增殖作用（精选9篇）
增殖作用 篇1
白刺 (Nitraria tangutorum Bor.) 为蒺藜科白刺属野生灌木。在甘肃的河西地区, 特别是武威、民勤等地分布面积较大, 资源非常丰富。白刺果含有丰富的人体必须氨基酸、维生素、微量元素、黄酮及其衍生物。白刺酮具有抗炎、止咳祛痰、降血压、扩张冠状血管、治疗静脉曲张、静脉炎、促进烧伤愈合等作用。民间常用白刺果治疗感冒、肝炎、胃及十二指肠溃疡等疾病。文章将白刺果提取物白刺酮给予人胃癌细胞进行体外培养, 观察其细胞毒性作用及其对细胞增殖的影响, 为白刺酮的应用和开发提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
白刺酮:由甘肃省医学科学研究院药物研究所从民勤沙漠野生白刺果中分离提取制得, 黄色结晶, 实验时, 以二甲基亚砜 (DMSO) 助溶加RPMI1640培养液配制成所需浓度 (二甲基亚砜含量为30μL/L) 。5-氟尿嘧啶 (5-FU) :上海旭东海普药业有限公司生产 (批号20080916) 。人胃癌细胞, 由兰州军区总医院药局实验室惠增。
1.2 方法
白刺酮对人胃癌细胞毒性作用:取培养细胞, 调整细胞浓度为l×108/L , 接种于24孔培养板, 1mL/孔, 加培养液1mL/孔培养24h后, 实验组分别加入白刺酮 (0.1, 0.5, 5mg/L) 和5-氟尿嘧啶 (10mg/L) , 200μL/孔, 对照组加等量磷酸盐缓冲液, 每组4个重复孔。在5%的CO2, 37℃, 饱和湿度条件中分别培养6h、12h、18h、24h和48h, 加 0. 4%的台盼蓝20μL/孔, 用血球计数板在光镜下计活细胞数, 取平均值, 以培养时间为横坐标, 活细胞数为纵坐标作图。
白刺酮对人胃癌细胞增殖的作用 以4×105/L 接种于16孔板 (1mL/孔) , 每孔再加2mL培养液, 培养箱中培养24h, 实验组分别加入白刺酮 (0.1, 0.5, 5mg/L) 和5-氟尿嘧啶 (10mg/L) , 300μL/孔, 对照组加等量磷酸盐缓冲液, 每组3个重复孔, 静置培养7d, 用姬姆萨氏液染色10min, 流水缓慢洗去染色液, 在×10倒置显微镜下计数含50个细胞以上的克隆, 计算克隆数。
1.3 统计学分析
实验数据 采用SPSS10.0软件完成统计处理。计量资料差异比较采用DUNNETT单因素方差分析。
2 结果
2.1 白刺酮对人胃癌细胞毒性作用
台盼蓝法测定结果显示, 分别给予人胃癌细胞白刺酮 (0.1, 0.5, 5 mg/L) 和5-氟尿嘧啶 (10mg/L) 培养6 h、12 h、18 h、24 h和48 h, 白刺酮组、5-氟尿嘧啶组活细胞数随白刺酮浓度的增加和给白刺酮后培养时间的延长而减少。给白刺酮后培养6 h时, 白刺酮 (0.1, 0.5, 5mg/L) 组和5-氟尿嘧啶组活细胞数比对照组分别减少了33.8%、35.8%、60.8% 和40.3%, 到18 h分别减少了57.3%、80.1%、99% 和59.6%, 差异有显著性 (P<0.01) 。白刺酮组间比较, 差异有显著性 (P<0.01) 。见图1。
与对照组比:aP<0.01;与5-FU组和0.1mg/L组比:bP<0.01
2.2 白刺酮对人胃癌细胞增殖的影响
计数结果发现, 胃癌细胞在含有白刺酮 (0.1, 0.5, 5mg/L) 和5-氟尿嘧啶 (10mg/L) 的培养液中培养7d, 克隆形成数比对照组减少了40.4%、47.6%、83.6%和43.4%, 差异有显著性 (p<0.01) , 见图2。
与对照组比:aP<0.01。
3 讨论
受不良生活方式 (吸烟、酗酒) 、环境污染、经常接触一些化学物质、膳食营养的不合理等多种因素影响, 恶性肿瘤等非传染性疾病成为人类死亡的主要原因。从甘肃省分布地区上看, 恶性肿瘤死亡率最高的地区在乌鞘岭以西河西走廊的武威、天祝、张掖、敦煌一带;从发病和死亡年龄特征看, 30岁以后随着年龄的增长, 恶性肿瘤的死亡率增加, 到60岁达到高峰[1]。由于化学药物在治疗中出现的毒副作用, 或某些肿瘤细胞对化疗药物不敏感而导致治疗效果不理想及治疗费用高等原因, 开发天然药物越来越受到人们的重视。甘肃有丰富的中草药自然资源, 动物实验表明[2], 白刺酮以50mg/kg、100mg/kg剂量腹腔注射给药10d, 对Hep荷瘤BALB/c小鼠肿瘤生长抑制率分别为29.41%、35.95%;对S180生长抑制率为27.94%、35.29%, 能提高小鼠碳粒廓清指数, 对免疫器官的重量有不同程度的增重作用, 同时也可使小鼠血清溶血素生成值增高。实验结果表明, 白刺酮对人胃癌细胞具有明显的毒性作用, 给予白刺酮 (0.1, 0.5, 5mg/L) 培养6h、18h, 活细胞数比对照组减少了33.8%～57.3%、35.8%～80.1%、60.8%～99% (P<0.01) 。白刺酮对细胞增殖具有明显的抑制作用, 给予白刺酮 (0.1, 0.5, 5mg/L) 培养7d, 克隆形成数比对照组减少了40.4%、47.6%、83.6% (p<0.01) 。
河西走廊的武威、天祝、张掖、敦煌一带正是白刺果分布生长最广泛的地区, 该地区日照时间长, 环境污染少, 可充分利用白刺果资源, 预防和抑制肿瘤的发生。
参考文献
[1]王永祥.兰州晨报[N].2003-01-04-A2.
[2]俞发荣, 连秀珍.白刺酮细胞毒性及其免疫功活性研究[J].中华综合临床医学杂志, 2004, 6 (12) :1-2.
