骨髓腔内以具有多向分化潜能的各种未分化幼稚细胞为主。因此,我们选取2.5月龄的日本大耳白兔作为实验动物,用以分离到数目相对较多且功能良好的BMSCs。

5.2 利用壳聚糖制备组织工程支架的可行性

组织工程支架从取材方面看分为天然材料、人工合成材料和天然与人工合成复合材料。天然材料主要有几丁质类(壳聚糖,Chitosan,CS)、胶原(Collagen,COL)、纤维蛋白(Fibrin,FIB)、藻酸盐(Alginate,ALG)、蚕丝蛋白等;人工合成材料主要有聚乳酸(Polylactide,PLA)、聚羟基乙酸(Polyglycolide,PGA)、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(Polylactic-co-glycolic acid,PLGA)、羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)、磷酸三钙(Tricalcium phosphate,TCP)等;天然与人工合成复合材料支架,如CS/HA支架、COL/TCP支架、COL/PLGA支架等。

其中壳聚糖支架的优点有:(1)良好的生物相容性和组织相容性[8,9]。壳聚糖是自然界广泛存在的一种天然多糖类有机聚合物,它的分子结构和软骨基质糖氨多糖(GAG)结构相似,具有良好的生物相容性和组织相容性,对软骨细胞有较好的吸附作用,能促进细胞在材料上的增殖与分化[10]。(2)多孔结构特性[11]。通过冻干法将混合溶液中的聚乙二醇去除,从而形成多孔结构,诸多多孔结构利于细胞的渗透,增大细胞在支架上的黏附生长面积,为组织的重建奠定基础。(3)良好的加工性能。由于实验中以72孔板为磨具,制备的材料以圆柱形为主。实际上我们可以根据临床需要,设计并制备大小、形状、厚度相匹配的支架,从而构建出适合需要的细胞/支架修复体。(4)支架易于消毒、保存,消毒后支架材料不降解[12]。壳聚糖支架的消毒可应用酒精浸泡方式消毒,并通过缓冲液及培养液的反复洗涤去除酒精,实验证实该种消毒方式下细胞在支架上能够较好生长,并未见明显其他细菌滋生。不足之处:力学特性和耐磨损性能相对差,关节部位由于其解剖特点特殊,其受力因素较为复杂,在机体运动过程中,关节部位的受力不但有纵向和横向受力,而且存在切面方向的滚压式受力,因此支架材料的选择应适合力学环境下的需要,保持一定的力学性能和耐磨性适应临床治疗的需要。

5.3 骨髓间充质干细胞三维培养的必要性和可行性

实验表明[13],细胞在单层培养时,细胞在增殖、生长一段时间后常会发生细胞之间的接触性抑制,从而抑制了细胞生长和增殖。利用三维培养,为细胞提供三维立体的生长环境,从而更加利于细胞的生长、黏附,减少细胞间的接触性抑制。同时,我们知道,软骨组织的缺损其结构亦为立体结构,单层细胞无法对软骨缺损进行修复。三维培养就是为种子细胞提供三维立体结构,按照支架结构的形状、大小形成组织,以适应临床需要,并且三维多孔结构,孔与孔之间相通,在培养液中添加药物或生长因子,可通过孔道相互传递,达到浓度均一,从而利于外界因素对组织工程化软骨形成的干扰,对组织的构建提供更好的平台。

6 结语