增殖作用 篇2
1、学情分析
1）、认知基础：经过高一半个学期的学习，学生对生物学习有了一定的了解。而且作为高中生有了一定的自学能力，求知欲也较比初中强烈。高一前半个学期的学习，对本节只是有很强的铺垫作用，如细胞核——系统的控制中心，遗传信息的携带者——核酸及细胞膜的流动镶嵌模型等。但是认识还不深刻，经过本节课的学习可以更进一步的了解细胞的生命起始过程。
2）、前科学概念：由于这是微观方面的知识，很多学生对它存在误解。比如说学生可能认为细胞分裂就是一分为二，细胞直接断裂形成两个细胞，然后细胞会进行增长。在教学过程中会用自制教具向学生展示，用以改正学生的错误认识。
2、教材分析
本课题来源于高中生物《必修1——分子与细胞》（人教版）第六章 第一节 ,本课题为今后学习细胞的分化，衰老和凋亡，细胞的癌变及必修2的减数分裂作铺垫。
3、教学目标
1）、知识与技能目标
（1）、简述细胞增殖的方式。
（2）、准确说出细胞周期的概念及有丝分裂各时期的特点。
（3）、说出动植物有丝分裂的异同。
2）、过程与方法目标（1）、画出有丝分裂各时期的细胞及染色体、DNA的数量变化图。
（2）、能够用给定的材料制作临时装片，观察并辨认出细胞是处于哪个时期。
3）、情感态度价值观目标
（1）、认同细胞增殖的生物学意义。
（2）、树立结构与功能、局部与整体相统一的观点。
4、教学重难点
1）重点：有丝分裂各时期的特点及染色体、DNA、染色单体的数量变化。
2）难点：染色体、DNA、染色单体的数量变化。
5、教学策略
用自制平面教具演示有丝分裂各时期，再结合多媒体观看有丝分裂、无丝分裂动态变化，让学生能有一个直观感受。
6、课时安排
1课时
7、教学过程
导入：（2min）
同学们，通过上节课所学的内容，我们现在来回顾一下，什么是细胞周期？
生：连续分裂的细胞，从一次细胞分裂完成开始，到下一次分裂完成为止。
同学们，我们都知道细胞在进行分裂之前做了大量的物质准备，如DNA的复制、有关蛋白质的合成，那么这节课我们就来学习一下细胞是怎样进行分裂的以及在分裂过程中，细胞中发生的一些奇妙变化。
新知：（40min）
我们知道间期的染色质丝螺旋缠绕，缩短变粗，成为染色体。而每条染色体包括两条并列的姐妹染色单体，这两条染色单体由一个共同的着丝点连接着。（展示分裂期动态PPT，向学生说出染色体的条数=着丝点的个数，指引学生在观看PPT时注意染色体和DNA数目的变化）
分裂前期，核仁逐渐解体，核膜逐渐消失，从细胞的两级发出纺锤丝，形成一个梭形的纺锤体。这些过程都是动态的，是连续发生的，同学们，看一下书上的前期图片，它所能体现的是某一时刻的，现在，给大家展示动态图片（展示动态PPT）特点：核仁逐渐解体
核膜逐渐消失
染色体凌乱的分布在纺锤体中央
总结为一句话：“膜仁消失现两体” 接下来，进入分裂中期
先向学生展示PPT，与前期的染色体相比较，看染色体是不是数目比较清晰？形态比较稳定？
生：是
也因此，我们在做染色体的观察实验时，会选择中期的染色体。（指导学生看书上的图片，进行讲解）同学们看一下，着丝点的两侧是不是都有纺锤丝的附着？
生：是
在这里，纺锤丝所起的作用是牵引染色体运动，使染色体的着丝点排列在细胞中央的一个平面上。这个平面与纺锤体的中轴垂直，类似于地球上赤道的位置，(学习过初中地理知识，同学们可以想象一下)称为赤道板。（向学生说明赤道板实际上是不存在的，只是为了理解，而假想的）
因此中期的特点为
特点：染色体数目清晰，形态稳定
着丝点都排列在赤道板上
总结为一句话：“形定数晰赤道齐”
那么，同学们，分裂后期的变化有哪些呢？现在，我们来学习一下细胞周期中的分裂后期。
展示PPT，从图上，我们可以看到，每个着丝点分裂成两个，姐妹染色单体分开，成为两条子染色体，这时，我们任然可以看到着丝点处，有着纺锤丝的附着，那么这里，纺锤丝的作用是什么呢？
生：牵引
嗯，是的，子染色体在纺锤丝的牵引下移向细胞两级，这时，细胞的两极各有一套染色体（再次提醒学生注意染色体数目和DNA数目的变化）。也因此，这两套染色体的形态和数目是完全相同的，每一套染色体与分列前亲代细胞中的染色体的形态和数目也是完全相 同的。
特点：着丝点分裂，姐妹染色单体分开
染色体向细胞两极移动
我们可以归纳为一句话：“点裂数加均两极”
（PPT）当染色体到达两极后，染色体解螺旋为染色质，同时，纺锤丝也逐渐消失，出现新的核膜、核仁。核膜把染色体包围起来，形成两个细胞核，而赤道板位置出现一个细胞板，细胞板由细胞中央向四周扩展，形成新的细胞壁，这就形成了两个子细胞
特点：染色体、纺锤体消失
核膜、核仁重新出现
因此，可以总结为：“两消两现重开始” 向学生展示有丝分裂整个动态过程（PPT)
五、植物细胞和动物细胞有丝分裂的比较
1、相同点：过程基本相同
2、不同点：1）植物细胞是纺锤丝，动物细胞是中心体发出的星射
线。
2）、动物细胞分裂末期不形成细胞板，而是从细胞的中
部向内凹陷，最后把细胞缢裂成两部分。
3、有丝分裂的意义
通过刚才所学的内容，我们知道，亲代细胞的染色体经过复制（实质为DNA的复制）后是精确地分配到两个子细胞中。而细胞有丝分裂的重要意义正是在这里，亲代和子代之间保持了遗传性状的 稳定性。可见，细胞的有丝分裂对于生物的遗传有重大作用。
六、无丝分裂
简要介绍无丝分裂的定义：分裂过程中没有出现纺锤丝和染色体的变化。
展示动态PPT（蛙的红细胞的无丝分裂）作业：课后习题二的第2题
8、板书设计
第一节 细胞增殖(第二课时）
一、细胞周期
1、定义：连续分裂的细胞，从一次细胞分裂完成开始，到下一次分裂完成为止，为一个细胞周期
2、分裂间期
特点：1）、完成DNA的复制
2）、有关蛋白质的合成 结果：1）、染色体数目没变
2）、一条染色体形成两条姐妹染色单体 3）、DNA数量加倍
3、细胞分裂期各个时期的特点： 1）、前期：膜仁消失显两极 2）、中期：形定数晰赤道齐 3）、后期：点裂数加均两极 4）、末期：两消两现重开始
二、植物细胞和动物细胞有丝分裂的比较：
1、相同点：过程基本相同
2、不同点：1）、植物细胞是纺锤丝，动物细胞是中心体发出的星射
线。
2）、动物细胞分裂末期不形成细胞板，而是从细胞的中
部向内凹陷，最后把细胞缢裂成两部分。
3、有丝分裂的重要意义：
亲代细胞的染色体经过复制（实质为DNA的复制）后是精确地分配到两个子细胞中。
三、丝分裂的定义：
增殖作用 篇3
1 资料与方法
1.1 主要试剂与仪器
RPMI1640 (Gibco) , 胎牛血清 (杭州四季青) , Trizol (上海生工) , RT-PCR试剂盒 (大连宝生物) , PCR仪 (PTC100型) , 电泳仪 (型号PS3000) , 紫外凝胶图像分析系统 (UVP 型号 GDS7500) , 其余为国产分析纯。
1.2 细胞培养
人血管内皮细胞 (EC304, 南京凯基生物工程有限公司提供) 。EC304细胞培养于含10%胎牛血清 (FBS) 的RPMI1640培养基中, 置37 ℃含5%二氧化碳培养箱中孵育, 待长致瓶底的60%～80%, 用0.05%的胰蛋白酶消化、传代。
1.3 MTT法分析高糖对血管内皮细胞增殖的作用
将对数生长期细胞以5×104/mL密度接种于96孔培养板中。孵育24 h后, 改用无血清培养液孵育24 h, 使细胞处于相对静止期后按下列方法分为4组。对照组, 培养液含D-葡萄糖浓度为5.5 mmol/L。15 mmol/L组, 培养液D-葡萄糖浓度为15 mmol/L。25 mmol/L组:培养液D-葡萄糖浓度为25 mmol/L。35 mmol/L组, 培养液D-葡萄糖浓度为35 mmol/L。每组设6个复孔, 同时设调零孔。分别于培养后6 h、12 h、24 h、48 h、96 h进行MTT检测。为排除培养液中营养成分消耗对结果产生的影响, 每隔48 h换1次培养上清。反应结束后每孔加入25 μL MTT (5 mg/mL) 溶液, 继续孵育4 h, 弃上清, 每孔加入100 μL二甲基亚砜 (DMSO) , 在微型混合器上振荡30 min后于酶标仪490 nm处测光吸收 (OD) 值。
1.4 RT-PCR方法检测HGFmRNA的表达
1.4.1 总RNA的提取
将对数生长期的血管内皮细胞以2×105/mL的密度转种于50 cm2的细胞培养瓶中, 同步化后分为两组, 对照组培养液含D-葡萄糖浓度为5.5 mmol/L。高糖组培养液含D-葡萄糖浓度为25 mmol/L。每组同时重复3次。于培养6 h、12 h、24 h、48 h、96 h后用Trizol试剂提取细胞总RNA, 提取的细胞总RNA用紫外分光光度计测定RNA的纯度; OD260与OD280比值为1.8～2.0, 说明RNA纯度符合实验要求。
1.4.2 RT-PCR
HGF根据Genebank的大鼠HGF基因cDNA序列由Primer3软件设计:上游引物:5’-ACA GCT TTT TGC CTT CGA GCT A- 3’;下游引物:5’-CAT CAA AGC CCT TGT CGG GAT A -3’。预期扩增产物长度290bp。内参照为GAPDH, 引物设计参照文献[2]:正义序列:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’, 反义序列:5’-TCCACCA CCCTGTTGCTGTA-3’; PCR反应参数为:预变性94 ℃ 5 min, 变性94 ℃ 30 s, 退火58 ℃ 30 s, 延伸72 ℃ 45 s, 共30个循环, 再延伸72 ℃ 5 min;预期扩增产物大小为450bp。
1.4.3 PCR产物的检测
用0.5×TEB制备1.8%琼脂糖凝胶, 在0.5×TEB中恒压电泳, 完毕后经紫外凝胶图像分析仪进行数据分析, 以目的基因mRNA扩增后产物的紫外OD值与内参照GAPDHmRNA扩增后产物紫外OD值的比值作为HGFmRNA的相对值。
1.5 统计学处理
数据以均数±标准差
2 结果
2.1 各组不同作用时间的细胞增殖
对照组 (5.5 mmol/L 组) 细胞从6 h～96 h持续增殖。EC304在高糖的诱导作用下, 6 h时各组细胞增殖能力无明显差别, 但随着作用时间的延长, 作用12 h时, 细胞增殖较对照组明显增强, 且随着浓度的增加, 细胞增殖明显增强, 细胞增殖致24 h达高峰, 48 h细胞增殖被抑制, 细胞数量较24 h明显减少, 出现抑制细胞增殖的现象, 96 h细胞的数量进一步减少, 且呈浓度依赖性。详见表1。
与对照组 (5.5 mmol/L) 相比, 1) P<0.05
2.2 各组细胞HGFmRNA的表达
作用6 h, 高糖组HGFmRNA的表达与对照组无明显差别, 作用12 h, 高糖组HGFmRNA的表达较对照组升高, 作用24 h, HGFmRNA的表达开始降低, 随着作用时间的延长, HGFmRNA的表达逐渐降低, 即高糖降低HGF mRNA的表达。详见表2。
与对照组相比, 1) P<0.05
3 讨论
糖尿病以慢性高血糖为共同特征。血管内皮细胞分泌多种血管活性物质, 血管内皮细胞功能紊乱促进动脉粥样硬化;高血糖造成内皮细胞功能失常, 使多种内皮细胞源性因子如HGF、前列腺环素 (PGI2) 、一氧化氮 (NO) 、C型利钠素 (CNP) 等合成减少, 导致血管的硬化改变[3], 因而保护血管内皮细胞可抑制动脉粥样硬化, 减少糖尿病人群心脑血管病患病率。
血管内皮损伤是血管病变的基础, 糖尿病有多种因素可直接或间接导致血管壁受损, 使内皮细胞功能紊乱, 内皮损伤可能是动脉粥样硬化起始过程, 随后出现血小板生长因子释放, 后者引起血管平滑肌增生[4]。本实验观察到高糖早期通过上调HGFmRNA的表达诱导细胞增殖, 晚期HGFmRNA表达下调, 诱导细胞凋亡。高糖刺激血管内皮细胞早期增殖可能的机制之一是:血管内皮细胞作为对高糖损伤应激性地引起HGF分泌增加, 即高糖环境下12 h, HGFmRNA表达上调, 细胞增殖明显增加, 随着作用时间的延长, 高糖诱导细胞凋亡, HGFmRNA表达下调。高糖环境下bax-caspase蛋白激酶被激活而诱导细胞凋亡, 且浓度增加细胞死亡明显增加, 高葡萄糖主要增加bax蛋白, 而不影响bcl-2, 并且激活caspase3和caspase9;而HGF主要增加bcl-2的表达, 影响bax水平, 并且减少caspase3和caspase9的活性;高D-葡萄糖引起bax蛋白的迁移也能够被过度表达bcl-2完全阻断[5]。另外高浓度D-葡萄糖通过促进转化生长因子β (TGF-β) 分泌抑制局部HGF产生, 而HGF具有明显的促细胞有丝分裂增殖作用, 给予TGF-β抗体可以抑制这种减少[6]。因而HGF系统在糖尿病动脉粥样硬化中具有重要作用。
临床可应用HGF抑制或延缓动脉粥样及促进新生血管形成。Morishita等[7]对患有严重肢体缺血性疾病患者给予HGF质粒DNA治疗, 认为肌注HGF质粒DNA治疗是安全有效, 并且能够获得成功治疗。
HGF系统在糖尿病动脉粥样硬化中具有重要作用, HGF可促进血管内皮细胞增殖、迁移和新生血管形成, 抑制其凋亡, 在内皮细胞的凋亡与增殖平衡中发挥重要作用, 维持血管内皮细胞功能;抑制动脉粥样硬化, 减少糖尿病患者心脑血管的并发症。
参考文献
[1] Morishita R, Aoki M, Hashiya N, et al.Therapeutic angiogenesis using hepatocyte growth factor (HGF) [J].J Curr Gene Ther, 2004, 4 (2) :199-206.
[2]Yoshida S, Harada T, Mitsunari M, et al.Hepatocyte growth fac-tor/met system promotes endometrial and endometriotic stromalcell invasion via autocrine and paracrine pathways[J].Clin Endo-crinol Metab, 2004, 89 (2) :823-832.
[3] Nishimura M, Ushiyama M, Ohtsuka K, et al.Serum hepatocyte growth factor as a possible indicator of vascular lesions[J].J Clin Endocrinol Metab, 1999, 84 (7) :2475-2480.
[4] Tschoepe D, Roesen P, Schwippert B, et al.Platelets in diabetes:The role in the hemostatic regulation in atherosclerosis[J].Semin Thromb Hemost, 1993, 19 (2) :122-128.
[5]Nakagami H, Morishita R, Yamamoto K, et al.Hepatocyte growthfactor prevents endothelial cell death through inhibition of baxtranslocation from cytosol to mitochondrial membrane[J].Diabe-tes, 2002, 51 (8) :2604-2611.
[6] Morishita R, Nakamura S, Nakamura Y, et al.Potential role of an endothelium-specific growth factor, hepatocyte growth factor, on endothelial damage in diabetes mellitus [J].Diabetes, 1997, 46 (1) :138-142.
细胞增殖教学反思 篇4
教学内容包括
1、细胞不能无限长大的原因。
2、细胞增殖的周期性。
3、有丝分裂过程。
4、观察根尖分生组织细胞的有丝分裂。考虑到一节课教学内容的完整性，本节课我只复习第2、3点内容。该部分内容的重点内容主要有以下两个方面：细胞增殖的周期性和有丝分裂过程中染色体的行为变化。我先复习细胞周期的概念，对哪些细胞具有细胞周期、细胞周期的起始点利用图解进行了解读与分析，再分析了细胞周期的几种表达方式：扇形图、直线图、曲线图和柱形图。接下来，我花了大量的时间引导学生分析有丝分裂几个时期的染色体行为变化过程：
1、利用有丝分裂完整的分裂过程图，引导学生看书归纳各个时期的变化。
2、利用间期染色体的复制结果先做了一个画图演示、并分析了染色体、DNA、单体的数量判断方法。
3、接着我布置了一个任务，以一个细胞有4条染色体为例，让学生画细胞分裂过程。
4、进行变式，一个细胞有2N个染色体为例，染色体、DNA、单体的数量变化。
5、画曲线图。这样，通过多种模型的建构，目的是让学生更深刻的理解有丝分裂的过程。接着，我用一个动物细胞的有丝分裂过程动画，引导学生分析对比归纳植物细胞和动物细胞有丝分裂的区别。最后，进行课题练习。
一节课下来，我基本完成了教学内容，但对应的练习没有完成，特别是一些针对性的练习题目一题都没有练上。通过课后的评课，我得到了很好的教学建议：课堂时间有限，对应的核心练习必须要及时，必须要有针对性。
这节课也暴露了我很多的问题与不足：
1、生物学素养不够严谨。如画细胞分裂图像时间期没有画核仁、末期没有画核膜、没注意动植物细胞的区别。
2、对某些非重点内容耗时过长。如细胞周期、连续增殖或永不增殖细胞等内容。
3、课堂走动范围局限，没有注意到后排学生的练习错误。
4、练习题型的设置注意与新高考接轨，不设多选题。
5、存在知识性错误。对着丝点的分裂，我讲成了由于纺锤丝的牵引。
增殖作用 篇5
有研究显示雷帕霉素抑制膀胱癌5637 细胞增殖同时可以诱导细胞凋亡[8]。对于RAPA抗恶性血液肿瘤作用的机制研究报道不多。本研究以人慢性粒细胞性白血病K562 细胞为研究对象, 分析雷帕霉素对慢性粒细胞白血病K562 细胞株的增殖及细胞凋亡的影响, 为临床治疗慢性粒细胞白血病找到新方法。
1 材料与方法
1.1 细胞株
人慢性髓性白血病K562 细胞细胞株 ( 陕西省人民医院血液内科中心实验室) 。
1.2 主要试剂
雷帕霉素 ( 美国LC公司) 、二甲基亚砜 ( DMSO) ( Sigma) 、噻唑蓝 ( MTT) 购自上海生工公司、RPMI-1640 ( Gibco公司) 、Annexin V-FITC/PI双标记染色试剂盒 ( 晶美公司) 。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养
人慢性髓性白血病K562 细胞常规培养于含10g/dl胎牛血清的RPMI-1640 培养液, 并加入含1g/dl青霉素-链霉素, 培养条件为37℃、饱和湿度为5ml/dl CO2培养箱培养, 取对数生长期K562 细胞进行实验。
1.3.2 MTT检测细胞增殖
将处于对数生长期的K562 细胞, 调整细胞密度为5×105个/ml, 接种于96 孔无菌培养板中, 分别用25、50、100nmol/L雷帕霉素处理K562细胞, 每组均设3 个复孔, 各组细胞置于37℃、5ml/dl CO2培养箱培养24h、48h和72h后, 然后加入10μl MTT孵育4h, 将孵育后培养板取出, 小心吸弃孔内上清, 每孔加入150μl DMSO, 于摇床上振荡10min, 使结晶物充分溶解。 以调零孔调零, 在酶标仪上490nm波长处检测各孔吸光度值, 实验重复三次, 按照如下公式计算细胞增殖抑制率:细胞增殖抑制率 ( %) = ( 1-实验孔A490/对照孔A490) ×100%。
1.3.3 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率
取对数生长期K562 细胞, 调整细胞密度为1×106个/ml, 分别用25、50、100nmol/L雷帕霉素处理K562 细胞, 每组均设3 个复孔, 各组细胞置于37℃、5ml/dl CO2培养箱培养24h、48h和72h后, 4℃预冷PBS洗1 次, 弃上清, 用100μl钙缓冲液重悬细胞, 加Annexin V-FITC10μl和PI5μl, 室温孵育15min, 加钙缓冲液300μl。 应用流式细胞仪检测早期凋亡细胞百分率, 实验重复三次。
1.3.4 统计学处理
采用SPSS 13.0 软件进行统计分析, 计量资料用±S表示, 均数的两两比较用t检验, p<0.05 有统计意义。
2 结果
2.1 雷帕霉素抑制K562 细胞增殖抑制作用:
不同浓度雷帕霉素处理K562 细胞24h、48h和72h后, 随着浓度的增加和时间的延长, 对K562 细胞抑制作用逐渐增加, 细胞增殖抑制率增高, 见表1。 雷帕霉素对K562 细胞生长有明显的抑制作用, 并呈现浓度和时间双重依赖性, 与对照组比较有明显差异 ( p<0.05) 。
注:* 表示RAPA处理组与对照组比较, p<0.05.
2.2 雷帕霉素诱导K562 细胞凋亡
流式细胞仪检测结果显示, 25, 50, 100nmol/L的雷帕霉素作用于K562 细胞, 作用24h, 48h, 72h后细胞凋亡率均较空白对照组显著增加 ( p<0.05) , ( 表2) 表明具有剂量依赖性, 因此雷帕霉素处理组可以诱导K562 细胞凋亡。
注:* 表示RAPA处理组与对照组比较, p<0.05.
3 讨论
慢性粒细胞白血病 ( CML) 是起源于造血干细胞的克隆性增殖性疾病, 目前研究在探索治疗慢性粒细胞白血病的机制及其新方法, 诱导肿瘤细胞调亡是治疗白血病的必要手段。 研究表明, m TOR通路抑制剂可以使细胞周期阻滞在G1 期, 并可进一步促进线粒体损伤途径, 产生自噬及介导细胞凋亡[9]。 雷帕霉素是一种强有效的新型大环内酯类抗生素, 其主要作用位点在m TOR信号传导通路, 靶向m TOR信号通路是治疗肿瘤的一个新的方向, 目前临床上已经应用雷帕霉素治疗肾细胞癌, 在恶性血液疾病研究当中逐渐开始关注, 探索雷帕霉素在慢性粒细胞白血病的作用机制, 为临床治疗提供理论依据。
采用MTT法检测不同浓度雷帕霉素处理K562 细胞24h、48h、72h后, 对细胞生长增殖的影响, 结果显示, 雷帕霉素处理K562 细胞增殖明显被抑制, 并呈时间和剂量依赖性。增殖抑制率与对照组相比, 差异具有统计学意义 ( p<0.05) , 表明雷帕霉素作为mTOR的抑制剂, 可以抑制K562 细胞中的mTOR的活性, 已有研究显示, 雷帕霉素对白血病细胞HL-60、SUP-B15 细胞具有较强抑制作用, 因而, 证实雷帕霉素抑制K562 细胞的增殖, 可以为慢性粒细胞白血病联合用药治疗提供新的治疗方案。
流式细胞术检测不同浓度雷帕霉素对K562 细胞的早期凋亡率, 结果显示, 作用K562 细胞24h后, 早期凋亡率分别是15.19±0.32, 21.56±0.12, 25.95±0.16, 各实验组与对照组比较, 差异具有统计学意义 ( p<0.05) , 雷帕霉素使得大量K562 细胞停滞于G0/G1 期, 不能进入S期进行DNA的合成, 抑制肿瘤细胞的增殖, 并诱导细胞凋亡。 研究表明, 雷帕霉素可通过抑制m TOR信号, 从而导致造血干细胞发育分化进程被抑制, 阻止细胞周期的转变[10], 提示雷帕霉素明显抑制K562 细胞增殖, 诱导细胞凋亡, 具体机制有待进一步研究。
摘要：目的:探讨雷帕霉素 (RAPA) 对人慢性髓系白血病K562细胞株增殖和凋亡作用的影响。方法 :取对数生长期K562细胞, 用不同浓度的雷帕霉素 (25、50、100nmol/L) 处理K562细胞24、48、72h后收集细胞, MTT比色法检测处理组细胞的生长抑制率, 流式细胞术检测细胞早期凋亡率。结果:MTT法检测结果显示, 与对照组相比, 不同浓度的雷帕霉素对K562细胞的增殖均有明显的抑制作用, 100nmol/L雷帕霉素处理72h后抑制率高达48%, 且呈浓度和时间双重依赖性, 与对照组相比具有统计学意义 (t=6.691, p<0.05) ;流式细胞术检测25、50、100nmol/L雷帕霉素作用24h后, K562细胞早期凋亡率分别为13.12±0.32, 18.56±0.12, 25.95±0.16, 均较对照组明显增高, 48h、72h细胞凋亡率明显增高, 两两比较差异具有统计学意义 (t=4.900, t=14.640, t=16.830, p<0.05) 。结论:雷帕霉素对K562细胞的生长具有抑制作用, 并诱导细胞凋亡。
关键词：雷帕霉素,K562细胞,增殖,凋亡
参考文献
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增殖作用 篇6
microRNA可以调节多种基因的表达。近年来发现miR-145是正常动脉中含量最丰富的miRNA,且主要聚集在VSMC[1]。miR-145在原代培养的VSMC中含量最丰富而在去分化的VSMC中的表达是下调的[2]。本实验室前期已经成功构建了大鼠miR-145重组慢病毒载体并在去分化型VSMC中过表达,但是miR-145是否能抑制去分化型VSMC增殖及其机制仍不清楚。故本实验以体外培养的大鼠原代VSMC为模型,应用 PDGF-BB 作为外界刺激因子诱导 VSMC 增殖,同时用构建好的大鼠miR-145重组慢病毒载体浸染目的细胞,CCK-8法检测细胞增殖情况,并在分子水平探讨miR-145是否通过抑制PDGF激活MAPK途径从而抑制VSMC增殖,从而为其抑制VSMC 增殖的作用机制提供新的思路及实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
山西医科大学实验动物中心提供健康SD大鼠,体重110 g～130 g;DMEM细胞培养基、胎牛血清购自Hyclone公司;PDGF-BB购自美国PEPROTECH公司;CCK-8试剂购自碧云天公司;TRIzol、逆转录试剂盒、RT-PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司;引物设计与合成由上海吉玛公司完成;蛋白提取试剂盒购自北京普利莱公司;PVDF膜购自北京索莱宝公司;磷酸化ERK1/2和总ERK1/2抗体购自北京博奥森公司;磷酸化JNK和总JNK抗体、磷酸化p38MAPK和总p38MAPK抗体均购自美国Cell signaling technology公司;羊抗兔二抗购自Santa公司;marker购自富酶泰斯生物技术(深圳)有限公司;Ecl-plus发光试剂盒购自武汉博士德公司;其他试剂均系进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 大鼠原代VSMC培养
采用组织块贴壁法培养VSMC,传代后对VSMC进行抗αSM-actin免疫细胞化学染色鉴定。选择3～8代进行实验。
1.2.2 实验分组
将细胞分为4组。空白对照组:培养的大鼠原代VSMC不做任何处理。PDGF-BB组:大鼠原代VSMC中加入终浓度为10 g/mLPDGF-BB。PDGF-BB+ miR-145组:细胞转染miR-145慢病毒载体72 h后加入终浓度为10g/mLDGF-BB。miR-NC组:细胞转染阴性慢病毒载体。
1.2.3 CCK-8法测细胞增殖
收集对数期细胞种96孔板,每孔加入100 μL细胞,边缘孔用无菌PBS填充,加入各组中的药物及慢病毒,每孔100 μL,每组设5个复孔。5%CO2,37 ℃孵育48 h。每孔加入10 μLCCK-8溶液继续培养1 h～4 h。酶标仪在450 nm波长处测每孔的光密度值。
1.2.4 细胞RNA提取和RT-PCR反应
使用Trizol 试剂盒提取细胞总RNA, 逆转录反应得到对应细胞的cDNA 模板, 采用SYBR Green 法进行Real-time PCR检测,反应体系为20 μL,包含上下游引物、DNA 模板、Taq DNA polymerase和ddH2O。定量反应条件: 95℃预变性30 s,95℃变性5 s,60 ℃退火31 s,进行40个循环。各组PCR 均重复3 次。使用凝胶成像系统分析结果。mRNA 的相对表达量用2 -△△Ct方法来表示,其中△Ct = Ct 目标mRNA - CtGAPDH,△△Ct =△Ct 处理-△Ct 对照。
1.2.5 Western印迹方法检测ERK1/2
和 p-ERK1/2等的表达 用Bradford法测蛋白浓度。5% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,转移至硝酸纤维膜(PVDF膜),依次加入兔抗鼠ERK1/2和p-ERK1/2抗体(1∶2 00)、兔抗鼠JNK和p-JNK 抗体(1∶2 000)、兔抗鼠p38MAPK和p-p38MAPK(1∶2 000)浸泡滤膜,4 ℃过夜,洗涤后加入碱磷酶标记的羊抗兔IgG(1∶3 000),洗膜后ECL化学发光试剂检测。定量分析采用分子生物学图像分析系统。
1.3 统计学处理
采用SPSS13. 0软件,用均数±标准差
2 结果
2.1 miR-145对PDGF诱导VSMC增殖的影响
CCK-8结果显示,与空白对照组比较,miR-NC组OD值无统计学意义;PDGF组OD值明显升高(P<0.05),PDGF可促进VSMC增殖。与PDGF-BB组比较,PDGF-BB+miR-145组OD值明显下降(P<0.05),提示miR-145可抑制PDGF诱导的VSMC增殖。详见表1。
2.2 miR-145对VSMC相关基因的影响
RT-PCR结果显示:与空白对照组比较,miR-NC组PCNA、c-Jun及SM22a mRNA的表达无统计学意义,PDGF组PCNA、c-Jun mRNA的表达分别上调1.37倍和2.68倍(P<0.05),而SM22a mRNA的表达下调80%(P<0.05)。提示PDGF可促进VSMC增殖抑制VSMC分化;与PDGF-BB组比较,PDGF-BB+miR-145组PCNA、c-Jun mRNA的表达分别下调66.4%和77.2%(P<0.05),而SM22a mRNA的表达上调4.4倍(P<0.05)。提示miR-145可抑制PDGF诱导的VSMC增殖而促进VSMC分化。
2.3 miR-145对PDGF诱导的p-ERK/ERK蛋白表达的影响
Western-blot结果显示:PDGF-BB(10 ng/mL)诱导VSMC后,p-ERK水平明显上调,与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。转染miR-145干预72 h后再加入PDGF-BB刺激,p-ERK水平明显下调,与PDGF组相比差异有统计学意义(P<0.05)。空质粒组与对照组相比无统计学意义。详见图1。
Total ERKP-ERK
2.4 miR-145对PDGF诱导的p-JNK/JNK蛋白表达的影响
Western-blot结果显示:PDGF-BB(10 ng/mL)诱导VSMC后,p-JNK水平明显上调,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。转染miR-145干预72 h后再加入PDGF-BB刺激,p-JNK水平明显下调,与PDGF组相比差异有统计学意义(P<0.05)。空质粒组与对照组相比无统计学意义。详见图2。
Total JNKP-JNK
2.5 miR-145对PDGF诱导的p-
p38MAPK/p38MAPK蛋白表达的影响 Western-blot结果显示:PDGF-BB(10ng/mL)诱导VSMC后,p- p38MAPK水平明显上调,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。转染miR-145干预72 h后再加入PDGF-BB刺激,p- p38MAPK水平明显下调,与PDGF组相比差异有统计学意义(P<0.05)。空质粒组与对照组相比无统计学意义。详见图3。
Total P38MAPKP-P38MAPK
3 讨论
VSMC由分化表型向去分化表型转化是VSMC增殖与迁移的关键性起始步骤,这是许多血管增生性疾病如:动脉粥样硬化、高血压和经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄等疾病共同的细胞病理基础之一。microRNA是近些年来研究的热点之一,而miR-145受到关注是由于它在许多癌症中的表达下调,能够抑制癌细胞增殖,是一种新发现的抑癌基因[3,4]。然而,miR-145能否抑制VSMC的增殖仍不清楚。miR-145是VSMC一个重要的表性标记物和表型调节剂,能够抑制新生内膜的形成[1]。但是抑制新生内膜形成的具体机制尚未阐明。因此,进一步研究miR-145抑制VSMC增殖的机制是本次研究的重点。
细胞增殖是一系列基因有序调控的结果,在许多病理情况下,外界环境造成某些生长因子(如PDGF)增多,通过刺激信号转导网络调节某些基因表达增多,使VSMC 的增殖失控,引起一系列病理改变[5]。MAPK 是刺激脊柱类动物细胞增殖、分化的信号在细胞内传递的交汇点或共同通路[6,7]。PDGF能够吸引血管中层平滑肌向内膜下迁移,使VSMC从收缩型变为合成型,合成型(即去分化型)VSMC有很强的增殖能力及更高的MAPK水平[8]。PDGF通过受体酪氨酸酶途径激活静止期VSMC的MAPK[9],MAPK激活转录因子,增加VSMC的DNA合成,促进细胞增殖[10]。miR-145能否通过抑制去分化型VSMC中的MAPK信号通路,进而抑制VSMC的增殖尚不清楚。本实验测CCK-8比较PDGF组和转染miR-145慢病毒载体再给PDGF组的VSMC增殖情况;RT-PCR说明miR-145抑制增殖的机制与VSMC相关基因的表达有关;同时做western blot说明miR-145抑制PDGF诱导的VSMC增殖的机制与其抑制MAPK通路中的p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p- p38MAPK/p38MAPK蛋白的表达有关。
参考文献
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增殖作用 篇7
骨性关节炎(osteoarthritis,OA)也称为退行性关节炎,是一种以关节软骨组织变性、破坏及关节非承载面骨赘形成,软骨下骨硬化增生为特征的慢性关节炎疾病[1]。OA疾病病变发生于全身各处大小关节,其中以髋关节、膝关节为主,伴随着关节疼痛和功能障碍、畸形[2]。近年众多关节炎分子生物研究表明,骨性关节炎发病发展涉及多种因素诱导其发病:年龄、外伤、异常重力应载、遗传易感性、软骨组织新陈代谢失平衡以及软骨细胞凋亡和增殖异常[3]。但是,临床上治疗骨关节炎疾病的药物少之又少,主要是氨基葡萄糖类药物,所以研究骨关节炎病理生理发展和信号级联调控通路是非常必要的。
MicroRNA(miRNA、miR)是一类由内源基因编码的长度约18~22个核苷酸的非编码单链RNA分子,在转录后期靶向结合mRNA 3’非编码区,抑制mRNA翻译或促进mRNA降解,以致调节蛋白质表达,参与介导细胞内活动,例如细胞凋亡、细胞增殖和分化[4]。尽管miRNAs家族广泛地分布人体组织内,但是miRNAs的表达呈现细胞表型、组织特异性以及细胞分化阶段特异性[5]。据报道,miRNAs参与多种疾病病理生理发生、发展[6]。MiRNA作为多种疾病发生发展的重要调节因子是因为人体处于某种疾病情况下,特定miRNAs表现出调节功能障碍[7,8]。近年来研究表明,miRNAs在调节关节内稳态、在OA发病机制中起着重要的调节作用。Silvia Díaz-Prado等利用miRNA基因芯片技术筛选出在OA软骨组织中具有潜在调节作用的miRNA[9]。在我们之前研究miRNA-25过表达促进OA软骨细胞合成蛋白多糖及Ⅱ型胶原蛋白,miR-25介导OA发病发生、进展中发挥着保护性调节作用[10]。但是关于miRNA-25参与调节OA软骨细胞凋亡和增殖尚未见报道。本次试验研究,miRNA-25是否参与调控OA软骨细胞凋亡、增殖,可能对OA具有潜在的治疗作用。
2 材料和方法
2.1 实验材料与试剂
2.1.1 实验动物
雄性Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠20只,SPF级,重200~250 g,购于斯莱克景达实验动物有限公司(SCXK(湘)2011—0003),中国湖南)。
2.1.2 实验试剂
木瓜蛋白酶(0.2g/m L)(Solarbio,中国上海)、戊巴比妥钠(2%,w/v)(全式金,中国北京)、胰蛋白酶(0.25%,w/v)(全式金,中国北京)、Ⅱ型胶原蛋白酶(1%,w/v)(全式金,中国北京)、100μm尼龙细胞过滤网(Canspecsci,中国上海)、生长培养基(含青霉素和链霉素)(博士德,中国武汉)、胎牛血清(BI,以色列)、MiRNA-25(模拟物和抑制剂的质粒载体)及其空质粒载体、miR-25引物(吉玛公司,中国上海)、Lipo2000(全式金,中国北京)、Annexin V-FITC/PI(贝博公司,中国上海)、细胞计数盒CCK-8 kit(全式金,中国北京)。
2.2 实验方法
2.2.1 骨关节炎动物模型制作
雄性Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠),称重约200~250 g,购于斯莱克景达实验动物有限公司(中国湖南)。动物抵达后,立即饲养于南昌大学第二附属医院动物研究中心。每4只大鼠饲养在同一鼠笼(大小25 cm×40 cm)。大鼠均给予标准实验动物饲料和饮用水,并保持室内温度(26±1)℃,实行12 h明暗更变方案,早7点开灯照明。所有的动物实验操作均按照中国动物伦理委员会社会准则。南昌大学附属医院审查委员会正式批准实施的动物获得作为所描述的实验对象。
行膝关节腔注射木瓜蛋白酶(Solarbio,中国上海)诱发单侧骨关节炎模型[[11,12]]。以往研究表明分别于第1、4、7天总计3次注射诱导OA[11],但是单次注射木瓜蛋白酶后第7天OA关节负重面可能会恢复正常。因此,我们采用于第1、4、7、10、13天行膝关节腔注射木瓜蛋白酶。选取40只实验大鼠,首先使用戊巴比妥钠(2%,w/v)(全式金,中国北京)行腹腔注射麻醉大鼠,75%医用酒精消毒右侧膝关节区域,触诊膝关节髌骨位置,使用28号针头于髌骨下侧垂直进针,穿透髌韧带,向近端转向插入膝关节腔,直至感到落空感。100μL稀释0.2 mg木瓜蛋白酶注射入右膝关节腔,左侧膝关节不做处理,作为对照组。在第40天进行Kraus改良Mankin评分(评分标准如表1)。
2.2.2 SD大鼠软骨细胞分离和原代培养
为了软骨细胞分离并原代培养,软骨组织从股骨髁和胫骨平台剥离,利用磷酸盐缓冲盐水(PBS)和青霉素(100单位/m L)和链霉素(100μg/m L)冲洗3次,于培养皿(直径=6cm)中手术刀刀片切成1mm×1 mm,接着使用胰蛋白酶(0.25%,w/v)(全式金,中国北京)在37℃培养箱中预消化30 min和使用Ⅱ型胶原蛋白酶(1%,w/v)(全式金,中国北京)消化3 h。经过3 h消化后,将组织样品通过100μm尼龙细胞过滤网(Canspecsci,中国上海)以消去未消化的软骨组织,过滤后软骨细胞离心分离(1 000 r/min,5 min)后再次重悬于生长培养基(含青霉素和链霉素的DMEM和10%胎牛血清)(博士德,中国武汉和BI,以色列),并贴壁生长。所有细胞培养置于恒温37℃、5%CO2培养箱,每2~3天更新一次培养基。
2.2.3 miRNA-25转染
MiRNA-25(模拟物和抑制剂的质粒载体)及其阴性对照购于吉玛公司(中国上海)。MiRNA-25模拟物(5μL),抑制剂(5μL)和阴性对照(5μL)利用Lipo2000(全式金,中国北京)分别转染至OA软骨细胞。转染后24 h后利用荧光显微镜(OLYMPUS TH4—200,日本)观察6孔板模拟物和抑制剂转染细胞活性,进行荧光素蛋白分析,计算转染率[10]。
2.2.4 软骨细胞增殖检测
按照试剂制造商说明通过细胞计数盒(CCK-8kit)检测软骨细胞增殖活性。简而言之,大约3×103细胞接种于每孔含有100μLDMEM的96孔板中,随后IL-1β(5ng/m L)加入培养基中,然后培养24 h。miR-25模拟物、抑制剂、阴性对照分别转染至各组。混有10μL CCK-8溶液的100μL新DMEM培养基(v/v,含有10%胎牛血清)加入每孔并于37℃孵育4 h。四块96孔板依次以miRNA-25转染后0 h、24 h、48 h、72 h检测(吸光度:490 nm)。每次检测重复3次。
2.2.5 软骨细胞凋亡检测
软骨细胞凋亡依据Annexin V-FITC/PI(贝博公司,中国上海)试剂说明检测。4℃PBS冲洗细胞培养皿3次后,无EDTA的0.25%胰蛋白酶(全式金,中国北京)消化30 s,轻轻吹打细胞,离心(1 000rpm,5 min)弃去上清液,分离细胞。避光下依次加入Annexin V-FITC和PI,各自室温下孵育15min、5 min。软骨细胞通过流式细胞仪(BD Biosciences公司,美国)分别在530/30 nm(FITC)和582/42nm(PI)下进行分析。使用Cell Quest软件进行细胞凋亡比例分析。每次试验重复3次。
2.2.6 统计分析
数据按Mean±S.E.M形式表示。统计使用两样本t检验行两组之间进行比较。P值<0.05被认为具有显著差异统计学意义。
3 结果
3.1 骨关节炎模型评价和分析
对照组和木瓜蛋白注射组进行骨关节炎动物模型评价分析,确定对照组没有软骨损伤,而木瓜蛋白酶注射组关节软骨表面形态变化明显,提示木瓜蛋白注射组软骨退变。依照Kraus改良Mankin评分,木瓜蛋白注射组明显不同于对照组,证明处理组明显关节退变(图1)。
图1(a)木瓜蛋白酶注射组软骨组织HE染色(200×);(b)对照组软骨组织HE染色(200×);(c)木瓜蛋白酶注射42D后骨关节Kraus改良Mankin评分明显升高,每组均包括5个软骨组织样本(n=5),**P<0.01 vs对照组Fig.1(a)HE staining of Papain injected cartilage(100×);(b)HE staining of Control group(100×);(c)Kraus modified Mankin score significantly increased 42 days after Papain injected cartilage,each groups included 5 samples,**P<0.01 vs.Control
3.2 miRNA-25转染OA软骨细胞
已发表的研究[10]MiR-25模拟物/抑制物转染至OA软骨细胞24 h经荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,并计算转染率为66%,证明了转染miR-25模拟物/抑制物成功。
3.3 miRNA-25对IL-1β促进软骨细胞凋亡和抑制细胞增殖调节作用
为了研究miRNA-25是否具有调节OA软骨细胞凋亡作用,IL-1β(5 ng/m L)刺激OA软骨细胞24h后,然后研究miRNA-25可能的调节作用。因此,转染miR-25模拟物或者抑制物后,通过Annexin V-FITC/PI检测细胞存活率。如图2A所示,转染miR-NA-25模拟物的OA软骨细胞组凋亡率显著降低,而转染miRNA-25抑制物的OA软骨细胞组的凋亡率明显增高。同时软骨细胞增殖活性通过细胞计数盒8(CCK-8)检测。如表2、图2B所示,miRNA-25模拟物转染组的细胞增殖显著增高;而miRNA-25抑制物转染组的细胞活性明显下降。
4 讨论
软骨外基质(ECM)新陈代谢平衡失调是骨关节炎在分子水平上的主要特点,该平衡失调主要由多种促炎性因子介导并发挥重要作用,例如白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)[13]。IL-1β是退行性骨关节炎发病机制及病理发展过程中起重要促进作用的主要炎性细胞因子[14]。该细胞因子诱导基质金属蛋白酶合成和抑制软骨外基质合成[15]。IL-1β同样诱导软骨细胞凋亡,进一步导致关节软骨退变[16],提示IL-1β可以作为促进骨关节炎体外模型的炎性因子。
在之前研究[10]中,证明了IL-1β可以抑制软骨细胞合成蛋白多糖和II型胶原蛋白以及miR-25参与调节ECM合成,其过表达促进蛋白多糖和II型胶原蛋白合成。因此在本次研究中,检测了miR-25是否参与调节IL-1β诱导OA软骨细胞凋亡和细胞增殖,进一步参与调节骨关节炎疾病发展。分别通过Annexin V-FITC/PI和CCK-8检测miR-25转染后OA软骨细胞凋亡和增殖,miR-25过表达抑制IL-1β诱导OA软骨细胞凋亡和促进OA软骨细胞增殖;而miR-25低表达正好相反,提示miR-25可能参与调节细胞活性,延长细胞“寿命”,达到延缓骨关节炎疾病发展的目的。根据miRNA数据库其miR-25靶向结合基因序列预测并不收录ACAN、Col2a1,但是收录了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)4基因,然而丝裂原活化蛋白激酶信号通路涉及OA软骨细胞合成基质糖原,参与骨关节炎疾病发生与发展[17]。丝裂原激活通路蛋白激酶家族是信号转导过程中非常重要的信号分子,在疾病发生和发展过程中起重要调控作用,细胞内磷酸化级联反应的终反应是MAPK激活,而丝裂原活化蛋白激酶4是信号通路重要的激活剂[17]和丝裂原活化蛋白激酶4是P38重要的激活蛋白,P38通路在细胞凋亡中在Caspase通路上游起作用,因此P38信号通路参与了细胞增殖、分化以及凋亡过程[18]。所以我们假设miR-25通过靶向结合丝裂原活化蛋白激酶4基因,参与P38和Caspase通路,调节OA软骨细胞凋亡,但是需要进一步研究证实。
图2A miR-25转染OA软骨细胞24 h后细胞凋亡检测。(a)对照组,(b)miR-25 mimic组,(c)NC组,(d)miR-25inhibitor组,(e)NC组,(f)各组细胞凋亡柱状图,平均光度值(ODs±SEM)分别表示细胞凋亡。未转染miR-25的OA软骨细胞为对照组,*P<0.05,#P>0.05 vs control Fig.2A OA chondrocytes apoptosis tested by Annexin V-FITC/PI 24hours after chondrocytes were transfected with miR-25.(a)Control,(b)miR-25 mimic,(c)NC,(d)miR-25 inhibitor,(e)NC,(f)Histogram of cellular apoptosis,apoptosis rates were indicated with ODs±SEM.OA chondrocytes non-transfected with miR-25 act as Control group,*P<0.05,#P>0.05 vs.control
总而言之,试验结果表明miR-25延缓了OA疾病进展,抑制OA细胞凋亡和促进细胞增殖。MiR-25进一步研究,可能对OA发病机制有新的认识和提示OA新治疗策略。
增殖作用 篇8
1 非神经细胞中nAchRs的表达
人类、鼠和兔子的正常支气管表皮细胞表达多种nAchRs亚基。实验表明, 非神经nAchRs位于支气管表皮和内皮细胞膜上。许多实验数据表明, 支气管上皮、内皮细胞等合成乙酰胆碱, 这些细胞具有胆碱乙酰转化酶活性, 在非小细胞肺癌癌细胞、癌旁正常组织和正常组织中nAchRs的表达模式不同, 这揭示了β4亚基的上调和α4水平的伴随下降。通过RT-PCR和免疫杂交技术, 在胸膜间皮活组织切片检查到a7 nAchRs, 但其亚细胞定位不能通过免疫组化的方法定位, 且仍需进一步的实验验证人类非小细胞肺癌nAchRs亚基是通过尼古丁受体和离子门通道起作用的。
2 nAchRs和细胞增殖
2.1 尼古丁对细胞增殖的影响
nAchRs激动剂尼古丁是烟草的主要活性成分。尼古丁处理SCLC、NSCLC等细胞系诱导依赖nAchRs方式的细胞增殖[1]。此外, 在hamster鼠中研究表明尼古丁和氧过多结合能够诱导肺癌。这一发现表明肺部结合氧的减弱以及nAchRs的慢性刺激诱导肺癌发生。nAchR拮抗剂的产生加强了nAchRs在细胞增殖中作用的研究。尤其a7nAchRs被表明具有调节尼古丁的增殖作用。以往在NHBE、SCLC和NSCLC细胞的研究表明a7nAchRs拮抗剂、a金环蛇毒素等能够减弱尼古丁的增殖作用。然而, 有一些研究者在BEAS-2B无限增殖的人支气管上皮细胞和吸烟者的NHBE细胞中未检测到a7nAchRs的表达。已表明, 尼古丁通过a7nAchR刺激间皮瘤的增长。此外, 通过MTT和软凝胶实验在两株由胸膜活检组织建立原发肿瘤细胞系中, 100nm筒箭毒碱终止细胞生长。这些研究强调了nAchR做为肿瘤治疗分子靶位点的可行性。
2.2 尼古丁诱导细胞增殖的信号通路
尼古丁通过增加生长因子如BDNF等和生长因子受体如VEGFR-2等水平促进细胞增殖。尼古丁通过增加细胞内Ca2+和Ca2+通道诱导表皮生长因子受体转导。细胞内Ca2+引起EGFR转导的可能的机制之一, Ca2+的上升诱导胞浆激酶活性, 进一步磷酸化EGFR。尼古丁在胃癌细胞中通过刺激COX-2的表达上调血管内皮生长因子受体VEGFR。这些结果首次表明了MMPs和纤溶酶原在nAchR信号途径中的作用。
在A549细胞系中, 尼古丁可以促进蛋白磷酸酶1 (PP1) 的抑制性磷酸化。磷酸化使PP1功能丧失, 降低细胞周期依赖性激酶抑制子p27Kip1的水平, p27Kip1反作用促进细胞周期过程。尼古丁以依赖α7受体模式, 通过诱导纤维结合素和α5β1整合素的表达增强NSCLC细胞的生长。影响α7nAchR作用的纤维结合素受ERK和PI3K/mTOR信号通路的激活调节。
尼古丁在小细胞肺癌细胞、角质化细胞及间皮瘤中激活Ca2+流入, 尼古丁与α7 nAchR结合导致膜去极化、Ca2+通道激活和5-羟色胺释放[2～4]。尼古丁诱导细胞增殖的其它信号通路包括NF-kB、Src, Akt、HIF-1α和COX-2激活的信号通路[3]。在间皮瘤细胞中, 尼古丁结合nAchR引起Ca2+流入, 并激活激酶MEKK-1、ERK1/2和p90RSK。随后, MEKK1激活转录因子NF-kB复合物, 后者诱导细胞进入S期。尼古丁也能激活MAP激酶通路, 以依赖于α7nAchR的方式增加Raf-1、ERK1/2和MEK1的水平[4]。1μm尼古丁处理A549细胞引起Rb和Raf-1信号激酶的生理性相互作用。Rb-Raf之间的相互作用是调节细胞增殖的重要早期事件。此外, 尼古丁引起Rb-Raf下游的细胞周期蛋白和依赖细胞周期蛋白激酶的失活, 随后E2F1从Rb解离下来促进细胞生长。尼古丁可以促进E2F1、E2F2和E2F3结合到增殖启动子上, 引起它们的相互作用使细胞进入S期。
2.3 烟草烟碱诱导的信号通路
烟碱是烟草的主要成分, 它们与nAchR具有高亲和力。已发现NNK是α7 nAchR的高亲和力激动剂, 而NNN结合epabidine敏感的nAchRs。DEN具有与多种nAchR结合的低亲和力[5]。长期暴露在NNK的A/J鼠引发肺癌[1]。NNK和NNN也可以通过上调细胞核增殖抗原和Bcl-2, 引起Het-1A口腔上皮恶性转移[1]。此外, 在BEP2D支气管上皮细胞中, NNK和NNN通过α7nAchR刺激不同的信号通路, 而NNK引起转录因子GATA-3、NF-kB和STAT-1的激活, NNN主要激活GATA-3和STAT-1。此外, 在SCLC中, NNK促进Ca2+流入, 释放血清素, 并通过PKC和MAP激酶通路激活细胞增殖[1]。
2.4 尼古丁诱导的血管生成
新血管生成是肿瘤生长和转移的关键步骤。已证明尼古丁诱导血管生成和动脉粥状硬化[1], 并在上皮细胞高氧症和缺血症中上调和活化α7nAchR。此外, 尼古丁受体在肿瘤血管生成、免疫系统和心血管系统网络中起基础作用。
总之, nAchR诱导的增殖信号通路的近期资料强调了受体在调节非神经细胞级联反应中的重要作用。
3 nAchR和生存途径
尼古丁可以抵抗由于外界因素诱发的细胞凋亡。尼古丁通过磷酸化Bcl-2导致磷酸酯酶C活化, 保护H82 SCLC细胞避免由于顺铂诱导的凋亡。NHBE细胞中含a3和a4亚基的nAchR通过Akt通路调节尼古丁的凋亡活性。此外, 数据显示尼古丁可以诱导Akt位点特异性磷酸化 (Thr308和Ser473) 。尼古丁也导致下游Akt分子的磷酸化, 如mTOR、FKHR等。参与尼古丁抗凋亡的其它信号通路包括:PKC、PKA和NFkβ的激活以及肿瘤抑制因子p53的下调。尼古丁诱导前凋亡蛋白Bad的多位点磷酸化, 导致Bad失活并阻止凋亡。尼古丁诱导的Bad磷酸化通过PKC、PKA、MEK和PI3K信号途径调节。凋亡抑制蛋白IAPs在尼古丁抗凋亡中的作用在NSCLC中已有研究。尼古丁在A549细胞中, 以α3 nAchR依赖方式可以调节XIAP和survivin的上调。关于乙酰胆碱受体何种亚基负责尼古丁的抗凋亡作用, 目前存在争论。一些实验室数据显示, 在尼古丁生存作用中存在二氢-β-刺桐敏感的α3或α4受体[6], 这表明尼古丁增殖作用和生存作用是受不同nAchR受体类型调控的。α7nAchR和β-肾上腺素受体在一些细胞系中调节尼古丁抗凋亡作用。这种差异部分可由nAchR亚单位抑制子的多效性解释。
nAchRs在支气管、血管和口腔上皮中的功能鉴定, 有可能表明nAchR受体调节烟草相关的细胞毒作用。一些有争论的研究猜测, 烟草在心血管和呼吸系统的细胞毒性可能是通过尼古丁结合靶细胞nAchRs触发的。α3β2 nAchR通过p21、Bcl-2、NF-kB和STAT1途径调节烟草毒性。相反, α7nAchR在口腔角质形成细胞通过MAP激酶和JAK/STAT途径的激活调节烟草的细胞毒作用。通过对人类口腔角质形成细胞基因表达谱、吸烟环境和纯尼古丁条件下基因表达情况的研究发现, 尼古丁和吸烟环境都依赖α7-nAchR使生存因子NF-Kb的转录活性增加7倍。
4 结束语和前景
吸烟是肿瘤和心血管疾病的关键因素之一, 尤其是吸烟与90%小细胞肺癌和60%非小细胞肺癌相关。尼古丁在非神经细胞上通过nAchRs促进肿瘤生长和生存。nAchRs的促存活和有丝分裂作用为这些现象提供了可能的分子机制。从新的生长因子信号和烟草的作用两个角度, 非神经细胞nAchR信号对细胞命运和存活具有重要意义。nAchR信号网络的研究将与暴露于尼古丁替代物 (如粘贴或口香糖) 的患者尤为相关。
今后的研究需要定义不同nAchR亚基在非神经细胞中的功能及其参与细胞增殖和抗凋亡的下游信号通路。nAchR为基础的药物治疗在脑瘤中和中枢神经系统中有潜在的副作用, 需要进一步准确评估。nAchR类似物的发展将有助于nAchR信号通路的研究, 有利于与烟草相关肿瘤的抗癌药物的设计。
摘要：吸烟是肿瘤和心血管疾病的关键因素之一, 尼古丁是烟草的主要有效成分, 已发现尼古丁在非神经细胞上通过nAchRs促进肿瘤生长和生存。nAchRs的促存活和有丝分裂作用为这些现象提供了可能的分子机制。nAchR类似物的发展将有助于nAchR信号通路的研究, 有利于与烟草相关肿瘤的抗癌药物的设计。
关键词：肿瘤,尼古丁乙酰胆碱受体,细胞增殖,细胞凋亡
参考文献
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增殖作用 篇9
1方法
1.1 MTT法检测胡桃醌对MCF-7细胞的增殖抑制作用。方法参见[4], 酶标仪在检测波长为570 nm条件下测吸光度 (A) 值, 计算细胞抑制率。
1.2荧光显微镜观察细胞形态学改变。方法参见[4], 在荧光显微镜下观察细胞形态。
1.3流式细胞术测定细胞凋亡率。方法参见[4], 300目网过滤后, 用流式细胞仪检测。
2结果
2.1 MTT法检测胡桃醌对MCF-7细胞的生长抑制作用。结果如图1所示, 胡桃醌对人乳腺癌MCF-7细胞的IC50为11.99μmol/L, NAC+胡桃醌联合给药组的IC50为49.75μmol/L。
2.2荧光显微镜观察胡桃醌诱导MCF-7细胞凋亡形态。结果如图2所示, 空白对照组细胞界限清晰, 细胞核呈现的荧光, 均匀弥散;阳性对照组有明显的凋亡小体出现;胡桃醌给药组随浓度增加, 细胞质或细胞核内, 出现明显的浓染致密的颗粒状荧光, 而且凋亡小体逐渐增多, NAC联合给药组作用MCF-7细胞24h后, 与相应剂量单独胡桃醌组比较, 诱导MCF-7细胞凋亡作用明显减弱。
2.3流式细胞仪检测胡桃醌对MCF-7细胞凋亡率的影响。结果如图3所示, 阳性对照组凋亡率为 (12.75±0.23) %, 5、10、20μmol/L的胡桃醌剂量组凋亡率分别为 (6.35±0.35) %、 (12.43±0.17) %、 (28.55±0.64) %, , NAC联合给药组凋亡率分别为 (3.46±0.34) %、 (9.52±0.42) %、 (25.33±0.41) %, 与相同剂量单独胡桃醌组比较, 细胞凋亡率明显下降, 具有统计学意义 (P<0.01) 。
3讨论
本课题研究结果显示胡桃醌具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用, 并在实验中, 增设NAC联合给药组, 即给药的同时加入NAC (10mmol/L) , N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 是细胞内还原性谷胱甘肽的前体, NAC分子中含有活性巯基 (-SH) , 可对抗不同原因所致的组织氧化损伤。本课题以人乳腺癌细胞株 (MCF-7) 为研究对象, 采用MTT法、荧光显微镜、流式细胞仪等多种方法对胡桃醌的体外抗肿瘤作用进行研究, 为进一步的抗肿瘤机制研究奠定基础。
**Compared with matched doses Juglone P<0.01
参考文献
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